JPS63111467A

JPS63111467A - 免疫測定方法

Info

Publication number: JPS63111467A
Application number: JP25697986A
Authority: JP
Inventors: Norio Hagi; 規男萩; Nobuko Mitoma; 三苫　伸子
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1986-10-30
Publication date: 1988-05-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は免疫測定法に関する。更に詳しくは、サンドイ
ッチ法による酵素免疫測定の為のキット構成物について
、抗体がマイクロタイタープレートに固定化されている
ものに、さらにこれに標識抗体を加え、凍結乾燥し、こ
れにより免疫測定する方法に関する。

（従来の技術）一般に血清、尿等の生体試料中に含有される微量物質、
例えば蛋白質類の含有量を測定するサンドイッチ法酵素
免疫測定用のキットを製造する際には抗体の結合した支
持体と標識抗体とを別々に保管することが多い。また、
通常、このようなキットは試験管を用いて行われること
が多く、その場合一般的に抗体の結合した支持体は、プ
ラスチック製のビーズを用いられる。掟って、検体を測
定する際には、抗体の結合したビーズ等を試験管に入れ
、これに検体及び標識抗体を入れ、インキエペートする
という操作が必要となる。この際のビーズを試験管に入
れること、さらに検体及び標識抗体をそれぞれの試験管
に入れるという手技なすべて行うということは、実際上
、極めて煩雑な操作であり、測定を行う者にとって大き
な負担となるものである。そこで、近年マイクロタイタ
ープレートにて、こういった酵素免疫測定を行うという
ことが簡便さという点から注目されている訳であるが、
この場合、マイクロタイタープレートにおいて固相支持
体に結合させるため抗体を測定する際の前処理として吸
着させたり、又は、既に抗体が固相支持体に結合させた
状態で測定者に供与されるということが行われている。

しかるに、後者の場合ですら測定者は検体、さらに酵素
標識抗体のマイクロタイタープレートへの分注トいう２
つの操作を行わなくてはならない訳である。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、マイクロタイタープレートを用いたサン
ドイッチ法による酵素免疫測定を行うにあたり、マイク
ロタイタープレートの各ウェルに第１抗体を固定化した
後、さらに酵素標識抗体を加え、それらを凍結乾燥する
ことにより、実際に測定する際、測定者が検体をマイク
ロタイタープレートに加えるだけの１操作にて抗原抗体
反応が起こり、検体中の抗原濃度を測定できるという知
見を見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の利点としては、マイクロタイタープレートを用
いることにより、操作が簡便となったこと、さらに抗原
抗体反応を行わせるにあたり、第１抗体及び酵素標識抗
体が既に内在しているため、検体を分注するだけの１回
の分注操作で良いということが挙げられる。又、第１抗
体及び酵素標識抗体は、凍結乾燥物として供与されるこ
とがらキ、トとしての安定化も期待できる。

本発明における第１抗体の固相への固定化及び酵素標識
抗体を加えての凍結乾燥は公知の手法を用いて行えば良
い。例えば、α０１〜１０μ９／−の抗体、１０〜３０
０μｔをマイクロタイタープレートの各ウェルへ分注し
、２〜８℃で、３〜２４時間放置して、抗体をマイクロ
タイタープレートへ吸着させる。この後、この抗体溶液
を除去した後、１０２〜２重量％の牛血清アルブミン溶
液、又は、牛血清を加えた抗体溶液よりも多い分址加え
（例えば１００μｔの抗体溶液を加えた場合には、１０
０〜３５０μｔの牛血清アルブミン溶液、又は、牛血清
を加える）２〜２５℃で、３〜２４時間放置することに
より、マイクロタイターグレートのウェルの蛋白質を吸
着させる部位をブロックしてしまう。次いで、このプロ
、キングに用いた牛血清アルブミン溶液、又は、牛血清
を除去した後、１０〜３００μｔの酵素標識抗体を加え
る。これを−８０℃〜−２０℃のインキ瓢ベーターに、
２〜２４時間置い装、凍結させた後、１０４〜１０−’
　ｔｏｒｒ　　の減圧下−２０’（：、０℃で、３〜１
６時間乾燥した後、さらに室温で２〜４時間乾燥させろ
ことによって、マイクロタイタープレートに凍結乾燥さ
れた第１抗体及び酵素標識抗体を得ることができる。

測定の際には、この測定用マイクロタイターフレートへ
水又は緩衝液にて希釈された試料を１００〜３００μを
加え、一定時間インキユベートした後、洗浄を行い、標
識物の検出を行う。すなわち、一定量の酵素基質を加え
、インキユベートし、その生成物の量を測定すれば良い
。

（発明の効果）以上の如（、本発明によれば、従来のキットよりも扱い
が簡便になり、また、その保存、輸送形態も標識抗体が
既にプレートに内在しているという点で簡素化される。

さらに不法によるキットにおいては、データの信超性も
回答問題ないことも特徴である。

（実施例）以下、本発明を実施例により更に説明するが、本発明は
これら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ヒトフェリチンのエンザイムイムノア、セイボリスチレ
ン製マイクロタイタープレートに、ヒトフェリチンのウ
サギ抗体１μ９／−を３５０μｔ−３’つプレートの各
ウェルに分注した。抗体を溶かす緩衝液として、５０ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９，６を用いた。これを４
°Ｃにて１夜静γｔした後、ＰＢＥＩ−Ｔ緩衝液（塩化
ナトリウム５９７ｔ、リン酸水素１カリウム（Ｋ鴇Ｐへ
）ＬＬ２ｇ７ｔ。

リン酸水素２ナトリウム（Ｎａ、ＨＰＱ、）　　１．１
５９　／　ｔ。

塩化カリウム０．．２９／ｌ、　　「ライ−：／２０Ｊ
　Ｑ、５ａｔ／Ｌ’を含むｐＨ７，４の水溶液）にて各
ウェルを洗浄し、さらにブロッキングのためα１重ｉ％
となるように牛血清アルブミンをＰＢＳ−Ｔ緩衝液に溶
解したもの（以下ブロッキング緩衝液と略す）３００μ
ｔを各ウェルに分注し、４℃で１夜静置した。その後、
各ウェルを（Ｌ８５重址％の塩化ナトリウム水溶液で洗
浄した。さらに１各ウエルに１００μｔの西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（１，０゜１．１）．１．７）で標識さ
れた抗ヒトフェリチンウサギ抗体を含む溶液を加え、−
８０℃の冷凍庫へ入れ、内容物を凍結した。次いで、こ
のプレートを１０−１〜１０−”　ｔｏｒｒの減圧下、
０℃で１６時間、さらに室温で３時間乾燥させることに
より、内容物を凍結乾燥し、免疫測定用グレートを得た
。

測定に当たっては、まず各ウェルに２０μｔの血清と３
００μｔのＰＢＳ−Ｔ緩衝液を加え、２５℃で３時間静
置した。次いで、プレートなＰＢｓ−ＴｔＩ衝液にて洗
浄し、これにペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ　
（ペーリンガーマンハイム社製：２．２−アジノージ−
〔５−エチルペンツチアゾリンスルホン酸ニアンモニウ
ム塩）及び過酸化水素を含むｐＨ４の緩衝液を２００μ
ｔずつ各ウェルに分注し、２５℃にて３０分間静置した
後、さらに各ウェルに１００μｔの反応停止液であるシ
ェラ酸溶液を加え、酵素反応を停止させた。

また、対照として凍結乾燥しない以外は、前記と同様に
した従来法も行った。

測定にあたってはプレートにあるＰＢＳ−Ｔ緩衝液を除
いた後、各ウェルに２０μｔの血清と５００μｔのＰＢ
Ｓ−Ｔ緩衝液を加え、２５℃で３時間静置した。次いで
プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液にズ洗浄し、これにペルオ
キシダーゼの基質であるＡＢＴＳ及び過酸化水素を含む
ｐＨ４の緩衝液を２００μｔずつ各ウェルに分注し、２
５°Ｃにて３０分間静置した後、さらに各ウェルに１０
０μｔの反応停止液であるシェラ酸溶液を加え、酵素反
応を停止させた。

ここで、ヒトフェリチンの濃度の既知のものを標準サン
プルとし、測定により得られた吸光度（４１５ｎｍ）と
から検量線を作成し未知濃度サンプルの濃度を決定した
。その結果を表１に示す。

注）１）ここで記載されたフェリチン濃度Ｏｎり／―のもの
は、正常人血清を抗ヒトフェリチンウサギ抗体を固定化
したカラムに通し、フェリチンを除いたものである。

２）既知濃度フェリチン溶液は、精製されたフェリチン
をフェリチン濃度Ｏｎｇ／Ｔｎｔの浴液（脱フェリチン
血清）にて希釈し、該濃度に設定したものである。

用い、４回同じ測定をくり返し、その再現性の結果を下
表に示す。

凍結乾燥しないで得たプレートにより同じサンプルの測
定をくり返し、その再現性の結果を下表に示す。

実施例２ベーター２−ミクログロブリンのエンザイムイムノア、
セイポリスチレン製マイクロタイタープレートにヒトベータ
ー２−ミクログロブリンのウサギ抗体１μ９／ｇｔｆｚ
（２００μｔずつプレートの各ウェルに分注した。抗体
を溶かす緩衝液は、実施例１と同じ（５０ｍＭ炭酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ９，６を用いた。これを４℃にて１夜
静置した後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液にて各ウェルを洗浄し、
さらにプロ、キング緩衝液５００μｔを各ウェル罠分注
して、４℃で１夜静置した。その後、各ウェルをα８５
・重量％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに各
ウェルに２５．５０，１００μｔのアルカリ性ホスファ
ターゼ（Ｅ、　０．１．Ａ１．３）で標識された抗ヒト
ベーター２−ミクログロブリン　ウサギ抗体を含む溶液
を加え、−８０℃の冷凍庫へ入れ、内容物を凍結した。

次いで、このプ・レートを１０′〜１０＝ｔｏｒｒの減
圧下０℃で１６時間、さらに室温で３時間乾燥させるこ
とにより内容物を凍結乾燥し、免疫測定用プレートを得
た。

測定にあたっては、各ウェルに蒸留水にて１０００倍に
希釈された血清ｓｏｎμｔを分注し、２５°Ｃで５時間
静置した。次いでグレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液にて洗浄
し、これにアルカリ性ホスファターゼの基質であるバラ
ニトロフェニルリン酸ヲ１ｍＭ及び１　ｍ　Ｍ　Ｍｇ０
４を含むα５Ｍ２−アミノ−２−メチル−１−グロバノ
ール（ＡＭＰ）緩衝液ｐＨ１０を２００μｔずつ各ウェ
ルに分注し、２５℃にて静置した。その後、酵素標識抗
体溶液ルに加え、酵素反応を停止させた。ここで、ヒト
ベーター２−ミクログロブリンの濃度の既知のものを標
準サンプルとし、測定により得られた吸光度（４０５ｎ
ｍ）とから検ｆｋ線を作成し、未知濃度サンプル中のベ
ーター２−ミクログロブリンの濃度を決定した。

なお、対照として凍結乾燥しない従来法も行った。

測定にあたっては、プレートにあるＰＢＳ−Ｔ緩衝液を
除いた後、各ウェルに蒸留水にて１００倍に希釈した血
清２０μｔを分注し、これに２５μｔ、５０μｔ、１０
０μｔの酵素標識抗体溶液を加え、さらにそれぞれ２５
μｔの酵素標識抗体溶液添加外に対しては、２７５μｔ
、５０μｔＫ対しては２５０μｔ、１００μｔに対して
は２００μｔの蒸留水を加え、２５℃で３時間静置した
。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液にて洗浄し、こ
れにアルカリ性ホスファターゼの基質である１ｍＭパラ
ニトロフェノールリン酸及び１ｍＭ　　Ｍｇ０Ｌ、を含
むｐＨ１０の緩衝液を２００μｔずつ各ウェルに分注し
、２５℃にて静置した。

その後、酵素標識抗体溶液を２５μｔずつ分注したもの
については１００分後、５０μを及び１００μｔずつ分
注したものについては５０分後に酵素反応停止液を１０
０μｔずつ各ウェルに加え、酸素反応を停止させた。こ
こで、ヒトベーター２−ミクログロブリンの濃度の既知
のものを標準サンプルとし、測定により得られた吸光度
（４０５ｎｍ）とから検量線を作成し、未知濃度サンプ
ル中のベーター２−ミクログロブリンの濃度を決定した
。その結果を表２．３．４に示す。

表２　酵素標識抗体浴液を２５μｔずつ加えた系米　ベ
ーター２−ミクログロブリン１）ベーター２−ミクログロブリン濃度０μ９／−のも
のは牛血清をそのまま用いたものである。

２）ベーター２−ミクログロブリンの各濃度は、牛血清
に精製されたベーター２−ミクログロブリンを添加し、
所定濃度に調整したものである。

未知サンプルによる再現性試験表３　酵素標識抗体溶液を５０μｔずつ加えた系出来　
ベーター２−ミクログロブリン１）ベーター２−ミクログロブリン濃度０μｇ／−のも
のは牛血清をそのまま用いたものである。

２）ベーター２−ミクログロブリンの各濃度は牛血清に
精製されたベーター２−ミクログロブリンを添加し、所
定濃度に調整したものである。

表４　酵素標品抗体浴液を１００μｔずつ加えた系米ヘ
ーター２−ミクログロブリン１）ベーター２−ミクログロブリン濃度０μ９／−のも
のは、牛血清をそのまま用いたものである。

以上の如く、本発明によれば従来のキットよりも扱いが
簡便になり、また、データの再現性についても回答問題
がないことがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗体が結合したマイクロタイタープレートに標識
抗体を加え、凍結乾燥し、次いで試料を注入し免疫測定
することを特徴とする免疫測定用材料の測定方法。
（２）免疫測定方法がサンドイッチ法であることを特徴
とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）標識方法に酵素を用いることを特徴とする特許請
求の範囲第（１）項又は第（２）項記載の方法。