JPWO2003004654A1

JPWO2003004654A1 - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎａｄｐ）の製造方法

Info

Publication number: JPWO2003004654A1
Application number: JP2003510812A
Authority: JP
Inventors: 重幸河井; 幸作村田; 寛和松川; 昭一冨迫; 与志夫安藤; 雄志松尾
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2002-07-02
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2022-07-02
Also published as: EP1416051A1; JP4088251B2; US20040248263A1; EP1416051B1; CA2452399C; CA2452399A1; US7863014B2; WO2003004654A1; EP1416051A4

Abstract

本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の新規な製造方法を提供する。本発明の方法はポリリン酸若しくはその塩及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を基質とし、ミコバクテリア属由来のポリリン酸依存性のＮＡＤ＋キナーゼを用いてリン酸化反応を行う、ここにおいて、反応溶液は０．１ないし１５重量％のポリリン酸若しくはその塩、および５ないし１５０ｍＭの二価の金属イオンを含むことを特徴とする。

Description

技術分野
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の製造方法に関する。
背景技術
ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）は、血液および尿の酵素的な分析のための診断試薬として使用されている［１］。ＮＡＤ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）にリン酸基を転移する反応は、従来よりＮＡＤ^＋キナーゼを利用した酵素合成反応により行われてきた。その際に用いられているＮＡＤ^＋キナーゼは微生物由来のものが多く、たとえば酵母や動植物由来、ならびに微生物としてＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のものが、酵素ハンドブック１９８３朝倉書店ｐ．３３９ページ［２０］やＭａｔｓｕｓｈｉｔａＨｅｔａｌ．１９８６Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：５８５−５９０［２］に記載されてる。
ＮＡＤ^＋に対するリン酸供与体の種類により、ＮＡＤ^＋キナーゼは大別すると、以下の３つに大別される。産業的な利用価値との関係を下表にまとめる。

現在、産業的にはＮＡＤＰの製造は、ＡＴＰの存在下でＮＡＤのリン酸化を触媒するＡＴＰ−依存性ＮＡＤキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２３）を含む、酵素的な方法によって産生されている［２］。これは、ＮＡＤ^＋キナーゼの多くは微生物や酵母や動植物においてＡＴＰ依存型のもの（上表の１）タイプ）が広く存在し、産業的な活用面で利用しやすかったことを理由の一つとする。ＡＴＰ依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを用いたＮＡＤＰ^＋合成の場合には、工業的に高価なＡＴＰを使用するためにＡＴＰ再生反応とカップルさせる必要が生じる。ＡＴＰ再生反応とＮＡＤＰ^＋合成反応との収支を次式にまとめる。

Ｘ−Ｐ：生物中の高エネルギーリン酸化合物、例えば、アセチルリン酸、
カルバミルリン酸、ホスホエノールビルビン酸、ＡＤＰなど
Ｘ：酢酸、カルバミル酸、ビルビン酸、ＡＭＰなど
ＡＴＰ再生反応に利用する酵素：酢酸キナーゼ、カルバメートキナーゼ、
ピルビン酸キナーゼ、アデニル酸キナーゼなど
しかしながら、上記方法はＡＴＰが高価であり、そして酵素の安定性及び細胞内含量が低いという欠点を有する。そこで、ＮＡＤ^＋からＮＡＤＰ^＋を工業的に生産する場合には、リン酸供与体として安価に入手が可能なポリリン酸を使用できるＮＡＤ^＋キナーゼが望ましい。ポリリン酸は、ＡＴＰのリン酸結合とエネルギー的に同等の無水リン酸結合を介した無機オルトリン酸残基のポリマーである（図１）［６］。ポリリン酸はＡＴＰと比較して非常に低価格で大量を商業的に入手可能である。
ポリリン酸依存型のものは（表１の区分２及び３）、ＭｕｒａｔａＫらにより既に報告されているが（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９７９２１：８８７−８９５やＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８０４４：６１−６８）［４］、報告のあったＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属では微生物菌体内での含量が少なく産業的に利用できるまでには至っていない。これは、おそらくＢ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ細胞中のポリリン酸ＮＡＤキナーゼの活性が低いことに因ると思われる。
一方、Ｋａｗａｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６、ｐ．５７−６３（２０００））［７］は、ミコバクテリア属の結核菌（ミコバクテリア・ターバキュロシス）Ｈ３７Ｒｖ由来の機能未知のオープンリーディングフレームＲｖ１６９５がポリリン酸依存型のＮＡＤ^＋キナーゼをコードすることを記載している。しかしながら、ＮＡＤＰ製造のための最適の反応条件の検討は十分に行われておらず、より効率が高く、かつ安価にＮＡＤＰを製造するための方法が希求されていた。
発明の開示
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の新規な製造方法を提供することを目的とする。本発明の製造方法は、ポリリン酸若しくはその塩及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）を基質とし、ミコバクテリア属由来のポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを用いてリン酸化反応を行う、ここにおいて、反応溶液は０．１ないし１５重量％のポリリン酸若しくはその塩、および５ないし１５０ｍＭの二価の金属イオンを含む、ことを特徴とする。
本発明の方法は一態様において、好ましくは、結核菌（ミコバクテリア・ターバキュロシス）由来のＮＡＤ^＋キナーゼを用いる。
本発明の方法は一態様において、好ましくは、反応溶液は２ないし１０重量％のポリリン酸又はその塩を含む。また、好ましくは、反応溶液は５０ないし１００ｍＭの二価の金属イオンを含む。
発明の詳細な説明
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究に努めた結果、効率よく安価にＮＡＤＰを製造する方法を見出し、本発明を想到した。
よって、本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の新規な製造方法を提供する。本発明の方法はポリリン酸若しくはその塩及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）を基質とし、ミコバクテリア属由来のポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを用いてリン酸化反応を行う、ここにおいて、反応溶液は０．１ないし１５重量％のポリリン酸若しくはその塩、および５ないし１５０ｍＭの二価の金属イオンを含む、ことを特徴とする。
ＮＡＤは、酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで，還元型はＮＡＤＨである。ジホスホピリジンヌクレオチド（ＤＰＮ、ＤＰＮＨ）、補発酵素、補酵素Ｉ（ＣｏＩ）などとも呼称され、体内に最も多量に存在する補酵素である。ＮＡＤの構造は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）とアデニル酸がホスホジエススル結合している。酸化型ＮＡＤにおけるピリジン環の窒素原子はピリジウムイオンとして存在するので、これをＮＡＤ^＋と表現する。ＮＡＤ^＋の生合成は動物ではおもに肝臓でトリプトファンが、植物ではグリセロールとアスパラギン酸がそれぞれ前駆体となり、キノリン酸を経て合成される。また、ビタミンのニコチン酸、ニコチンアミドからも合成される。ＮＡＤ^＋の重要な機能は生体エネルギー産生機構（酸化反応）にＮＡＤ^＋の還元が共役している点にある。
ＮＡＤＰは、赤血球のグルコース−６−リン酸代謝の研究からグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに作用する補酵素として発見された。ＮＡＤＰの構造は、基本的にはＮＡＤと共通であり、ＮＡＤのアデニル酸のリボースの２’位にさらにリン酸がエステル結合している。ＮＡＤＰは、生体内では肝臓に多く存在するが、その含量はＮＡＤの約半量である。ＮＡＤＰの酸化型と還元型の変換様式はＮＡＤと同一であり、酸化型ＮＡＤＰはピリジニウムイオンによるプラス（＋）の電荷を有する（ＮＡＤＰ^＋）。ＮＡＤＰとＮＡＤの構造と反応様式は類似しているが、酵素はこれらを厳格に識別する。ＮＡＤＰの関与する反応としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素反応はＮＡＤＰの分光学的定量と同時に、種々の共役酵素反応の指示反応としても広く利用されている。この際、還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の吸光度Ａ_３４０の差を用いる測定法が一般的である。ＮＡＤＰ^＋をアルカリ処理して蛍光物質に変化させるとさらに高感度に測定できる。
脂肪酸やステロイドなどの生体成分の合成反応には数次の還元過程を伴うが、これらの反応の水素供与体のほとんどはＮＡＤＰＨである。逆に酸化過程は、分解系−エネルギー産生系（解糖、クエン酸回路、脂肪酸のβ酸化）に認められるが、これらにＮＡＤＰ^＋は関与せず、ＮＡＤ^＋とフラビンタンパク質（ＦＰ）が当たる。細胞内におけるＮＡＤＰとＮＡＤの酸化還元の存在状態の相反と機能分担は明らかである。
ＮＡＤ ^＋キナーゼ
ＮＡＤ^＋キナーゼは、基質のリン酸基をＮＡＤ^＋のアデニル酸のリボースの２’位に転移し、ＮＡＤＰ^＋を生成する酵素である。従来、リン酸を供給する基質としてはＡＴＰが一般的に使用されてきた。本発明の方法で使用するＮＡＤ^＋キナーゼは、ポリリン酸、又はポリリン酸とＡＴＰの双方をリン酸供給基質として利用する、ポリリン酸依存性ＮＡＤ^＋キナーゼであることを特徴とする。即ち、本発明の製造方法としてはリン酸供与体として従来からのＡＴＰを使用しない。そのため、従来ＡＴＰの使用により、ＮＡＤ^＋キナーゼによるリン酸転移反応時に副産物として生じていたＡＤＰやＡＭＰが、反応混合液中に存在しない。よって、ＮＡＤ^＋キナーゼ反応混合液として高純度のＮＡＤＰ^＋を得ることが可能となった。
ポリリン酸は図１に示したように、ＡＴＰのリン酸結合とエネルギー的に同等の無水リン酸結合を介した無機オルトリン酸残基のポリマーである（図１）［６］。図１においてｎは縮合度を表す。ｎは特に限定されないが、好ましくはｎ＝３ないしｎ＝３２である。ポリリン酸縮合度に対する本発明の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来及び対照のＭｙｃｒｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｕｓ由来のＮＡＤ＋キナーゼの相対的反応性は、Ｋａｗａｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６、ｐ。５７−６３（２０００））［７］に詳細な記述が記載されている。ポリリン酸はＡＴＰと比較して非常に低価格で大量を商業的に入手可能である。限定されるわけではないが、本発明において使用される好ましいポリリン酸は、メタリン酸、ヘキサメタリン酸およびそれらの塩である。好ましくはメタリン酸およびその塩である。ポリリン酸は、例えば、和光純薬工業、シグマアルドリッチ、メルク社などより入手可能である。
メタリン酸は、氷状リン酸とも呼ばれ、一般式（ＨＰＯ_３）_ｎで表される。普通、三量体、四量体の環状または直鎖のポリメタリン酸などの重合体として存在する。本明細書において「メタリン酸」とは、このような三量体、四量体の環状または直鎖のポリメタリン酸も含む。ポリメタリン酸はリン酸基が酸無水結合によって環状に連なった化合物であり、一般式Ｈ_ｎＰ_ｎＯ_３ｎで表される。室温で粘稠な液体で、冷却するとガラス状固溶体となる。水溶液は酸性で加熱すると容易に正リン酸に分解する。メタホスファターゼにより加水分解を受けて開環し、ポリリン酸となる。生物界では、高分子量のものは細菌・真菌・藻類などにみられ、酵母やある種の細菌ではトリメタリン酸のような縮合度の低いメタリン酸も存在する。そのリン酸無水結合は、いわゆる高エネルギーリン酸結合である。ポリリン酸キナーゼによる反応は可逆的で、高エネルギーリン酸結合及びリン酸の貯蔵に用いられていると考えられる。
ミコバクテリア属由来のポリリン酸依存性のＮＡＤ ^＋キナーゼ
本発明のＮＡＤ^＋キナーゼは、ミコバクテリア属由来である。例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ、Ｍ．ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ、Ｍ．ｆｏｒｌｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｖａｃｃａｅなどが含まれる。ミコバクテリウム属菌種についての詳細な説明は、例えば財団法人発酵研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｆｏ．ｏｒ．ｊｐ）、又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）に記載されている。
本発明のＮＡＤ^＋キナーゼは、ポリリン酸、又はポリリン酸とＡＴＰの双方をリン酸供給基質として利用する。好ましくは、ポリリン酸に対する反応率がＡＴＰに対する反応率の６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは１００％以上、最も好ましくは１２０％以上である。
本発明におけるＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。また、後述するように、精製されたタンパク質を固定化した状態、あるいは、当該タンパク質を発現する細胞自体を固体化した状態で、本発明の方法に使用しうる。
本発明のミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼは、好ましくは結核菌（ミコバクテリア・ターバキュロシス）由来のＮＡＤ^＋キナーゼである。本発明におけるＮＡＤ^＋キナーゼは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する（アミノ酸残基Ｎｏ．１−Ｎｏ．３０７）からなるタンパク質である。配列番号１は、Ｋａｗａｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６、ｐ。５７−６３（２０００））［７］に記載されている、ミコバクテリア属の結核菌（ミコバクテリア・ターバキュロシス）Ｈ３７Ｒｖ由来の機能未知のオープンリーディングフレームＲｖ１６９５の塩基配列から推定されるアミノ酸配列である。ゲノム断片Ｒｖ１６９５はまた、ＴｈｅＳａｎｇｅｒＣｅｎｔｅｒに寄託されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｃｏｓｍｉｄｓ．ｓｔｍｌを参照）。以降、本明細書において、ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼ、あるいは結核菌由来のＮＡＤ^＋キナーゼを、「Ｐｐｎｋ」（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＮＡＤｋｉｎａｓｅ）と呼称することがある。
その他、ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼとして、現在、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ由来の配列が知られている。具体的には、結核菌由来のＰｐｎｋタンパク質（Ｒｖ１６９５：ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ）のアミノ酸一次配列を基に、Ｂｌａｓｔ検索を行い、既知遺伝子配列との相同性を確認した。結果を以下に示す。

天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異の存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、典型的には遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。しかしながら、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の一部を欠いていても、ポリリン酸、又はポリリン酸とＡＴＰの双方をリン酸供給基質として利用するという性質を有する限り、本発明の製造方法に用いることが可能である。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
よって、本発明のミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼは、配列番号１と少なくとも７０％より高い同一性を有し、かつポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼ活性を有するポリペプチドを含む。同一性は少なくとも７０％より高い、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５（１９９２））に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡＤａｔａＢａｎｋｏｆＪａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現されたポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での本発明のポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除去してもよい。一般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよい。
ＮＡＤ ^＋キナーゼタンパク質の調製方法
本発明のＰｐｎｋタンパク質は、例えば結核菌Ｈ３７Ｒｖ系より公知の方法に従って精製することができる。結核菌Ｈ３７Ｒｖを適当な緩衝液（ｐＨ６ないし８の範囲で緩衝能を有するようなリン酸緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、各種グッドバッファー等を選択できる）に溶解後、分子篩（ゲル濾過）クロマトグラフィー、ブルーアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーで順次分画し、純粋標品を得ることができる。その際に公知の方法を用いて測定したＮＡＤ^＋キナーゼ活性を指標とすることが可能である。
あるいは、例えば配列番号１のＰｐｎｋをコードする配列番号２の核酸残基Ｎｏ．１−Ｎｏ．９２１又はその一部を含むＤＮＡ配列を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を遺伝子工学的に大量に得ることもできる。
また、本明細書では、配列番号１及び２においてヒトのＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を開示しているが、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応などの遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードするタンパク質も本発明の方法に利用可能である。
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれうる。
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７（１９８４））に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
本発明において遺伝子を組み込んでタンパク質を発現させるための組換えベクターは既知の方法を用いて作製することができる。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＴＢ１、ＬＥ３９２またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。好ましくは、ＪＭ１０９（例えば、宝酒造）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：ｐ．５５７−５８０（１９８３））、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＴＲＰ（特開平８−１０３２７８）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。好ましくは、ｐＥＴ３ａ又はｐＴＲＰである。発現用ベクターの構築に当たっては、速やかなｍＲＮＡへの転写が行えるように、２シストロン系の工夫を行うことも可能である。２シストロン系の詳細な説明は、例えば、ＢｒｉｇｉｔｔｅＥ．ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：ｐ．９４−１０３、１９９０［２１］に記述がある。ｐＴＲＰベクターに２シストロン系を組み合わせたｐＴＲＰ−２ｃｉｓベクターを用いることもできる。
本発明の好ましい態様として、ｐｐｎｋ遺伝子を含む発現ベクターｐＥＴ３ａ−ＮＡＤＫで宿主細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した、形質転換体ｐＥＴ３ａ−ＮＡＤＫ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、平成１３年６月２０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭＰ−１８３８３として寄託した。同様に、ｐｐｎｋ遺伝子を含む発現ベクターｐＴＲＰ−２ｃｉｓ−ＮＡＤＫで宿主細胞ＪＭ１０９を形質転換した、形質転換体ｐＴＲＰ−２ｃｉｓ−ＮＡＤＫ／ＪＭ１０９を、平成１３年６月２０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭＰ−１８３８４として寄託した。
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベククーが有用である。発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが知られており、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
哺乳動物発現用のベクターの例としては、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３：２８０、１９８３）が開示されているように構築されたベクターである。Ｃ１２７マウス乳腺上皮細胞における、哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を実質上Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）が記載したように構築してもよい。あるいは、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏにおいて神経細胞中で発現させるためのベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、あるいはｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１８：ｐ．５３２２、１９９０）を改変したベクター（ｐＥＦ−ＣＩＴＥ−ｎｅｏ，Ｍｉｙａｔａ，Ｓｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１６：ｐ．６１３−６２２，１９９８）を使用することができる。
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のＰｐｎｋタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のＰｐｎｋタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望のＰｐｎｋタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
前記発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
本発明のＰｐｎｋタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｃｌｌｕｌｏｆｉｎｅ、ＭｏｎｏＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅなど）などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
例えば、本発明のＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０ｍＭないし１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０ないし８．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法（例えば超音波処理）で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、タンパク質の精製、単離に供することができる。精製・単離の方法としては、以下の方法を挙げることができる。即ち、当該タンパク質に６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパク質といったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば抗体アフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
ＮＡＤＰ製造の反応条件の検討
本発明によるＮＡＤＰの製造方法は、ポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを使用し、ポリリン酸およびＮＡＤ^＋を基質とする反応である。

温度、ｐＨ、ポリリン酸の種類、反応溶液中のポリリン酸の濃度、金属イオンの濃度、金属イオンの種類等の種々の条件上記反応の効率に影響を与える。本発明者は種々の条件を検討した結果、反応溶液中のポリリン酸及び金属イオンの濃度が反応効率に特に影響を与えることを見出した。
反応溶液中のポリリン酸又はその塩の濃度は、反応溶液の０．１ないし１５重量％である。好ましくは、２ないし１０重量％である。より好ましくは、５ないし１０重量％、最も好ましくは約１０重量％である。ポリリン酸の種類は特に限定されない。例えば、先に記載したメタリン酸、ヘキサメタリン酸等から適宜選択可能である。
ポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼの上記反応では、金属イオン、特に二価の金属イオンの存在を必要とする。反応溶液中の二価の金属イオンの濃度は５ないし１５０ｍＭ、好ましくは５０ないし１５０ｍＭ、より好ましくは５０ないし１００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭである。二価の金属イオンは特に限定されないが、好ましくはマグネシウムイオン又はマンガンイオンから選択される。特に好ましくはマグネシウムイオンである。金属イオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩又は硝酸塩のいずれか金属塩として反応溶液に含まれる。
さらに、ＮＡＤ＋キナーゼ反応終了後ＮＡＤＰ^＋を高い収率で得るためには、ＮＡＤ^＋からのリン酸転移効率が高いこととともに、いったん合成されたＮＡＤＰ^＋を安定に保つことが重要である。ＮＡＤＰ^＋は、ＮＡＤ＋よりも熱やｐＨに対して不安定であることが知られている（例えば、オリエンタル酵母２０００年カタログ）。そのために、ＮＡＤ^＋キナーゼ反応条件をＮＡＤＰ＋が安定な組成でおこなう必要が生じる。
限定されるわけではないが、反応条件として、温度は好ましくは２０−３７℃、より好ましくは３７℃行う。ｐＨは好ましくはｐＨ５−８、より好ましくはｐＨ６−７で行う。本発明の方法では、ＮＡＤＰ^＋がより安定なｐＨ領域（ｐＨ３−７の範囲）に至適な作用ｐＨを有するミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼを用いる。
ＮＡＤ ^＋キナーゼの形態
本発明の方法に使用するＮＡＤ^＋キナーゼの形態としては、天然源若しくは組換え宿主細胞より精製した可溶化タンパク質でよく、又は可溶化タンパク質を固定化した固定化酵素でもよい。あるいは、ＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を発現する菌体を直接、アクリルアミドなどの化学処理により固定化したような固定化菌体酵素を用いてもよい。
天然源又は組換え宿主細胞よりＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を精製する手法については、先に「ＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質の調製方法」の項で詳述した。得られた精製タンパク質を可溶化タンパク質として使用可能である。また、精製タンパク質を固定化して固定化酵素として使用してもよい。酵素の固定化方法は既知の方法を用いて行うことが可能である。例えば、精製したＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を活性化ゲル（例えば、ホルミル−セロファインゲル（チッソ製）など）と失活しない温和な条件下で混和し、懸濁し、精製ＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を不溶化ゲルに固定化することができる。精製タンパク質の固定化に関する詳細な操作手順の説明は、例えば、ホルミル−セロファインゲルを用いる場合は、生化学工業社のカタログに記載されている。その他、数多くの活性化ゲルの記載があり、例えばファルマシアバイオテク社のメーカーマニュアルを参照してもよい。
あるいは、より効果的にはＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を発現する微生物菌体を固定化し、又は菌体の細胞亜分画を用い、微生物菌体内に存在する解糖系などの代謝経路を利用した方法を採用してもよい。代表的な例は、ＭｕｒａｙａｍａＡｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１６５：６４４−６５０［１４］、やＦｕｊｉｏＴｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７６１：９５６−９５９［１５］に記述されている。
微生物菌体を固定化する方法としては、カラギン酸やアクリルアミドを用いる方法が知られている。微生物菌体の固定化方法については、例えば、上述のＭｕｒａｔａＫｅｔａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９７９２１：８８７−８９５［４］に記述されている。さらに、微生物菌体を固定化後、アセトンなどの有機溶媒処理にて菌体膜を破壊し細胞内の可溶性酵素を働きやすくするといった種々の改良がなされている。
限定されるわけではないが、後述する実施例４ではＰｐｎｋタンパク質を過剰発現する宿主細胞をポリアクリルアミドゲル格子中に固定化し、さらに、基質［ＮＡＤ及びポリリン酸（ｐｏｌｙ（Ｐ）_ｎ）］及び／又は産物［ＮＡＤ及びポリリン酸（ｐｏｌｙ（Ｐ）_ｎ−１）］の透過性を増加させるためにアセトンで処理した。
具体的には、先ず、回収した宿主細胞を冷却した食塩水で洗浄し、［１０］に記載の方法に若干の変更を加えた方法によって固定化した。先ず、宿主細胞を０．７５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中に懸濁し、アクリルアミド溶液と完全に混合し、次いで、氷水下０℃ないし４℃で、１０分ないし１時間放置する。アクリルアミド溶液は、例えば、１０％ないし５０％のアクリルアミド、０．２％ないし１％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、０．１％ないし０．５％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、及び０．１％ないし０．５％の過硫酸アンモニウムカリウムからなる。得られたゲルをキューブ状（例えば、３．０ｍｍ×３．００ｍｍ×３．０ｍｍ）に切断する。
上記ゲルをさらに以下のようにアセトン処理してもよい。具体的にはキューブ状のゲルをアセトンに懸濁し、穏やかに撹拌しながら０℃で２分間ないし２０分間インキュベートする。ゲルを冷却した５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で十分に洗浄し、そして、同様の緩衝液に例えば、０．０１ｍＭないし１ｍＭのＮＡＤ^＋及び０．０１ｍＭないし１０ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加したものに、使用するまで約４℃で放置する。
実施例４では、５．０ｇ（湿重量）のＳＫ２７細胞又はＳＫ４５細胞が１５ｍｌのポリアクリルアミドゲル中に、即ち、約０．３３ｇ（湿重量）細胞／１ｍｌゲルの割合で固定化された。
精製Ｐｐｎｋタンパク質の使用によるＮＡＤＰ産生はいくつかの欠点を有している。例えば、（ｉ）Ｐｐｎｋタンパク質の精製には長く、複雑な操作を必要とする、（ｉｉ）Ｐｐｎｋの安定性はあまり高くない、そして（ｉｉｉ）酵素を不溶化させない限り、酵素の再利用が不可能である、等である。この点、細胞自体を固定化したものを使用するすると、酵素の精製が不溶であり、また、より高いイオン強度の基質溶液に適用が可能なため、簡便である。さらに。固定化菌体を利用した場合では、反応終了後に濾過などで反応混合液と容易に分離できるため、再利用が可能となる。
しかしながら、固定化菌体を使用する場合、菌体内あたりのＮＡＤ^＋キナーゼ存在量が十分でない、固定化菌体を調製する際の化学処理により部分失活などが起こりやすいなどの欠点を有する。このため、長時間（たとえば２〜７日間）の酵素反応を持続したとしても、ＮＡＤＰ＋の生成収量が低い。また、長時間の反応により分解産物が生じる、反応終了後の混合液に着色が生じる、等の問題点を抱えている。精製したＮＡＤ^＋キナーゼタンパク質を使用する場合、このような欠点はない。
本発明は、精製タンパク質、固定化酵素、固定化細胞のいずれを使用してもよいが、適切な反応条件を採用することにより、商業スケールでのＮＡＤＰの産生を可能にした。
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１９．Ｓ．Ｔ．Ｃｏｌｅ，ｅｔａｌ．，：ＤｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｆｒｏｍｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ３９３，ｐ．５３７−５４４（１９９８）
２０．酵素ハンドブック１９８３朝倉書店ｐ．３３９ページ
２１．ＢｒｉｇｉｔｔｅＥ．ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：ｐ．９４−１０３（１９９０）
２２．ＳｕｚｕｋｉＹ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，ｐ．８３９−８４３（１９８７）
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書の実施例において、特に記載しない限り以下の方法を使用した。
（１）Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性−ＮＡＤキナーゼ活性のアッセイ
Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性−ＮＡＤキナーゼ活性のアッセイは、５．０ｍＭＮＡＤ、５．０ｍＭＭｇＣｌ_２、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．０ｍｇ／ｍｌのポリリン酸及びＰｐｎｋタンパク質からなる反応混合物（１．０ｍｌ）中で、既知の方法［５］、［７］に従って行われた。ポリリン酸はメタリン酸（和光純薬、大阪、二本）を使用した。Ｐｐｎｋ活性の１単位は、３７℃、１時間で１．０μｍｏｌのＮＡＤＰを産生する活性と定義した。比活性は、「単位／ｍｇタンパク質」で表した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄら［９］の方法に従って、ウシ血清アルブミンを標準として決定した。
（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイ
ＮＡＤＰ−産生反応は、３７℃で反応混合液（４．０ｍｌ）中、振盪させながら行った。反応混合液は、５０ｍＭＮＡＤ、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍｇ／ｍｌポリリン酸（メタリン酸）、並びに、精製したＰｐｎｋ（１４．４単位、即ち０．１６ｍｇのタンパク質）又は種々の細胞調製物［細胞（０．０３ｇ）若しくは固定化細胞（０．１０ｇ）、又はこれらのホモジェネート］の一つからなる。１時間の反応後、反応混合物のうち１０μｌを取り出し、その中のＮＡＤＰをイソクエン酸デヒドロゲナーゼを用いて酵素的に測定した（日本Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｌｉｃｈ、東京、日本）［７］。活性は、μｍｏｌ／１ｇ細胞／時間で表した。
（３）ホモジェネートの調製
無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞およびアセトン処理済細胞のホモジェネートは、細胞を０℃で１０分間、５．０ｍｌの５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中、Ｓｏｎｉｆｅｒ（Ｂｒａｎｓｏｎ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）で破壊することによって調製した。固定化細胞、及びアセトン処理済固定化細胞のホモジェネートは、３．０ｍｌのゲルを、０℃で２０分間、５．０ｍｌの５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中、乳棒ですりつぶすことによって行った。
実施例１組換えＰｐｎｋタンパク質の発現
（１）発現ベクターの構築
Ｋａｗａｉら［７］に記載の方法に従い、結核菌Ｈ３７Ｒｖ染色体ＤＮＡより機能未知のオープンリーディングフレームＲｖ１６９５を以下のようにＰＣＲで増幅した。具体的には、先ず、結核菌Ｈ３７Ｒｖ染色体ＤＮＡを、ＳｕｚｕｋｉＹ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，ｐ．８３９−８４３（１９８７）［２２］に記載の方法に従い、培養菌体より調製した。Ｈ３７Ｒｖの染色体ＤＮＡのゲノム配列については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｃｏｓｍｉｄｓ．ｓｔｍｌを参照できる。次いで、以下のＮｄｅＩ切断部位を有するＮｄｅＩプライマーとＢａｍＨＩ切断部位を有するＢａｍＨＩアンチセンスプライマーを用いてＲｖ１６９５を特異的に増幅するとともに、増幅したＲｖ１６９５をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを利用してプラスミドに挿入できるようにした。
ＮｄｅＩプライマー

ＢａｍＨＩアンチセンスプライマー

ＰＣＲ反応液組成は（１００μＬ）あたり、２．５ＵＫＯＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）、０．２５μｇ結核菌Ｈ３７Ｒｖ染色体ＤＮＡ、４０ｐｍｏｌＮｄｅＩプライマー、４０ｐｍｏｌＢａｍＨＩアンチセンスプライマー、２０ｎｍｏｌｄＮＴＰｓ、１００ｎｍｏｌＭｇＣｌ_２を含む１ｘＫＯＤバッファー（東洋紡）とした。ＰＣＲ反応は、９８℃ １５秒間（変性）、６７℃ ２秒間（アニーリング）、７４℃ ３０秒間（伸長）を２５サイクル繰り返し、目的とする０．９３ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、結核菌Ｈ３７ＲｖのＲｖ１９６５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｃｏｓｍｉｄｓ．ｓｔｍｌを参照）［１９］と一致することを確認した。次いで、得られたＰｐｎｋをコードするｐｐｎｋ遺伝子のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＴ７プロモーター支配下に、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを利用して挿入し、発現プラスミドベクターを構築した。
（２）組換えタンパク質の発現
上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、組換え結核菌Ｐｐｎｋタンパク質の発現を行った。宿主細胞としては、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた［７］。Ｐｐｎｋ遺伝子を含む発現ベクターｐＥＴ３ａ−ＮＡＤＫで大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖｇａｎ）を既知の方法に従って形質転換し、組換え体ＳＫ２７を得た。形質転換体ＳＫ２７、即ち、ｐＥＴ３ａ−ＮＡＤＫ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、平成１３年６月２０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭＰ−１８３８３として寄託した。一方、対照として、Ｐｐｎｋ遺伝子を含まない空のベクターｐＥＴ３ａで、ＢＬ２１を同様に形質転換し、ＳＫ４５を得た。
また、同様に、ｐＴＲＰ−２ｃｉｓプラスミドに、特開平０８−１０３２７８及び特開平１０−１９１９８４に記載の操作手順に従い、ＰＣＲ増幅したＲｖ１６９５遺伝子を挿入後、大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造）を形質転換し、組換え体ｐＴＲＰ−２ｃｉｓ−ＮＡＤＫ／ＪＭ１０９を得た。当該形質転換体を平成１３年６月２０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１８３８４として寄託した。
ＳＫ２７（及びＳＫ４５）の菌体培養は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地［８］にてＯＤ６００＝０．７付近になるまで３７℃で振盪培養し、０．４ｍＭイソプロピル−β−Ｄガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加後１８℃に冷却した。その後、振盪培養を３日間継続し組換えＰｐｎｋタンパク質の発現をおこなった［７］。一方、ｐＴＲＰ−２ｃ−Ｒｖ１６９５／ＪＭ１０９の場合は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩振盪培養し、組換えＰｐｎｋタンパク質を発現させた。
実施例２Ｐｐｎｋタンパク質のＮＡＤ ^＋キナーゼ活性
実施例１の大腸菌形質転換体の菌体を破砕後、ポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼ活性を菌体破砕後の抽出液中に可溶性分画として回収した。「材料と方法」（１）Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性−ＮＡＤキナーゼ活性のアッセイに従って、活性を調べたところ、培養液１Ｌあたりおよそ６，０００単位、即ち、３１単位／ｍｇ細胞抽出物の活性発現量であった。これは、従来ＮＡＤ及びポリリン酸（メタリン酸）［４］からＮＡＤＰを産生するのに使用されてきたＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのＮＡＤキナーゼ（０．０７５単位／ｍｇ）より約４００倍高い値である［４］。なお、組換えＰｐｎｋタンパク質のＮＡＤ^＋キナーゼの活性は、活性測定の操作手順は、上述のＫａｗａｉＳら［７］の方法に従い、３７℃で６０分間加温あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰ^＋生成量を１単位とした。
実施例３組換えＰｐｎｋタンパク質の精製
組換えＰｐｎｋタンパク質の精製のために、先ず、実施例１の培養凍結菌体を融解し抽出バッファー（１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＮＡＤ^＋、１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび０．５ｍＭＥＤＴＡを含む）にて１０％（ｗ／ｖ）になるように再懸濁した。次いで、氷水中で５分間超音波破砕処理をおこなった。さらに、遠心分離後、抽出液上清を得た。
ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業）を充填したカラムを抽出バッファーにて平衡化した後に、抽出液をチャージし、よく洗浄を行った。その結果、ＮＡＤ＋キナーゼ活性は、０−０．５ＭＮａＣｌの濃度勾配からなるグラジエント溶出にて０．２ＭＮａＣｌ付近に単一な溶出ピークとして回収できた。この段階で、実質上フォスファターゼの混在が認めらない組換えＰｐｎｋタンパク質を得ることができた。「材料と方法」（１）Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性−ＮＡＤキナーゼ活性のアッセイに従って、活性を調べたところ、比活性はおよそ１５０単位／ｍｇタンパク質を示した。
得られた精製結核菌Ｐｐｎｋタンパク質の酵素的性質について調べ、従来より知られているミクロコッカス・フラバスのポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼの性質と比較した。結果を以下の表２に示す。

酵素的な性質の比較により、結核菌Ｈ３７Ｒｖ由来の組換えＰｐｎｋタンパク質がポリリン酸をリン酸供与体としＮＡＤ^＋からＮＡＤＰ^＋を合成するのに好適な変換酵素であることが示された。
実施例４ポリアクリルアミドゲル中への細胞の固定化
精製Ｐｐｎｋタンパク質の使用によるＮＡＤＰ産生はいくつかの欠点を有している：
（ｉ）Ｐｐｎｋの精製は長々と時間がかかり、そして複雑である。
（ｉｉ）Ｐｐｎｋの安定性はあまり高くない。
（ｉｉｉ）酵素の再利用は、（酵素を不溶化させない限り）不可能である。
Ｐｐｎｋタンパク質をイオン交換上に固定化し、そしてＮＡＤ及びメタリン酸からのＮＡＤＰの連続的な産生のために使用した。現在は、固定化された酵素（Ｐｐｎｋ）システムを商業スケールで実施することも可能である。しかしながら、酵素を固定化するよりも細胞自体を固定化したものを使用する方がより簡便であると考えられている。なぜなら、酵素の精製が不要であり、そして、よりイオン強度の基質溶液を適用することが可能だからである。そこで、Ｐｐｎｋタンパク質を過剰発現するＳＫ２７細胞をポリアクリルアミドゲル格子中に固定化し、基質［ＮＡＤ及びポリリン酸（ｐｏｌｙ（Ｐ）_ｎ）］及び／又は産物［ＮＡＤＰ及びポリリン酸（ｐｏｌｙ（Ｐ）_ｎ−１）］の透過性を増加させるためにアセトンで処理した。
具体的には、先ず、実施例１において培養されたＳＫ２７又はＳＫ４５細胞を回収し、冷却した０．８５％食塩水で２回洗浄した。細胞の固定化は［１０］に記載された方法に従ったが、若干の変更を加えた。
具体的には、５．０ｇ（湿重量）のＳＫ２７又はＳＫ４５細胞を、６．０ｍｌの０．７５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中に懸濁した。細胞懸濁液を４．５ｍｌのアクリルアミド溶液（３０％アクリルアミド、０．６％Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、０．２５％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、及び０．２５％過硫酸アンモニウムカリウム）と完全に混合し、次いで、０℃で３０分放置した。得られたゲル（１５ｍｌ）をキューブ状（３．０ｍｍ×３．００ｍｍ×３．０ｍｍ）に切断した。
これをさらに５０ｍｌのアセトンに懸濁し、穏やかに撹拌しながら０℃で５分間インキュベートした。ゲルを冷却した５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、０．１０ｍＭＮＡＤ及び０．１０ｍＭＭｇＣｌ_２を添加した５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で使用するまで保存した。
本方法では、５．０ｇ（湿重量）のＳＫ２７細胞又はＳＫ４５細胞が１５ｍｌのポリアクリルアミドゲル中に、即ち、約０．３３ｇ（湿重量）細胞／ｍｌゲルの割合で固定化された。
実施例５精製Ｐｐｎｋタンパク質のＮＡＤＰ産生
ＳＫ２７［７］の細胞抽出物から精製されたＰｐｎｋ（１５０単位／ｍｇ）を用いてＮＡＤＰを産生した。ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイは、精製されたＰｐｎｋの１４．４単位を使用し、５０（黒四角）、１００（黒丸）又は１５０（黒三角）ｍｇ／ｍｌメタリン酸の存在下で、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。その結果、５０ｍＭＮＡＤ及び１００ｍｇ／ｍｌのメタリン酸から３０ｍＭ（２７ｇ／ｌ）のＮＡＤＰが産生された（図２Ａ）。しかしながら、ＮＡＤからＮＡＤＰへの転移は、メタリン酸の濃度に関係なく、６０％未満に留まった（図２Ａ）。
転移率の低さは、産生されたＮＡＤＰによる、Ｐｐｎｋタンパク質のポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼ活性の阻害に起因すると考えられている。実際、Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼ活性は、ＮＡＤＰによって有意に阻害されるが、ＡＤＰによっては、阻害されない。阻害は、３０ｍＭのＮＡＤＰによってほぼ完全に生じる（図２Ｂ）。
実施例６種々の細胞調製物のＮＡＤＰ−産生活性
「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従い、種々の細胞調製物のＮＡＤＰ−産生活性を調べた。結果を、以下の表３に示す。

細胞ホモジェネートのＮＡＤＰ産生活性は、１，５３０μｍｏｌ／１ｇ細胞／時間であった。これを「ｐ」とする。一方、固定化細胞ホモジェネートのＮＡＤＰ産生活性は、９２５μｍｏｌ／１ｇ細胞／時間であった。これを「ｑ」とする。これは、無傷細胞中に当初存在するＮＡＤＰ−産生活性の約６０％［（ｑ／ｐ）×１００］がポリアクリルアミドゲル中に包括されたことを意味する。さらに、アセトン処理済固定化細胞のホモジェネートの活性（８４３μｍｏｌ／１ｇ細胞／時間）は、アセトン処理済固定化細胞の場合（６７２μｍｏｌ／１ｇ細胞／時間）よりも高かった。このことは、ポリアクリルアミドゲル格子は、基質及び又は産物の輸送の障害となることを示唆する。
なお、アセトン処理済固定化細胞は実施例４で得られたものを使用した。アセトン処理をしていない固定化細胞は実施例４においてアセトン処理をする前のものを使用した。さらに、ポリアクリルアミドで固定化しない細胞のアセトン処理は、アクリルアミド処理前の細胞をよく冷却した５．０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄集菌し、次いで実施例４記載の手順に従ってアセトン処理する、ことによって行った。
実施例７固定化細胞内のＰｐｎｋの機能
実施例４で得られたアセトン処理済固定化細胞中のＰｐｎｋの機能を調べ、固定化していないアセトン処理済細胞の場合と比較した。以下の特に記載する以外は、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。
（１）固定化効果
アセトン処理済固定化細胞中のＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生活性の５０％を失活するのに、６０℃で１０分間の熱処理を必要とした。一方、固定化していないアセトン処理済細胞の場合、Ｐｐｎｋ活性の５０％失活に５０℃の処理で十分であった（図３Ａ）。これは、ポリアクリルアミドゲル格子中への固定化によってＰｐｎｋの熱安定性が増強されることを示す。ＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生活性の最適温度は、固定化によって５０℃から５５℃に転移した（図３Ｂ）。
（２）ｐＨ効果
アセトン処理固定化細胞中のＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生の至適ｐＨは７．０であり、固定化していないアセトン処理細胞の至適ｐＨ６．５よりも若干高かった（図３Ｃ）。
（３）使用安定性
アセトン処理固定化細胞をＮＡＤＰ−産生反応のアッセイに繰り返し使用し、そのＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生活性の使用安定性を、同様に使用した固定化していないアセトン処理細胞のＰｐｎｋの場合と比較した（図３Ｄ）。固定化していない細胞のＰｐｎｋ活性は５回繰り返し使用した後に完全に失われた。一方、固定化された細胞の活性は開始時と同じ一定レベルに維持された。アセトン処理固定化細胞中のＰｐｎｋ活性の半減期は、７５日以上と起算された。
実施例８固定化細胞によるＮＡＤＰの産生
実施例４で得られた固定化細胞をアセトン処理し、アクリルアミド包埋菌体からＮＡＤ^＋キナーゼ活性を出現させたアセトン処理済固定化細胞によるＮＡＤＰ−産生のための条件を検討した（図４Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ）。以下の特に記載する以外は、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。
（１）メタリン酸濃度
アセトン処理固定化細胞中のＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生活性は、低濃度ではメタリン酸濃度の増加に伴って増加し、１００ｍｇ／ｍｌでプラトーに達し、そして、徐々に減少した（図４Ａ）。ＡＴＰの場合も同様の活性−基質濃度の関係が観察され、ＮＡＤＰ−産生活性は１５０ｍＭＡＴＰで最大に達した。［ＡＴＰ］：［Ｍｇ^２＋］＝３：２（図４Ｂ）。
（２）ＮＡＤ濃度
アセトン処理固定化細胞中のＰｐｎｋのＮＡＤＰ−産生活性は、ＮＡＤの量に応じて増加した（図４Ｃ）。但し、５０ｍＭより高い濃度のＮＡＤを使用した場合については測定していない。
（３）金属イオン濃度
Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼ活性に有効であると報告されている金属イオン（Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、及びＣａ^２＋）［７］において、Ｍｇ^２＋が最も有効であった。１００ｍｇ／ｍｌメタリン酸及び５０ｍＭＮＡＤの存在下において、１００ｍＭＭｇ^２＋によって最大活性が得られた（図４Ｄ）。Ｍｎ^２＋、及びＣａ^２＋は、５．０ｍＭを越える濃度で沈殿を形成する。
実施例９結核菌組換えＰｐｎｋタンパク質を用いたＮＡＤＰ ^＋合成反応の条件検討
実施例３で得られた結核菌組換えＰｐｎｋタンパク質、並びに、実施例４で得られた、アクリルアミド包埋菌体からＮＡＤ^＋キナーゼ活性を出現させたアセトン処理済固定化細胞の両者を用いて、ＮＡＤＰ^＋合成反応条件に関する諸条件の最適化をさらに、検討した。その結果、反応条件としては下表のｐＨ、ポリリン酸、金属イオン濃度が最適であることが示された。

実施例１０本発明の至適条件におけるＮＡＤ ^＋キナーゼ活性
実施例４のアセトン処理固定化細胞（１０単位）を至適反応混合物中［５０ｍＭＮＡＤ、１００ｍｇ／ｍｌメタリン酸（又は１５０ｍＭＡＴＰ（図５Ｂ））、１００ｍＭＭｇＣｌ_２、及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）］でインキュベートした。反応終了後、合成されたＮＡＤＰ^＋量をＮＡＤＰ^＋特異的なグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（酵母由来、オリエンタル酵母製）を用いた酵素法にて分析した。その結果、最大収量の１６ｍＭのＮＡＤＰ（１４ｇ／ｌ）が産生された（図５Ａ）。一方、固定化ＳＫ４５細胞は、同一の条件下でＮＡＤＰを全く、又は極わずかしか産生しなかった（図５Ａ、Ｂ）。
制限されるわけではないが、ＮＡＤからＮＡＤＰへの転換率の低さ（約３０％）は、アセトン処理固定化細胞によるＮＡＤ及びＮＡＤＰの分解は無視できることから、産生されたＮＡＤＰの阻害効果（図２Ｂ）によるか、及び／又は、ポリアクリルアミドゲル格子による産物若しくは基質の拡散の制限によるのではないか、と考えられる。反応系からのＮＡＤＰの除去は、転移効率の増加をもたらす。
固定化ＳＫ２７細胞によって産生されたＮＡＤＰの量（１６ｍＭ、１４ｇ／ｌ）（図５Ａ）は、固定化Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ細胞によって得られたＮＡＤＰの量（２．０ｍＭ、１．７ｇ／ｌ）［４］の約８倍であった。さらにこの値は、基質としてメタリン酸の代わりにＡＴＰ（１５０ｍＭ）（図５Ｂ）を使用した場合のＮＡＤＰ産生量とほぼ匹敵するものであった。
また、精製Ｐｐｎｋタンパク質についても同様に、至適条件でＮＡＤＰ産生活性を調べたところ、ＮＡＤＰ、ＡＴＰのいずれを使用した場合も、３０ｍＭ、２６ｇであった。各組換えＮＡＤ^＋キナーゼ反応終了後のＮＡＤＰ^＋生成量を下表にまとめた。

上記表５は、本発明の結核菌由来のＰｐｎｋ（精製、及び又は固定化組換え細胞中）は、従来のＡＴＰ−依存性ＮＡＤキナーゼ［４］と比較して非常に効率的にであることを示す。
実施例１１反応産物の分析
精製Ｐｐｎｋ及び固定化細胞を用いて、ＡＴＰ又はメタリン酸の存在下でＮＡＤＰ−産生反応を行い、反応の前後における成分の変化を調べた。
具体的には、ＮＡＤＰ産生反応は、精製Ｐｐｎｋタンパク質及び固定化細胞を使用して、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従って、但し、５０ｍｇ／ｍｌメタリン酸又は５０ｍＭＡＴＰの存在下で行った。２４時間反応終了後、５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて５０倍希釈し、希釈液（３０μｌ）をＴＳＫ−ＧＥＬ８０ＴＳカラム（直径０．４６ｃｍ×高さ１５ｃｍ）（東ソー、東京、日本）にアプライした。次いで、カラム吸着したヌクレオチド画分を０−１０％メタノールの勾配溶出にて分離した。流速は、０．７ｍｌ／分になるように調整した。ヌクレオチドの抽出された部分は２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。
その結果、ＡＴＰ及び精製Ｐｐｎｋタンパク質を用いた場合、反応後の混合物は反応生成物のＮＡＤＰ及びＡＤＰ、加えて、未反応のＡＴＰ及びＮＡＤを含んだ（図６Ｂ）。ＡＴＰ及び固定化細胞を用いた場合、反応後の混合物はＮＡＤＰ及びＡＤＰ、加えて、未反応のＡＴＰ及びＮＡＤ、さらにＡＤＰの分解産物のＡＭＰも含んだ（図６Ｃ）。薄層クロマトグラフィーではアデノシンの形成も観察された（データ示さず）。一方、ＡＴＰの代わりにメタリン酸を使用すると、精製Ｐｐｎｋ（図６Ｅ）、固定化細胞（図６Ｆ）のいずれの場合も、反応後の混合物はＮＡＤＰと未反応のＮＡＤのみを含んでいた。
実施例１２メタリン酸中のリン酸供給基質
メタリン酸は、種々の重合度を有する環状、及び／又は線状リン酸ポリマーの混合物である。Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性−ＮＡＤキナーゼ活性の本質的なリン酸供給基質を調べるために、メタリン酸中のリン酸ポリマーを以下のように、イオン交換カラムによって分離した。
メタリン酸（１０％、６０ｍｌ、ｐＨ７．０）を、ＳｅａｍｌｅｓｓＣｅｌｌｕｌｏｓｅＴｕｂｅ（除去サイズ：１２，０００−１４，０００Ｄａ）（ＶｉｓｋａｓｅＳａｌｅｓＣｏｒｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて、３，０００ｍｌの水に対して、２５℃で２４時間、透析した。透析された外側の溶液（２，９００ｍｌ）を、Ｄｏｗｅｘ１×２（Ｃｌ⁻、２００−４００メッシュ）カラム（３．０×６．０ｃｍ）（室町化学工業株式会社、東京、日本）に通した。次いで、吸着リン酸ポリマーをＬｉＣｌ（６００ｍｌ、０−１．０Ｍ、ｐＨ２．０）の直線勾配で、６分毎に各６．０ｍｌの画分に溶離した。各画分の一部（０．１０ｍｌ）を用いて、上述したように、Ｐｐｎｋのポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼ活性のアッセイを行った。図７は、Ｄｏｗｅｘ１×２カラム上のメタリン酸中のリン酸供給物質の溶離パターンを示す。黒丸はリン酸供給活性、白丸は酸不安定性リン酸、そして点線はＬｉＣｌの濃度を表す。１分間に産生されるＮＡＤＰの量をリン酸供給活性として定義した。各画分中の酸に不安定なリン酸は、溶離物を１ＮＨＣｌ中、７分間煮沸した後にメタリン酸から放出された無機オルトリン酸を決定することにより、見積もった［１２］。
図７に示されるように、メタリン酸を水に対して透析すると、０．２０ＭＬｉＣｌ（図８の画分番号２５−８０）より高濃度で溶離された全ての画分で、リン酸供給活性が検出され、約８４％のリン酸供給活性が外側の溶液から回収されることがわかった。これは、酵素の基質の大部分が約１２，０００−１４，０００Ｄａより小さい分子量を有するリン酸ポリマーであることを意味する。図７には４カ所のピーク（画分３２−４０、画分４４−５２、画分５６−６０、及び画分６４−７２）が観察されることから、メタリン酸が、ポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼの少なくとも４種類のリン酸供給基質を有していることが示唆されている。
発明の効果
現在までのところ、微生物酵素の産業上の利用は分解及び単純な形質転換反応の触媒に限られている。エネルギー（ＡＴＰ）供給を必要とする合成反応への酵素の広範囲の適用は、商業スケールでは行われていない。経済的に実行可能なＡＴＰ要求性の方法の開発を妨げる障壁の一つは、ＡＴＰの適切な（再）生成及び／又は再循環システムが無いことである。
よって、ＡＴＰの（再）生成システムの構築が酵素の経済的な利用のためだけでなく、方法の経済性及び反応の効率ために不可欠である。この目的のために、化学合成、細胞全体、細胞内小器官若しくは準細胞（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）システム、及び無細胞系システムを含むＡＴＰ（再）生成の種々の経路が検討されている［１３］。しかしながら、近年の技術の大幅な進歩にもかかわらず、ＡＴＰ再生成システムとしてのこれらの経路の技術的及び経済的実行可能性は、準細胞システム（解答系）の使用以外は、未知である［１４］［１５］。
本発明によって提供されたポリリン酸をリン酸供給物質として使用する産生システムは、以下の理由により有用な化合物の産生のために、ＡＴＰ依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを使用するシステムの代替となるものである。
１．本発明の方法で使用するポリリン酸は安価に購入可能である。よって、ポリリン酸−依存性ＮＡＤキナーゼ（図７）の基質として十分な量使用することが可能であり、本発明の産生システムは非常に経済的である。
２．本発明の産生システムは、反応後にＡＴＰ分解産物（ＡＤＰ、ＡＭＰ）を含まないので、産物（ＮＡＤＰ）の単離が容易である（図６）。
３．エネルギー源としてポリリン酸を使用する種々の酵素が、微生物中に存在する［６］。それらのうちいくつかは、有用な生化学物質の産生（例えば、固定化されたＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｂｕｔｙｒｉ細胞カラム［１１］によるグルコースとメタリン酸からのグルコース−６−リン酸の産生）のための生合成系に容易に適用可能である。よって、さらには、本発明のＮＡＤＰ^＋産生反応と例えばグルコース−６リン酸の産生反応及びＮＡＤＰ^＋依存性グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、酵母由来、オリエンタル酵母工業（株）製）を組み合わせると、次式のようにグルコース、ポリリン酸、ＮＡＤ＋から安価かつ容易にＮＡＤＰＨを合成することも可能になる。

４．当業者に周知の遺伝子工学及びタンパク質工学を使用して、既知のＡＴＰ依存性ＮＡＤ^＋キナーゼを、ポリリン酸依存性キナーゼに変換させることが可能である。最近の知見によれば、大腸菌中のＡＴＰ依存性ＮＡＤキナーゼは非常に低いレベルであるが、ポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼ活性も有することが示されている。また、大腸菌及び酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＴＰ依存性ＮＡＤキナーゼのヌクレオチド配列［１７］は、本発明の結核菌Ｈ３７Ｒｖ由来のポリリン酸／ＡＴＰ依存性ＮＡＤキナーゼの配列（配列番号１）と類似している。
生化学的エネルギー担体はポリリン酸に由来することを考えると［１８］、ヌクレオチド配列の類似性は、ＡＴＰ依存性ＮＡＤキナーゼがポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼから、おそらくは点突然変の蓄積によって進化してきたものであることを示唆する。実際、ランダムな突然変異法を用いてＡＴＰの代わりにポリリン酸を基質とするＮＡＤキナーゼの作製も成功しつつある。種々のミコバクテリア属由来、あるいはその他の属由来のＡＴＰ依存性ＮＡＤキナーゼを基に、突然変異によりポリリン酸依存性ＮＡＤキナーゼに変換させ、本発明に利用することが可能である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、無機ポリリン酸［ポリ（Ｐ）］の構造を示す。鎖の長さｎ＋２のポリリン酸を示している。
図２は、精製Ｐｐｎｋタンパク質のＮＡＤＰ産生活性を示す。特に記載しない限り、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。
（Ａ）は、精製ＰｐｎｋのＮＡＤＰ産生活性に対するメタリン酸濃度の影響を示す。５０（黒四角）、１００（黒丸）又は１５０（黒三角）ｍｇ／ｍｌメタリン酸の存在下で、ＮＡＤＰ産生活性をアッセイした。
（Ｂ）は、精製ＰｐｎｋのＮＡＤＰ産生活性に対するＮＡＤＰ及びＡＤＰ濃度の影響を示す。種々の量のＮＡＤＰ（黒丸）又はＡＤＰ（白丸）の存在下でＮＡＤＰ産生活性を調べた。
図３は、アセトン処理固定化細胞中でのＰｐｎｋの機能を示す。アセトン処理固定化細胞中でのＰｐｎｋの機能はＮＡＤＰ産生活性を測定し、固定化していないアセトン処理細胞の活性と比較した。特に記載しない限り、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。各細胞種におけるＰｐｎｋの最大ＮＡＤＰ産生活性を１００％とした。
（Ａ）熱安定性
アセトン処理固定化細胞（黒丸）又はアセトン処理細胞（白丸）を、０．５ｍｌの５．０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中で１０分間、種々の温度でインキュベートした。ＮＡＤＰ産生活性の残存率を測定した。
（Ｂ）至適温度
アセトン処理固定化細胞（黒丸）又はアセトン処理細胞（白丸）を、種々の温度でインキュベートし、ＮＡＤＰ産生活性の残存率を測定した。
（Ｃ）至適ｐＨ
アセトン処理固定化細胞（黒三角、黒丸）又はアセトン処理細胞（白三角、白丸）を、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（黒三角、白三角）又はトリス−ＨＣｌ（黒丸、白丸）中でインキュベートし、ＮＡＤＰ産生活性の残存率を測定した。
（Ｄ）使用安定性
アセトン処理固定化細胞（黒丸）又はアセトン処理細胞（白丸）をＮＡＤＰ産生活性のアッセイのために繰り返し使用した。各回１時間反応後に、細胞を５．０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、そして新たに調製された反応混合物中で反応のために再使用した。
図４は、アセトン処理固定化細胞中のＰｐｎｋの機能を示す。アセトン処理過程と細胞中のＰｐｎｋのＮＡＤＰ産生活性は、特に記載しない限り、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従って測定した。但し、（Ａ）メタリン酸（Ｂ）ＡＴＰ、（Ｃ）ＮＡＤ及び（Ｄ）Ｍｇ^２＋の量を変更した。（Ａ）において、４０ｍｇ／ｍｌメタリン酸よりも低い濃度で、沈殿物が形成された。（Ｂ）において、ポリリン酸の代わりにＡＴＰを使用した。Ｐｐｎｋの最大ＮＡＤＰ産生活性を１００％とした。
図５は、アセトン処理固定化ＳＫ２７細胞（実線）及びＳＫ４５細胞（点線）によるＮＡＤＰ産生を示す。特に記載しない限り、「材料と方法」（２）ＮＡＤＰ−産生活性のアッセイに記載の方法に従った。ＮＡＤＰ産生反応は、５０ｍＭＮＡＤ、１００ｍＭＭｇＣｌ_２、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、固定化細胞（０．１０ｇ）、及び１００ｍｇ／ｍｌメタリン酸（Ａ）若しくは１５０ｍＭＡＴＰ（Ｂ）から成る最適反応混合物（４．０ｍｌ）中で行った。示した時間において、反応混合物中の１０μｌを回収し、混合物中のＮＡＤＰの量を測定した。
図６は、反応産物の分析結果を示す。精製Ｐｐｎｋ（Ｂ及びＥ）並びに固定化細胞（Ｃ及びＦ）を用いて、ＡＴＰ（左側のカラム）又はメタリン酸（右側のカラム）の存在下でＮＡＤＰ−産生反応を行った。反応前（Ａ及びＤ）並びに反応後（Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦ）の成分の変化を測定した。
図７は、Ｄｏｗｅｘ１×２カラム上のメタリン酸中のリン酸供給物質の溶離パターンを示す。透析液（外液）中のリン酸ポリマーをＤｏｗｅｘ１×２カラム上を通し、吸着したリン酸ポリマーを０ないし１．０Ｍ（ｐＨ２．０）のＬｉＣｌ直線勾配で溶離させた。黒丸はリン酸供給活性、白丸は酸不安定性リン酸、そして点線はＬｉＣｌの濃度を表す。

Claims

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の製造方法であって、ポリリン酸若しくはその塩及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）を基質とし、ミコバクテリア属由来のポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼを用いてリン酸化反応を行う、ここにおいて、反応溶液は０．１ないし１５重量％のポリリン酸若しくはその塩、および５ないし１５０ｍＭの二価の金属イオンを含む、ことを含む前記方法。
ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼが、結核菌（ミコバクテリア・ターバキュロシス）由来のＮＡＤ^＋キナーゼである、請求項１に記載の方法。
ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼが、以下の
１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１ないし複数のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を伴うアミノ酸配列を有し、かつ、ポリリン酸依存性のＮＡＤ^＋キナーゼ活性を有するポリペプチド
から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
ミコバクテリア属由来のＮＡＤ^＋キナーゼが、可溶化された若しくは固定化された天然由来のタンパク質若しくは組換えタンパク質として、又は固定化細胞の状態で使用される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
反応溶液が２ないし１０重量％のポリリン酸又はその塩を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
ポリリン酸若しくはその塩が、メタリン酸、ヘキサメタリン酸、およびそれらの塩、ならびにそれらの混合物からなるグループから選択される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
反応溶液が５０ないし１００ｍＭの二価の金属イオンを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
二価の金属イオンがマグネシウムイオン又はマンガンイオンから選択される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
金属イオンが塩化物、硫酸塩又は硝酸塩のいずれか金属塩として反応溶液に含まれる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。