JPS63245700A - 新規ｃＤＮＡプロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 ヒトの主要組織適合性複合体である白血球抗原及（ＨＬ
Ａ）は、臓器等の移植に重要なかかわりをもつ。本発明
は、このＨＬＡの型判別法に関するものである。

〈従来の技術〉 ＨＬＡの型判別法は、従来血清学的または細胞学的方法
により行われている。即ち、ＨＬＡのクラスＩ抗原であ
るＡ、Ｂ、Ｃ及びクラス■抗原のうちＤＲ，ＤＱの各抗
原は血清学的方法、換言すれば特異抗体と補体を用いた
リンパ球障害テストにより型別の判定が行われている。

またクラス■抗原のうちＤ抗原はＭ　Ｌ　Ｃ（Ｍｆｅｄ
　ＩｙａｐｈｏｃｙｔｅＣｕｌｔｕｒｅ）法で、ＤＰ抗
原及Ｐ　Ｌ　Ｔ　（ＰｒｉｉｅｄＬｙｗ＋ｐｈｏｃｙｔ
ｅ　Ｔｙｐｉｎｇ）法でそれぞれ判定されて°いる。

〈発明が解決しようとしている問題点〉最近ＨＬＡに関
する研究が進展し、ＨＬＡの遺伝子の同定、更には遺伝
子のクローニングが行われるようになった。ＨＬＡは高
度の遺伝的多型性を持つ抗原であるので、クローニング
された遺伝子をプローブとして用い、遺伝子ＤＮＡの制
限酵素切断パターンの違いからＨＬＡ型の判定をする試
みがなされた（例えば１．ＨＬ　ＡクラスｎＤ１Ｎ抗原
に対して試みた特許出願公開　昭５８−１３００００　
＞。ＨＬＡクラス■抗原にはＤＲのみならず、ＤＳＤＱ
、ＤＰ、Ｄｏ、等の抗原が含まれるが、これらの型のＤ
ＮＡ上や多型性を利用した判別法は未だ確立されるに到
っていない。

く問題点を解決するための手段〉 本発明は、ＨＬＡクラスＩＩＤＱ抗原及びＤ抗原の型判
別を遺伝子ＤＮＡの多型性に基づく制限酵素切断パター
ンの違いにより判定することを特徴とする。そのために
は、多型性を検出するためのプローブＤＮＡの取得と、
試料ＤＮＡの切断に際して適切な制限酵素を選択するこ
とが必要である。

ＤＱ抗原α鎖遺伝子に対するｃＤＮＡのクローニングと
塩基配列の決定を以下のように行った。

ＤＱ膜抗に関してＤＱｗｌ型をホモ接合体としてもつこ
とが判明しているヒト由来の細胞株ＡＫＩＢＡ（＋（。

ｌＮ０ＫＯら、Ｐｒｅｓｅｎｔ　　ａｎｄ　　ｆｕｔｕ
ｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　　ｏｆｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ、東海大学出版、１９８５）から以下
に記す方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＤＱ膜抗
のα鎖に対するｃＤＮＡを含むクローンを単離した。即
ち、ＥＢウィルスで形質転換し、株化したＡＫＩＢＡ細
胞をｌＧ％ウシ胎児血清を加えたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６
４０で培地で培養し、細胞を凍結保存した。約１０１個
の凍結細胞を液体窒素下で破砕し、緩衝液（０，１Ｍ）
リス−塩酸、ｐ）（９，０，１％ＳＤＳ。

２５ａＭ　ＥＤＴＡ、　　１ａ＋Ｍ　ＤＴＴ、　Ｏ，１
Ｍ　ＮａＣ１゜２００ｍＭ　バナジル・リボヌクレオシ
ド複合体を含む）と混合する。この混合液と等量のＯ，
１Ｍ　　）リス緩衝液で飽和したフェノール液を加え、
よく撹拌してたんばく質を変性除去する。この操作を数
回繰返した後、全ＲＮＡ画分を取得する。オリゴ（ｄＴ
）カラムを用いて、全ＲＮＡよりＰ　ｏｌｙ（Ａ　）”
ＲＮＡを分取し、更に、ショ糖密度勾配遠心により目的
とするａＲＮ　Ａを多く含む両分を分取する。

このＲＮＡ画分に、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を
加え、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成せしめる。更１
こ、ＤＮＡポリメラーゼのＫ　ｌｅｎｏｗ−ｆｒａｇｌ
ｅｎｔを用い、二本鎖ＤＮＡとする。得られた二本鎖ｅ
ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ処理してからｄＣ−ｔａｉｌ
ｉｎｇを行なう。一方、プラスミドｐＡ　Ｔ　１５３を
制限酵素Ｐｓｔｌで切断後ｄＧ−ｔａｉｌｉｎｇしたも
のを用意し、前記のｄＣ−ｔａｉｌｉｎｇしたｃＤ　Ｎ
　Ａとアニーリングする。得られたｃＤＮＡ挿入プラス
ミドを大腸菌ｘ　１７７Ｂに形質転換する。このように
して、ＤＱ抗原α鎖遺伝子の一部の塩基配列を含むプラ
スミドｐＤＣα１０７を得た。このプラスミドＤＮＡに
ライて、Ｍ　ａｘａｍ−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ法又はＳ　ａ
ｎｇｅｒ法に準じた方法に従うことにより、塩基配列を
決定した。

ＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡ　ＡＴＡＴ
ＧＡＴＣＣＴ　ＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴ
ＧＧ　ＧＧＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴ
ＧＡＴＯＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧ　　ＴＧＡＡＧ
ＡＣＡＴＴ　　ＧτＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣ
ＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡ　　ＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡ
ＧＴＴＴＴＡＣＧＧ　　ＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴ
ＴＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡ　　ＴＧＧＡＧＡＴ
ＧＡＧ　　ＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡ
　　ＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧ　　ＡＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣ
Ｔ一方、ＨＬＡの型判別をＤＮＡの多型性を利用して行
なう場合、試料は通常判定すべき個人から採取した血液
を用いる。約２　Ｘ　ｔＧ’個の血球を集め、ＰＢＳに
分散させたものに、３倍量の緩衝液（５ｈＭ　トリス−
塩酸、ｐＨ８，０，２０講Ｍ　ＥＤＴＡｌｌｏｈＭ　Ｎ
　ａＣ１，１％　５ＤＳ）を加えて細胞を溶解させる。

プロテアーゼ処理、フェノール抽出により除たんばく後
、リボヌクレアーゼ処理してＲＮＡを除く。これに２倍
量の冷エタノールを添加して不溶化した高分子ＤＮＡを
得る。このＤＮＡを制限酵素で切断して分析に供するが
、この時適切な種類の制限酵素を選定することが型判別
を明瞭に行う上で必要である。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れは本発明の範囲を何ら制限するものではない。

〈実施例１〉 第１図の上欄に記号をもって示された１３種類のヒト由
来細胞株のＨＬＡｆｆｉを調べた。これらの細胞のＨＬ
Ａ型は従来用いられている血清学的方法およびＭＬＴ法
によりＤＲ型、およびＤＱ型に関して判別されている。

試料細胞から高分子ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉを用いて切断した後、アガロース・ゲル電気泳動によ
り断片長による分別を行う。ゲルからナイロンメンブレ
ンにＤＮＡ断片を移行させた後、ＨＬ’ＡクラスＩＩ　
　ＤＱ抗原α鎖に対するｃＤＮＡをプローブとしてハイ
ブリダイゼイシクンを行うと、第１図に示すようにそれ
ぞれ１７．６．６．５．６．２．８　ｋｂｐの鎖長をも
つ４種類の断片の組合せによるパターンが得られた。こ
のパターンを整理すると１７　ｋｂｐおよび６．６　ｋ
ｂｐ断片の有無により、試料細胞群のＨＬＡ　　ＤＱ膜
抗の型を２群に大別できた。更に、ＤＱ抗原型で大別し
た一方の群はＨＬ　Ａ　　Ｄ　Ｒｗ　５２型を同時に有
し、他はＨＬＡＤ　Ｒｗ　５３型を同時に有することが
判明した。

〈実施例２〉 実施例１で用いたものと同じ試料ＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔｌで切断し、同じａＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
イションを行なうと、第２図に示すようにそれぞれ１８
．９．０．５．９．２．５．１．８　ｋｂｐの鎖長をも
つ５種類の断片の組合せによるパターンが得られた。こ
のパターンを整理すると　１８．５．９．２．５　ｋｂ
ｐ断片の有無により試料細胞群のＨＬＡＤＱ抗原の型を
２群に大別できた。更にＤＱ抗原型で大別した一方の群
はＨＬＡＤＲｗ５２型を同時に有し、他はＨＬ　Ａ　　
Ｄ　Ｒｗ　５３型を同時に有することが判明した。

〈発明の効果〉 ＨＬＡ　　ＤＱ膜抗の型判別は従来血清学的方法で行わ
れている。この方法は、予めＤＱ膜抗の各型に対する抗
血清を用意しておく必要があり、高い力価をもつ抗血清
を常に確保することは大きな努力を要する。本発明で提
供するＤＮＡの遺伝的多量に基づく制限酵素切断片のパ
ターンの多様性をＨＬＡ　　ＤＱ抗原遺伝子に対するｃ
Ｄ　Ｎ　Ａをプローブとして解析する方法は、その簡便
性において従来の方法より優れている。実施例において
示したように、多数の試料に対しても一つのプローブＤ
ＮＡを用いればよく、複数の制限酵素を用いることによ
り判定の精度を高めることができる。

本発明で提示したＨＬＡ　　ＤＱ抗原α鎖に対するｃＤ
ＮＡプローブは、ＤＱ膜抗のｗ５２、ｗ５３両型の判別
にも利用できることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、株化ヒト細胞より抽出したＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲ１で切断し、ＤＱ膜抗α鎖ｃＤＮＡをプローブ
とした時の断片分布を示す。 第２図は、株化ヒト細胞より抽出したＤＮＡを制限酵素
Ｐｓｔｌで切断し、ＤＱ膜抗α鎖ｃＤＮＡをプローブと
した時の断片分布を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＨＬＡクラスII　ＤＱ抗原（ヒト白血球抗原）及び
   Ｄ抗原をＤＮＡの多型性を利用して型判別する時に使用
   するｃＤＮＡプローブ。 ２、ＤＱ抗原のα鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡで下記
   の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡプローブ。 【遺伝子配列があります】 ３、特許請求範囲第２項記載の塩基配列を含むプラスミ
   ド。 ４、特許請求範囲第１項記載のプローブを用いてＨＬＡ
   　ＤＱ抗原及びＤ抗原をＤＮＡの多型性を利用して型判
   別する時に制限酵素としてＰｓｔ I およびＥｃｏＲ I
   を用いること。