JPS6370167A - フロ−サイトメトリ−による白血球分類に使用される試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における血球の分類測定に使
用される試薬に関するものであり、さらに詳しくは、フ
ローサイトメーターを用いて、螢光染色処理された血球
を光学的に測定し、白血球を分類するときに使用きれる
試薬に関するものでらるＯ （従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンノミ球、単球、好
中球、好酸球、好塩基球の種類がある、これらは各々と
の機能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数す
ることによって、病気の診断に貢献することができる。

たとえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白面１な
どにみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、男性不
良性貧血、無顆粒球症などにみられる。好酸球の増加は
、寄生虫症、ホジキン關、アレルギー疾患などにみられ
る。単球の増加は感染症の快復期、羊球性白血病などに
みられる。

白血球を分類・計数するために従来から最も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鑵で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類・計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な神木作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類・計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのために、測定者に大きな負
担をかけるものとなっている。さらに、計数する白血球
数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布となっ
ている場合もあシ、熟線した測定者でも再現性のある測
定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行なえる方
法が強く求められており、現在のところ大きく分けて二
種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型にな）
、価格が高くなるという問題もある。

白血球を自動的に分類・計数するもうＳ方法は、フロー
システムを利用した方法である。この方法は、血球を希
釈液中に浮遊させた試料を用い血球が一個ずつηｔｉｔ
い検出器中を通過するようにこの試料を匠し、このとき
検出器で発生する信号を分桁することによシ白血球を分
類するものである。

このフローシステムを利用した方法は、さらに、二つの
方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した一ｔＳ液を細孔中に流し、血球が細孔を通過し
たときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信
号の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光ＴＪλと、試料中の細胞が１個ずつ細
い流路を流れるようにした７０−セルと、細１押から発
せられた光を検出する測光部と、検出信号を解所する解
チ装置とを備えたフローサイトメーターを使用するもの
である。この方法では、血球を染色し、染色された血球
を光で照射し、そのとき血球から発する螢光および場合
によっては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によ
って白血球を分類しようとするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメラツキー（Ｌ
、Ａ、Ｋａｍｅｎｔｅｋｙ）　「ブラッド・セルズ（Ｂ
ｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　）　Ｊ　、第６巻、１２１〜１
４０頁、１９８０年に記載された方法がある。この方法
は、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色液を加え
、１分間インキユヘートシたのち、アルゴンイオンレー
ザ−等の光源で照射したとき血球から発する緑色螢光と
赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球を分類
・計数するものである。

この第２の方法に属する他の例としては、特開昭５０−
２０８２０号公報およびエイチ・エム・シャピｏ　（Ｈ
，Ｍ、５ｈａｐｉｒｏ）他［ザ・ジャーナＡ／＋オブ・
ヒストケミストリー・アントドサイトケミストリー（Ｔ
ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　ｊ、第
２４Ｇ第１号、３９６〜４１１頁、１９７６年；同じく
第２５巻第８号、９７６〜９８９頁、１９７７年に記載
された方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色液
ｌを加え、３分間インキュベートした後、血液と等容の
２０％ホルムアルテヒドを加え、５分間固定を行ない、
希釈用の染色液１１で１５〜２０倍に希釈し、フローサ
イトメーターで測定するものである。

この測定に用いられるフローサイトメーターは、光源と
して光を３分割した水銀アークランプ又は三本のレーザ
ーを備え、染色液に會まれる３種の螢光染料を各々励起
し、その３ｆ４の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸光
の６つのパラメーターを測定し、４段階の二次元分布解
仇によシ白血球を分類・計数する装置である。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全には行
なわれ得ない場合もあり、このときＫは測定値の正確さ
が損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差が最大となる時間に測定するこ
とを特徴としている。

しかしながら、白血球数が極端に多いが、または少い検
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることになシ、検体ごとに適切な染色
時間を選定しなければならない。また、この方法は螢光
強度の差のみによって白血球を分離しようとしているた
め、リンパ球と単球との分離等容血球の分離が必ずしも
良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうち、特開昭５
０−２０８２０号公報等に記載された方法は、操作手順
が多く、染色時間が長くかかる上に、複雑な試薬を使用
しなければならない。また光源が３種必要であることに
加え、６つのパラメーターを測定しなければならないた
め装置が非常に複雑で高価なものとなる。さらに、この
ように多くのパラメーターを測定しているため解析が複
雑となり、大容量の解析装置を必要とするという問題も
ある。

この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、フローサイトメトリーによる白血球分類を、
簡単な手順と構成で正確に行なえるようにするために使
用される試薬を提供するものである。

（問題点を解決するための手段） この発明の、フローサイトメトリーによる白血球５分類
に使用される試薬は、以下の組成を有する。

（１）好酸球を特異的に強く染色する染料たとえばニュ
ートラルレッド （２）好塩基球を特異的に強く染色する染料　アストラ
ゾン・オレンジＧ又はオーラミン０（特にアストラゾン
・オレンジＧが好適である。）（３）緩衝剤（リン酸、
クエン酸、ホウ酸、ＴＲ工Ｓ、ＨＥＰＩＳ、グリシン、
炭酸、コリジン、タウリン等） （４）浸透圧補償剤（アルカリ金属塩）又、単球分画を
さらに良好に分離するために下記成分（５）を付加する
こともあり得る。

（５）単球を特異的に強く染色する染料、ＤｌｏＣ１（
３）。

Ｄ１０Ｃ２（３）、ＤｌｏＣ３（３）、Ｄ１０Ｃ５（３
）、ＤｌｏＣ６（３）、ＴＡ−２および１−〔γ−（１
′−エチル−４７，ｓ／−ペンゾチアソリリデン）フロ
ベニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾオキサシリウム
　ヨーシトのうちの少くとも一つ。

（％にＤｌｏＣ３（３１が好適である。）上記成分（１
）、　（２）および（５）として使用される染料の化学
構造式は次のとおりである。

Ｈ ＤｉＯＣｎ（３）　（１、１’−ジアルキルオキサカル
ボシアニン）ｎ＝１．２２３．　５．６ ２−（ｒ−（１’−エチル−４′、５′−ベンゾチアゾ
リリデン）フロベニル〕−１−エチル−４，Ｓ−ベンゾ
オキサシリウム　ヨーシト この発明の試薬は、複雑な前処理等の操作を必要とせず
、一段階の簡単な染色のみで、フローサイトメーターに
より血液中の白血球だけを分類・計数するために使用さ
れるものである。

この発明の試薬が使用されるフローサイトメーターの光
学系の一具体例を第１図に示された図面に基いて説明す
る。

第１図は側方散乱光と昼餐光と緑螢光とを測定する場合
を示している。このフローサイトメーターの光学系１０
に使用された光源は、波長；４８８ｎｍ　＊　ｌｆｊ　
力；　１０　ｍＷのアルゴンイオンレーザ−１２である
。レーザー１２から発せられた光は、シリンドリカルレ
ンズ１６によって畝られ、フローセル１４中を流れる測
定用試料を照射する。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。

このうち、側方へ発せられ斤散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過し
たのち、グイクロイックミラー２２に達する。

グイクロイックミラー２２は１ｎｉｌ方散乱光２４を反
射し、螢光２６を透過させる。グイクロイックミラー２
２によって反射された側方散乱光２４は光電子増倍管２
８によって測定される。グイクロイックミラー２２を透
堝した螢光２６のうち昼餐光３２はグイクロイックミラ
ー３０によって反射させられ、緑螢光３８のみが透過さ
せられる。反射された昼餐光３２はカラーフィルター３
４を通過したのち、光電子増倍管３６によって測定され
る。退治した緑螢光３８はカラーフィルター４０を通過
したのち光電子増倍管４２によって測定される。

ところで白血球より発せられる前記複数の信号のうち、
側方散乱光信号は細胞内情報を反映するものであるっす
なわち、細胞内の純胞核が大きいほど、また、顆粒が多
いほど細胞内での光の反射が強まり、側方散乱光強度は
増大する。したがって、リンパ球は、その内部に顆粒が
存在しないか、あるいは少ないので、散乱光強度は一番
小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存在し、また
、大きな核を持つので、散乱光強度は一番大きくなる。

単球、好酸球、好塩基球による散乱光強度はリンパ球と
好中球の中間にある。このような理由により、各白血球
の側方散乱光の相対強度は、第２図に示すものとなる。

一方、螢光信号は、細胞化学的特性を反映するものであ
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。

したがって、側方散乱光信号に、染料に応じて、少くと
も一つの螢光信号を、組み合わせることにより、白血球
をさらに良く分類できるようになる。

さて、白血球を、側方散乱光と数種の螢光とからなる６
１１定／々ラメ−ターのうちの二つのパラメーターによ
る二次元分布から４種以上に分類できる染料は（ただし
光源はアルゴンイオンレーザ−（Ａｒ−１ｏｎ　Ｌａ５
ｅｒ）　４８３ｎｍに限定した場合に）１７種類あるこ
とが実験的にわかった。（Ｌ　Ａ　やｐ！、　）特にア
クリジンオレンジ、ロードリンオレンジ等では５分類以
上が可能である。

上記１７種の染料で白血球と赤血球及び血小板とを十分
区別できる様に螢光染色しフローサイトメーターで側方
散乱光と螢光で二次元分布を描くと、第３図〜第５図の
様なパターンが得られる。

ただし、第３〜５図中の１はリンパ球、２は単球、３は
好中球、４は好酸球、５は好塩基球の各集合を表わして
いる。また、５ｉｄｅ　Ｓｃ、は側方散乱光の相対強度
、１ｉ’Ｌ、は螢光の相対強度を表わしている。

第３図に示したパターンは、キサンチン（Ｘａｎｔｅｎ
θ）系、オキサカルボシアニン系、アクリジン系の染料
で見られる。アクリジン系染料では緑螢党と赤螢光によ
る二次元分布も同様のパターンを示す。

第４図に示したパターンはニュートラルレッドで見られ
る。

第５図に示したパターンはアストラゾン・オレンジＧ１
オーラミンＯで見られる。

又、白血球を３分類する染料は約２０種類あることを見
いだしたつそれらの染料では第６図のパターンが得られ
る。

第４図、第５図に示す様な二種の染料を適切に混合し、
両方の染料の螢光を受光するとイク光／側方散乱光で第
７図の様なパターンが得られるっ又螢光を二色に分割し
緑螢光（Ｇｒｅｅｎ　ＦＬ、　）　　と赤螢光（Ｒｅｄ
　ＦＬ、　）の波長を染料の特性に応じ適切に選ぶと第
８図の如く好酸球４と好塩基球５が他の白血球と分離で
きる。残υの部分は螢光／側方散乱光で第９図の如く分
離できる。

第７図の状態に第６図のパターンを与える染料を加える
と、リンパ球１、単球２、好中Ｒ３の分離が一層良くな
り第１０図の様なパターンが得られる。この場合にも緑
／赤螢光（第１１図）と螢光／側方散乱光（第１２図）
の二段階解析も可能である。

染料の作用 ａ、ニュートラルレッド 白血球を螢光染色する染料であシ、特に好酸球４を強く
染色し、何方散乱光と赤螢光で白血球を＠４図のように
分画する。

第１３図はニュートラルレッドの励起・螢光特性を示す
ものである。

コノニュートラルレッドで染色した場合、特ニ５８０〜
６４０　ｎｍの（橙赤色の）波長帯域で好酸球が強く（
特異的に）染色される。

ｐＨ５〜１１、染料濃度３〜３００μ９７扉ｌの染色液
で第４図のような二次元分布がイ￥ｔられる。染料濃度
が３μ９７ｍ１以下でも好酸球特異的分布ノミターンは
得じ）れるが、他の白血球はノイズが多く正確な測定が
できなくなる。好酸球４のみの信号をイ！チるのであれ
ば染料濃度は０．１μ９／ｎｇ程度以上で良い。

ｂ、アストラゾンオレンジＧ 白血球を螢光染色する染料であυ、特に好塩基球５を強
く堅色し、何方散乱光と緑螢光で白血球を第５図のよう
に分画する。

第１４図はアストラゾンオレンジＧの励起・螢光特性を
示すものである。

このアストラゾンオレンジＧで染色した場合、特に５４
０　ｎｍ付近を中心とした（黄緑色の）螢光波長帯域で
好塩基球が強く（特異的に）染色される。

ｐＨ５〜１１、染料濃度１〜３００１１ｇ／罰の染色液
で第５同のような二次元分布が得られる。

オーラミンＯでもアクリジンオレンジＧ　トｌｎＪ様の
結果が倚られる。

Ｃ０その他の染料 白血球を螢光染色する染料であり、特に単球を強く染色
し、四方散乱光と螢光で白血球を第６図のように少くと
も３つに分画する。

ｄ、ニュートラルレッドとアストラゾンオレンジＱの組
み合せ ニュートラルレッドにより好酸球４を、アストラゾンオ
レンジＧによυ好塩基球５を強く染色し、何方散乱光と
黄〜赤色の螢光で白血球を第７図のように分画する。

ｐＨ５〜１１、ニュートラルレッド濃度０１〜３０μ９
／ｙｔ１．　’アストラゾンオレンジＧｐ度１〜３００
μ９／ｗｉｔの染色液で第７図のような二次元分布が得
られる。

ｅ、ニュートラルレッドとアストラゾンオレンジＧとそ
の他の染料の組み合せ ｄとＣの染料を適切に組み合せることにより、ｄよりも
単球２の分離が良い（リンノ々球１．好中球３の混入ん
少い）状態に染色することが可能となり、側方散乱光と
黄〜赤色の螢光で白血球を第１０図のように分画する。

この目的で用いることが可能な上記Ｃの染料はＤｌｏＣ
ｌ（３）、　Ｄ１０Ｃ２（３１，Ｄ１０Ｃ３（３）、　
Ｌ）１０Ｃ５（３）、　ＤｔＯＣｆｉ３）。

等のオキサカルボシアニン色素、ＴＡ−２（日本感光色
素研究所（岡山市）で製造しているスチリル染料）、２
−〔γ−（１′−エチル−４′、５′−ベンゾチアシリ
リフ’ン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
オキサシリウム　ヨーシト等のシアニン色素、等である
。

オキサカルボシアニン色素口体は第１５図の如く好酸球
４を好中球３よりも弱く染色し、白血球を４分類に分画
するが、本性では、混在するニュートラルレッドの強い
好酸球特異的染色性により、好酸球４は好中球３の上に
分布する。

Ｃに属する染料は他にも存在するが、この目的に使用で
きるものは、染色条件、染色強度、螢光波長等の制限か
ら、上記の染料及びその類似体のみである。

その他の染色液成分 ａ、緩衝剤 染色液を至適ｐＨに保つために用いる。ｐＨにより染料
の染色性及び染色される血球内諾白質の種類が異なるた
め、ｐＨの保持は大切である。血液自体もｐＨを７．４
付近に保つ様に緩衝機能を有しているので、この作用を
打ち消し希望するｐＨにするための量の緩衝剤を必要と
する。

この目的のため５〜２００　ｍＭのリンｒ３７、クエン
酸、ホウ酸、ＴＲ工Ｓ、ＨＥＰＥＳ、グリシン、炭１１
ノ、コリジン、タウリン等を用いる。

ｂ、浸透圧補償剤 白血球の極端な変型・溶血等が起こらない様にするため
加える、人血の生理浸透圧（２８０ｍｏθｍＡ９）の４
０％〜２５０％程度々なる様に６０　ｍＭ〜３８０　ｍ
Ｍのアルカリ金属塩を使用する。

この発明を実施するにあたっては以下の点に留意しなけ
ればなら々い。

ａ、混合する染料は特異的染色を行なう最適の濃度、ｐ
Ｈ等が一般に異なるので、全ての染料を目的通りの特異
性で用いる染色条件を見出さなければならないこと。

ｂ、各染料は螢光強度（一般に照射党量工ｏ、その波長
での吸光度係数ε、量子効率φ、染料濃度Ｃ２光学系に
よる補正係数αの全てを乗じたものが各染料の螢光強度
となる。）が異なるので、望みのパターンを得る様に、
加える各染料量のｔａ　ａ　？しなければならないこと
。

Ｃ５特異性のある二次元パターンが得られるように、受
光波長ｋＭ択しなければならないこと。

（実施例） 本発明を下記実施例１〜６によってより具体的に説明す
る。

実施例１　にュートラルレッド及びアストラゾンオレン
ジＧの濃度） ７５　ｍＭのＮａ（４を含むｐＨ９，０の１０ｍＭホウ
酸緩衝液にアストラノンオレンジＧとニュートラルレッ
ドを表１の１加えた染色液を作成した。

これらの染色液２ｒｘｌにＥＤＴＡ抗凝固新鮮血８０μ
ｌを加え１分間インキュベートした後第１図に示す様な
光学系を有するフローサイトメーターで白血球の緑螢光
、昼餐光、側方散乱−Ｘを測定したつその結果、表１に
示す様に白血球が数種に分画できた。

＊１）昼餐光＊６）／側方散乱光で５分類＊３）　　昼
餐光／緑螢光＊７）で好酸球と好塩基球を分画後、螢光
／側方散乱光で残りを３分画する５分類 ＊４）昼餐光／側方散乱光で４分類 ＊５）昼餐光／緑螢光で好酸球を含む３分類＊２）分類
不能 ただし 昼餐光；　５８０　ｎｍ以上 縁螢光；５２０〜５８０　ｎｍ 実施例２　　（ｐＨ） ７５ｍＭのＮａＣＡ！　ｋ含む１０ｍＭホウｆｆ１ｍ衝
液にアストラゾンオレンジＧＩＯμｇ／ｍｌ、ニュート
ラ／Ｌ／　ｌ／　ノド１１１９フ １０、０　の３種の染色／ｙ．を作成し、実施例１と同
様にして測定を行なった。その結果、ｐＨ１０．０では
昼餐光／　（Ｉｌｌ方散乱元での５分類はできないが、
繰替光／赤螢光で好塩基球、好酸球を分画した後、繰替
７１：／側方散乱光で残り３種を分画し、白血球全５分
類できる。ｐＨ９．０では昼餐光／側方散乱光で５分類
ができる。ｐＨｓ．ｏでは、昼餐光／側方散乱光で４分
画が可能である。

実施例３　（　ＮａＣｌ３濃度） アストラゾンオレンジＧＩＯμ９／ｒｎｌ，ニュートラ
ルレッド１μ９１ａｔを含むｌｏｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ
９．０にＮａ（Ｊ　ｆ　５　０，　７　５、１５０，３
００ｍＭ加えた４神の染色液を作成し、実施例１と同様
にして６１１１定金行なった。この軸間では特に大きな
分画パターンの変化はなく、いずれの染色液でも、白血
球が５分類可能である。

実施例４（緩衝剤濃度） ＮａＣ６　７　５　ｍＭ，アストラゾンオレンジＧＩＯ
μ９／払　ニュートラルレッド１μ’ａ／ｒｔｔｌ’ｆ
ｒ：　含ｂ　ｐＨ９、０のホウ酸緩衝液の緩衝剤濃度を
３、１０、３０ｍＭとした３種の染色液全作成し、実施
例１と同様にして測定を行なった。この範囲では特に大
きな分画パターンの変化はなく、いず７Ｌの染色液でも
白血球が５分類可能である。

実施例５（螢光波長） ７５ｍＭのＮａＣ７、アストラゾンオレンジＧ１　０　
μ’ａ／ｍｅ、ニュートラルレッド１ｓ７ｍｔ；を含む
ｌＱｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０の染色液を用い、実施
例１と同様に６４１１定した。ただし第１図のグイクロ
イックミラー３０の位置に全反射ミラーをカラーフィル
ター３４にロングパスフィルターを使用し、光電子増倍
管３６で５２０ｎｍ以上、５４０ｎｍ以上、５　６　Ｑ
　ｎｍ以上、５８０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６２０
ｎｍ以上の６種類の螢ｙｔＳを受光し、螢光／側方散乱
光で解析を行なった。

受光波長全長波長へ郡・助させると相対的に好塩基球と
リンパ球が接近し、好酸球と好中球が離れる。５分類が
分離良く行なえる受光波長としてば５ｆ３０ｎｍ以上、
５８０ｎｍ以上の２つが特に良い。

実施例６（昼餐尤、繰替光波長） 実施例５と同様の測定を行ない表２に示す波長の昼餐光
と繰替光とを受光した。

表２ （１　　　　　　５４０　〜６００　　　　　５６０以
上以上　　　　　　　　　　　　　　５８０以上以上　
　　　５４０〜５８０　　　　　　５　６　（１以上ｄ
　　　　　　　　　　　　　　　５８０以上５（）０〜
５４０　　　　　５　６　０以上特にＣ，ｅの螢光波長
で好塩基球、好酸球が特異的に強く染色され他の白血球
との分離が良い。

なお、以上述べた実施例は、すべて、完全に染色が終了
したのちに、すなわち染色が平衡状態に達したのちに測
定を開始するものであるから、画定中に試料が経時変化
することは無く、また、白血球が極端に多いか、または
、少い検体についても、常に、一定時間で適正な強度に
まで染色レベルが達している．、したがって、安定な測
定が可能となるとともに、比較的低ｉｔｌ力の光源を使
用しても、充分な螢光強度の信号が得られる。たとえば
、この実施例では、すべて、ＩＱｍＷのアルコ゛ンイオ
ンレーザーをフローサイトメーターの光源として使用し
ている。

以上の実施例から下記条件で上記試薬を使用した場合良
好な結果が得られることがわかった。

アストラゾンオレンジＧ；　３〜１００（μ９／／’）
ニュートラルレッド　　；　０３〜１０（μ９／ｍｅ）
ｐＨ；　　８．０〜１１．０ 螢光波長 緑発光　　　　　；　５００〜５８０ｎｍ赤螢光　　　
　：　　５６０ｎｍ以上 しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、Ｈｅ−Ｃｄレーザー、Ｈｅ−Ｎθレーザ
ー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光臨であって
もかまわない。そのときには、各光源に応じた最適染料
、染色条件、測定条件を設定すれば良い。

（発明の効果） この発明の試薬を使用してフローサイトメーターによっ
て血液を測定し、白血球を分類・計数すると、以下に述
べる様な効果が得られる。

（１）染色液に抗凝固処理を施した血液を加えるという
一段階の染色のみでＩＩＩ定用試用試料られるので、試
料の前処理が非常に簡単にできる。

（２）１公租度の染色時間で測定することが可能である
ため、測定迄に要する時間が短くて済む。

（３）完全に染色が終了した状態で６１１１定するため
、測定中の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体
のみならず、白血球が極端に多いか、または少い検体に
ついても、一定時間で常に適正な強度に染色がなされて
いる。このため検体によって染色時間を変えるという必
要は生じない。

（４）完全に染色が納了し、強い染色強度に達したのち
測定するので、フローサイトメーターの光源は低出力の
もので良い。さらに光源は一個しか必要とせず、測定パ
ラメーターも螢光２チヤンネル、側方散乱光１チヤンネ
ルの中から２つのパラメーターを選択して測定し、分析
するだけで良いので、この発明の試薬を使用する装置は
、構成が簡単で低価格のものとなる。

（５）　　この発明の試薬は、細胞を染め分ける作用が
非常に強いので、分離度の良い各白血球の分類結果が得
られる。

（６）螢光に加えて側方散乱光をも一緒に測定した場合
には、リンパ球と単球の分離をはじめとして、分離度の
一段と良い各白血球の分類結果が得られる。

（７）赤血球、血小板、および幼若赤血球は、螢光強度
が白血球に比べて非常に弱いので、これらは白血球と完
全に区別できる。このため、この発明の試薬を使用すれ
ば、唄１ｊ定前にあらかじめ赤血球を溶九１させる必要
がない。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の試薬が使用されるフローサイトメー
タの光学系の一具体例を示す概略図。 図中の各符号は次のとおりである： １０：フローサイトの光学系、１２：レーザー、１４：
フローセル、１６：フリント９リカルレンズ、２２：ダ
イクロイックミラー、２４：側方散乱光、２６：＊党、
２８：光電子増倍管、３０：ダイクロイックミラー、３
２：昼餐光、３４：カラーフィルター、３６：光電子増
倍管、３８：緑発光、４０：カラーフィルター、４２：
光電子増倍管、第２図は、各白血球の側方散乱光強度を
示すグラフ。 第３〜１２図および第１５１２′ｌは二つの信号を使用
して、白血球を分類したときの二次元分布図。 これら分布図中１はリンパ球、２は単球、３は好中球、
４は好酸球、５は好塩基球の各集合を表わす。 第１３図は、ニュートラルレッドの励起・螢光特性を示
すグラフ、 第１４図は、アストラゾンオレンジＧの励起・螢光特性
を示すグラフ。 各図面中５ｉｄｅ　Ｓｃは側方散乱光の相対強度、Ｐ’
Ｌ、　ｒ＜ｅｄｉ＋’Ｌ　、およびＧｒｅｅｎ　Ｆ’Ｌ
、　　は各々螢光の相対強度、昼餐光の相対強度および
緑発光の相范１図 一一一−１ルメ珠 側旧ｆｚｇＬ素用柑９ 箪３Σ　　　　　　　　　暴４Ｖ ２Ｌ５図　　　　　　　　　　尾ろ凹 ’　５ｉｄｅ　　３ｃ、　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５ｉｄｅ　５ｃ。 罵７凹 匙１０図 １２１５口 ５ｉｄｅ　５ｃ。 琴Ｑ２　　　　　　馬ｑ凹 占Ｈ凹　　　　　奥、１２凹 ＲｅｄＦＬ、　　　　　　　　　　５ｉｄｅ　５ｃ。 ２、発明の名称 フローサイトメトリーによる白血球分類に使用される試
薬 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 Ｉｎｌ　　拵ｏ１団ル９ｔｌ斜めヒらｆ訂正す入−６、
補正の内容 （１）明細書を次のように訂正する。 百行　誤　　　　正 ８　８　多いが、　　　　　　　　多いか、１６１６　
　　ニークリシン　　　　　ニークリジン２１　７　混
入ん　　　　　　　　混入の２５　９　界雷光　　　　
　　　　＊６）界雷光２５１０　　緑蛍光　　　　　　
　　＊７）緑蛍光３１　　下３　　フローサイト　　　
　　　フローサイトメーターＲｅｄ　ＦＬ。 手続補正書 昭和６２年４月２日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）好酸球を特異的に螢光染色する染料及び好塩基球
   を特異的に螢光染色する染料を含むことを特徴とするフ
   ローサイトメーター用白血球５分類試薬。
2. （２）好酸球を特異的に螢光染色する染料がニュートラ
   ルレッドである特許請求の範囲第１項の試薬。
3. （３）好塩基球を特異的に螢光染色する染料がａ、アス
   トラゾンオレンジＧ ｂ、オーラミンＯ のいずれかである特許請求の範囲第１項の試薬。
4. （４）好酸球を特異的に螢光染色する染料、好塩基球を
   特異的に螢光染色する染料及び単球を特異的に螢光染色
   する染料を含むことを特徴とするフローサイトメーター
   用白血球５分類試薬。
5. （５）単球を特異的に螢光染色する染料が、１，１′−
   ジメチルオキサカルボシアニン、１，１′−ジエチルオ
   キサカルボシアニン、１，１′−ジ−（ｎ−プロピル）
   オキサカルボシアニン、１，１′−ジ−（ｎ−ペンチル
   ）オキサカルボシアニン、１，１′−ジ−（ｎ−ヘキシ
   ル）オキサカルボシアニン、ＴＡ−２または ２−〔γ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
   オキサゾリウムヨージド である特許請求の範囲第４項の試薬。