JPS63500800A - インタフェロン誘発された蛋白をコ−ドする遺伝子の動物中への挿入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インタフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の動物中への挿入 本発明は、インクフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の動物中への挿入 に関するものである。さらに本発明は、ウィルス感染から動物を保護しうるイン タフエロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を動物中へ挿入することからなる ウィルス感染に対する動物の保護方法に関するものである。 好適具体例において、本発明はインフルエンザウィルスに対したとえば哺乳動物 または鳥類などの動物を保護する方法に関するものである。 オルトミキソウイルス感染はヒト（インフルエンザ）、馬（馬インフルエンザお よび咽頭インフルエンザ）並びに豚（豚インフルエンザ）を含む各種の哺乳動物 における感染、並びに七面鳥、アヒルおよび鶏を含む各種の鳥類動物にューキャ スル病および家禽疫病）における感染を引き起す〔ザ・インフルエンザ・ウィル ス・アンド・インフルエンザ、キルボーネ編集、アカデミツク・プレス出版、ニ ューヨーク（１９７５））、感染はしばしば死亡および／または重大な経済上の 損失をもたらす。 約２５年前、同系交配実験ネズミｆｆ：Ａ２Ｇは、試験した他′の全での同系交 配種に対し致死的であるインフルエンザウィルスの投与に対し耐性であること〔 リンデンマン、パイロロジー、第１６巻、第２０３頁（１９６４））、およびこ の特徴はＭｘと呼ばれる単一の優性対立遺伝子によって受け継がれることが突き 止められた〔リンデンマン、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ。 Ｅｘｐ、　Ｂ　ｉ　ｏ　１．、　Ｍｅｄ、　、第１１６巻、第２０３頁（１９６ ４））、それ以来、僅か１ｒｉの他の耐性実験種ＳＬ／Ｎ１ＡＬか見い出されて いない、インビボおよびインビトロ試験が示すところでは、インフルエンザウィ ルスに対するこの耐性は、インクフェロン（α型もしくはβ型であるが、Ｔ型で ない）によって媒介され〔ハラ−等、ジャーナル・エキスベリメンタル・メジメ ン、第１４９巻、第６０１〜６１２頁（１９７９）；ハラ−等、ネイチャー、第 ２８３巻、第６６０−６６２頁（１９８０）；アルンハイターおよびステへり（ Ａｒｃｈ、Ｖｉｒ、）、第７６巻、第１２７頁（１９８３）；ステへり等、パイ ロロジー、第１３２巻、第４５６−４６１頁（１９８４）　）　、かつＩ型ＩＦ Ｎで刺戟した後、Ｍｘ＋細胞（Ｍｘ−細胞でない）はＭｘと命名した蛋白を生産 する〔ホリスベルガー、ス°テヘリおよびハラ−、プロシーディング・ナショナ ル・アカデミ−・サイエンス。 ＵＳＡ、、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３））。 Ｍ　ｘ　”およびＭｘ−〇ＩＦＮ処理したネズミ細胞が他のウィルスに対し示す 感受性には差がなかったので〔ハラ−等、ネイチャー、第２８３巻、第６６０〜 ６６２頁（１９８０））、Ｍｘ遺伝子の作用はミキソウイルス特異性である。■ 型のＩＦＮは、Ｍｘの他に多くの蛋白を誘発し或いはその細胞内レベルを増大さ せる。現在まで、インフルエンザウィルスに対する耐性がＭｘ発現自身によるも のであるかどうか、或いは他のＩＦＮ銹発された蛋白を補なうにはＭｘが必要と されるかどうか決定することができなかった。さらに、実験ネズミおよび野性ネ ズミの両者にはＭｘ−遺伝子の頻度が高いため、Ｍｘ＋が野性もしくは突然変異 の表現型を示すかどうかが明らかでなかった。 本発明者等は、ネズミＭ　ｘ　ＣＤ　Ｎ　Ａを分離しかつその構造を決定し、ネ ズミ細胞におけるＭｘの発現はＩＦＮ（インクフエロン）処理がなくともインフ ルエンザウィルスに対し耐性を付与するのに充分であることを示し、さらにＭｘ −表現型はＭｘ遺伝子における欠失から生ずることを確認した。 本発明者等は、ＴＦＮ−αで処理したラットおよびヒト細胞が抗−Ｍｘ抗体に対 し交差反応する蛋白を合成することを突き止め、このことはこれら蛋白がネズミ Ｍｘ蛋白に対し構造上の相同性を有することを示している。本発明者等は、ヒト 細胞がＩＦＮ−α（ＩＦＮ−γでない）誘発に呼応して８０．０００ダルトンの 蛋白を合成しかつこの蛋白が他のヒトもしくはネズミ蛋白には見られない少な（ とも１種の抗原決定子とネズミＭｘとを共有することを突き止めたＣＰ、ステへ り。 等、モレキュラ・セルラー、バイオロジー、第５巻、第２１５０−２１５３頁（ １９８５））。さらに本発明者等は、ネズミＭｘ　ｃＤＮＡが多くの哺乳動物に おけるゲノムＤＮＡにハイプリント化することを突き止めた０本明細書において 、特記しない限り、Ｍｘ蛋白と言う用語は抗Ｍｘ抗体に対し交差反応するポリペ プチド或いはネズミＭｘ　ｃＤＮＡに対しハイブリッド化するＤＮＡによりコー ドされるポリペプチドを包含すると了解すべきである。　。 本発明者等は、欠陥Ｍｘ遺伝子を有しかつインフルエンザに対し感受性である動 物細胞の耐性を、この細胞中へＭｘ遺伝子を挿入することにより実質的に向上さ せうろことを突き止めた。遺伝子の天然補体の１部としてＭｘ遺伝子を有する細 胞はインフルエンザに対する耐性を発生するが、これはインクフヱロンで処理し た後においてのみである。さらに本発明者等は、永久的に発現されるＭｘ遺伝子 を細胞中へ挿入することにより、動物細胞中にＭｘ蛋白を生せしめれば、この細 胞はインフルエンザウィルスに対し永久的に耐性になることを突き止めた。この 種の細胞、特に動物におけるこの種の細胞は、遺伝子の天然補体の１部としてこ の種の遺伝子を有する細胞よりもインフルエンザウィルスに対し耐性が大である 。何故なら、後者は抗ウイルス状態が確立される前に先ず最初にインクフェロン を産生せねばならないからである。同様に、Ｍｘ蛋白以外のインクフェロン誘発 された蛋白に関する遺伝子を動物細胞中へ挿入すれば、この種の細胞がインクフ ェロンにより刺戟されていなくても、インクフェロンＴＡＢされた蛋白を生産さ せることができる。 さらに、インクフエロン誘発された蛋白は他の有利な作用をも与える。たとえば 、インタフェロンは細胞表面にてＨＬＡクラス■型蛋白およびβ−マイクログロ ブリンの発現を誘発し、かつ表面にこれら蛋白を有する癌細胞は免疫系によって 一層容易に破壊されることが示されている〔ヒュイ等、ネイチャー、第３１１巻 、第７５０〜７５２頁（１９８４）、タナ力等、サイエンス、第２２８巻、第２ ６−３０頁（１９８５）；ワリソヒ等、ネイチャー、第３１５巻、第３０１〜３ ０５頁（１９８５））、たとえば、表面にＨＬＡクラスＩ型蛋白およびマイクロ グロブリンを肴するＩ！瘍細胞が生物内で発生すれば、これは急速に破壊されて 癌を発生しない。 かくして、本発明者等による知見は、抗ウイルス性のインクフェロン誘発された 蛋白をコードする遺伝子を動物へ与えることにより、インフルエンザまたはその 他のオルトミキソウイルス感染に対しヒトを含む動物を保護する方法をもたらす 。これは、過当な遺伝子を胚芽系組織の細胞中（好ましくは、受胎した卵細胞も しくは極めて早期の胚芽中）へ挿入し、次いで動物中へのこれら細胞（好ましく は受胎した卵細胞または極めて早期の胚芽）の発生を容易化させて行なうことが できる。このようにして動物における感染の潜在的部位の細胞中でなく、動物中 へ遺伝子を挿入すれば、所望の遺伝子を永久に保持しかつウィルス感染に対し耐 性となるこの種の動物の子孫を生せしめることができる。同様にして、オルトミ キソウイルスに対する耐ウィルス特性以外の有利な性質、たとえばピコルナウィ ルス感染のようなウィルス感染（たとえば口蹄疫ウィルス）またはたとえば犬ジ ステンパもしくはリンデルペスト（牛に感染する）のようなバラミキソウィルス 感染に対する抗１ｔ！！特性もしくは抗ウイルス特性を有するインクフエロン誘 発された蛋白をコードする遺伝子を動物（たとえばヒトを含む哺乳動物並びに鳥 類および魚類）に対して付与することができる。 遺伝子を胚芽系組織の細胞中へ挿入する場合、この挿入は動物中に現存する細胞 或いは動物から取出されている細胞を用いて行なうことができる。たとえば、卵 子を動物の輸卵管から流出させ、試験管内で受胎させ、所望の遺伝子を微量注入 し、次いで動物へ手術して戻し、または他の動物へ移植・することができる、さ らに、胚芽（たとえば１細胞もしくは２細胞の胚芽）を微量注入することもでき る。これらの技術は、ハマー等、ネイチャー、第３１５＠、第６８０〜６８３頁 （１９８５）に充分記載されている。 本発明は、天然インクフェロンの誘発なしに或いはインクフェロン誘発された蛋 白の不充分な発現の下で動物中にインクフェロン誘発蛋白を生産させる方法に関 するものであり、この種の蛋白をコードする遺伝子を動物中へ挿入することがら なっている０本発明の好適具体例においては、インクフェロン誘発された蛋白を コードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子をたとえば１細胞胚芽のような動物細 胞中へ挿入し、かつ動物中へのこれら細胞の発生を容易化させる。これら組換Ｄ ＮＡ分子が挿入されている動物細胞を培養して、産業上有用な量の所望蛋白を製 造することができる。 好適具体例において、本発明はウィルス感染に対する動物の保護方法に関するも のであり、この方法はウィルス感染から動物を保護しうるインクフェロン誘発さ れた蛋白をコードする遺伝子を、感染に対し感受性である動物中へ挿入すること からなっている。好ましくは、インクフェロン誘発された抗ウイルス性蛋白をコ ードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子をたとえば１１１１１胞胚芽のような動 物細胞中へ挿入し、かつ動物中へのこの細胞の発生を容易化させる。 より好適な具体例において本発明は、感染に対し感受性である動物中へ、Ｍｘ蛋 白をコードする遺伝子を挿入することからなる、インフルエンザウィルスによる 感染に対し動物を保護する方法に関する。好ましくはＭｘ蛋白は、保護すべき動 物の種類に通富見られるようなＭｘ蛋白である。たとえば、豚Ｍｘ蛋白をコード する遺伝子が豚中へ挿入される。特に好適な具体例においては、Ｍｘ蛋白（たと えば豚Ｍｘ蛋白）をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子を、たとえば１細 胞胚芽のような動物細胞（たとえば腫細胞）中へ挿入し、がつ動物中へのこの細 胞の発生を容易化させる。 好ましくは、Ｍｘ遺伝子の発現は構成プロモータもしくはウィルス感染に対し特 に感受性である組織（たとえば呼吸器官もしくは腸管の粘膜）にて活性であるプ ロモータ、或いは外来薬剤（インクフエロンを含む）により便利に活性化しうる プロモータの制御下にある。本発明の方法は、動物がインクフェロン誘発遺伝子 を持たない場合或いはインクフェロン誘発された蛋白の発現が不充分である場合 に有益である。本明細書中で使用する「インクフェロン誘発された蛋白の不充分 な発現」という表現は、１つもしくはそれ以上の理由でインクフエロン誘発され た蛋白の発現を増大させかつ／または連続的にすることが望ましいことを言味す る。これは次の場合のいずれかとすることができる： ＋１１動物はインクフェロン誘発された遺伝子を有するが、この遺伝子はインク フェロン誘発の後にのみ所望の蛋白を発現し、かつ所望蛋白の発現を連続的にす るのが有利な場合；または （２）動物は所望のインクフェロン誘発された遺伝子を有するが、細胞に対する この種の遺伝子の１回もしくはそれ以上の追加が有利である場合。 さらに本発明は、インクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組 換ＤＮＡ分子で形質転換された動物細胞、並びにこの種の細胞を含む動物に関す るものである。好適具体例において、本発明はウィルス感染に対し細胞を保護し うるインタフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子 により形質転換され、自然状態においてウィルス感染に対し感受性である動物細 胞に関し、さらにこの種の細胞を含む動物に関するものである。特に好ましくは 、ウィルス感染はインフルエンザであり、がっ遺伝子はＭｘ蛋白をコードする遺 伝子である。或いは、Ｍｘ蛋白と類似した抗ウィルス作用を有するポリペプチド （たとえば、Ｍｘ蛋白の断片であるポリペプチドまたはより安定もしくはより効 果的となり或いはインビボにて一層高い治療指数を存するよう改変したＭｘ蛋白 の誘導体）をコードする遺伝子を、Ｍｘ蛋白をコードする遺伝子の代りに用いる こともできる。すなわち、本明１ｉＩ書においては特記しない限り、「インクフ ェロン誘発された蛋白」と言う用語は、たとえばＭｘ蛋白のような天然の蛋白だ けでなく、インクフェロンＸｆｆ　Ｑされた蛋白の作用と同様な生物学的作用を 存する他のポリペプチドをも包合すると了解すべきである。 一般に、本発明の方法は、天然状態においてインクフェロン誘発された蛋白のた めの所望遺伝子を持たず、或いは構成的に活性な型でこの遺伝子を持たず、或い はＩＦＮ刺戟後に抗ウイルス保護を与えるのに充分な量で蛋白を生産しないよう な動物細胞に適用することができる。しかしながら、本発明の方法は、さらにこ の種の遺伝子の１種もしくはそれ以上を既に有する動物細胞に対し、インクフエ ロン誘発された蛋白をコードする遺伝子の１種もしくはそれ以上を追加して、天 然のＩＦＮ制御下で構成的にまたは任意にインクフエロン誘発された蛋白を全て の組織もしくは成る種の組織で所望の効果（たとえば、ウィルス感染に対する抗 性）を生せしめるのに充分な量にて生産させるように適用することもできる。 さらに本発明は、式： ％式％ を有するポリペプチドにも関するものであり、ここで単一文字のアミノ酸コード によって示されるアミノ酸は次のように規定される： Ａ−Ａ、Ｉａ　Ｃ＝Ｃｙｓ Ｄ＝Ａｓｐ　Ｅ＝Ｇ１ｕ Ｆ＝Ｐｈｅ　ｃ＝ｃｔｙ Ｈ＝Ｈｉｓ　Ｉ＝１１ｅ Ｋ””Ｌ）’Ｓ　Ｌ＝Ｌｅｕ Ｍ＝Ｍｅｔ　Ｎ＝Ａｓｎ Ｐ＝Ｐｒｏ　Ｑ＝Ｇ１ｎ Ｒ＝Ａｒｇ　５＝Ｓｅｔ Ｔ＝Ｔｈ　ｒ　Ｖ＝Ｖａ　Ｉ Ｗ＝Ｔｒｐ　’　Ｙ＝Ｔｙｒ さらに本発明は、他の動物の細胞によって合成されるふズミＭｘ蛋白と同類であ るポリペプチド、特にネズミＭｘ蛋白に向けられたモノクローナル抗体２Ｃ１２ ＣＰ、ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、 第１８２１−１８２５頁（１９８５））で免疫沈澱させうるＩＦＮ誘発性の８０ ，０００ダルトンのヒトＭｘポリペプチドに関するものである。 さらに本発明は、上記ポリペプチドを含む医薬組成物、並びに動物（たとえばヒ トを含む哺乳動物並びに鳥類および魚類）におけるウィルス感染の治療（治療ま たは予防）のためのポリペプチドの使用に関するものである。ウィルス感染の治 療に同様な用途を有する上記ポリペプチドの誘導体および断片も作成しうろこと が了解されよう。この種のＨＲ４体および断片も本発明の範囲内に包含されると 考えられ、上記ポリペプチドに対する説明（たとえば下記の治療方法および組成 物の説明）は特記しない限りこれらの誘導体および断片をも包含すると了解すべ きである。 さらに本発明は、上記ポリペプチドを製造するのにを用な組換ＤＮＡ分子にも関 するものである。好適組換ＤＮＡ分子ん）Ｃ−ＧＴＧＣＧＣＣＣＣＴにＴＡＴＴ ＣＡ　ＣＣＴＣＡ　Ｔ　ＣＣＡ　ＣＡ　ＣＣＣＴｃＡＣｒＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴ にＴＧＣ−ＡＧＣＡｌ：Ａ：ｌＡ　ＣＣＴＣ−ＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴ　 ＣＣＣＴＣＴ　ＣＡＴＴαχ℃ＡＣＣＡ　ＧＡ　Ｇ　ｈ　−ＣＡＧＧＡＣＡＴＡ ＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣ入八ＣＣＴＧＣ；Ｔ（、ＧＴＡ ＧＴＣＣＣＣＡにごＡＡＴＣＡＧＧへＣＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＣＣ ＡＧＡ（１；ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣ ＴＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡ（、ＣＡＡＧＴＣＴｒＣＴｒＣ Ａ＋ＩＩＧＣ；ＡＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡ（、ＡＴＣλＡＡτ八λＡＴＡＧへＡ ＧＴＣＡＴＣＡ（、ＡにＴＣＣＡＡＧＣｃＡＧＧＡＧｃτＣＣ入Ｇ人ＡＣ。 ＴＡＣＣＧＴ（１；（ＡＣ；ＡＣＡＴＡＣＣＡＣ，入ＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＣ （、＾ＣＣ入ｒｃｒｃｃｒロ工τＣＧＴにＡＡτλ人ＡＡＴＣｋＧＴＧＣＣＴτ ＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣ入ＡＴＴＴ　ＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡ　Ｇ ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＧｋＧＡＧｋＡＣａＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧλんりＫ に（ＧＧＣｈ　−＝τ入ＡＧＣＣτＧＣＡτＣＡＧＣ，ＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧ Ｃ”ｎＧｃｃＡＡＡ’：’τＣＴＣＣＣＡＴのＤＮＡ配列、 （′ｂ）前記ＤＮＡ配列に対しハイブリッド化しかつ発現に際しアミノ酸配列が 上記に示されたポリペプチドまたはその他のＭｘ蛋白（ヒ）　Ｍ　ｘ蛋白を含む ）をコードするＤＮＡ配列、および ＴＣＩ遺伝子コードの結果として上記ＤＮＡ配列まで縮退しかつアミノ酸配列が 上記されたポリペプチドまたはその他のＭｘ蛋白（ヒトＭｘ蛋白を含む）をコー ドするＤＮＡ配列よりなる群から選択されたＤＮＡ配列を特徴とする。 図面の簡単な説明 第１図は電気泳動により分析したゲルフラクション１０〜１９からのｍＲＮＡ％ Ｍｘ”　ＢＡＬＢ−Ａ、２Ｇ−ｍｘ細胞（＋）からの未分画ｍＲＮＡおよびＭｘ −ＢＡＬＢ／ｃ細胞（−）からの未分画ｍＲＮＡの免疫沈澱された翻訳生成物の 放射能写ス図を示しく詳細については実施例１参照）、第２Ａ図はｐＭｘ３４ｃ ＤＮＡ挿入物の制限地図を示し、第２Ｂ図はｐＭｘ３４ｃＤＮＡ挿入物のヌクレ オチド配列および対応のアミノ酸配列を示し、これらヌクレオチドの番号はＧｓ のストリングの後の第１ヌクレオチドから出発し、第２Ｃ図はネズミＭ　ｘ蛋白 のアミノ酸配列を示し、アミノ酸の番号は第１メチオニン残基から出発し、第２ Ｄ図はＭｘ−ＤＮＡをクローン化してｐＭｘ３４を生成させたベクターｐＨ０３ ２７を示し、クローン化はｃ、ＤＮＡがＳＶ４０早期プロモータから転写される ような方向性で５ｓｔＴ部位に挿入され、 第３図はｐ　Ｓ　Ｖ　２−　ｎ　ｅ　ｏ　（ａ）もしくはｐＳＶ２−ｎｅｏおよ びｐ　Ｍ　ｘ　３４プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（ｂ）により形質転換されたＧ４１ ８−耐性ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＭｘ特異性抗体による免疫螢光性を示し、ｐＭｘ３ ４で形質転換された細胞のみがその核内にＭｘ蛋白を含有し、 第４図はインフルエンザウィルス（ａ、ｂ）またはｖＳｖ（ｃ、ｄ）が感染した トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞の特異性抗体による免疫螢光性を示し、細胞 を組換Ｍｘ蛋白（ａ、Ｃ）の合成およびインフルエンザウィルス蛋白山）もしく はＶＳＶ　Ｇ蛋白（ｄｌの合成につき分析し、この図面は校内にＭｘ蛋白を有す る細胞がウィルス複製の徴候を示さないのに対し、殆んどまたは全＜Ｍｘ蛋白を 核内に持たない細胞がその細胞質中にウィルス蛋白ををすることを示し、第５図 はＩＦＮ処理したＭｘ’″およびＭｘ−細胞からのＲＮＡにおけるＭｘ特異性転 写物を示し、その際ポリソーム結合したｍＲＮＡのノーザンプロット（３μｇ） をｐ　Ｍ　ｘ３４挿入物の１．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩ制限断片にノ＼イブリッド化 させ、血清を含まない媒体（Ｃ）もしくは３００Ｕ／ｍｌのネズミＩＦＮ−α／ β（ＩＦＮ）のいずれかで処理したＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ　（Ｍｘ”）および Ｂ　、Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ（Ｍｘ−）胚芽細胞からｍＲＮＡを作成し、第６図は Ｍｘ　ｃＤＮＡに関するネズミゲノム配列のサウザン移動分析を示し、その際ネ ズミ肝臓ＤＮＡ試料（１０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼで切断し、０．８％ アガロースゲルで電気泳動にかけ、ニトロセ、ルロース膜へ移しかつＭｘ　ｃＤ ＮＡの（Ｐ”　）−放射能標識された断片でハイブリフト化させ、さらにＢＡＬ Ｂ−Ａ２Ｇ−ｍｘ　（＋）もしくはＢＡＬＢ／ｃ　（−）ネズミ（Ａ）からのＤ ＮＡをＭｘｃＤＮＡのヌクレオチド６５８〜２３１７に対応する断片或いはＭｘ 　ｃＤＮＡの１．０ｋｂ　ＢＡＭ　Ｈ１１部（Ｂ）　へハイブリッド化させ、異 なるネズミ種からのＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡ　（Ｃ）およびＨ４ｎｄｎ［−切断 ＤＮＡ　（Ｄ）をヌクレオチド６５８〜２３１７に対応するＭＸ　ＣＤＮＡの同 じ断片と比較した。 Ｍｘ蛋白以外のインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子も、下記する 方法を用いて動物細胞中へ導入することができる。この種の他の蛋白は２’、５ ’オリゴアデニレートシンセターゼ〔バグリオニ、セル、１１７−１！、第２５ ５頁（１９７９）；バグリオ二等、バイオケミストリー、第１８巻、第１７６５ −１７７０頁（１９７９））、蛋白キナーゼ〔ジャルビス等、セル、第１４巻、 第８７９〜８８７頁（１９７８））、グアノシン結合蛋白〔ディング等、ジャー ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻、第７７４６〜７７５０頁、 （１９８３））、）（ＬＡ　Ｉ型〔バシャム等、プロシーディング・ナショナル ・アカデミ−・サイエンス、第７９巻、第３２６５−３２６９頁（１９８２）； ヨシエ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第１３１ ６９〜１３１７２頁（１９８２））、β２−マイクログロブリンＣローザ等、Ｅ ＭＢＯＪ、、第２巻、８２３９頁（１９８３））　、並びにフィル等により分離 された他の蛋白〔ネイチャー、第３０１巻、第４３７〜４３９頁（１９８３）、 およびアンチバイラル・リサーチ、第３巻、第３０３−３１４頁（１９８３）） を包含する。 所望のインクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子は、一般に遺伝子が発 現制御配列に作用結合されている組換ＤＮＡ分子の１部として細胞中へ導入され る。インクフェロン誘発された蛋白をコードする遺伝子を含んだ組換ＤＮＡ分子 を宿主細胞中へ導入する方法は次の通りである：（ａｌ直接的微量注入〔ハマー 等、ネイチャー、第３１５巻、第６８０〜６８３頁（１９８５）； 山）ウィルスベクターの使用〔ムニオン等、ジャーナル・パイロロジー、第７巻 、第８１３〜８２０頁（１９７１））；（Ｃ１細胞−細胞融合、すなわち植換中 に包封された所定数の染色体の細胞に対する融合〔ホルニエール等、プロシーデ ィング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７４巻、第３１９〜３２３頁 （１９７７））； ＋ｄｌカルシウムーＤＮＡ錯体の微量沈澱物の細胞エンドシトシス〔バチエッチ およびグラハム、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第 ７４巻、第１５９０〜１５９４頁（１９７７）；マイトランドおよびマクドーガ ル、セル、第１１巻、第２３３〜２４１頁（１９７７）；ペリセル等、セル、第 １４巻、第１３３〜１４１頁（１９７８）；ビグシー等、セル、第１４巻、第７ ２５〜７３１頁（１，９７８）；および１９８１年９月３日公開のＰＣＴ特許出 願公開第ＷＯ３１１０２４２６号参照〕　；（ｅ）ミニセル融合； （１１エレクトロポレーシヨン〔ノイマン等、ＥＭＢＯＪ、、第１巻、第８４１ 頁（１９８２））： ｆｇｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを有するリポソームとの融合〔フロシーおよびババハドゴプ ール、マイクロバイオロジー・アンド・イミュノロジー、第９６巻、第１７１〜 １９１頁（１９８２）におけるカレントトピックス〕　； （ｈｌプラスミドＤＮＡを有する細面性原形質との融合〔ショフナー、プロシー ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第２１６３−２１ ６７頁（１９８０）；ラスールザデガン等、ネイチャー、第２９５巻、第２５７ 〜２５９頁（１９８２））。 上記技術のいずれか１つの使用は、たとえば情報挿入の効率、ＤＮＡの特定の性 質もしくは情報に関する選択性、ＤＮＡ断片の許容寸法などの各種の因子に依存 する。 カルシウム−ＤＮＡ錯体の微量沈澱物を用いる場合、選択標識を有する遺伝子を 含め複数の無関係な遺伝子を用いることができ、かつ共存結合していないＤＮＡ の混合物をコンプレツシヨンによって導入することができ、すなわちＤＮＡの種 々異なる断片がしばしば同時に感受性細胞中へ入る。したがって、選択標識を有 するような細胞は、導入することが望ましい遺伝子（たとえば、ＭＸ蛋白の遺伝 子）の遺伝能力をも有すると思われる。 本発明を実施する際、所望の遺伝子は１細胞胚芽中へ導入されると思われる〔た とえばハマー等、上記〕、これは微量注入によるトランスゲニックウサギ、羊お よび豚の生産につき記載している。さらに、動物中への胚芽の発生は、好ましく は他の雌動物（養母）中への移動によって容易化される。 しかしながら、所望の遺伝子は他の組織の細胞、たとえば骨髄細胞、肝臓細胞お よび腸粘膜の細胞にも導入することができる〔米国特許第４，４９７，７９６号 〕。さらに、所望の遺伝子は呼吸器官の細胞にも導入することができる。 インクフェロン誘発された蛋白のための遺伝子を動物中へ導入する一般的な目的 は、動物へ所望の蛋白（たとえば保護作用または他の幾つかの有利な作用を有す る蛋白）を付与することにある。しかしながら、本発明の方法は、適当な宿主（ たとえば動物細胞）を用いてインクフェロン誘発された蛋白を産業生産するのに も適用することができる。後者の目的で、当業者はベクターの発現制御配列に作 用結合された所望のＤＮＡ配列を有する発現ベクターによって適当な宿主を形質 転換基せ、この宿主を適当な増殖条件下で培養し、かつ培養物から所望のポリペ プチドを回収するという公知方法から選択することができる。好ましくは、宿主 細胞を静止期に達せしめた後、所望ポリペプチドを回収することができる。 本発明のポリペプチドは、ウィルス感染に対し細胞を保護する際に細胞内でこれ を発現させるのに有用である。しかしながら、ポリペプチドまたは他のインクフ ェロン誘発された蛋白は、たとえばヒトにおいて、これらがを劾であるインフル エンザおよび／または他のウィルスに対し予防および／または治療用途にてかっ ／またはこれらウィルス病の伝染を防止するため次のように施こすこともできる ：ｆａｔ呼吸器官（たとえば鼻の通路および／または肺）への噴霧、 （ト））注射、または （Ｃ１局部投与。 これらの用途の場合、たとえば無凹水（注射用もしくは鼻腔内用）のような慣用 の医薬上許容しうるキャリヤ、或いは皮膚病学上許容しうるクリームまたは軟膏 と配合される。好ましくは、ポリペプチドまたは他のインクフェロン誘発された 蛋白は凍結乾燥され（好ましくは、たとえばグリシンのような増量剤を用いて） 、かつ次いでたとえば無菌水のようなキャリヤにより使用前に再編成される。本 発明のポリペプチドまたはその他のインクフェロン誘発された蛋白は、１日１回 の投与で或いは分割投与（たとえば毎日４回）で投与することができる。正確な 投与量は処方医などの臨床医によって決定され、患者の種類、患者の年齢および 体重、患者の病状、処方された医薬に対する患者の反応、並びに患者における副 作用の観察に依存する。 本発明の好適具体例においては、抗インフルエンザに有効量のヒトＭｘ蛋白を、 この種の治療を必要とするヒトに対し予トδ的にまたは治療的に投与する。組１ ＤＮＡ法によるヒトＭｘ蛋白の製造については、後記実施例９に記載する。 以下の説明は、その後の研究または産業上の目的で有用なインクフェロン誘発さ れた蛋白を発現させかつ次いで分離するためのを用な指針とすることを！図する が、当業者は記載した多くの技術がインクフェロン誘発された蛋白の分離を所望 せずに、所望の生物学的作用（たとえば抗ウィルス作用）を生物内もしくは細胞 内で生せしめる目的でインクフエロン誘発された蛋白を発現させようとする場合 にも有益であることが判るであろう。 インクフエロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列をクローン化しかつ発現 させる際、広範な種類のベクターを使用することができる。これらは、たとえば 染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の断片よりなるベクター、たとえばＳ Ｖ４０の各種の公知誘導体、公知の細菌性プラスミド、たとえばｃｏ　ＩＥｌ、 ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９を含むイー・コリからのプラスミドおよびそ の誘導体、広範囲の宿主プラスミド（たとえばＲＰ４）、ファージＤＮＡ、たと えばファージλの多数の誘導体（たとえばＮＭ９８９）、並びにその他のＤＮＡ ファージ、たとえばＭ１３およびフィラメント状一本ｉｎ　Ｄ　Ｎ　Ａファージ 、酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドもしくはその誘導体、並びにプラス ミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクター、たとえばファージＤ ＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いるよう改変したプラスミドを包含する 。 それぞれ特異性クローン化もしくは発現ビークルには、各種の部位を選択してイ ンクフエロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列を挿入することができる。 これらの部位は一般にこれらを切断する利尿エンドヌクレアーゼによって命名さ れ、かつ当業者に充分認識されている。これらの部位へＤＮＡ配列を挿入して組 換ＤＮＡ分子を生成させる各種の方法も周知されている。これらは、たとえばｄ Ｇ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ、ｆ：端結合、直接的結合、合成リンカ−、エンド ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に続く結合またはＤＮＡポリメラ ーゼ、および適当な一本鎖雛型によるＤＮＡストランドの延長に続く結合などを 包含する。勿論、本発明に有用なりローン化もしくは発現ビークルは、選択した ＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を持たなくても良いこ とを了解すべきである。率ろ、ビークルは他の手段によって断片へ結合すること もできるであろう。 インクフェロン誘発された蛋白をコードするＤＮＡ配列の発現には、これらのＤ ＮＡ配列を発現ベクターにおける１種もしくはそれ以上の発現制御配列に作用結 合させる。選択したＤＮＡ配列をクローン化ビークル中へ挿入する前または後に 行ないうろこの種の作用結合により、発現制御配列は挿入されたＤＮＡ配列の発 現を制御しかつ促進することができる。 広範な種類の発現制御配列（作用結合した際にＤＮＡ配列の発現を制御する配列 ）の任意のものをこれらベクターに使用して、インクフェロン誘発された蛋白を コードするＤＮＡ配列を発現させることができる。この種の有用な発現制御配列 は、たとえばＳＶ４０の早期および後期プロモータ、上ａｃ系、土工上系、工人 旦もしくは工上工系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコ ート蛋白の制御領域。 ３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホ スファターゼのプロモータ（たとえばｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモー タ、並びに原核もしくは真核細胞またはそのウィルスおよび各種のその組合せの 遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列を包含する。哺乳動物細胞 においては、さらにデヒドロホレートレダクターゼをコードする単位へ遺伝子を 結合させ、かつ宿主である支那ハムスター卵細胞に対し選択することにより発現 単位を増殖させることも可能である。 ベクターまたは発現ビークル（特に本発明で使用される選択ＤＮＡ断片および発 現制御配列を挿入すべく選択される部位）は、たとえば特定の制限酵素に対し怒 受性の部位の個数、発現すべき蛋白の寸法、ベクター配列に対する開始コドンお よび停止コドンの相対的位置のような発現特性など各種の因子、並びに当業者に 認識されたその他多くの因子によって決定される。特定蛋白配列に対するベクタ ー、発現制御配列および挿入部位の選択はこれら因子のバランスによって決定さ れ、必ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは限らない。 本発明の好適具体例において、イー・コリにてＭｘ蛋白を発現させることを所望 する場合は、バタテリオファージλ（ＰＬ）から誘導された発現制御配列を用い 、これをＭｘｃＤＮＡに融合させて、原核配列の末端におけるＡＴＧをＭｘ配列 の第２コドンに隣接させる。 インタフェロン誘発された蛋白を発現させることを所望する場合は、次の異なる 種類のプロモータを使用することができる： （１１構成プロモータ； （２）　天然のインクフェロン依存性プロモータ（たとえばＭｘを天然で欠如す るか、またはこれを極めて弱く発現する動物）； （３）増大した発現割合を有するが、まだインクフェロン依存性（全ての動物に 対し）であるハイブリッドプロモータ〔ハイブリッドプロモータの説明について は、ライヤルス等、セル、第４１巻、第４９７〜５０７頁（１９８５）を参照す ることができる〕　；または （４）　インクフェロン以外の物質に依存するプロモータ。 ヒトを含む哺乳動物または鳥類の細胞にてＭｘ蛋白の発現を達成しようとする場 合は、好ましくはメクロチオニンプロモータを用いる。 次いで、発現制御配列に作用結合した所望の遺伝子を有する組換ＤＮＡ分子を用 いて広範な種類の適当な宿主を形質転換させ、これら宿主（形質転換体）が遺伝 子を発現しかつノλイブリフトＤＮＡによりコードされるインクフエロン誘発さ れたポリペプチドを生産することができる。さらに、この組換ＤＮＡ分子を用い て宿主を形質５．換させ、これによりこの宿主が複製に際しインクフェロン誘発 された蛋白をコードする遺伝子源としてさらに組換ＤＮＡ分子を生成するように することもできる。 動物細胞（たとえば上記したようにヒトを含む哺乳動物細胞または鳥類細胞）の 他、さらに組換ＤＮＡ分子およびインクフェロン誘発蛋白を生産するには広範な 種類の宿主が有用である。これらの宿主はたとえばイー・コリ、バチルスおよび ストレプトミセスのような細菌類、並びに酵母のような真菌類、並びに組織培養 の植物細胞を包含する。 上記用途に対する適当な宿主の選択は、当業者で認識された多くの因子によって 決定される。これらは、たとえば選択ベクターとの適合性、副生物の毒性、所望 ポリペプチドの回収容易性、発現特性、生物安全性およびコスト等を包含する。 特定の組換ＤＮＡ分子またはポリペプチドにつき、これらファクターのいずれか だけで宿主を完全に選択することはできない、寧ろ、これら因子をバランスさせ ねばならず、必ずしも全ての宿主が特定の組換ＤＮＡ分子の発現に対し同等に有 効でないことを認識すべきである。 クローン化もしくは発現ビークルの選択部位に挿入されるＤＮＡ配列は、所望ポ リペプチドをコードする実際の遺伝子の１部でないヌクレオチドを含んでも良く 、或いはこの蛋白のための全遺伝子の断片のみを含んでも良いことが了解されよ う、必要とされることは、どのＤＮＡ配列を用いても形質転換された宿主が所望 のインクフエロン誘発されたポリペプチドを生産することのみである。たとえば 、本発明の方法に使用されるＤＮＡ配列は、発現ベクターにおける同じ解読枠に て少なくとも１種の真核もしくは原核キャリヤ蛋白をコードするＤＮＡ配列また は少なくとも１種の真核もしくは原核信号配列をコードするＤＮＡ配列またはそ の組合せの１部に融合させることができる。この種の構成は所望ＤＮＡ配列の発 現に役立ち、宿主細胞からの所望ポリペプチドの精製を向上させまたはその分泌 および熟成を可能にする。或いは、ＤＮＡ配列をＡＴＧ開始コドンを単独で、ま たは所望ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする配列に直接融合された他のコ ドンと組合せて含むこともできる。この種の構成は、たとえばメチオニルまたは その他のペプチジルポリペプチドの生産を可能にする。次いで、このＮ−末端メ チオニンもしくはペプチドを各種の公知の方法により細胞内または細胞外で切断 し、或いはポリペプチドをメチオニンまたはこれに結合した他の融合体と共に使 用することもできる。 以下、限定はしないが実施例により本発明を説明する。 実施例 実施例１ 蛋白ＭｘをコードするｍＲＮＡの部分精製、対応Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃおよび 同系のＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘネネズからネズミ胚芽細胞を作成した〔ステへり 等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２ １〜１８２５頁（１９８５）、アルミハイターおよびステへり、アルチ・パイロ ロジー、第７６巻、第１２７頁（１９８３））。これらの細胞を、１０％胎児牛 血清を含をするジュルベッコの改変最小必須培地で培養した。これら細胞を３〜 ５回使用した。 融合性の細胞単層（約１０７個の細胞／　１５０　ｙ１皿）を、３００単位／ｍ ｌの部分精製されたネズミ■ＦＮ−α／β（１０７単位／■）を含有する血清を 含まない培地で３時間処理した〔トベイ等、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏ ｌ。 Ｍｅｄ、、第１４６巻、第８０９〜８１５頁（１９７４））。 コロンおよびバングにより実質的に記載されたようにしてポリソーム結合したｍ ＲＮＡを分離した〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、 第９２３４〜９２３７頁（１９８２））、ただし、ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡをフ ェノール／クロロホルムでの抽出によってさらに精製した。 ベセスダ・リサーチ・ラボラドリース社から入手したウサギ網状赤血球溶解物の インビトロ蛋白合成系において、製造業者の指針にしたがいｍＲＮＡを翻訳した 。放射能活性アミノ酸としてＳ２５メチオニン（１２００Ｃｉ／ミリモル；２ｐ ｃｉ／μｆｆ）を用いて１０．ｃｏｇ／ｍｌのｍＲＮＡを１８μβの反応物で翻 訳した。このｍＲＮＡを部分精製するため、Ｍｘ＋胚芽細胞から得られた６　０ 　ｐ　ｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡを寸法分画し、メチル水銀−ヒドロキシアガロ ースでの電気泳動により１０００　Ｕ／ｍｌのｍｕ−ＩＦＮ　ｃｔ／βで次のよ うに３時間処理した： ６０μｇのポリ　（Ａ）′″ＲＮＡをＩＦＮ−処理されたＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍ ｘ胚芽細胞からエタノールで沈澱させ、２０ミリモルのメチル−ＨｇＯＨを含有 する６０μｌの０．５×電気泳動緩衝液（５０ミリモルのｌａ酸と５ミリモルの 硼酸ナトリウムと１０ミリモルの硫酸ナトリウムと１ミリモルのＥＤＴＡを含有 ）に熔解させ、５０“Ｃにて５分間培養し、３Ｃ１１１Ｘ０．２ＣＩ１１のスロ フトに充填し、かつ６ミリモルのメチル−ＨｇＯＨを含有する電気泳動緩衝液に てＬＧＴ　（低ゲル化温度）アガロース（ＦＭＣコーポレーション社）の１２％ ゲルに対し’ｆＥ−ｆｉ液で電気泳動にかけ、これについてはベイソーおよびダ ビッドソンによりアナリチカル・バイオケミストリー、第７０巻、第７５頁（１ ９７６）に記載されている０次いで、このゲルを０．２モルの酢酸アンモニウム と２０ミリモルの２−メルカプトエタノールとの溶液中に１０分間浸漬し、次い でこれを４０枚の寸法２ｍｌのスライスに切断した。ｍＲＮＡを１固々のゲルフ ラクション力）ら抽出し、そのＰＨ固々のアガローススライスを６５℃にて３分 間溶解させ、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、かつエタノールでの沈澱 により個々のゲルフラクションからｍＲＮＡを回収した。個々のゲルフラクショ ン（１０〜１９）のｍＲＮＡの１部またはＩＦＮ−処理されたＭｘ”　ＢＡＬＢ −Ａ２Ｇ−ｍｘ細胞（＋）もしくはＭｘ−ＢＡＬＢ／ｃ細胞（−）のいずれかか らの未分画ｍＲ，ＮＡ１００μｇを、放射能活性アミノ酸として３３ｇメチオニ ンを用いることにより、網状赤血球溶解物のインビトロ蛋白合成系で翻訳した。 ６μｌの各翻訳生成物を４３μｌのＰＢＳで希釈し、Ｍｘ蛋白に対する抗体を含 をする１μ！のネズミ高免疫血清〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））を添加し、 かつこの混合物を４　’ｃにて２時間培養した。抗体を蛋白Ａ−セファローズで 回収し、免疫沈澱した蛋白をステへり等によりジャーナル・バイオロジカル・ケ ミストリー、第２６０ｔ−１第１８２１−１８２５頁（１９８５）に記載された ように８％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（頂部から底部への電 気泳動）によって分析し、さらに放射能写夏によって可視化させた。長さ約３ｋ ｂのｍＲＮＡを有するゲルフラクションは、蛋白ＭｘをコードするｍＲＮＡを含 有した（第１図）。 Ｍｘ　ｍＲＮＡ活性が１０〜２０倍？Ｅ縮された０、５／ｊｇのポリ（Ａ）”　 ｍＲＮＡフラクションを使用して、オカヤマおよびベルクの方法〔モレキュラ・ セルラー・バイオロジー、第２巻、第１６１〜１７０頁（１９８２））にしたが い、ベクター処理されたｃＤＮＡ合成を行なったが、その際ｐＫ　ＣＲ〔オーハ レ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７ ８巻、第１０５２７〜３１頁（１９８１））から誘導したクローン化ベクターｐ ＨＧ３２７を用い、３ｓｔｌリンカをｐＫＣＲの独特なりａｍＨ１部位に挿入し てＢａｍＨ１部位を再生させ、リンカに整列させた。 ＳＳｔ■部位におけるクローン化を行なうことにより、クローン化した配列およ び１３ａｍＨＩの便利な切断を可能にした。 得られたハイブリッドプラスミドを用いて、ハナハンの方法〔ジャーナル・モレ キュラー・バイオロジー、第１６６巻、第５５７〜５８０頁（１９８３））によ りイー・コリ菌株ＤＨ−１細胞を形質転換させた。１ｇのＲＮＡは約２Ｘ１０’ の形質転換体を発生した。 Ｍｘ″特異性のｃ　ＤＮＡ挿入物を存する組換プラスミドを同定するため、Ｍｘ 部位の対立遺伝子が相違し〔ステへり等、パイロロジー、第１３２巻、第４５６ 頁（１９８４））かつその結果として蛋白Ｍｘを合成する能力が相違する同系ネ ズミ種Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃおよびＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘを利用した（Ｂａ ｌｂ／ｃ種はＭｘ−であり、Ｍｘ蛋白を蓄積しない）〔ステへり等、ジャーナル ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁（１９ ８５）；ホリスベルガー、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ ンス、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３））。 Ｍｘ−同系ネズミのＩＦＮ−処理された細胞におけるｍＲＮＡ複合体は蛋白Ｍｘ をコードするｍＲＮＡ以外には殆んど同一であると仮定して、コロニーハイブリ ッド化の差〔セント・プローブ、セル、第１６巻、第４４３頁（１９７９）ｉヘ イジメーカー、ジーン、第８巻、第３９１頁（１９８０））によりｃ　ＤＮＡ保 存物をスクリーニングした。ハイブリッド化プローブとして、未分画でな（寸法 分画された（約長さ３ｋｂ）のＩＦＮ処理されたＢＡ、ＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞 またはＩＦＮ処理されたＢ　Ａ、　Ｌ　Ｂ　／　ｃ細胞のいずれがのｍＲＮＡが ら作成・コリＤＨ−１（直径９０のプレート当り５００１固）を、１００μｇ／ ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で増殖させた。タウブおよびトンプソン の方法〔アナリチカル・バイオケミストリー、第１２Ｅｉ！、第２２２〜２３０ 頁（１９８２）　）によりコロニーハイプリント化のためのフィルタを作成した ０選択されたメチル−ＨｇＯＨアガロースゲルフラクションから回収したｍ　Ｒ Ｎ　Ａの逆転写用のプライマとして、オリゴｄＴを用いることによりｐ３２放射 能標識したｃＤＮＡ　（２ｘ　１０’　ｃ　ｐｍ／ｐｇ　ＲＮＡ）を作成した。 「＝」プローブを作成するためＩＦＮ処理されたＢＡＬＢ／Ｃ胚芽細胞からのｍ 　ＲＮ　Ａを使用し、「＋」プローブを作成するためＩＦＮ処理された同系ＢＡ ＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ胚芽細胞からのｍＲＮＡを使用した。先ず最初にフィルタを 「−」プローブにハイブリッド化させた。放射能写真の後、ハイプリント化プロ ーブを、０．５Ｍ　ＮａＯＨで室温にて５分間培養しかつ０．５　Ｍ　トリス− ＭＣＩ（ｐＨ８）で中和することによりフィルタから洗浄した０次いで、これら フィルタを「＋」プローブにバイブリソ、ド化させた。ハイブリッド化は、１５ ０ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ５）と０．７５ＭのＮａＣ１と５ｍＭのＥＤＴＡ と０．２％のＳＤＳと０．０２％の生血清アルブミンと０．０２％のポリビニル ピロリドンと０．０２％のフィコールと０．２■／ｍ＋の鮭楕子ＤＮＡとを含有 する溶液中にて５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍ＋で６５℃にて１４時間行なった。これら フィルタを０．２　ｘＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣ１および０．０１５ 　Ｍクエン酸ナトリウムである）および０．２％ＳＤＳの溶液にて６５℃で洗浄 し、かつフィルタをフジＲＸフィルムに一７０℃にて強化スクリーンを介して露 出させた。「＋」プローブにハイブリッド化するが「−」プローブにはハイブリ ッド化しないコロニーを釣り上げて再クローン化した。 分析した１０．０００種のクローンのうち、ＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞からの ｃＤＮＡに強力にハイブリッド化するがＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ細胞からのｃＤ ＮＡには検出可能にハイブリッド化しない２種のコロニーを同定した。これら２ 種のコロニーの刷出したｃＤＮＡ挿入物は互いにハイブリッド化し、このことは これらが思らく同じｍＲＮＡ種類から誘導されたことを示している。大きい方の クローン（ｐＭｘ５）の挿入物は長さ約１ｋｂであった。これはＩＦＮ処理され たＢＡＬＢ・Ａ　２　Ｇ　−Ｍ　ｘ細胞のｍＲＮＡに対しハイブリッド化したが 、Ｍｘ　ｃＤＮＡにつき予想されるように未処理比較細胞のｍＲＮＡにはハイブ リッド化しなかった。 さらに、このｃＤＮＡを次のようなハイブリッド化翻訳分析により同定した：ｍ Ｍｘ５プラスミドＤＮＡもしくはベクターＤＮＡをニトロセルロースフィルタに 結合させ、かつＩＦＮ処理されたＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−Ｍｘ細胞のポリ（Ａ）”Ｒ ＮＡにハイブリッド化させた。ｐＭｘ５ＤＮＡを固定したがベクターＤＮＡを固 定せず、Ｍｘ蛋白をコードするｍＲＮＡを効率的に結合し、これは変性条件下で フィルタから遊離されたＲＮＡをインビトロで翻訳しかつこの生成物を免疫沈澱 およびゲル電気泳動により分析して示した。かくして、ｐＭｘ５は思ら（Ｍ　ｘ 蛋白をコードするＭｘＲＮＡに対し相補的なｃＤＮＡを含有すると結論された。 この結論に対する明確な証明は、下記するような形質転換実験によって得られた 。 予備的なノーザン形質転換分析を次のように行なった：上記したようなメチル− ＨｇＯＨアガロースにより３μｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを電気泳動にかけた 。電気泳動後、ゲルを０．２Ｍの酢酸アンモニウムと２０ｍＭの２−メルカプト エタノールに１５分間浸漬し、水で１０分間洗浄し、かつＲＮＡを２０ＸＳＳＣ によりニトロセルロース膜へ移した〔トーマス、プロシーディング・ナショナル ・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第５２０１〜５２０５頁（１９８０）） 、この膜を８０℃にて減圧下に２時間焼成し、かつ２０ｍＭのＰｉｐｅｓ　（ｐ Ｈ６，４）と５ｘｓｓｃと５０％のホルムアミドと０．２■／ＩＩ＋１の鮭楕子 ＤＮＡと０．１％のＳＤＳと０．０４％の牛血清アルブミンと０．０４％のポリ ビニルピロリドンと０．０４％のフィコールとよりなる溶液中で４２℃にて６時 間予備ハイブリッド化した。ニック翻訳により２　ｘ　１０”　ｃ　ｐｍ／μｇ の比活性まで放射能標識したＭｘ　ｃＤＮＡの制限断片２×１０　’　ｃ　ｐ　 ｍ／ｍｌにて同じ緩衝中で４２℃にて１８時間ハイブリッド化した０次いで、こ の膜をＩ　Ｘ５ＳＣと０．１％のＳＤＳとで５０℃にて洗浄し、かつ−７０℃に て放射能写真にかけた。この分析は、ＲＮＡにおける全長ＭＸが長さ約３．５ｋ ｂであり、ｐＭｘ５のｃＤＮＡ挿入物よりもずっと長いことを示した。したがっ て、全長Ｍｘ　ｃＤＮＡの分離を行なった。 全長Ｍｘ　ｃＤＮＡクローンを分離するため、ｃＤＮＡ保存物（全部で約１０， ０００種の独立した形質転換体を有する４つのバッチ）を液体培養で増殖させた 。形質転換したイー・コリＤＨ−１（培地１１当り２．５Ｘ１０’）を、１００ μｇ／＋ｏｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地にて静止期まで増殖させた。こ れら培養物から作成したプラスミドは、室温にて１０分間にわたりｐＨ１２，４ で処理し、次いでトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）での再生とフェノール抽出とエ タノール沈澱とによりスーパーコイル型につき濃縮した９次いで、このＤＮＡを ＬＧＴアガロースの０．８％ゲルにより電気泳動にかけ、約２０００ｂｐより大 きくかつ約５ｏｏｏｂｐまでの挿入物を有するプラスミド（適当な比較と対比し た移動から推定）を分離し、かつこれを使用してイー・コリＤＨ−１を形質転換 させた。コロニーハイブリッド化用のフィルタを作成し〔タウブおよびトンプソ ン、アナリチカル・バイオケミストリー、第１２６巻、第２２２〜２３０頁（１ ９Ｂ２））、かつｐ　Ｍ　ｘ５のニック翻訳され、Ｐ″２放射能標識された（１ ０”ｃｐｍ／μｇ）挿入物へハイブリッド化させた。ハイブリッド化および洗浄 の条件は上記と同様である。陽性クローンを釣り上げかけ再クローン化した。 約２００，０００　ｆｔのアンピシリン耐性コロニーを、ｐＭｘ　５のニック翻 訳挿入物に対するハイブリッド化によって分析した。 ２００．０００　［のコロニーのうち約１％が陽性のハイブリッド化信号を与え た。さらに、任意に選択した４８種のクローンを特性化した。全クロー、ンの挿 入物は、ポリＡから上流の約ｌｋｂに位置する単一のＢａｍＨＩ部位を有した。 １種のクローンの挿入物は長さ３．３　ｋｂ　（ｐＭｘ３４）であり、１２種の クローン（ｐＭｘ４１を含む）は２．５〜２．８　ｋ　ｂの挿入物を有し、かつ 残余のクローンは２．５　ｋ　ｂより短い挿入物を有した。９ＭＸ３４およびｐ Ｍｘ４１については実施例２に記載するように詳細に特性化した。 さらに、イー・コリＤＳ−１０にてネズミＭｘ蛋白を発現させるため、完全な作 成を行なった。先ず最初にＴｒｐプロモータをＭｘコード配列に融合させて、Ａ ＵＧコドンに末端整列させた。イー・コリＤＳ−１０を得られた組換ＤＮＡ分子 で形質転換させ、かつこの形質転換体を３０℃にて増殖させた０次いで、形質転 換体をリゾチームで破壊しかつ解凍した。破壊した細菌を遠心分離した後、上澄 液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いで推定のＭｘ蛋白を 膜フィルタに移した。次いで、蛋白含有の膜をＭｘに対するネズミ抗体と共に培 養した。Ｓ−ペルオキシダーゼ酵素に結合した山羊抗−ネズミ抗体を用いて、抗 原−抗原複合体を検出し、したがって７２．０００〜７５，０００ダルトンのバ ンドはネズミＭｘ蛋白として陽性であると同定された。 実施例１に記載したように得られた制限断片をポリヌクレオチドキナーゼにより ５’　（Ｐ”　’　）標識するか、或いはクレノーＤＮＡポリメラーゼによりま たは末端トランスフェラーゼにより、放射能標識されたジデオキシ−ＡＴＰを用 いて３′（Ｐ”　’　）−標識し、かつマキサムおよびギルバートの方法〔プロ シーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス。 ＵＳＡ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７））にしたがい配列決定した 。 ｐＭｘ３４のｃＤＮＡ挿入物における制限地図およびヌクレオチド配列を第２区 に示す。ヘテロポリマ配列は３２１８個のヌクレオチドからなり、かつ１２＠固 のＧ残基が存在し、次いで約８０個のＡ残基が存在した。番号付けはＧｓのスト リングに続く最初のヌクレオチドから出発した。ヌクレオチド２１４における最 初のＡ、　Ｔ　Ｇから位置２１０７におけるＴ　Ａ　Ａ　停止コドンまで存在す る開放解読枠は、６３１個のアミノ酸を有する蛋白をコードする。最初のＡＴＣ コドンの上流における配列は３個の解読枠の全ての翻訳停止信号を含み、このこ とはｐＭｘ３４がＭｘ　ｃＤＮＡの完全なコード化領域を有しかつ次のＡＴＧコ ドンが位置８０２に位置するため位置２１４におけるＡ、　Ｔ　Ｇで翻訳が開始 すると思われることを示している。Ｍｘ　ｃＤＮＡコード化配列に続いて１１０ ８ｂｐの３′−非翻訳領域が存在し、この領域は位置３１９９における一致した ポリＡ付加信号Ａ　、６．、　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａを含有する。 プラスミドｐＭｘ　３４を含有するイー・コリ　（イー・コリＤＨ−１／ｐＭｘ ３４と命名する）を１９８５年７月３０日付けでアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションに寄託し、ＡＴＣＣ嵐５３２０７が付与された。 逆転写酵素のエラーおよびその他のクローン化の間違いを最小化するため、ｐＭ ｘ３４とは無関係に生じたｐ　Ｍ　ｘ　４１のヌクレオチド配列を決定した。ｐ Ｍｘ４１の２６５０ｂｐ挿入物は、Ｍｘ゛特異性ｍＲＮＡの不完全コピーであっ た。 ｐＭｘ４１の配列はｐ　Ｍ　ｘ　３４のヌクレオチド６５８〜３２１８に対応し 、１個のヌクレオチドの相違もなかった。 蛋白Ｍｘの予想アミノ酸配列を第２Ｂ図に示す。番号付けは、配列の最初のメチ オニンから出発する。主たるＭｘ！Ｉｌ訳生成物は６３１個のアミノ酸残基より なり、７２，０３７の分子量を有する。 ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定したＭＸ、蛋白は、６３１個のア ミノ酸から構成される。Ｍｘ蛋白の計算分子！７２，０３７を実験値７２，５０ ０　Ｃホリスベルガー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ ンス、第８０巻、第１９１０〜１９１４頁（１９８３）　）　、７５．０００　 （ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１ ８２１−１８２５頁（１９８５））および７８　、０００〔ホリスベルガー等、 ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１７３０−１７３ ３頁（１９８５））と比較することができ、これらは天然Ｍｘ蛋白の５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により推定された。 驚くことに、Ｍｘ蛋白は帯電アミノ酸が極めて多い幾つかの領域を有し、たとえ ば位置７６〜８９のセグメントは３（固の陰帯電したアミノ酸と６個の陽帯電し たアミノ酸とを存し、位置９３〜１０７のセグメントは８個の陰帯電した残基を 有し、また位置５１１〜５２２の断片は１個のアミノ酸を除いて交互に塩基性と 酸性との残基で構成される。４０個のカルボキシ末端残基は２６個の親水性残基 を含み、そのうち２０個が帯電している。位置６０６〜６１４のセグメントは７ （固の塩基性アミノ酸で構成される。陽帯電した領域は、核酸のような陰帯電し た細胞成分と相互作用する。 親水性範囲の幾つかは酸性残基の緻密な列で構成され、成るものは交互に塩基性 および酸性であり、また成るものは主として塩基性残基、特に配列Ａｒｇ−Ｇｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ”Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ’ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇをカ ルボキシ末端の近傍に有する。（カルボキシ近位）の塩基性アミノ酸の範囲Ｐｒ ｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原 の核位面になると思われる〔カルゾロン等、セル、第３９巻、第４９９−５０９ 頁（１９８４＞）。 Ｍｘ蛋白の予想配列と４．ｏｏｏ＋ｆｆｉ以上の公知蛋白配列とのコンピュータ による比較では、インフルエンザウィルス蛋白とＭｘ蛋白との間に顕著な相同性 を検出しなかった。 Ｓ　Ｖ　４．０早期プロモータに対する相対的位置およびプラスミドｐＭｘ、３ ４におけるＭｘ　ｃＤＮＡの方向性は、真核細胞におけるその発現の試験を可能 にする。５ｘ１ｏ’個のＮＩＨ３Ｔ３ネズミ細胞を、１０％の胎児牛血清を含有 するジュルベソコの改変最小必須培地にて直径９０１１の皿で１８時間培養した ０次いで、１０ｍ１の新鮮な培地を添加し、その４時間後に２０部ｇの燐酸カル シウム沈澱したＤＮＡを添加した。１部ｇのｐＳＶ２−ｎｅｏ　（サウザンおよ びベルク、ジャーナル・モＩ／キュラ・アプライド・ゲネチフクス、第１巻、第 ３２７〜３４１頁（１９８２））プラスミドＤＮＡと、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ の肝臓から得られた２０部ｇの高分子量キャリヤＤＮＡとを用い、或いは１．ｃ ＋ｇのｐｓＶ２−ｎｅｏと２０部ｇのＳ；ｌｉ＋−線状ｐＭｘ　３４プラスミド ＤＮＡとを用いて、ウィグラ等の方法〔プロシーディング・ナショナル・アカデ ミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７７巻、第３５６７−３５７０頁（１９７９）） にしたがいＤＮＡ沈澱物を作成した。混合物を３７℃にて２０時間維持した後、 ＤＮＡ含を培地を新たな培地と交換し、かつこれら細胞を２４時間増殖させた。 次いで、これらをトリプシン処理しかつ１：８の分割比にて新たなプレートに接 種した。２４時間後に培地を１■／徊１の０４１８（ゲネチシン、ギブコ社）を 含有する培地と交換し、この培地を２〜３日毎に交換した。耐性クローン（プレ ート１枚当り５０〜１００個）が２週間後に出現した。これら細胞に、ｐＳＶ２ −ｎｅｏプラスミドＤＮＡ　（形質転換細胞には薬剤０４１８に対する耐性を付 与）の１部と線状化したＩＩ）　Ｍ　Ｘ　３４プラスミドＤＮＡの２０部もしく はキャリヤＤＮＡの２０部とによってトランスフェクトさせた。これらの細胞を 、１■／ｍｌのネオマイシン同族体Ｇ４１８（ギブコ社）が補充された培地に保 った。 ０４１８耐性を発現する永久トランスフェクトされた細胞を選択し、単一クロー ンを分離することなく各プレートのＧ４１８耐性細胞を保存した。免疫螢光分析 を用いて、約１００種の個々の０４１８耐性の形質転換体につき蛋白Ｍｘを合成 する性質を示す保存物の能力を分析した。 Ｇ４．１８Ｍ性細胞をガラスカバースリップ上にて２０時間増殖させ、ＰＢＳで 洗浄し、３％バラホルムアルデヒドで２５℃にて１０分間固定し、かつ０．５％ トリトンＸ−１００で５分間透過性にした。Ｍｘ蛋白を検出するため、固定され かつ透過性にした細胞を、Ｍｘ蛋白にりＪする抗体を有する０、４％ネネズ高免 疫血清と共に、５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳ中にて１５分間培養した〔 ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８ ２１〜１８２５頁（１９８５））、結合した抗体を示すため、ガラスカバースリ ップ上 ＩｇＧＣノルジツク社）と共に２５゛ｃにて１５分間培養し、５％正常山羊血清 を含有するＰＢＳ虫で１：５０に希釈し、ＰＢＳで洗浄しかつ５．０ｍＭトリス −ＨＣ１（ｐ）１８．６　）および５０％グリセリン中に入れた。ライヘルド− ユング・ポリバール顕微鏡を用いて、紫外線入射光の螢光顕微鏡分析のために用 いた。 原Ｍｘ＝３Ｔ３ネズミ細胞、およびＭＸ　ＣＤＮＡでなくｐＳＶ２−ｎｅｏプラ スミドでトランスフェクトされた３Ｔ３細胞は、これらがＩＦＮで処理されてい てもいな（でも蛋白Ｍｘを合成することができなかった（第３Ａ図および第４図 ）、これに対し、Ｍｘ　ｃＤＮＡでトランスフェクトされた３Ｔ３細胞の高比率 はＭｘ蛋白を合成した。Ｍｘ　ｃＤＮＡはＳＶ４０早期プロモータの制御下で発 現されたので、組換Ｍｘ蛋白はトランスフェクトされた細胞内で構成的に合成さ れ、ＩＦＨによる誘発を必要としなかった。ＩＦＮ処理されたＭｘ＋細胞におけ る天然蛋白と同様に、組換蛋白Ｍｘはトランスフェクトされた３Ｔ３細胞の核中 に蓄積した（第３Ｂ図）、プレート３４／６から生ずるトランスフェクトされた 細胞の約３０％がＭｘ蛋白を合成した（第３Ｂ図）。 ＩＦＮによる処理は、トランスフェクトされた細胞におけるＭｘ蛋白発現に対し 検出可能に影響を与えなかった。形質転換細胞においてＭｘ蛋白はＳＶ４０早期 プロモータの制御下で構成的に転写されるので、これはＭｘ遺伝子の発現が単に 転写制御の下に置かれる限り予想された結果である０個々の細胞におけるＭｘ蛋 白発現のレベルは変化することができた。トランスフェクトされた細胞の少数は 、１０００　Ｕ１０＋１のＩＦＮ−α／βで１８時間処理した充分誘発されたＭ ｘ”胚芽細胞と同程度のＭｘ蛋白（免疫螢光染色により測定）を含をしたのに対 し、Ｍｘ蛋白発現性３Ｔ３細胞の大半は低濃度のＭｘ蛋白を含有した０組換およ び天然Ｍｘ蛋白は３［の異なる特異性モノクローナル抗体との反応性において区 別することができず、かつウェスタンプロットにおいてこれらは同じ見掛は分子 量を有した。 保存物３４／６の細胞を、０４１８含有の培地中で３ケ月以上増殖させた。この 期間の後、蛋白Ｍｘ発現性細胞の個数並びに相対的発現レベル（免疫螢光分析に より測定）は比較的一定に留まり、これは蛋白Ｍｘが細胞増殖を阻害しなかった ことを示している。希釈を制限することにより、蛋白Ｍｘ−生産性３Ｔ３細胞を クローン化した。２サイクルのクローン化および増殖の後、約９５％の蛋白Ｍｘ 生産性細胞を存する培養物を得たが、これら培養物はまだ非生産性細胞を含有し 、培養物３４／６におけると同様に個々の細胞の蛋白Ｍｘ発現レベルは均一でな く、このことはトランスフェクト細胞におけるＭｘ蛋白合成の錯体調整を示唆し ている。 ガラスカバースリップ上のトランスフェクトされた３４／６細胞の培養物に、イ ンフルエンザＡウィルスの菌株ＦＰＶ−Ｂ或いは比較実験として小水胞性口内炎 ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）のインディアナ株を感染させた。１ｍｌ当り約１０’個 のプラーク形成単位（ＰＦＵ）までＮＩＨ３Ｔ３細胞上で増殖させたプラーク精 製したウィルスから各ウィルスを作成した。これら細胞をいずれかのウィルスに より、２％ＦＣ３（胎児牛血清）を含有する培地で１細胞当りｌ０ＰＦＵの倍率 にて室温で３時間感染させた０次いで、これらの細胞を培地で２回洗浄し、２％ ＦＣ３を含有する培地中で３７℃にて３〜４時間培養した。これらの条件下で、 ＮＩＨ３Ｔ３比較細胞培養物の個々の細胞の９８％は、特異性抗ウイルス抗体で の免疫螢光分析で分析した際、陽性となった。細胞を室温にて３％パラホルムア ルデヒドにより１０分間固定し、かつこれらを０．１％トリトンＸ−１００によ り５分間透過性にした。Ｍｘ蛋白とウィルス蛋白（すなわち、どのウィルスを感 染用に使用するかに応じてインフルエンザウィルス蛋白もしくはＶＳｖＧ蛋白） を同時に監視するため、固定されかつ透過性にした細胞をＭｘ蛋白に指向される ネズミ抗体とウィルス蛋白（インフルエンザもしくはＶＳＶ）に対するウサギ抗 体との混合物で処理した。０．４％のＭｘ蛋白に対する抗体を含有するネズミ高 免疫血清〔ステへり等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０ 巻、第１８２１〜１８２５頁（１９８５））と、０．２％のインフルエンザウィ ルスに対するウサギ抗血清と、２．５％のｖｓｖ　ｃ蛋白に対するウサギ抗血清 〔アルンハイター等、セル、第３９巻、第９９−１０９頁（１９８４））とを使 用した。これら抗血清を、５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳで希釈した。こ れら抗体を有する混合物を２５℃にて１５分間培養した。Ｍｘ蛋白に結合した抗 体を可視化させるため、ローダミン結合した山羊抗−ネズミ抗体（ノルジツク社 ）を使用した。ウィルス蛋白に結合−ウサギ抗体（ツルジンク社）を使用した。 培養物をこれら標識された抗体に対し５％の正常山羊血清を含有するＰＢＳ中２ ％にて室温で１０分間反応させた。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、これらを ５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，６）と５０％のグリセリンとに入れ、かつ 個々の細胞をＵＶ入射光螢光顕微鏡分析によりローダミン−およびフルオレシン −特異性螢光の両者につき分析した。このように免疫螢光技術を用いて、個々の 細胞を蛋白Ｍｘを合成する能力と同時にインフルエンザウィルス蛋白の合成につ き分析することができた。第４図に示す通り、フルオレシン核によって証明され るようにＭｘを生産した細胞（第４ａ図）はインフルエンザ特異性蛋白を含有し なかった（第４ｂ図）、インフルエンザ特異性蛋白を生産する細胞はＭｘ陰性で ある。 かくして、組換Ｍｘ蛋白を含有するトランスフェクト細胞はインフルエンザウィ ルス蛋白の合成を可能にしなかったのに対し、Ｍ！蛋白を欠如する細胞はインフ ルエンザウィルスＦＰＶ−Ｂに対し感受性であった（第４ａ図および第４ｂ図） 。 Ｍｘ蛋白発現性細胞はインフルエンザウィルスに対し選択的に保護された。Ｍｘ 蛋白を欠如する細胞とＭｘ蛋白を含有する細胞との両者は、ローダミンｖＳｖに 対し完全に感受性であった（第４Ｃ図および第４ｄ図）０個々の細胞のインフル エンザウィルスに対する耐性程度は可変であった。高濃度のＭｘ蛋白を有する細 胞は充分保護されたのに対し、低濃度のＭｘ蛋白しか含有しない細胞は小程度し か保護されなかった。 Ｍｘ蛋白と１細胞当り１０プラ一ク形成単位の倍率にてインフルエンザＡウィル スＦＰＶ−Ｂで感染された７４６個の個々の３４／６１［１胞のインフルエンザ ウィルス蛋白の相対量を記録した。３７℃にて３時間後、免疫螢光分析により各 細胞を、Ｍｘ蛋白およびインフルエンザウィルス蛋白の高生産体、恒生産体また は非生産体のそれぞれとして分類した。第１表は多量のＭＸ蛋白を合成した細胞 の１００％がインフルエンザウィルスに対し耐性であったことを示している。 第１表 トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＭｘ蛋白の合成とインフルエ ンザウィルスの阻止と多量　０　０　３６ 少量　２４　５４　７６ 検出できず　３８５　１６２　９ 殆んどＭｘ蛋白を生産しなかった細胞の約５０％はインフルエンザウィルスに対 する特異性抗体で染色可能であったのに対し、検出可能量のＭＸ蛋白を含有しな かった細胞の９８％はインフルエンザウィルス陽性であった。 同一の培養において、高レベルのＭｘを発現する細胞がインフルエンザウィルス に対し耐性であるのに対し、Ｍｘ蛋白を欠如する細胞は充分感受性であることを 示すことにより、クローン化配列がＭｘ１９能をコードすることを証明した。Ｍ ｘ蛋白がＩＦＮの添加なしにその抗ウィルス活性を発揮しうるかどうかの質問に ついては、ｙｅｓと答えられる。ＩＦＮ誘発されたＭｘ４″細胞と同様なレベル にてＭｘ蛋白を発現したＭｘ　ｃＤＮＡ形質転換３Ｔ３細胞は、ＩＦＮを添加し なくてもインフルエンザウィルス感染に対し耐性であった。 かくして、予想外に、Ｍｘの存在はＩＦＮ処理がなくてもインフルエンザウィル ス感染に対し細胞を保護するのに充分である。しかしながら、天然のＭｘ細胞は 、ＩＦＮで処理された後にのみインフルエンザウィルスに対し耐性を発生す、る 。 実施例５ Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃまたは同系ＢＡＬＢ・Ａ２Ｇ−Ｍｘネネズの細胞を、血 清を含有しない培地または３００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−α／βを含有する培地で３ 時間処理して、ポリソーム結合したポリ　（Ａ）“ＲＮＡを作成した。各調製物 のｍＲＮＡ３μｇをメチル水銀ヒドロキシル−アガロースゲルで電気泳動しくベ イリーおよびダビソドソン、アナリチカル・バイオケミストリー、第７０巻、第 ７５頁（１９７６））、ｍＲＮＡをニトロセルロース膜へ移し、次いでこのｍＲ ＮＡを放射能標識されたＭｘ　ｃＤＮＡプローブにハイブリッド化させた〔トー ツス、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７７巻、第 ５２０１−５２０５頁（１９８０）　）　。 ＩＦＮ処理されたＭｘ’″細胞は長さ約３．５　ｋ　ｂのｍＲＮＡを含有し、こ れはＭｘ　ｃＤＮＡに対し強力にバイブリフト化した。未処理比較細胞からのｍ ＲＮＡはＭｘ　ＣＤＮＡに対しハイブリッド化しなかった（第５図）、Ｍｘ　ｃ ＤＮＡのコード化領域から得られたプローブと、反復配列を有するＭｘｃＤＮＡ の３′非コード化領域から得られたプローブとにより同一の結果が得られた。 ＩＦＮ−α／βに呼応してＭｘ−胚芽細胞はＭｘ　ｃＤＮＡプローブにハイブリ ッド化したｍＲＮＡを合成することを突き止めた。このｍＲＮＡはＭｘ＋細胞の ＭＸ−特異性ｍ　ＲＮ　Ａよりも短い約２００〜５００個のヌクレオチドであっ た。 Ｍｘ−細胞のポリソームポリ（Ａ）＝　ＲＮＡ調製物は極めて低濃度のこのｍＲ ＮＡを含有し、ノーザンプロットで検出するのに丁度足る濃度であった（第５図 ）、未処理比較細胞ではＭｘ特異性ｍＲＮＡを検出することができなかった０Ｍ ｘ　＋およびＭｘ−細胞のＭｘ−特異性ｍＲＮＡの合成は、したがって同様な制 御下にあると思われる。 さらに、３ｕｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡをＱ、５　ａｏＸ　Ｏ，２００スロツ トに充填しかつ１．２％のシグマ■型アガロースのゲルで電気泳動することによ り、分析ゲル電気泳動を行なった。電気泳動の後、これらゲルを０．２Ｍの酢酸 アンモニウムと２０ｍＭの２−メルカプトエタノールとの溶液に１０分間？＋　 ’ｔＭし、かつ臭化エチジウムで染色するかまたはこれらのゲルをノーザン移動 分析に使用した。 Ｍ　ｘ−ネズミの欠陥の性質を調べるため、放射能標識されたｐＭｘ４１の１． ６５ｋ　ｂ　Ｂ　ａ　ｍＨ！断片をプローブとして使用することにより、Ｂ　Ａ 　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミからの染色体ＤＮＡのサウザンプロットを分析した。　 第６Ａ図に示すように、同系ＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−ＭｘおよびＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ 　ｃネズミの制限パターンは同一でなかった。ＥｃｏＲＩ−切断されたＭｘ±Ｄ ＮＡの５ｋｂおよび７．５　ｋ　ｂにおけるバンドはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃＤ ＮＡでは存在しなかったが、約４ｋｂにおける新たなバンドが出現した。Ｂａ　 ｍ　ＨＩ切断されたＤＮＡにおける２、３ｋｂの弱いバンドと６．５　ｋ　ｂの 強いバンドとはＭｘ−ＢＡＬＢ／ｃ　ＤＮＡには欠如した代りに、７ｋｂに新た なバンドが検出された。同様に、Ｍ　ｘ　：！：Ｄ　Ｎ　Ａの３ｋｂおよび１０ ｋｂのＨ４ｎｄｌｌ＋断片はＭｘ−ＤＮＡにおける９ｋｂ［ｉ片で置換され、か つ５ｋｂ　Ｐｓｔ＋断片は２．５　ｋ　ｂ断片で置換された。サウザンブローブ としてＭｘ　ｃＤＮＡの放射能標識されたｌ、Ｑ　ｋ　ｂのＢａｍＨＴ断片を用 いて、Ｍｘ“ネズミからのＤＮＡにおけると同様にＭｘ−ネズミからのＤＮＡに 対し僅かな重なったバンドを得た（第６Ｂ図）、これらの結果は、ＢＡＬＢ／Ｃ ゲノムのＭｘ遺伝子における欠失と一致する。 この欠失ば恐らくエキソンとイントロンとの両者を含むと思われ、Ｍｘ　ｃＤＮ Ａの位置２３１７におけるＢａｍＨＩ部位の上流に位置すると思われる。 ８種の異なるネズミ種の制御パターンを比較した（第６Ｃ図および第６Ｄ図）。 ２種の同系ｆｔＢＡＬＢ−Ａ２Ｇ−ＭｘおよびＳＬ／ＮｉＡ、並びに異種の親戻 り動物（Ｔ９ＸＣＢＡ）ＦｌｕＲは表現型においてＭｘ”であったのに対し、同 系種ＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ、Ａ／Ｊ、１２９／ＪおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊは同一のＥ ｃ　ｏＲＩ制限パターンを示し、このことはこれらの種類がＭｘ遺伝子の同一欠 如を有することを示唆している。種類ＣＢＡの制限パターンは他のＭｘ一種類と は明らかに相違し、かつＨｉ　ｎｄｌ−切断ＤＮＡにおいてもＣＢＡＤＮＡとＭ ｘ”　ＤＮＡとの間に明らかな相違が見られた。 Ｍｘ”　ＤＮＡで得られたｌ　Ｏｋｂにおける強いバンドはＣＢＡネズネズ検出 されず、その代りに５ｋｂにおけるバンドが見い出された。かくして、少なくと も２種の異なるＭｘ一対立遺伝子が同系種類の間で生じ、長さおよび／または位 置において異なる欠失を伴なった。これら２種類の欠失が独立しているのか、或 いは一方が他方から誘導されるのかどうかは、まだ未知である。 これらの結果は明らかに、Ｍｘ−の頻度にもかかわらず野性の表現型がＭｘ＋で あり、かつＭ　ｘ−は欠失によってこれから生ずることを示している。実験種類 におけるＭ　ｘ　”の優性はファウンダー効果によるものであるが、ハラ−等に より野性種に見い出されたＭｘ一対立遺伝子の高頻度は説明されないままである 。 実施例日 ネズミＭ　ｘに対し相同性を有する他の哺乳動物蛋白の免疫沈澱分析 他の哺乳動物におけるネズミＭ　Ｘに対し相同性の蛋白が存在するかどうかを決 定するため、他の動物からのインクフェロン誘発された蛋白に対するネズミＭｘ 特異性抗体の交差反応性を分析した。 ３種の異なるモノクローナル抗体（５Ｄ１１．６Ｄ４および２Ｃ１２）（ステへ り等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜 １８２５頁（１９８５）　）を使用して、ヒトおよびラット細胞をネズミＭｘに 対し相同性の蛋白の存在につきスクリーニングした。ＴＦＮ処理された細胞およ び未処理細胞（比較）を３２５メチオニンで代謝的に標識し、かつこれら細胞の 細胞質抽出物を免疫沈澱分析に使用した。ＩＦＮ−α／β処理した同系ＢＡＬＢ −Ａ２Ｇ−Ｍｘ　（Ｍｘ”）細胞〔ステへり等、上記〕からの細胞抽出物で免疫 化したＢＡＬＢ／ｃ　（Ｍｘ”’）ネズミからモノクローナル抗体５Ｄ１１．６ Ｄ４および２Ｃ１２を作成した。 ネズミ細胞の細胞質抽出物を免疫沈澱分析した際、３種のモノクローナル抗体は 全てネズミＭｘ蛋白に対し高特異性を示し、かつ単一の７５，０００ダルトンの 蛋白を沈澱し、これはポリクローナル抗−Ｍｘ抗体と同様であった〔ステへり等 、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１−１８ ２５頁（１９８５））。 ヒト細胞の細胞質抽出物を免疫沈澱分析した際、ｒ　ＦＮ−α誘発の後に新鮮な 肺血液リンパ球（ＰＢＬ）、培養されたヒト胎児肺細胞（ＨＦ、ＬＣ）、並びに 新生児および成人供与体からの培養皮ｒｔ繊維芽細胞のような種々の細胞により 合成された２Ｃ１２−交差反応性ヒト蛋白を見い出した。健全供与体からのヒト ＰＢＬをイー・コリ産生されたＩＦＮ−α２（１０”Ｕ／■）または天然ＩＦＮ −α（１０’Ｕ／■）と共に培養した。他のＰＢＬは、比較として未処理のまま にした。これら細胞を３７℃にて２時間維持した後、細胞を洗浄しかつ細胞蛋白 を３３５メチオニンで代謝的に標識した０次いで、細胞抽出物を作成し、かつス テへり等の方法〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第 １８２１−１８２５頁（１９８５））にしたがってその１部をネズミＭｘ蛋白に 対する抗体により免疫沈澱しうる蛋白につき分析した。 全ヒト供与体（１１種の全て）のＩＦＮ処理されたＰＢＬは、モノクローナル抗 体２Ｃ１２で免疫沈澱しうる８０．０００ダルトンの蛋白を合成した。この蛋白 は未処理比較細胞では検出できなかった。イー・コリ産生したＩＦＮ−α２およ び天然ＩＦＮ−αは、ＰＢＬにおいてこの蛋白の合成を誘発する能力において区 別できなかった。ネズミＭｘ蛋白に対する２種のイカのモノクローナル抗体（６ Ｄ４および５Ｄ１１）はヒト蛋白に対し反応しなかった。また、ポリクローナル 抗血清〔ステへり等、上記〕は、低いが顕著な交差反応の測定値を示した。 次いで、ＨＦＬＣをネズミＭｘに対し相同性の蛋白の合成につき分析した。この 場合も、モノクローナル抗体２Ｃ１２はＩＦＮ−α２誘発された８０．０００ダ ルトンの蛋白を沈澱したが、６Ｄ４もしくは５Ｄ１１は沈澱しなかった。この蛋 白は、未処理ＨＦＬＣでは検出できなかった。１ｍｌ当り５〜２５ＵのＩＦＮ− α２の濃度は明らかに交差反応性のヒト蛋白の合成を誘発させた。この誘発は１ ２５Ｕ／ｍｌにて一層顕著となり、かつ６２５もしくは３１２５Ｕ／ａ＋１にて 最大値に達した。 ＨＦＬＣは、ＩＦＮ処理の開始後２時間で比較的低割合にて交差反応性蛋白を合 成した０合成の割合は時間と共に増大し、かつ６〜１２時間で最大に達した。 ＨＦＬＣ抽出物において、モノクローナル２Ｃ１２は低濃度で存在する第２のＩ ＦＮ−α２誘宛蛋白（分子量約７５．’０００グルトン）と反応した。この蛋白 は８０．０００ダルトンの蛋白の減成生成物または未改変先駆体を示し、或いは これは独特なｍＲＮＡの生成物である。 次いで、ＨＦＬＣの抽出物を種々の時間にわたり高濃度（１０’　Ｕ／ｍｌ）の イー・コリ産生されたＩＦＮ−γ（５×１０’Ｕ／■）で処理したが、認めうる 量の８０．０００ダルトンの蛋白を検出することができなかった。ＩＦＮ−γの この調製物はＨＦＬＣに対し他の点では活性であり、これは６７にのＧＢＰ、す なわち種々異なる種類のＩＦＮにより繊維芽細胞で誘発されるグアニレート結合 蛋白の合成を誘発する能力、或いはＨＦＬＣにおけるウィルス複製を阻止する能 力によって証明された。 さらに、同様な手順を用いて、未処理でなくＩＦＮ処理されたラットの胚芽細胞 は、抗−Ｍｘ抗体に対し交差反応する蛋白を合成することを突き止めた。モノク ローナル抗体５Ｄ１１および６Ｄ４は単一のＩＦＮ−誘発された７２，０００ダ ルトンの蛋白を免疫沈澱するのに対し、２Ｃ１２は多量の２種の８０、０００ダ ルトン蛋白と少量の７２．０００および６５．０００ダルトンの蛋白を免疫沈澱 させた。ヒトおよびネズミにおけると同様に、抗−Ｍｘ抗体に対し交差反応する 全てのラット蛋白は未処理の比較細胞には存在せず、ＩＦＮ−αで処理された細 胞にて強力に誘発されるが、ＩＦＮ−ｒで処理された細胞では誘発されなかった 。さらに、抗体２Ｃ１２は高度の特異性を示した。これは正常な未処理細胞に存 在する全てのヒト蛋白を識別することができなかった。°さらに、これは蛋白Ｍ ｘ基以外全てのネズミ蛋白に対し特異的に反応しなかった〔ドライジング等、パ イロロジー、第１４０巻、第１９２−１９６頁（１９８４）；ステへり等、ジャ ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５頁 （１９８５））。 上記の結果は、２Ｃ１２交差反応性蛋白が少なくとも１種の独特な抗原決定子（ 他のヒトもしくはネズミ蛋白には見られない）とネズミＭｘとを共有すること、 並びにこの実施例で記載したヒトおよびネズミ蛋白の両者の合成がＩＦＮ−αに より誘発されるがＩＦＮ−γでは誘発されず、したがって同様な制御下にあると 思われることを示している。かくして、上記の２０１２交差反応性蛋白は、ネズ ミＭｘ蛋白のヒト同族体であると思われる。 実施例９ ヒトＭｘ　ｃＤＮＡの分離および発現 先ず最初に、ネズミｃＤＮＡに対するヒト遺伝子の交差ハイブリッド化に対する 最適条件を決定した。この決定のため、先ず最初に３ｆｔの制限酵素（たとえば ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＩｒおよびＢｇｌＩ［）とネズミｃＤＮＡ比較とを用いて全 ヒトＤＮＡのサウザンプロットを作成した。ヒトＤＮＡを許容しうる条件下でネ ズミｃＤＮＡとハイブリッド化させた後、種々異なる厳密な条件下で洗浄して、 交差ハイブリッド化のための最適条件を決定した。 次いで、充分なＭｘ、ｍＲＮＡ含有量を有するヒト細胞ラインまたはその組織、 並びに最適ＩＦＮ誘発条件を決定した。 この決定のため、まず最初にヒトリンパ球およびヒト細胞ライン（たとえばヘラ 細胞、ＨＥＬ６０細胞、ＷＩＳＨｌ［１胞。 単細胞、リンパ芽球およびダウジ細胞）を種々異なる濃度（０，３０，３００， ３０００Ｕ／ｍｌ）のヒトインクフエロンαで０．２．４および１０時間にわた り処理した。次いで、ＲＮＡおよび必要に応じポリ　（Ａ）′″ＲＮＡを各試料 並びに陽性比較細胞（Ｉ　ＦＮ誘発されたネズミＭ　ｘ　”細胞）から精製した ０次いで、ニック翻訳されたネズミＭｘ　ｃＤＮＡを用いて、上記のような最適 条件下でＲＮＡをドツトしかつノーイブリッド化させた６次いで、放射能分析に よりノーイブリッド化を定量化し、かつ適当なＭＸ　ｍＲＮＡ含有量を有するヒ ト細胞ラインもしくは組織並びに最適ＩＦＮ誘発条件を決定した。 ヒトＭｘ　ｍＲＮＡ含有のポリ　（Ａ）”ＲＮＡを作成しかつ特性化するため、 上記で決定された条件下にてヒトＭＸｍＲＮＡの最良の原料であることが判明し た細胞を誘発させた。次いで、標準法によりポリ（Ａ）”ＲＮＡを精製し、かつ ノーザンプロット分析を行なってＭｘ　ｍＲＮＡの長さを決定した。 次いで、ｃ　ＤＮＡ保存物を作成しかつスクリーニングした。 ノーザンプロット分析により特性化されたポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを雛型として 用いることにより、ガブシーホフマン法でｃＤＮＡを作成した。二重鎖ｃＤＮＡ をＥＣＯＲ■ＣＯＲ−ゼで処理し、次いで二重鎖ｃＤＮＡをＤＮＡリガーゼによ りＥＣ０ＲＩリンカ−に結合させた。アガロースゲルで分画した後、Ｍｘ　ｍＲ ＮＡの長さ±２００ヌクレオチドに対応するｃＤＮＡフラクションをλｇｔｌｏ の横方向断片（アーム）に結合させ、次いで得られた組換ファージを組込んだ０ 次いで、このファージを用いてイー・コリに感染させた。感染した細菌を常法に したがってプレート塗抹した（Ｔ、マニアチス等、モレキュラ・クローニング・ コールド・スプリンク′ハーバ−・ラボラドリース社、ニューヨーク　（１９８ ２））。 次いで、得られた保存物を上記したような最適交差反応条件下で、ニック翻訳さ れたネズミｃＤＮＡでスクリーニングした。 クローン化されたＭｘ　ｃＤＮＡを特性化するため、先ず最初に推定Ｍｘ　ｃＤ ＮＡをスミスービルンシュティールによる方法〔ヌクレイツク・アシッド・リサ ーチ、第３巻、第２３８７頁（１，９７６））による制限地図化にかけた。次い で、マキサム−ギルバート法〔プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サ イエンス、ＵＳＡ、第７４巻、第５０６−５６４頁（１９７７））により、ＭＸ 　ＣＤＮＡを配列決定しかつこの配列をネズミＭｘ　ｃＤＮＡの配列と比較して 、相同性の程度を決定した。 ヒ）Ｍｘ　ｃＤＮＡの機能競合性を試験するため、先ず最初に上記のように決定 されたコード化配列を（構成）ＳＶ４０早期プロモータの制御下で補乳動物発現 ベクターｐβＧにクローン化させた０次いで、このベクターをＭｘネズミＬ細細 胞へ、並びにヒトヘラ細胞およびＣｏｓ細胞中へ導入した。 次いで、ネズミＭｘ　（これはヒト蛋白に対し交差反応することが示されている ）に対する螢光性抗体を用いて、−次的および永久に形質転換された細胞にてそ の場におけるＭｘの発現を試験した。形質転換細胞にインフルエンザウィルスを 感染させた後、上記したように螢光性抗−インフルエンザ抗体を用いてその場で ウィルス複製につき評価した〔ステへり等、セル、第４４巻、第１４７−１５８ 頁（１９８６）参照〕。 ヒトＭｘ蛋白を生成させるため、ヒトＭｘのコード化配列を各種のプロモータ（ たとえばＴｒｐ、λ、ＰＬもしくはｔａｃ）および種々異なる３′非コード化領 域に融合させて、イー・コリで発現させた。或いは、Ｍｘコード化配列を［ＦＮ 信号配列に結合させて、ＤＨＦＲ−プラスミドにて発現させ、その際メトトレキ セート増殖技術を用いた０次いで、免疫学的方法〔たとえばＰ、ステへり等、ジ ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第１８２１〜１８２５ 頁（１９８５）　）により発現を測定した。免疫親和性クロマトグラフィーに関 する方法によってＭｘを精製した。 細胞フリー系および組織培養におけるネズミおよびヒ）　Ｍ　ｘ蛋白の生物学的 活性を評価するため、次の方法を用いた：（ｉ）細胞中への微量注入および上記 したようなウィルス耐性の試験；（ｉｉ）インフルエンザウィルス複製に対する 細胞フリー系の使用〔たとえばフルーグ等、パイロロジー、第５６巻、第２０１ −２０６頁（１９８５））（これはＭｘがインフルエンザウィルスＲＮＡ合成を 阻止することにより作用すると思われ、この活性につき分析することができる） 　；　（ｉｉｉ）Ｍｘ−充填された血小板を用いる細胞中へのＭｘの導入および 細胞融合或いはＭｘ生産性イー・コリとＬ細胞との融合、またはＭｘ充項された リポソームとネズミＬ９２９細胞との融合、或いはＭｘの溶液によるネズミＬ９ ２９細胞の単なる処理、および上記のようなインフルエンザウィルス耐性につい ての分析。 動物におけるＭｘ蛋白の生物学的活性を評価するため、Ｍｘ−ネズミにヒトもし くはネズミ蛋白溶液またはリポソーム含有Ｍｘを静脈注射した。インフルエンザ ウィルスを感染させた後、生存するネズミを計数した。 以上、本発明を多数の具体例につき説明したが、ここに説明した具体例を改変し て本発明の方法および組成物を用いる他の具体例を提供しうろことが明らかであ り、したがって本発明の範囲は実施例により上記した特定具体例のみに限定され ないことが了解されよう。 ＦＩＧ、１ ム ３ｋｂ ＴＣＴＴＣＴＣ；ＡＡＴＣＡＡＡＣＣｒＣ；丁ＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＣＧ入入 ＴＣＣＴＣＣＴＧＧλ入入ＡＣ入ＴＡＣλＡλＧＡＴＣ；入ＧＴＴＣＴＴＡＡＣ ＡＡＣＧＴＣ入ＧＡＡＧＧ　ＡＡＡＧ入ＧＣＴＧＡＴＴｒＣｒｒＣλＴＣＣ人Ｃ ＴＣ入ＣＴＣＣ；ＡＴＡＣＣＡＡＧＴ７９０　Ｂ１０　２３０ ８ｇｏ　８７０　ｃ１９０ ９１０　９コ０　９５０ １２１．０　１２３０　１２５０ １２７０　１２９０　１：ｌｌ。 １３コ０　１コ５０　１３７０ １４５０　１４７０　１４り０ １８１０　１８：１０　１８５０ １Ｅ１７０　１８９０　１９１０ ２２９０　２３１０　２３コ０ ＴＡＣＡ　ｒｒｒｒ丁ｒｒＴτＧＣＡＡＡＡＡＴｒＴＴＡＡＣ入ＡＧＧＡＴｒＣ ＣＡＣＣＴＣＴＣｒＴＴｒＡＣ；ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧ ＴＧＧＡＡＣ；ＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡ　ＧＣＣＴＡＴＣＣ；Ａ　Ｃ０ＡＡ Ｇ　ｒＣＣＡＣＣＴＧＴｒＣＡ　ＣＣ■lＴ ＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧ（、ＣＣＧＡＣ；ＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣ，Ｃ ＡＣＣＡＧＴＴＣ，１ＣＴＣＣＣＡ”ｆＡＡＣＡＡＡＣＡＣbＡ ２６５０　２６７０　２ら９０ ２７１０　２７コ０　２７５０ ＡＧＣＴＡＴＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴｒＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡ ＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＣ入ＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣ；Ｃ；ＡＡＣＣＴＣＡ ＣＡＡＧτＡＣ；ＴｒＣＴｒＡＣＧτｃＡｃｘ入入ＴσＴＣＧＣＴＣ；Ｔへ人Ａ ＣＣＡＣＡＡｅＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡ（、ＣＣＴＣＣＣ； ＴｒＧＣｒＣＡＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣτｒｒｃ’ｒｃ入Ｃ；ＧＴＣＡＴＡＴs コ０１０　３０３０　３０５０ 丁ＡＴＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴＣＣＴＴｒＣＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣ ＡＡＴＣ；ＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＴｒＴＣ３０７０、３０９０３１ １０ ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴｒＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＣＴｒＴＣＡＴＣＴＣ ＴｒＴｃＣＴＴＣＡＧＣ人ＡＣＡＣ八τＣＡＴＴＴＣ３１３０へ　３１５０　３ １７０ ＡＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡ−へＣＡＴＣＡＴｒＴにＡＴＡＴＡＡ ＣＴＡｊｔσＩＴＴＣＣＡ入αシＧＡσ■χ；ＡＡＧＴＡ　（Ａｌａ）　＝　３ ４　（５，４３＜）　Ｃ（Ｃｙｓ）　ａ　１１　（１，７５８＋Ｄ　ＴＡｓｐｌ 　ｇ　３日　（６，５ｋ）　Ｅ　（Ｇｌｕｌ　−５９（９，３５ｇ）’ｒ　（Ｐ 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ＴＦＯＮＮＳＱＦＰＯＫＧＬＴＴＴＥＭＴＱＨＬＫＡＹＹＱＥ（ＲＲＮＩＧＲＱ ＩＰＬＩｒＱＹＦＩＬＫ　丁　ＦＧＥＥＩ　ＥＫＭ　阿　ＬＱＬＬＱＤＴＳＫＣ ５ＷＦＬＥ二　Ｏ６Ｄ　Ｔ　ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲＬＬＲＬＤＥＡＲＱＫＬ　＾ 　に　Ｆ　Ｓ　Ｄ ＦＩＧ、２Ｄ ９にｐｎｌ　ＱＳａｌｌ　９　０（７１ＩＩ　中　Ｓａｌ　ｌＱ　Ｂａｍ　Ｄ　 Ｉ　［；］　Ｅｃｏ旧　７　Ｐｖｕｌｌ　中Ｐｓｔ　ｌＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、６Ｃ ＦＩＧ、６Ｄ 手続補正書却 昭和６２年　５月１８日 特許庁長官　黒　１）　明雄　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１８１８ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国、カリフォルニア州　９２１２２、サン　ディエゴ、カミ ノ　ヒュアータ　７８５８５、？！正の対象 （１）　明細書および請求の範囲の翻訳文６、補正の内容 Ｃ関　Ｔ　麺　存　邦　告 １ｍｅｒＭｌ＜Ｐａｌ＾ｌ１ｏｂｃ＋ｈｏｎｌｉｏ、　ＰＣＴ／ｕｓ１０ｕｑ＋ ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウイルス感染に対し動物へ保護しうるインタフェロン誘発された蛋白をコー ドする遺伝子を動物中へ挿入することを特徴とするウイルス感染に対する動物の 保護方法。 ２．ウイルス感染がインフルエンザウイルスによって引き起こされ、かつ遺伝子 がＭｘ蛋白をコードする請求の範囲第１項記載の方法。 ３．遺伝子が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合されている請求の 範囲第１項または第２項記載の方法る４．インタフェロン誘発された蛋白をコー ドする遺伝子を含む組換ＤＮＡ分子で形質転換された宿主。 ５．宿主がその天然状態においてウイルス感染に対し感受性である動物細胞であ り、かつ組換ＤＮＡ分子がウイルス感染に対し細胞を保護しうるインタフェロン 誘発された蛋白をコードする遺伝子を含む請求の範囲第４項記載の宿主。 ６．ウイルス感染がインフルエンザであり、かつ遺伝子がＭｘ蛋白をコードする 遺伝子である請求の範囲第５項記載の宿主。 ７．遺伝子が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合されている請求の 範囲第４項乃至第６項のいずれかに記載の宿主。 ８．式： 【配列があります】 を有するＤＮＡ配列。 ９．（ａ）請求の範囲第８項記載のＤＮＡ配列、（ｂ）請求の範囲第８項記載の ＤＮＡ配列にハイブリッド化しかつ発現に際しＭｘ蛋白をコードするＤＮＡ配列 、および （ｃ）遺伝子コードの結果として前記ＤＮＡ配列まで縮退しかつ発現に際しＭｘ 蛋白をコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択されたＤＮＡ配列を含む組換Ｄ ＮＡ分子。 １０．ＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合されている 請求の範囲第９項記載の組換ＤＮＡ分子。 １１．（ａ）構成プロモータ、 （ｂ）天然のインタフェロン依存性プロモータ、（ｃ）インタフェロン依存性で あるが、天然のインタフェロン依存性プロモータよりも大きい発現を示すハイブ リツドプロモータ、および （ｄ）インタフェロン以外の物質に依存するプロモータよりなる群から選択され るプロモータを含む請求の範囲第９項記載の組換ＤＮＡ分子。 １２．（ａ）アミノ酸配列： 【配列があります】 からなる第一ポリペプチド、および （ｂ）前記第一ポリペプチドの少なくとも１つの断片からなり、インフルエンザ に対する動物の保護作用を有する第二ポリペプチド よりなる群から選択されるポリペプチド。 １３．（ａ）モノクローナル抗体２Ｃ１２で免疫沈澱することができかつヒト末 梢血液リンバ球，ヒト胎児肺細胞およびヒト繊維芽細胞にてインタフェロン−α もしくはインクフェロン−βにより誘発させうるが、インタフェロン−γでは誘 発させえない約８０，０００ダルトンの分子量を有する蛋白、および （ｂ）前記蛋白の少なくとも１つの断片からなり、インフルエンザに対し動物の 保護作用を有するポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチド。 １４．抗ウイルス上有効量の請求の範囲第１２項または第１３項記載のポリペプ チドと、医薬上許容しうるキャリヤとからなる抗ウイルス医薬組成物。 １５．抗ウイルス上有効量の請求の範囲第１２項または第１３項記載のポリペプ チドを、感染に対し感受性である動物に対し投与することを特徴とする動物にお けるウイルス感染の治療もしくは予防方法。