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JPWO2008105504A1 - 経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法 - Google Patents

経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法 Download PDF

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JPWO2008105504A1
JPWO2008105504A1 JP2009501301A JP2009501301A JPWO2008105504A1 JP WO2008105504 A1 JPWO2008105504 A1 JP WO2008105504A1 JP 2009501301 A JP2009501301 A JP 2009501301A JP 2009501301 A JP2009501301 A JP 2009501301A JP WO2008105504 A1 JPWO2008105504 A1 JP WO2008105504A1
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直貴 岡田
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卓也 藤田
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文男 神山
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英淑 権
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Abstract

本発明は、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法を提供する。無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする経皮免疫製剤、抗原を水又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする経皮免疫製剤の製造方法及び経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする経皮免疫方法。

Description

本発明は、免疫応答を調節するための、経皮的免疫に有用な経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法に関する。
経皮的免疫を成立させるには、抗原が皮膚(皮膚は通常抗原を通さない)を通過することと、抗原に対する免疫応答の両方が必要である。抗原は通常1,000ダルトンよりも大きい高分子物質であり、皮膚を通過することは極めて困難である。そのため、経皮免疫を行うためには、皮膚から角質層を剥離し、角質層を剥離した皮膚に抗原を含んだ製剤を貼付することが行われていた(例えば、特許文献1参照)。しかし、皮膚から角質層を剥離することは抗原投与の手間がかかるばかりでなく剥離部位からの細菌感染などの恐れがあるなどの欠点を有していた。
そのため、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付し、経皮的免疫が成立する経皮免疫製剤の研究が盛んに行われており、例えば、「1つ以上の抗原とアジュバント成分を含む経皮的免疫のための製剤であって、該成分の少なくとも1つは乾燥型であり、それにより無傷の皮膚への製剤の適用が、抗原に特異的な免疫応答を誘導する製剤及び経皮的免疫のための乾燥製剤の製造であって、(a)少なくとも1つの免疫活性成分を提供する工程(ここで製剤は、抗原活性を有する少なくとも1つの免疫活性成分を含有する);(b)免疫活性成分の少なくとも1つを溶解して、免疫活性液体を作成する工程;(c)包帯等の固体基質上の免疫活性液体を乾燥する工程;そして(d)免疫活性成分を一緒にして製剤を製造する工程を任意の順序で含み、ここで、少なくとも免疫すべき被験体の皮膚に製剤が適用されるまでは、免疫活性成分の少なくとも1つは乾燥型である、上記製造」(例えば、特許文献2参照)が提案されている。
アジュバントは、免疫系の抗原提示細胞(例えば、表皮のランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞、樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球)を活性化する及び/又は抗原提示細胞を誘導して、抗原を貧食させると記載されている。しかしながら、アジュバンドはそれ自身起炎性物質であり、皮膚に炎症を起こすのみならず免疫系のバランスを崩す作用もあり、人体への投与が好ましいものではない。又、上記製剤では抗原は包帯、ガーゼ等のマトリックスに分散付着されていたり、液体に溶解されているので、皮膚に接触する抗原濃度は薄く免疫活性が低かった。
特開平10−316585号公報 特表2003−523937号公報
本発明の目的は、上記欠点に鑑み、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法を提供することにある。
本発明の経皮免疫製剤は、無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮免疫製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする。本発明において“調節する”とは正の調節、即ち、免疫系を賦活、促進する調節導と、負の調節、即ち、免疫系を抑制する調節の両方を意味するものである。
我々の観察結果を説明するために述べると、経皮免疫製剤は抗原を免疫系の細胞まで運搬し、アジュバンドの助けを必要とせずに免疫応答が調節されると考えられる。抗原は、皮膚の正常な防御的外層(例えば、角質層)を通過し、直接又はTリンパ球に、処理した抗原を提示する抗原提示細胞(例えば、マクロファージ、樹状細胞、皮膚樹状細胞、Bリンパ球、またはクッパー細胞)を介して、免疫応答が調節する。場合により抗原は、毛嚢または皮膚の小器官(例えば、汗腺、脂腺)を介して角質層を通過してもよい。
上記抗原は、生物の免疫細胞に提示された時、特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、単一の免疫原性エピトープ又はB細胞受容体(即ち、B細胞の膜上の抗体)若しくはT細胞受容体により認識される複数の免疫原性エピトープを含んでよい。
上記抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、細胞(例えば、腫瘍細胞又は正常細胞)を感染することができる病原体由来の抗原が挙げられる。
上記細菌としては、例えば、炭疽菌、キャンピロバクター、コレラ、クロストリディウム(クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile))を含む)、ジフテリア、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、ジアルジア(giardia)、淋菌、ヘリコバクターピロリ又はヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ、インフルエンザ菌B、型別不能インフルエンザ菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム(結核に関与する生物を含む)、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌及びその腸毒素、A群ベータ溶血性連鎖球菌、連鎖球菌B、破傷風菌、コレラ菌(Vibro cholerae)、ボレリア・ブルグドルフィ(Borrelia burgdorfi)、エルシニア及びこれらの生成物等が挙げられる。
上記ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、デングウイルス血清型1〜4、エボラウイルス、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎血清型A〜E、単純ヘルペスウイルス1又は2、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ノーウォークウイルス、ウマ日本脳炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスB19、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、RSウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、セントルイス脳炎(St.Louis encephalitis)ウイルス、ワクシニアウイルス、成人T細胞性白血病ウイルス、他の抗原(例えば、マラリア抗原、水痘、黄熱等)をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター及びこれらの生成物等が挙げられる。
上記真菌としては、躯幹白癬、爪白癬、スポロトリクム症、アスペルギルス症、カンジダ症を引き起こす起こす真菌、及び他の病原性真菌等があげられ、上記寄生体としては、例えば、赤痢アメーバ、プラスモジウム(Plasmodium)、蠕虫、住血吸虫及びこれらの生成物等が挙げられる。
抗原としては、腫瘍関連抗原又は自己抗原等が挙げられる。例えば、自己抗原としては、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物(例えば、ピーナツと他のナッツ類)、Betv1等のアレルゲンが挙げられる。
化学的には、抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド又はこれらの化学的または組換え型結合体でもよい。抗原は、組換え手段、化学合成又は天然起源からの精製により得られる。タンパク質性抗原、または多糖との結合体が好適である。抗原は少なくとも部分的に精製された、無細胞型である。あるいは抗原は、生きたウイルス、弱毒化した生きたウイルス、または不活性化ウイルスの型で提供される。抗原は、適宜抗原をコードする核酸(例えば、DNA、RNA、cDNA、cRNA)でもよい。
上記人工合成核酸は、人工的に合成された核酸であり、例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸又はsiRNA(small interfering RNA)等が挙げられる。
上記抗原及び人工合成核酸の分子量が1,000ダルトン以下であると親水性高分子物質からなる基剤上に溶液状態で滴下した時内部に吸収されがちであり、抗原及び人工合成核酸が基剤の表面上に充分濃縮されないので抗原の分子量は、1,000ダルトンより大きいことが好ましい。
上記基剤は、水及び/又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質が好ましい。上記抗原及び人工合成核酸は水及び/又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁されるので、その水溶液若しくは懸濁液を水及び/又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなる基剤に滴下すると親水性高分子物質が水及び/又は含水アルコールを吸収するので基剤表面に濃縮された抗原若しくは人工合成核酸層が積層される。
上記親水性高分子物質としては、例えば、ポリアクリル酸アルコキシアルキル系高分子物質、でんぷん- アクリル酸グラフト系高分子物質、ポリアクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルアルコール系高分子物質、酢酸ビニル- アクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルピロリドン系高分子物質、イソブチレン- マレイン酸系高分子物質、N−ビニルアセトアミド系高分子物質等が挙げられる。
親水性高分子物質は架橋していると、水及び/又は含水アルコールの吸収によって膨潤しても高分子物質の強度の低下は全くないか、あっても少ないので架橋されているのが好ましい。架橋方法は、従来公知の任意の方法が採用されればよく、例えば、公知の多官能性イソシアネート、アルミニウムアセチルアセトネートなどの金属錯体を架橋剤として親水性高分子物質に添加すればよい。
又、上記ポリビニルアルコール系高分子物質の一種であるポリビニールアルコールハイドロゲルが好適に使用できる。ポリビニールアルコールハイドロゲルシートの製造は従来公知の方法が採用されればよく、例えば、5〜50重量%程度のポリビニールアルコール水溶液をポリエチレンテレフタレートフィルム等の基材フィルム上に流延してポリビニールアルコール水溶液層を形成し、−10〜−2℃程度で1日程度凍結した後常温に戻すことにより、架橋したポリビニールアルコールハイドロゲルシートが得られる。
又、基剤は、アクリル酸メトキシエチル40〜60重量%、(メタ)アクリル酸ラウリル30〜40重量%及び極性モノマー10〜25重量%よりなる共重合体100重量部と、乳酸オクチルドデシル2〜15重量部、グリセリン2〜10重量部及びヒアルロン酸0.01〜0.1重量部からなる、親水性高分子物質である基剤が好ましい。
上記極性モノマーとしては、N−ビニル−2−ピロリドン、(メタ)アクリル酸、アクリル酸2−ヒドロキシエチル等が挙げられる。共重合体中のアクリル酸メトキシエチルの含有量は多くなると、重合中にゲル化を起こし不溶性になりやすく、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。又、(メタ)アクリル酸ラウリルの含有量は少なくなると、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。更に、極性モノマーの含有量は少なくなると、得られた粘着剤の凝集力が低下する傾向があり、多くなると、皮膚に貼付するのに適当な粘着性が得られなくなる傾向があるので、アクリル酸メトキシエチル、(メタ)アクリル酸ラウリル及び極性モノマーの比率は上記範囲が好ましい。
乳酸オクチルドデシル、グリセリン及びヒアルロン酸は上記親水性高分子物質の親水性をさらに向上し水の吸収性を高めるとともに皮膚への接着性を良好にして皮膚貼付性を上げる効果を有するものであり、少量では効果が小さく多量になると親水性高分子物質が柔らかくなりすぎて実用性が低下するので上記範囲が好ましい。
本発明の経皮免疫製剤は基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸層が積層されており、基剤の厚さは特に限定されるものではいが、薄すぎると抗原若しくは人工合成核酸の水及び/又は含水アルコール水溶液若しくは懸濁液の水及び/又は含水アルコールを充分に吸収できなくなり、厚すぎると柔軟性が失われて皮膚への接触性が低下するので20〜5,000μmが好ましく、より好ましくは50〜2,000μmである。基材の形状は特に限定されるものではないが、パッチ状であるのが好ましい。又、基剤及び抗原若しくは人工合成核酸層の表面には、離型シートやポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ウレタンフィルム等の支持フィルムが積層されていてもよい。
上記基剤は、水及び/又は含水アルコールの吸収性を向上させるために親水性高分子物質と相溶する可塑剤を含有することが好ましい。該可塑剤は親水性の液体可塑剤が好ましく、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、乳酸ドデシルオクチル、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等が挙げられる。
又、上記基剤は抗原若しくは人工合成核酸の経皮吸収を促進させるために、化学吸収促進剤を含有するのが好ましい。上記化学的吸収促進剤は、従来公知の任意の化学的吸収促進剤が使用可能であり、例えば、メンソール、カンフル、セチルアルコール等のアルコール類;パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル;モノラウリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン等のグリセリンエステル;ラウリン酸ジエタノールアミド等の酸アミド;ポリエチレングリコールジラウリルエーテル等の中性界面活性剤等が挙げられる。化学的経皮吸収促進剤の添加量は、少なすぎると経皮吸収効果が向上せず、多すぎると基剤の粘着性が低下するので、基剤100重量部に対して3〜40重量部が好ましい。
更に、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素を基剤中に含有させることにより、それらの酵素が皮膚角質層に作用し、抗原若しくは人工合成核酸の経皮透過を更に促進することができる。プロテアーゼとしては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンドプロテナーゼ、プロナーゼ等が挙げられる。リパーゼは動物すい臓から抽出精製して使用できるが、市販品を用いてもよい。
本発明の経皮免疫製剤はアジュバンドを含有する必要はないが、抗原若しくは人工合成核酸層又は基剤がアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原若しくは人工合成核酸に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答又はT細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。
上記アジュバントとしては、例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント、ケモカイン(例えば、デフェンシンズ(difensing)1又は2、RENTES、MIP1−α、MIP−2、インターロイキン−8又はサイトカイン(例えば、インターロイキン−1β、−2、−6、−10又は−12;インターフェロンガンマ;腫瘍壊死因子−α又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子))、ムラミルジペプチド誘導体(例えば、ムラブチド、トレオニル−MDP又はムラミルトリペプチド)、熱ショックタンパク質若しくはその誘導体、リーシュマニアメージャー(Leishmania major)LeIFの誘導体、コレラ毒素又はコレラ毒素B、細菌性ADP−リボシル化外毒素及びそのサブユニット、細菌性ADP−リボシル化外毒素若しくはそのサブユニットを使用する組み換え体、リポ多糖(LPS)誘導体(例えば、脂質A、モノホスホリル脂質A又は脂質A類似体)、スーパー抗原、トリプシン切断部位の突然変異体を含むADP−リボシル化に影響を与える突然変異細菌性ADP−リボシル化外毒素、QS21、キル(Quill)A、みょうばん等が挙げられる。
本発明の経皮免疫製剤の製造方法は、抗原若しくは人工合成核酸を水及び/又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水及び/又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原若しくは人工合成核酸が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする上記経皮免疫製剤の製造方法である。
本発明においては、先ず、抗原若しくは人工合成核酸を水又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させて水溶液若しくは懸濁液を作成する。水又は含水アルコールとしては、水、水を含有するメタノール、エタノール等のアルコールがあげられ、これらの緩衝液が好適に用いられる。緩衝液としては、例えば、Ca++/Mg++の無いリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、正常な食塩水(150mMNaCl水溶液)、トリス緩衝液等が挙げられる。
抗原若しくは人工合成核酸は、一般に水又は含水アルコール及びその緩衝液に溶解するが、溶解しない抗原若しくは人工合成核酸は、10mMの酢酸で可溶化し、次に中性の水、含水アルコール、緩衝液で所望の容量に希釈すればよい。又、酸性pHでのみ溶解する抗原若しくは人工合成核酸の場合は、希酢酸で可溶化した後、酸性pHで酢酸−PBSを希釈剤として希釈すればよい。抗原若しくは人工合成核酸がそれ自体不溶性である疎水性抗原若しくは人工合成核酸(例えば、A型肝炎ウイルス、膜を横切るドメインを含有するポリペプチド等)は界面活性剤で懸濁化してもよい。
次に、得られた水溶液若しくは懸濁液を、前記基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させる。上記基剤は水及び/又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなるので、水溶液若しくは懸濁液中の水及び/又は含水アルコールは容易に基剤(親水性高分子物質)に吸収され、基剤(親水性高分子物質)表面に抗原若しくは人工合成核酸が取り残され濃縮した抗原層が形成される。
本発明の経皮免疫方法は、上記経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする。上記経皮免疫製剤の構成は上述の通りであり、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付することにより、抗原若しくは人工合成核酸は容易に皮膚を通過するか又は皮膚内に入る。
皮膚を通過するか又は皮膚内に入った抗原若しくは人工合成核酸は、免疫応答を直接調節するか、又は表皮中の抗原提示細胞集団(例えば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、表皮の樹状細胞、B細胞、またはクッパー細胞)に捕捉され、リンパ球に提示される。場合により抗原若しくは人工合成核酸は、毛包又は皮膚小器官(例えば、汗腺、脂線)を介して角質層を通過する。
例えば、例として細菌性ADP−リボシル化外毒素(bARE)を用いる経皮的免疫は、抗原提示細胞(APC)の中で最も効率的であることが知られている表皮性ランゲルハンス細胞を標的とする。bAREは、無傷の皮膚の表皮下に適用すると、ランゲルハンス細胞を活性化する。ランゲルハンス細胞は、抗原の食作用及びリンパ節への移動により特異的免疫応答を指令し、ここでAPCとして作用して、抗原をリンパ球に提示し、強力な抗体応答を誘導する。
一方、人工合成核酸を用いる経皮的免疫においては、炎症因子の遺伝子が発現することを防ぎ過剰な免疫反応を抑える、即ち、負の調節を行うものである。人工合成核酸が角質を通過し表皮層に存在する免疫担当細胞の遺伝子発現を抑える。
ランゲルハンス細胞は、すべての哺乳動物の重層扁平上皮上に存在する骨髄由来の細胞である。これらは、非炎症性の表皮中に存在する付属細胞活性の全てを構成し、表皮に適用された抗原に対する免疫応答の開始と伝播に必須である。ランゲルハンス細胞は、表皮及び固体臓器並びにリンパ系組織中に広く分布しているがあまり現れていない強力付属細胞(「樹状細胞」)のファミリーのメンバーである。
ランゲルハンス細胞(及びおそらく他の樹状細胞)は、少なくとも2つの明確な段階を有する生活史を有すると認識されている。表皮に存在するランゲルハンス細胞は、抗原捕捉性の「歩哨」細胞の正規のネットワークを構成する。表皮ランゲルハンス細胞は、粒状物(微生物を含む)を取り込むことができ、複雑な抗原の効率的な処理物質である。しかしこれらは、低レベルのMHCクラスIとII抗原および同時刺激性分子(CD40、CD80、およびCD86)を発現するのみであり、プライムされていないT細胞の弱い刺激物質である。
抗原と接触後、一部のランゲルハンス細胞は活性化され、表皮を出て、局所的リンパ節のT細胞依存性領域に移動し、ここで成熟樹状細胞として局在化する。表皮を出てリンパ節に移動する過程で、抗原担持表皮ランゲルハンス細胞は、形態、表面表現型および機能の劇的な変化を示す。表皮ランゲルハンス細胞に比較して、リンパ系樹状細胞は基本的に非食作用性であり、タンパク質抗原の処理が非効率的であるが、高レベルのMHCクラスIとクラスII抗原および種々の同時刺激性分子を発現し、同定されている天然のT細胞の最も強力な刺激物質である。
表皮ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は、経皮的に送達されるワクチンに利用することができる。皮膚免疫系を使用する経皮的免疫応答は、例えば、受動的拡散と、次にランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、これらの抗原をT細胞に提示するためにリンパ節に運ばれ、次にその抗原(例えば、BSA)に特異的な免疫応答を誘導する。
上記経皮免疫製剤の無傷の皮膚への適用する前に、抗原若しくは人工合成核酸の経皮透過を促進するために無傷の皮膚を酵素処理するのが好ましい。酵素としては、前述のプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素が挙げられる。酵素処理方法は、特に限定されるものではなく、例えば、酵素を適当なpHに調整した精製水等に溶解させた酵素水溶液を皮膚部位に適用する方法が挙げられる。その際、酵素水溶液をろ紙やその他多孔質単体にしみ込ませて適用すると実用上便利である。又、異なる酵素処理方法として、酵素を軟膏基剤に溶解させた酵素軟膏を皮膚に適用する方法、水性ゲル中に酵素を溶解させた酵素入り水性ゲルを皮膚に貼付する方法が挙げられる。
(発明の効果)
本発明の経皮免疫製剤の構成は上述の通りであるから、アジュバントを含まなくても免疫活性が高い。又、本発明の経皮免疫製剤の製造方法により、濃縮された抗原若しくは人工合成核酸層を有する経皮免疫製剤を容易に製造方法することができ、本発明の経皮免疫方法により皮膚が炎症を起こしたりすることなく免疫系のバランスを予防・治療に有利なように変更することが出来る。
図1は実施例1、2及び比較例1、2で測定したOVA特異的抗体力価を示す棒グラフである。 図2は実施例7、8及び比較例4〜7で測定したルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
次に実施例を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
基剤の調製
(1)基剤1
攪拌機付きの500ml反応容器に、酢酸エチル200g、アクリル酸メトキシエチル43g、アクリル酸ラウリル36g、N−ビニル−2−ピロリドン6g、アクリル酸3g、アクリル酸2−ヒドロキシエチル10g及びアゾビスイソブチロニトリル0.005gを仕込み、反応容器内を窒素置換した後、75℃で15時間重合を行った。
得られた重合溶液(固形分換算)100g、グリセリン3g、乳酸オクチルドデシル10g及びヒアルロン酸ナトリウム0.02gを良く混合し得られた溶液をポリエチレンテレフタレートフィルム上に、乾燥後の厚さが200μmになるよう設定したナイフコーターを使用して塗膜をつくり、温度50℃で24時間溶媒を乾燥させて基剤シートを得た。得られたシートを直径1cmの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤1を得た。
(2)基剤2
ポリビニルアルコールの40%水溶液をポリエチレンテレフタレートフィルムに厚さ400μmに流延し、−60℃で24時間保存して凍結成型し、しかる後常温に戻すことによって架橋されたポリビニルアルコールハイドロゲルシートを得、得られたシートを直径1cmの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤2を得た。
(3)基剤3
ポリアクリル酸ナトリウム1.5g、グリセリン2.5g及び水12.0gを混合した後、0.1N水酸化ナトリウム水溶液と0.1N塩酸を適宜滴下してpHを6.0付近に調整してポリアクリル酸ナトリウム水溶液を得た。得られたポリアクリル酸ナトリウム水溶液を不織布上に乾燥後の厚さが厚さ400μmになるように塗布乾燥した後、直径1cmの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤3を得た。
(実施例1)
分子量45,000ダルトンの蛋白質であるニワトリ卵白アルブミン(シグマ社製、商品名「OvalbuminGradeV」、以下「OVA」という。)をモデル抗原として抗体誘導の実験を行った。OVA10mgをCa++/Mg++の無いリン酸緩衝化生理食塩水「以下、「PBS」という。)1mlに溶解した溶液10μlを基剤1に滴下し、基剤1にPBSを吸収させ基剤1表面に100μgのOVA層が積層されたOVAパッチを得た。
得られたOVAパッチをBALB/cマウス(H−2;7週齢、メス、SLC社から購入)の耳介皮膚の両面に貼付して第1回の免疫操作を行い、24時間に貼付されていたOVAパッチを剥離し、更に2週間後に新しいOVAパッチを同様に貼付して第2回の免疫操作を行った。第2回免疫操作から2週間後、マウスの眼窩よりヘマトクリット毛細管を用いて血液を回収した。
回収した血液の血清中のOVA特異的抗体力価を酵素免疫測定法により測定し、結果を図1に示した。抗体力価は酵素免疫測定法における測定値(吸光度)が0.1未満まで減少する最高の希釈倍率をタイター値(Titer)として、Log Titer値の逆数で示した。この値をOVA特異的抗体力価とする。
酵素免疫測定法は以下の通りであった。
OVAを固相化バッファーに100μg/mlの濃度に溶解し、エライザプレート(Nunc社製、商品名「96 well ELISA plate」)に50μl/wellずつ分注し、4 ℃で1夜放置してOVAを固相化した。固相化したプレートにブロックキング剤(大日本住友製薬社製、商品名「Block Ace」を2倍希釈した溶液)を200μl加え、37℃で2時間インキュベートしてブロッキングした。次に、回収したマウスの血液から血清を分離し、ブロッキング剤を用いて2倍系列で段階希釈した。これらの希釈血清をブロッキングしたプレートに50μl/wellずつ添加し37℃で2時間インキュベートした。
次に、緩衝液でプレートを3 回洗浄した後、ブロッキング剤で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(以下、「HRP」という。)標識羊抗マウスIgG(5000倍希釈)を50μl/wellずつ添加した。37℃で2時間インキュベートした後、緩衝液でプレートを3回洗浄し、HRP基質溶液を100μl/wellずつ添加した。更に、15分間インキュベートした後、2NのHSOを100μl/well加えて反応を停止させ、吸光波長450nmにおける吸光度を測定し、OVA特異的抗体力価を評価した。
(実施例2)
BALB/cマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで8回ストリッピングして角質層を除去した後、実施例1で行ったと同様にして免疫操作を行い、第2回免疫操作後に血液を回収し、血清中のOVA特異的抗体力価を測定して結果を図1に示した。
(比較例1)
PBS1μlを基剤1に滴下し吸収させて得られたパッチを使用した以外は実施例2で行ったと同様にして免疫操作を行い、第2回免疫操作後に血液を回収し、血清中のOVA特異的抗体力価を測定して結果を図1に示した。
(比較例2)
10mgのOVAを1mlのPBSに溶解した溶液10μlをBALB/cマウスの耳介皮膚に皮下注射して第1回の免疫操作を行い、2週間後に再度皮下注射して第2回の免疫操作を行った。第2回免疫操作から2週間後、マウスの眼窩よりヘマトクリット毛細管を用いて血液を回収した。回収した血液の血清中のOVA特異的抗体力価を実施例1で行ったと同様にして測定して結果を図1に示した。
(実施例3)
10mgのOVAを1mlのPBSに溶解した溶液10μlを基剤2に滴下し、基剤2にPBSを吸収させ基剤2表面に100μgのOVA層が積層されたOVAパッチを得た。得られたOVAパッチを用い、実施例1で行ったと同様にして免疫操作を行い、第2回免疫操作後に血液を回収し、血清中のOVA特異的抗体力価を測定9.5であった。
(実施例4)
10mgのOVAを1mlのPBSに溶解した溶液10μlを基剤3に滴下し、基剤3にPBSを吸収させ基剤3表面に100μgのOVA層が積層されたOVAパッチを得た。得られたOVAパッチを用い、実施例1で行ったと同様にして免疫操作を行い、第2回免疫操作後に血液を回収し、血清中のOVA特異的抗体力価を測定10.5であった。
(実施例5)
BALB/cマウスの耳介皮膚の両面に、トリプシン(ナカライテスク社より入手)の0.1重量%水溶液に浸したガーゼを密着させて36℃で0.5時間保持して角質処置した。次に、皮膚を精製水により洗浄し、ガーゼで水をぬぐった後、実施例1で得られたOVAパッチを用い、実施例1で行ったと同様にして免疫操作を行い、第2回免疫操作後に血液を回収し、血清中のOVA特異的抗体力価を測定12.0であった。
(実施例6)
組み替えHBsタンパク(シグマ社より入手)40μgを10μlのPBSに溶解した溶液を基剤2に滴下し、基剤2にPBSを吸収させ基剤2表面に40μgの組み替えHBsタンパク層が積層された組み替えHBsタンパクパッチを得た。HBsに特異的な抗体に対して陰性である日本白色種雄性ウサギ(体重2〜2.5kg)3羽の背中を除毛した後、得られたパッチを貼付し、その上をドレッシングテープで覆い免疫感作操作を実施した。24時間後にパッチを除去した。免疫感作操作後3週間して、ウサギの静脈血液試料を採取し、HBs抗原に特異的な抗体力価を測定したところ、三羽とも陽性であった。尚、抗体力価の測定はバイオクリット−抗HBs(三光純薬製)を用いた。
(比較例3)
組み替えHBsタンパク40μgを10μlのPBSに溶解した溶液を、ガーゼを直径1cmの円形に打ち抜いた基剤に滴下し、基剤にPBSを吸収させ基剤表面に40μgの組み替えHBsタンパクを含有する組み替えHBsタンパクパッチを得た。得られたパッチを用いて実施例6で行ったと同様にして、HBs抗原に特異的な抗体力価を測定したところ、三羽とも陰性であった。
(実施例7)
アデノウイルスベクターを微粉砕し、10mg蛋白質/mlのアデノウイルスベクター粉砕水溶液を得た。得られた溶液10μlを基剤1に滴下し、基剤1にPBSを吸収させ基剤1表面に100μgのアデノウイルスベクター由来蛋白質層が積層されたアデノウイルスパッチを得た。
得られたアデノウイルスパッチを用いて実施例1で行ったと同様にして2回の免疫操作を行った。第2回免疫操作から2週間後にルシフェラーゼ遺伝子を発現するアデノウイルスベクター(以下「Ad−Luc」という。)をマウスに尾静脈内注射し、その48時間後に肝臓を摘出した。肝臓ホモジネート液を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬を加えてマイクロプレートリーダー(テカン社製、商品名「スペクトラフルオロプラス」)により肝臓におけるルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図2に示した。
(比較例4)
BALB/cマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで8回ストリッピングして角質層を除去した後、基剤1にPBSを滴下し吸収させて得られたパッチを使用した以外、実施例7で行ったと同様にして免疫操作、Ad−Lucをマウスに尾静脈内注射し、ルシフェラーゼ アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図2に示した。
(実施例8)
BALB/cマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで8回ストリッピングして角質層を除去した後、実施例7で行ったと同様にして免疫操作、Ad−Lucをマウスに尾静脈内注射し、ルシフェラーゼ アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図2に示した。
(比較例5)
10mg蛋白質/mlのアデノウイルス粉砕溶液10μlをBALB/cマウスの耳介皮膚に皮下注射して第1回の免疫操作を行い、2週間後に再度皮下注射して第2回の免疫操作を行った。第2回免疫操作から2週間後、実施例7で行ったと同様にしてAd−Lucのマウスに尾静脈内注射及びルシフェラーゼ アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図2に示した。
(比較例6)
Ad−LucをBALB/cマウスに尾静脈内注射し、その48時間後の肝臓におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ アッセイにより測定し、結果を図2に示した。
(比較例7)
BALB/cマウスの肝臓におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ アッセイにより測定し、結果を図2に示した。本比較例は全くのバックグラウンド値の測定である。
(実施例9)
フロロレッセンチオシアネート(以下「FITC」という。)標識NF−κBデコイ核酸(北海道システム・サイエンスより購入)水溶液を基剤1に50μg滴下して表面にFITC標識NF−κBデコイ核酸層が積層されたデコイ核酸パッチを得た。得られたデコイ核酸パッチをヘアレスマウスの背部皮膚に貼付し、24時間後にデコイ核酸パッチを剥がし、へアレスラット皮膚を摘出し皮膚切片を作成して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、FITCの緑色蛍光が皮膚表面から50ミクロンの厚さまで浸透していることが明瞭に観察された。本試験はNF−κBデコイ核酸が十分な皮膚深さまで浸透しアトピー性皮膚炎に対する有効性を証するものである。
(比較例8)
FITC標識NF−κBデコイ核酸の5mg/ml水溶液10μl(50μgのFITC標識NF−κBデコイ核酸相当)をヘアレスマウスの背部皮膚に塗布し、24時間後へアレスラット皮膚を摘出し皮膚切片を作成して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、FITCの緑色蛍光は皮膚表面にとどまり皮膚深部にはまったく拡散していないことが確認された。
本発明の製剤は非侵襲的製剤として、免疫製剤、アトピー治療製剤、等に有効に利用できるものである。

Claims (13)

  1. 無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする経皮免疫製剤。
  2. 抗原が、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される病原体由来の抗原、腫瘍関連抗原、自己抗原、アレルゲン又は抗原がコードされた核酸であることを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  3. 人工合成核酸がデコイ核酸、アンチセンス核酸又はsiRNA(small interfering RNA)であることを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  4. 抗原若しくは人工合成核酸の分子量が1,000ダルトンより大きいことを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  5. 基剤が、水及び/又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質であることを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  6. 親水性高分子物質が、ポリアクリル酸アルコキシアルキル系高分子物質、でんぷん- アクリル酸グラフト系高分子物質、ポリアクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルアルコール系高分子物質、酢酸ビニル- アクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルピロリドン系高分子物質、イソブチレン- マレイン酸系高分子物質又はN−ビニルアセトアミド系高分子物質であることを特徴とする請求項5記載の経皮免疫製剤。
  7. ポリビニルアルコール系高分子物質が、ポリビニールアルコールハイドロゲルであることを特徴とする請求項6記載の経皮免疫製剤。
  8. 基剤が、アクリル酸メトキシエチル40〜60重量%、(メタ)アクリル酸ラウリル30〜40重量%及び極性モノマー10〜25重量%よりなる共重合体100重量部、乳酸オクチルドデシル2〜15重量部、グリセリン2〜10重量部及びヒアルロン酸0.01〜0.1重量部からなることを特徴とする請求項5記載の経皮免疫製剤。
  9. 基剤が、可塑剤、化学的吸収促進剤及び/又は酵素を含有することを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  10. アジュバンドを含有することを特徴とする請求項1記載の経皮免疫製剤。
  11. 抗原若しくは人工合成核酸を水及び/又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水及び/又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原若しくは人工合成核酸が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項記載の経皮免疫製剤の製造方法。
  12. 請求項1〜10のいずれか1項記載の経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする経皮免疫方法。
  13. 無傷の皮膚を酵素処理した後、経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用することを特徴とする請求項12記載の経皮免疫方法。
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