JPS6344946A - カチオン交換性材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカチオン交換材料及びその製造法に関し、更に
特に液体クロマトグラフィーの充填材料と（７て特に十
分適しているカチオン交換担体材料に関する。

高速アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーは生
物学的分子の分析及び分離に利して強力な手段となって
きた。高速液体クロマトグラフィーの媒体に対するカチ
オン交換コーティングはいくつかの経路で合成されてき
た。最も簡単な経路はシリカ表面のア二オ“ン性有桟シ
ランでのシリル化である。しかしながら、そのような反
応は可逆的であり、蛋白質を不可逆的に結合することの
できる残存シラ７−ルを残してしまう。この問題は親水
性有機重合体層をシリカ表面上に結合させることによっ
て回避しうるけれど、この方法は必要とされる再現性を
Ｊｊ、えない。カチオン交換コーティングの他の合成経
路は、シリカ表面−にに反応性官能基を配置するために
有機シラン反応がら始めるものである。次いで官能基化
されたシリカを、共有結合した重合体静止相（Ｓ　ｔ、
ａｔｉｏｎａｒｙ　　ｐｌ＋ｕｓｅ）を与える予じめ製
造した重合体と反応させる。この最後の」二程は更ｌこ
係留された重合体をそれがアニオン性であるように改変
させる。製造されるカチオン交換コーティングは安定で
高結合力を有するけれど、このカチオン交換コーティン
グの製造法は全く艮々としている。

本明細書においで参考文献として引用される米国特１１
″第４．，２４５　、（ｌ　０５号に議論されているよ
うに、吸１３れなポリエチレンイミン化学を用いるアル
バー）　（Ａ　１ｐｅｒ１．）及び′リグニア（Ｒ，４
ｎｉｅｒ）による過去の研究は、それがアニオン交換静
止相の合成に対して非常にＪｊ能であることを示した。

吸３′１された重合体アニオン交換媒体の合成に則する
アルバート及びリグニアの先駆的現存する吸着技術を用
いれば、本発明のカチオン交換材料は製造される。

ヨーロッパ特許′Ｍ第０．１４３，４２３号はポリエチ
レンイミンから製造されるカチオン交換材料を教示して
いる。しかしながらヨーロッパ特許願第（，１，１４３
，４，２３号は、架橋してないポリエチレンイミンプロ
ビルシランが吸着よりむしろ共有結合している多孔性シ
リカを提供する。ヨーロッパ特許願ｔｔｒＪｏ、１４３
．４２３号では、粒状シリカゲルをポリエチレンイミ７
ブロビルトリメトキシシランと反応させ、架橋してない
共有結合したポリエチレンイミ／プロピルシリｌレージ
リカを、例えば不活性な有機溶媒中の適当な三塩基性酸
無水物での通常の処理（こより弱酸性のカルボキシル形
に転化する。

本発明はカチオン交換材料及びそのような材料の製造法
を提供する。本発明のカチオン交換材料は高速液体クロ
マトグラフィーにおける蛋白質及び生物学的重合体の分
離のための充填材料として十分適当である。

本カチオン交換材料の製造においては、最初にアミン基
を含んでなる吸着物、好ましくはポリエチレンイミンの
薄層を無機担体材料、例えばシリカ、アルミナ又はチタ
ニアに吸着させる。次いでこの吸着したコーティングを
架橋剤例えばエポキシ樹脂又は臭化アルキルによって随
時架橋させる。

次いで吸着した架橋コーティングの少くとも１つのアミ
ン基を、好ましくはプロトン捕捉剤の存在下に、少くと
も１つのカルボキシル基を生じせしめるのに十分な量の
試剤と反応させる。好ましくは吸着した架橋コーティン
グの多くのアミン基を、アミンの誘導によってカルボキ
シル基を生じさせるのに１−分な量の試剤と反応させる
。用いる試剤が多官能ヤ１゛の場合、試削は好ましくは
親水性重合体、更に好ましくは親水性重合体無水物、最
も好ましくはポリアクリル酸無水物を含んでなる。用い
る試剤がＱｔ官能性ならば、試剤は好ましくは親水性単
ｌｉｔ体、更に好ましくは親水性単量体無水物を含んで
なる。。

池に、架橋してない吸着されたコーティングのアミン基
を、好ましくはプロトン捕捉剤の存在下に、該コーティ
ングを架橋させ且つ同時に少くとも１つのカルボキシル
基を生じせしめるのに十分な寸の多官能性試剤と反応さ
せる。この多官能性試剤は好ましくは親水性重合体、更
に好ましくは親水性重合体無水物、最も好ましくはポリ
アクリル酸無水物を含んでなる。

従って、本発明の主な目的は安定で再現性のあるカチオ
ン交換材料を提供することである。

本発明の更なる目的は高負荷容量と優秀なりロー１２＝ マドグラフィー特性を有するようなカチオン交換材料を
提供することである。

本発明の他の目的は簡Ｑ１且つ安価に製造できるカチオ
ン交換材料を提供することである。

第１　Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ図はチトクロームＣ−リゾザイ
ム蛋白質混合物の分離に基づく４種の選択したカチオン
交換カラムのクロマトグラフィーによる評価を示すグラ
フである。

第２図は４種の選択したカチオン交換カラムにおけるリ
ゾザイムの保持を、　Ｉ−Ｉの関数として示すグラフで
ある。

第３（Ａ、Ｂ）及び（Ｃ，Ｄ）図はチトクロームＣ６５
゜を含有するＡ、７０スーアクアエ（ｆｌｏｓ−ａｑｕ
ａｅ）［アルが工（ａｌｇａｅ）］抽出物の２種の選択
したカチオン交換カラムのクロマトグラフィーによる評
価を示すグラフである。

本発明は特に、液体クロマトグラフィーにおける蛋白質
及び生物学的重合体の分離のための充填材料として特に
十分適しているカチオン交換材料の製造法に関する。

米国特許ｆｉＳ４．，２４．５，００５号における如く
、カチオン交換材料の製造では、吸着物に対して親和性
をイ５する担体材料の表面を、アミン基を含んでなる吸
着剤と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電
力によって該表面に吸着させる。

吸着物は好ましくは溶媒中に含まれ、吸着を部分的に該
溶媒の極性の調節１こ↓って嬉立することがでとる。溶
媒の極性が小さければ小さい程、吸着は強い。この目的
１こ月して適当な溶媒はメタノールである。吸着物は少
くとも２つの官能基を含み、ぞの１−〕は担体材判の表
面と州庁作用してその吸オ゛１を誘導しＩ↓つ他は架橋
のために使用される。ポリエチレンイミンは好適な吸着
物であるけれど、他の適当な吸着物は１．３−ノアミツ
−２−ヒドロキシプロパン、テトラエチレンペンタミン
、及びエチレンノアミンである。

１１１体月料は好ましくは無機担体材料例えばシリカ、
アルミナ及びチタニアであり、好適な担体材料はシリカ
である。無機担体材料の特別な例１ユ、リクロス７ア（
１、ｉｃｌ＋ｒｏｓｐｌ＋ｃｒ）Ｓ　ｉ　５００　（′
＃！径１０μ）、リクロソーブ（Ｌ　１Ｃｈｒｏｓｏｒ
ｂ）Ｓ　ｉ　１００（粒径１０μ）、リクロス７ア５ｉ
ｌＯＯ（粒径１（）μ）、クロモソーブ（Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂ）１．　Ｃ−６、バーチシル（Ｐａｒｔｉｅｉ
ｌ）１０、バイグク（Ｖ　ｙｄｕｃ　）　１’　ＰＢ、
調節された多孔質ガラス（粒径５〜１０μ；細孔径１０
０人）、スフエリソーブ（Ｓ　ｐｈｃｒｉ８ｏｒｂ）ア
ルミナ（粒径１０μ、細孔径１５０人）、ビオ−ラッド
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）塩基性アルミナ、活性■（粒径４０
μ）、ビオ−ラッド酸性アルミナ、活性Ｉ（粒ＰＦ、４
．０μ）、フーニング（ＣｏｒｎｉｎＨ）チタニア（４
０／６０メツシュ；細孔径４００人）、アミコン・マ■ ドレックス（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｍａｔｒｅｘ　　）シリ
カゲル、ノルコニル被覆シリカ（バイグクＴＰＢシリカ
−ににジルコニウムのコーティング）、及び酸化マグネ
シウムである。

アミン基を含んでなる吸着物の薄膜コーティングを担体
材料の表面に吸着させた後、該表面を架橋剤例えばエポ
キシ樹脂又は臭化アルキルにさらすことによって吸着し
た表面を架橋することができる。この場合好適な架橋剤
は多官能性エポキシ−１５＝ 樹脂である。適当なエポキシ樹脂架橋剤は１，２−エタ
ンジオールノブリシジルエーテル、１．４−ブタンジオ
ールシグリシノルエーテル及びｉ。

３−ノブリシジルグリセロールを含む。カチオン交換材
料を製造するために、続いて架橋した吸着コーティング
の少くとも１つのアミン基、好ましくは多くのアミン基
を、好ましくはプロトン捕捉剤の存在Ｆに及び好ましく
は乾燥中性溶媒例えばツメチルホルムアミドの存在下に
、表面アミンの誘導化によって少くとも１つの、好まし
くは１つより多くのカルボキシル基を生じせしめるのに
十分な量の試剤と反応させる。プロトン捕捉剤は好まし
くは第３級アミン、更に好ましくはジイソプロピルエチ
ルアミンを含む。架橋した吸着コーティングのアミン基
と反応してカルボキシル基を生成する試剤は単官能性又
は多官能性であってよい。

用いる試剤が単官能性であるならば、試剤は好ましくは
親木性単量体、更に好ましくは親水性単量体無水物、最
も好ましくは親水性単量体環式無水物を含んでなる。適
当な単量体無水物の例は、無水グルタル酸、無水コハク
酸、ジグルフール酸無水物及びテトラヒドロ７ラン２　
、３　、４．　、５−テトラカルボン酸二無水物である
。用いる試剤が多官能性である場合には、試剤は好まし
くは親水性重合体、更に好ましくは親水性重合体無水物
、最も好ましくはポリアクリル酸無水物である。

他にアミン基を含んでなる吸着物の薄膜コーティングを
担体材料の表面に吸Ｍさせた後、架橋してない吸着コー
ティングのアミン基を、好ましくはプロトン捕捉剤の存
在下に、表面アミンの誘導体化を経て該コーティングを
架橋させ旧つ少くとも１つ、好ましくは１つよりも多い
カルボキシル基を生じさせるのに十分な量の多官能性試
剤と反応させる。ここにプロトン捕捉剤は好ましくは第
３級アミン、更に好ましくはジイソプロピルエチルアミ
ンを含む。多官能性試剤は好ましくは親水性重合体であ
り、更に好ましくは親水性重合体無水物であり、最も好
ましくはポリアクリル酸無水物である。用いる多官能性
試剤が無水物である場合には、未反応の無水物の完全な
加水分解を希酸処理で保証する。。

次の限定を意味しない実施例は本発明を更に例示する。

実施例１ ハイタフ１０１　’「Ｆ’８５．５／ｊｍ（球、３３０
人）のシリカ１ｇをメタノール性１％四／νポリエチレ
ンイミン−１８（平均分子量＝１８００）の溶液１（１
＋Ａ６に＠濁させた。次いで吸着したコーティングを１
３％Ｖ／ジメタツール性ノグリシノルグリセロ−ル溶Ｑ
　１０　ｍｌを用いて架橋した。このコーティングし１
１つ架橋したシリカ０．７＋７を１１０°Ｃのか中に３
０分間装いた。次いで乾いたシリカを、乾燥ツメデルホ
ルムアミド４−１（乾燥及び再蒸留した）ノイソブロビ
ルエチルアミン（１）ＩＥＡ）２５　（ｌ　ｔｔ　Ｑ及
び無水コハク酸（Ｓ　Ｕ　Ｃ）２００　＋ｏｇカらなる
溶液に懸濁させた１、このアシル化反応は表（ｆ１１ア
ミンの誘導体化を経てカルボン酸を生成した。

無水物とアミンのコーティング扛っ架橋されたシリカと
の反応中に、隣るアミンを滴定しうる（それを不活ｆｉ
、　ＩＩＳさせる）酸が４−成するのでＩ）Ｉ　Ｅ　Ａ
をプロトン捕捉剤として用いた。この反応を、異なる無
水物−ジグリコール酸無水物（■）ＧＡ）、無水グルタ
ル酸（Ｇ　Ｌ、　Ｕ　）、及びテトラヒドロフラン−２
，３，４，５−テトラカルボン酸２無水物（ＴＥＴＲＡ
）を無水コハク酸の代りに用いて３回繰返した。反応を
６０”Ｃ下に終夜進行させた。次いで各生成物をグラス
フィルターで分離し、メタノール、水、トリエチルアミ
ン及びメタノールで連続的に洗浄した。真空下に乾燥し
た後、これらの物質を真空下に貯蔵した。得られたカチ
オン交換材料の各５０ｍ）（を、そのピクリン酸を結合
する能力に対して評価した。ピクリン酸イオンはアミド
とではなくて近づきうる（イオン化してない）アミンと
対を作る。それ故にアシル化の量は誘導化後のイオン対
を形成しうるアミンの消失％として決定することができ
る。

ピクリン酸の濃度を測定するためにパーキン−エル７−
　（Ｐ　ｅｒｋｉｎ　　Ｅ　１ｍｅｒ）　５５型分光磯
を用いた。ピクリン酸分析の結果を第１表に示す：Ｌｔ
−人 ｔｉｔ　ｔｉ体環式無水物から合成した吸着カチオン交
換静１１相の評価 （逆−ｇ／−５□２− コハク酸　　　　　　８０　　４２　　６．６１５，２
１１．４グルタル酸　　　　　６９　　３９　１０．３
１５．２　６．４ノグリコール酸　　　８６　　５］、
　　　９．０１２．４　５．２％Ｓ　Ｕ　Ｂは誘導体化
前及び後の双方におけるピクリン酸イオン対を形成する
能力の分析から決定した置換パーヒントである： ・般に、表面アミンの約７０％がアシル化できた（第１
表）。この数からの（無水物に依存しての）僅がなかた
よりは測定の精度（±５％）又は反応性の違いに由来し
た。ピクリン酸はすべて上述のコーティングに吸着され
るから、アミンがカルボキシル残基を有して点在した。

しかしながら、これらのカチオン交換材料は（ヘモグロ
ビンが負に荷電されているｐＨである）ｐＨ８において
ヘモグロビンを結合しなかった。このことはこれらのア
ミンが蛋白質のような大きい分子に近づけなくてピクリ
ン酸のような小さい分子にだけ近づけることを示す。

次にカチオン交換材料の各５０１１Ｉｇを、その大分子
（蛋白質が正に荷電しているようなｐＨ５，５における
牛の粗ヘモグロビン■型）を結合する能力に対して分析
した。ヘモグロビンの濃度の測定はパーキン−エルマー
５５型分光機を用いた。無水グルタル酸、無水コハク酸
、及びテトラヒドロフラン−２，３，４，５−テトラカ
ルボン酸２無水物を用いて合成したカチオン交換材料は
すべてがコーティングした担体材料１ｇ当り約４０＋ｎ
Ｈのヘモグロビンと結合した。ジグリコール酸無水物の
カチオン交換材料は多分誘導体化が増大したためがそれ
より僅かに多くのヘモグロビンと結合した（第１表）。

、：れらの材料の、ｐＨ５，５におけるヘモグロビン結
合能力を、蛋白質カチオン交換結合能次に無水コハク酸
（ＳＵＣ）、無水グルタル酸（Ｇ１＝　［Ｊ　）、ノグ
リコ・−ル酸無水物（Ｄ　ＣＡ　）、及びテトラヒドロ
フラン−２、３、４、５−テトラカルボン酸−無水物（
１’　Ｅ　Ｔ　ＲＡ　）のカチオン交換材料の名０．５
８を、それぞれカラムクロマトグラフィーによる評価の
ために０，４１Ｘ５ｃｍ内径のカラムに充填した（第１
表及び第１　Ａ、Ｂ、Ｃ図）。そして流出削として０　
、ＯＩ　Ｍ　　Ｎａ０ａｃ（ｐｌ−１５、５）から０．
ＯＬＭ　　Ｎａ０ｕｃ中０　、　５　Ｍ　　ＮａＣ１（
ｐＨ５，５）までの２０分間にわたる直線的グラジェン
トをｌｌ１ｌ１２／分の流速で用いることによってクロ
マトグラフィーを行なった［グラジェント・マスター（
Ｇ　ｒａｄｉｃｎｔ　　Ｍｎ５ｔｅｒ）を合むＩ−Ｄ　
Ｃ：Ｉ　ンスタメトリック（Ｃｏｎｓｔａｍｅｔ、ｒｉ
ｃ）　Ｉ及びＩＩＧシステムを使用−ラボラトリ−・デ
ータ・コントロール（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｄａｔ
ａ　　ＣｏｎＬｒｏｌ＋Ｒｉｖｉｅｒａ　　Ｂｅａｃｈ
ｙ　ｒ；”　１ｏｒｉｄａ）製］。分析用の試験試料（
２０μｌ）はチトクロームＣ（ＣＹＴｃ−馬の心ＭＩＸ
　＋Ｉ］　Ｉ　＝　９　。

２　＞　３　ｍｇ／　ｔａｇ！及びリゾザイム（１，−
Ｙ　７．−卵白、ｐｉ＝　１１　）５　ｍｇ／ｍ４と酸
化を禁止するための痕跡量の７スコルビン酸からなった
。検知はアルテックス（Ａ　１ｔｅｘ）Ｕ　Ｖ検知器１
５３型［アンスペク（Ａｎｓｐｅｃ、　Ａ　ｎｎ　Ａ　
ｒｈｏｒ、　Ｍ　ｉｃｈｉｇａｎ）Ｗ　］によりＡ２５
．で行なった。ＣＹＴｃ及びり、　Ｙ　Ｚのピークの保
持時間（１）を第１表に示し、これを第１図にグラフ的
に示す。ＣＹＴｃ及びＩ−Ｙ　ニア、間の分離（第１表
及び第１図におけるＲｓ）を方程式 ％式％ に従って計算した。ここに記号　Ｒ１及びＲ７は各ｔ　
　　　　　　　　［ ビークの保持時間であり、一方△　Ｒ１及びΔ　Ｒ７は
ビーク中である。添字１及び２はカラムがら流出する第
１及び第２ピークに関するものである。

リゾザイムは強く保持されたが、ＣＹ　Ｔ　ｃは早く流
出した（第ＩＣ図）。無水コハク酸材料の性能は経済的
理由のためにも価値があった。即ちそれは用いた無水物
の中で最低の価格のものである。

２３一 実施例１１ ポリアクリル酸（ＭＷ２０００、鎖長２８）５ｇを１０
０ｍ１の丸底フラスコに入れ、これを１８０°Ｃの油浴
中に置くことによってポリアクリル酸無水豐（Ｆ　Ａ　
Ａ　）を合成した。次いでこのフラスコを真空ポンプに
連結し、３時間脱気した。得られた黄色の固体をフラス
コから取り出し、デシケータ中に貯蔵した。ＮＭＲによ
る分析は重合体分子当り約１１個の無水物官能基に相当
して脱水されたカルボキシル基７９％を示した。

バイグクｊ０１ＴＰＢ５．５μｌ１ｌ（球、３３０人）
のシリカ０．７ｇを、１％Ｗ／Ｖメタノール性ポリエチ
レンイミンの１％溶液ＪＯｍｊ中に懸濁させ、室温下に
３０分間放置した。この吸着１７たシリカをグラス・フ
ィルター上に再分離し、１１０’Ｃの炉中に３０分間入
れた。次いでこの乾燥した媒体を、乾燥ジメチルホルム
アミド４ｍｊ！、乾燥・蒸留したノイソプロビルエチル
アミン２５０μｅ及び）―で調製したポリアクリル酸無
水物５０＋ｎｇ（］。

２％Ｅ）　Ａ　Ａ　）を含む５０ｍ１の丸底７ラスフー
こ移し一２４＝ た。異なる量のポリアクリル酸無水物、即ちポリアクリ
ル酸無水物）ＯＯｍｇ（２，４％Ｐ　ＡΔ）及びポリア
クリル酸無水物２００ｍ５（４，７％Ｉ”　Ａ　Ａ　）
を用いて上述の反応を更に２回繰返しｔ″、。反応を６
０℃で終夜進行させた。次いで各生成物をグラス・フィ
ルター−にに分離し、メタ／−ル、水、ｌ・リエチルア
ミン及びメタ／−ルで連続的に洗浄し。

た。真空下に乾燥後、これらの物質をデシケータ−中に
貯蔵した。種々のポリアクリル酸無水物を用いて合成し
たカチオン交換材料の各５０＋ｎＢを、ピクリン酸を結
合する能力に灯して評価した。分析の結果を第１１表に
示す。

第−１−表− ポリアクリル酸無水物を用いて合成した吸着カチオン交
換層１１−相の評価 （準ｇ／Ｂ１ ４．７　　　　　　　　５９　　５９　１０．６ＮＥ　
　（１）２．４　　　　　　　　６８　　５４　　８，
８１５．４８，６１．２　　　　　　　　５５　　３６
　　６．６　ｔｏ、６４．９興味あることに、これらの
カチオン交換材料のアシル化％は実施例１における単量
体無水物を用いて得られるものより低かった。大きいポ
リアクリル酸無水物の静１１・、相アミンへの接近は立
体的理由のために妨害されるかも知れない。アニオン交
換体のヘモグロビン結合は存在しないから、カチオン交
換材料は接近しうる残存の正荷電を有さずに適゛１冒こ
架橋されていると思われる。

ポリアクリル酸無水物カチオン交換材料の各５０ｍＢを
、ヘモグロビン（牛の粗■型）をｐＨ５，５のｐ　衝ｐ
　ｔｌで用いて、蛋白質カチオン交換体結合ｆｌｌｕ力
（Ｈｂ　　　）に対して評価した。この分析の結果を第
■表に示す。ヘモグロビンの結合はポリアクリル酸無水
物の濃度と共に増加した。最大の値は最高濃度（４，７
％Ｉ）　Ａ　Ａ　）で合成した材料のときに得られた。

この材料と２．４％１）Ａ　Ａを用いて製造した材料の
双方は、実施例Ｉで製造したジグリコール酸無水物のカ
チオン交換材料よりも多くのヘモグロビンを結合した。

実施例Ｉ及びＨのすべてのカチオン交換材料はすべて共
通の中間体（即ちバイダク・シリカに吸着した未架橋の
ポリエチレンイミン）を用いて製造しでいるから、増大
したヘモグロビン結合能力は共有結合したｌ）　ＡＡの
カルボキシル基に対するアミドの比に直接関係するよう
に見える。

ポリアクリル酸無水物は線状重合体である。カルボキシ
ル基が面の５つの原子内に存在するに違いない実施例Ｉ
の単量体無水物と違って、ポリアクリル酸の伸びたもの
（幹及び環）はシリカの細孔容量内に達し得ない。その
ような構造の存在は表面に鋸歯状の形態を力え、効果的
に表面積を増大させる。結合能力は直接後者に関連する
から、増加に帰結する。１．２％ＰＡＡで架橋したカチ
オン交換材料は実施例１の単量体無水物のカチオン交換
材料に匹敵してコーティングした担体１８当り−・モグ
ロビン３６ｍｇを結合した。ポリアクリル酸の低濃度ｔ
こおいて、幹と環構造は、表面アミンに則する競合が小
さく且つポリアクリル酸無水物が広範に反応するから、
主たるものでないかも知れない。

ポリアクリル酸無水物のカチオン交換材料の各約０．５
Ｂをクロマトグラフィーによる評価のために０．４１Ｘ
５ｃｍのカラムに充填した。そして実施例１のクロマト
グラフィー装置及び検知装置を用い且つ流出剤として０
．　ＯＩ　Ｍ　　Ｎａ０ａｃ（ｐＨ５，５）からＱ　、
（１１Ｍ　　Ｎａ０ａｃ中ＩＭＮａＣｌ（ｌｕｌｌ　５
　、　５　）までの２０分間にわたる直線的グラジェン
トを１　ｍ２７分の流速で用いてクロマトグラフィーを
行なった。分析試験試料（２０μρ）は実施例Ｉにおけ
る如（ＣＹ　Ｔ　ｃ及びり、　Ｙ　７．と痕跡用のアス
コルビン酸からなった。ＣＹ　Ｔ　ｃ及びＬＹＺのピー
クの保持時間（Ｒ）及びＣＹＴｃ及びＬＹＺ間の分離 （実施例Ｉにおける如く計ｔｉ１．）を第１１表に示す
。１゜２％Ｉ）　Ａ　Ａ材料に対するＣＹＴｃ及びＬ　
Ｙ　Ｚのピークの保持時間を第１図１こグラフ的に示１
゜ＣＹ１’ｃとリゾザイムの保持時間はＩ”　Ａ　Ａの
濃度と共に増加した。事実リゾザイムはＩＭＮａＣｌを
用いて４．７％ＰＡＡから流出ぜず、また２６４％のＦ
’　Ａ　Ａカラムからの脱着には０．７７　Ｍ　ＮａＣ
ｌが必要であった。これらの値は実施例■のカラムから
得たものよりも実質的に高い。強力に保持する４、７％
のカラムはそれがあまりにも保持しすぎるからクロマト
グラフィーで実用的でないかも知れないけれど、蛋白質
の固定化には使用することかでトよう。カチオン性ポリ
ペプチド例えば抗体は、免疫親和性クロマトグラフィー
に対するそのマトリックスにしっかり吸着することがで
きた。

０〜ＩＭＮａＣｌの２０分間にわたる直線的グラジェン
トを用いる場合、ＣＹＴｃ及び１．　Ｙ　２間の分離は
４．７％のＦＡＡカラムにおける「無限Ｊから１．２％
のＰ　Ａ　Ａカラムにおける４、９の値まで変化した。

４．７％１１）　Ａ　ＡカラムはＬ　Ｙ　Ｚの無限の保
持のため、Ｒｓが定義できなかった。１゜２％ｒ’　Ａ
　Ａカラムは上述の条件下に最低のＲｓを与えた。しか
しながら、二の値はグラジエン１の勾配を゛に分だけ減
少させると６．１に増加した（参照第１１）図）。

実施例Ｉｌ＋ ＣＹＴｃ及びＩ−、Ｙ　Ｚ、と痕跡量のアスコルビン酸
を含む実施例Ｉと同様の試験試料約２０μＰを、いくつ
かの流出ｐｌ−Ｉ値（他の条件は一定）において実施例
１の無水グルタル酸、無水コハク酸及びジグリコール酸
無水物のカラム及び実施例Ｈの１゜２％ポリアクリル酸
無水物のカラムでのクロマトグラフィーに供した。すべ
ての場合、保持はｐＨに対して逆の関係にあった（第２
図は正にリゾザイムの保持を示す）。この挙動は流出ｐ
Ｈが等電点以下に低下するにつれて蛋白質の真の正荷電
が増加することに由来する。更に詳しく検討すると、無
水グルタル酸のカラムが最もｐＨに敏感である。

無水グルタル酸は更なるメチレン基を含有するから、共
働的な疎水性−イオン性の相互作用が確かなものとなる
。この実験はこれらのカチオン交換材料の一般的な操作
１〕１１範囲を規定するのに役立つ。ＣＹＴｃ及びＩ−
、Ｙ　２間で４またはそれ以トの分離がｐＨ５，５−７
，５において得られた。

実施例■ 実施例Ｉの無水フハク酸のカラムと実施例■の１．２％
ポリアクリル酸無水物のカラムを、粗蛋白質混合物の分
画のための代表的媒体として選択した。試料はチトクロ
ームＣ，５３（ＣＹ　Ｔ　ｃｓｓ３）を含むシア／バク
テリヤ［ア７アニゾメ７ン・７０ス−アクアエ（Ａｐｈ
ａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ　　ｆｌｏｓ−ａｑｕａｃ）ｌか
らの抽出物からなった。この蛋白質は９．３の等電点、
ｉ、１，０００の分子−推及び独特なスペクトル的性質
を有した。還元状態において可視１数取スペクトルは２
８０．４１．０及び５５３　ｎｍに最大値を示した。

粗細胞抽出物を限外濾過（分子ｆｄ３０，０００のもの
を透過しない膜）により部分的に処理した。

蛋白質を（１、５Ｉｎｇ／　ｍρ以？’ｔ″含有する得
られたか液を集め、ｐＴ−（７にｉＭ節した。次いでこ
の混合物の８０μｐの両分を各カチオン交換カラム（０
゜４１Ｘ　５ｃｍ）にかけた。実施例１におけろように
、流出剤として０　、　ＯＩ　Ｍ　Ｎａ０ａｃ（ｐＩＩ
７　）から０゜０１　Ｍ　　Ｎａ０ａｃ中０．５　Ｍ　
　ＮａＣ１（ｐＨ７）までの２（）分間にわたる直線的
グラジェントを１＋ａｊ！／分の流速で用いることによ
り、クロマトグラフィーを行なった。ト１１）１０４０
Ａ型検知器［ヒユーレットＩ　ハラカード社（Ｉ（ｅｕ
＋１ｅｔｔ　　Ｐａｃｋａｒｄ、　Ｃ０ｒｖａｌ　ｌ　
ｉｓ、　ＯｒｅＨｏｎ）］を用い、２つの波長（２６０
及び４１０τ＋ｍ）で監視した。２６０肋のシグナルは
ｒべての蛋白質を検知し、−力４１０旧ｎのシグナルは
ポリポルフィリン環（例えばＣＹＴ（！、５３）を含む
ものを監視した。

無水コハク酸から得られたクロマトグラム（２６０ｎｕ
ｎ）は実質的な数の紫外線吸収材料を示す（第３　Ａ図
）。しかしながら８．５分で流出する小さいピークはそ
のスペクトル的性質に基づいてＣＹＴｃ、！％Ｉとして
同定できた（第３Ｂ図）。ピーク頂点における５　５３
／２８０の吸光度の比は０．４であった。１の値は純度
９０％と考えられるから、不純物が依然存在する。それ
にもかかわらず、残りのピーク面１＋二対するＣＹＴＣ
ｓｑ＊のピーク面積から判断して実質的な精製が達成で
きた。同一・の条件下における１、２％ポリアクリル酸
無水物のカラムでのクロマトグラフィーも同様の結果を
与えた（第３Ｃ図）。一般にこの担体は無水コハク酸の
カラムより僅かに保持的であり往っ僅かに選択的であり
、混合物を１０に対し１２の明確なピークに分離した。

この場合にもＣＹＴｃｓ、を保持時間５）、４分におけ
る可視吸収によって同定した。

ピーク最大値におけるスペクトル分析は約０．４５の５
５３／２８０の吸光度比を示した。

以１一本発明をその好適な具体例を参照しで記述してき
たけれど、他の具体例も同一の結果を達成することがで
きる。本発明の変化及び改変は同業者には明白であり、
本発明の精神及び範囲に入る如きすべてのそのような改
変及び同等物は特許請求の範囲に包含されろものとする
。。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ図はチ１クロームＣ−リゾザイム
蛋白質混合物の分離に基づく４種の選択したカチオン交
換カラムのクロマトグラフィーによる評価を示すグラフ
であり、 第２図は４種の選択したカチオン交換カラムにおけるリ
ゾザイムの保持をｐ■１の関数として示すグラフであり
、そして 第：（（Ａ、Ｂ）及び（Ｃ，Ｄ）図はチトクロームＣ５
５３を含有するＡ、７Ｃｌスーアクアエ（ｆ　ｌｏｓ　
−ａｑｕａｅ）［アル〃工（ａｔピａｅ）、抽出物の２
種の選択したカチオン交換カラムのクロマトグラフィー
による評価を示すグラフである。 １４間（々） 手　続　事由　ｊＥ　　書く方式） 昭和６２年８　Ｊ］２７　Ｅ＋ 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第］、１３６９９号 ２、発明の名称 カチオン交換性材料 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　パーデユー・リサーチ・ファウンデーション４
、代理人　〒１０７ ５　補（Ｆ命令の日付　　昭和６２年７月２８目（発送
日）６、補ＩＦの対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 ７　補正の内容 １　明細書の図面の簡単な説明の欄の記載をト記（７）
通り訂正する； （１）明細群第３５や２行に［第１Ａ、Ｒ，Ｃ及びＩ）
図１とあるを ｌ「第１国、η に、；１止する。 〈２〉同３５　Ｙ′ｆ９　’ＩＩに［第３　（Ａ、　ｌ
−１）及び（ｃ。 １”））１夕１１とあるを 「第３１ツ１．Ｉｌ に訂ＩＦする。。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）吸着物に対して親和性をもつ表面を有する担体
   材料を用意し； ｂ）該担体材料の表面を、アミン基を含んでなる吸着物
   と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電力に
   よって該表面に吸着させ；そしてｃ）吸着したコーティ
   ングのアミン基を、該コーティングを架橋させ且つ少く
   とも１つの、好ましくは多くの、カルボキシル基を生じ
   させるのに十分な量の多官能性試剤と反応させる、 工程を含んでなるカチオン交換材料の製造法。 ２、多官能性試剤が親水性重合体を含んでなる特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、工程ｃ）におけるアミンと多官能性試剤の反応に、
   第３級アミンを含んでなるプロトン捕捉剤を添加する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該担体材料がシリカ、アルミナ及びチタニアからな
   る群から選択される無機担体材料である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ５、該吸着物がポリエチレンイミン、１，３−ジアミノ
   −２−ヒドロキシプロパン、テトラエチレンペンタイミ
   ン、及びエチレンジアミンからなる群から選択される特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、該吸着物が溶媒中に含まれ且つ吸着が少くとも部分
   的に該溶媒の極性を調節することによって確立される特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、親水性重合体が重合体無水物を含んでなる特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 ８、重合体無水物がポリアクリル酸無水物を含んでなる
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、該カチオン交換材料を液体クロマトグラフィーにお
   ける充填材料として使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １０、該クロマトグラフィー充填材料を、蛋白質又は他
   の生物学的重合体を分離するために用いる特許請求の範
   囲第９項記載の方法。 １１、ａ）吸着物に対して親和性をもつ表面を有するシ
   リカ担体材料を用意し； ｂ）該担体材料を、ポリエチレンイミンを含んでなる吸
   着物と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電
   によって表面に吸着させ；そして ｃ）該吸着したポリエチレンイミンコーティングを、プ
   ロトン捕捉剤の存在下に、該コーティングを架橋させ及
   びカルボキシル基を生じせしめるのに十分な量のポリア
   クリル酸無水物と反応させる、 工程を含んでなるカチオン交換材料の製造法。 １２、ａ）吸着物に対して親和性をもつ表面を有する担
   体材料を用意し； ｂ）該担体材料の表面を、アミン基を含んでなる吸着物
   と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電力に
   よって該表面に吸着させ； ｃ）該表面に吸着した該コーティングを架橋させ；そし
   て ｄ）該吸着した架橋コーティングの少くとも１つの、好
   ましくは多くのアミン基を、少くとも１つの、好ましく
   は多くのカルボキシル基を生じせしめるのに十分な量の
   試剤と反応させる、 工程を含んでなるカチオン交換材料の製造法。 １３、工程ｃ）におけるアミンと多官能性試剤の反応に
   、第３級アミンを含んでなるプロトン捕捉剤を添加する
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、該担体材料がシリカ、アルミナ及びチタニアから
   なる群から選択される無機担体材料である特許請求の範
   囲第１２項記載の方法。 １５、該吸着物がポリエチレンイミン、１，３−ジアミ
   ノ−２−ヒドロキシプロパン、テトラエチレンペンタイ
   ミン、及びエチレンジアミンからなる群から選択される
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １６、工程ｄ）における試剤が多官能性である特許請求
   の範囲第１２項記載の方法。 １７、該多官能性試剤が親水性重合体を含んでなる特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、該親水性重合体が重合体無水物を含んでなる特許
   請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、該重合体無水物がポリアクリル酸無水物である特
   許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、工程ｄ）における試剤が単官能性である特許請求
   の範囲第１２項記載の方法。 ２１、該単官能性試剤が親水性単量体である特許請求の
   範囲第２０項記載の方法。 ２２、親水性単量体が単官能性の環式無水物を含んでな
   る特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、単官能性無水物が無水グルタル酸、無水コハク酸
   、無水ジグリコール酸及びテトラヒドロフラン−２，３
   ，４，５−テトラカルボン酸二無水物からなる群から選
   択される特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、該表面を、エポキシ樹脂及びアルキルブロマイド
   からなる群から選択される架橋剤にさらす、ことによっ
   て該吸着したコーティングを架橋する特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 ２５、該吸着物が溶媒中に含まれ且つ吸着を少くとも部
   分的に該溶媒の極性を調節することによって確立する特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 ２６、ａ）吸着物に対して親和性をもつ表面を有する担
   体材料を用意し； ｂ）該担体材料の表面を、アミン基を含んでなる吸着物
   と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電力に
   よって該表面に吸着させ；そしてｃ）吸着したコーティ
   ングのアミン基を、該コーティングを架橋させ且つ少く
   とも１つの、好ましくは多くの、カルボキシル基を生じ
   させるのに十分な量の多官能性試剤と反応させる、 工程を含んでなる方法によって製造されるカチオン交換
   材料。 ２７、多官能性試剤が親水性重合体を含んでなる特許請
   求の範囲第２６項記載のカチオン交換材料。 ２８、工程ｃ）におけるアミンと多官能性試剤の反応に
   、第３級アミンを含んでなるプロトン捕捉剤を添加する
   特許請求の範囲第２６項記載のカチオン交換材料。 ２９、該担体材料がシリカ、アルミナ及びチタニアから
   なる群から選択される無機担体材料である特許請求の範
   囲第２６項記載のカチオン交換材料。 ３０、該吸着物がポリエチレンイミン、１，３−ジアミ
   ノ−２−ヒドロキシプロパン、テトラエチレンペンタイ
   ミン、及びエチレンジアミンからなる群から選択される
   特許請求の範囲第２６項記載のカチオン交換材料。 ３１、該吸着物が溶媒中に含まれ且つ吸着が少くとも部
   分的に該溶媒の極性を調節することによって確立される
   特許請求の範囲第２６項記載のカチオン交換材料。 ３２、親水性重合体が重合体無水物を含んでなる特許請
   求の範囲第２７項記載のカチオン交換材料。 ３３、重合体無水物がポリアクリル酸無水物を含んでな
   る特許請求の範囲第３２項記載のカチオン交換材料。 ３４、ａ）吸着物に対して親和性をもつ表面を有する担
   体材料を用意し； ｂ）該担体材料の表面を、アミン基を含んでなる吸着物
   と接触させて、該吸着物の薄膜コーティングを静電力に
   よって該表面に吸着させ； ｃ）該表面に吸着した該コーティングを架橋させ；そし
   て ｄ）該吸着した架橋コーティングの少くとも１つの、好
   ましくは多くのアミン基を、少くとも１つの、好ましく
   は多くのカルボキシル基を生じせしめるのに十分な量の
   試剤と反応させる、 工程を含んでなる方法によって製造されるカチオン交換
   材料。 ３５、工程ｄ）における試剤が多官能性である特許請求
   の範囲第３４項記載のカチオン交換材料。 ３６、該多官能性試剤が親水性重合体無水物を含んでな
   る特許請求の範囲第３５項記載のカチオン交換材料。 ３７、工程ｄ）における試剤が単官能性である特許請求
   の範囲第３４項記載のカチオン交換材料。 ３８、親水性単量体が親水性の単官能性環式無水物を含
   んでなる特許請求の範囲第３７項記載のカチオン交換材
   料。 ３９、該担体材料がシリカ、アルミナ及びチタニアから
   なる群から選択される無機担体材料である特許請求の範
   囲第３４項記載のカチオン交換材料。 ４０、該表面を、エポキシ樹脂及びアルキルブロマイド
   からなる群から選択される架橋剤にさらすことによって
   該吸着したコーティングを架橋する特許請求の範囲第３
   ４項記載のカチオン交換材料。 ４１、工程ｄ）において、吸着した架橋コーティングの
   すべての反応性アミン基を、大きい分子例えば蛋白質に
   近づけないものを除いて、カルボキシル基を生じせしめ
   る試剤と反応させる特許請求の範囲第１２項記載の方法
   。