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JPS63102678A - アミラーゼ酵素並びにその生成方法 - Google Patents

アミラーゼ酵素並びにその生成方法

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Publication number
JPS63102678A
JPS63102678A JP62212660A JP21266087A JPS63102678A JP S63102678 A JPS63102678 A JP S63102678A JP 62212660 A JP62212660 A JP 62212660A JP 21266087 A JP21266087 A JP 21266087A JP S63102678 A JPS63102678 A JP S63102678A
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JP
Japan
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enzyme
amylase
starch
pullulanase
maltose
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Application number
JP62212660A
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JPH0364106B2 (ja
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メラスニエミ　ハンネス
コルホラ　マッティ
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Alko Oy AB
Original Assignee
Alko Oy AB
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Publication date
Application filed by Alko Oy AB filed Critical Alko Oy AB
Publication of JPS63102678A publication Critical patent/JPS63102678A/ja
Publication of JPH0364106B2 publication Critical patent/JPH0364106B2/ja
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
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    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新しいタイプのアミラーゼ、即ち、澱粉から
マルトースシロップを生成し得る方法によって高温で且
つ安定化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ（ｐｕｌ
ｌｕｌａｎａｓｅ）酸素に関する。この可溶性の酵素は
、デキストリン若しくは低分子量の可溶性澱粉を含む培
養媒体上でクロストリジウム属のサーモハイドロサルフ
ァリキュム（ｔｈｅｒｍｏ−ｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉ
ｃｕｍ）変種（ｓｔｒａｉｎｓ）が生長する時、該変種
によって培養媒体中に生成される。
（従来の技術） 澱粉のグルコース単位（ｕｎｉｔｓ）は、主にα−１゜
４−グルコシドの結合基（ｌｉｎｋａｇｅｓ）によって
互いに連結され長い主鎖を形成する。加えて、澱粉はα
−１，６−グルコシドの結合基を有し、これは上記主鎖
の側鎖部分に結合基として存在する。
α−アミラーゼは、主鎖に沿って澱粉の１．４結合基を
アトランダムに切り（ｃｌｓａｖｅ）、一方α−アミラ
ーゼは非還元性の主鎖末端で同様の結合基を切る。これ
に対しプルラナーゼは、枝切酵素であって分岐点の１．
６−結合基を切る。
マルトースシロップは、植物（ｐｌａｎｔ　）β−アミ
ラーゼをして澱粉を加水分解することにより、もしくは
糸状菌（ｍｏｌｄ）α−アミラーゼを糖化してバクテリ
ア性α−アミラーゼを用いて液化された澱粉を更に加水
分解することにより調製される。
いずれの方法によってもおよそ６０％のマルトースを含
むマルトースシロップが得られる。プルラナーゼとα−
アミラーゼを併用すればこれにより高い収率のマルトー
スが得られる。マルトースシロップは、特有のマイルド
な甘み、低粘度、低吸湿性及び高熱安定性の由に菓子及
びパン製造業において主に用いられている。
（発明が解決しようとする問題点） もし用いられる酵素が高温で活性且つ安定であれば、澱
粉の加水分解工程にとって好都合である。
しかし、β−アミラーゼ、糸状菌α−アミラーゼ及び肝
炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
　）及び桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等の商業的に有用
なプルラナーゼは６０℃以上の温度では使用不可である
。このように高熱安定性の麦芽糖酵素（ｍａｌｔｏｇｅ
ｎｉ　ｅｎｚｙｍｅ）はマルトースシロップの生成に好
適である。
もしいくつかの酵素を工程中に用いんとすれば、酵素の
安定化条件（ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎ
ｔｓ　）に関して中間物（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ　）
を形成すること、若しくは遷移中（ｉｎ　５ｕｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ　）に酵素を用いること及び中間工程を調整を
することのいずれかが通常必要とされる。簡略化及び経
済性の点から、単一の酵素が工程にとって満足するもの
であるならばより望ましいであろう、この理由から、マ
ルトースシロップの生成に用いられべき理想的な酵素は
、液化性、糖化性且つ澱粉の枝切能（ｄｅｂｒａｎｃｈ
ｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ）を備えているべきである。
Ｈｙｕｎ及びＺｅｉｋｕｓ（１９８５：　Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｅ、４９，１１６８）は、米国イエローストン
国立公園のオクトパス温泉（ｈｏｔ　０ｃｔｏｐｕｓ　
ｓｐｒｉｎｇ）から単離されたクロストリジウム属のサ
ーモハイドロサルファリキュム変種Ｅ３９（ＡＴＣＣ３
３２２３）により澱粉を分解することについて研究した
。この変種は、細胞結束（ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ）　し
たプルラナーゼ及びゲスコースアミラーゼは生成すこと
はあってもα−アミラ−ゼを生成することはない。上記
変種Ｅ３９から得られる製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｓ）は、中間生成物として観察されグルコース、マルト
ース以外のマルトトリオース若しくはマルトテトラオス
を生成しながら澱粉を加水分解する。
（問題点を解決する為の手段） 本発明で述べられている酵素は前述のアミラーゼとは異
なる。なぜなら、該酵素は、同じ蛋白質分子中に２つの
分離された酵素活性基、α−アミラーゼ及びプルラナー
ゼが共存する全く新しいタイプのアミラーゼ即ちα−ア
ミラーゼ−プルラナーゼである。
本発明で述べられているα−アミラーゼ−プルラナーゼ
酵素は澱粉を分解してマルトースとマルトトリオースに
する。
本発明によるα−アミラーゼ−プルラナーゼの生成物は
、１９６９年にオーストラリア砂糖工場で単離された（
Ｈｏｌｌａｕｓ　＆　Ｋｌａｕｓｈｏｆｅｒ、１９７３
　：　Ｉｎｔ。
Ｓｕｇａｒ　Ｊ、、７５，２３７−２４１及び２７１−
２７５　）クロストリジウム属のサーモハイドロサルフ
ァリキュム変種Ｅ１０１−６９（Ｄ　Ｓ　Ｍ　３７８３
）及びＥ　１００−６９（Ｄ　Ｓ　Ｍ５６７）と共にｗ
Ｒ察された。変種Ｅ１００−６９は、バクテリア性りロ
ストリジウム属のサーモハイドロサルファリキュムの新
しいタイプの変種である。クロストリジウム属のサーモ
ハイドロサルファリキュ１１変種Ｅ１０１−６９は、１
９８６年７月３日に上記の如く寄託番号ＤＳＭ３７８３
としてドイツの微生物寄託所（Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏ
ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託された。
変種Ｅ１００−６９はそれより以前に同じ寄託所（ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）にその発見者によって寄託された。
サツ力ロミケスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅ−ｒｅｖｉｓｉａｅ　）酵母のいくつかの変種
のうち、エタノールを生成す為炭素源としてマルトース
及びマルトトリオースが用いられ得る（Ｓｔｅｗａｒｔ
　＆　Ｒｕ５ｓｅｌ。
１９８３　：　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐ−１ｉｅｄ　
Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｐ、４６１．ｅｄｓ、Ｊ、５ｐｅｎｃ
ｅｒ、Ｄ、５ｐｅｎｃｅｒａｎｄ　Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　
ｓ　ａ　−アミラーゼ−プルラナーゼはとりわけ澱粉を
これら糖分の混合物に分解するので、α−アミラーゼ−
プルラナーゼをつぶした酵素（ｍａｓｈｉｎｇ　ｅｎｚ
ｙｍｅ）として用いることによって酵母菌によって澱粉
からエタノールが生成され得る。
（実施例） 添付の実施例図は、以下の如く本発明に係るα−アミラ
ーゼ−プルラナーゼの特性を示すものである。
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基の温度
特性を、第２図は８５℃（Ａ）及び６０℃（Ｂ）におけ
α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性を、第
３図は基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　）及びカルシウムを
含まない緩衝剤中での異なった温度におけα−アミラー
ゼ−プルラナーゼの不活性度を、第４図は高温度でのカ
ルシウムによるα−アミラーゼ−プルラナーゼの安定性
を、第５図は異なった温度における精製α−アミラーゼ
−プルラナーゼによる澱粉の加水分鮮度を、第６図は異
なった温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼによ
って形成された最終生成物の薄層クロマトグラムを、夫
々示す。
酵」賀Ｊ１基！ｌ乞ζ α−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性度は、これらに
より純粋なアミロース（ポテトから得たタイプｍ　：　
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、、Ｓｔ
、Ｌｏｕｉｓ、Ｍ。
６３１７８ＵＳＡ）及びプルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）
　−（Ｓｉｇｍａ）から遊離した糖分の減少速度を測定
することにより同定した。２５μＱの酵素を、２ミリモ
ルのＣａＣｌ２．０．１ミリモルのＮａ２−ＥＤＴＡ、
及び５０ミリモルのＮａＣ１を含みＰＨ５，６に調整さ
れた１００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中０．５％
濃度の基質１ｍｌに添加した。チューブ（ｔｕｂｅｓ　
）を８５℃で１５分間保温した後、Ｎｅ１ｓｏｎ　−Ｓ
ｏｍｏｇｙｉ法（Ｎｅｌｓｏｎ。
１９４４　；　Ｊ　、ＢＩＯＩ　−Ｃｈｅｗ　−１１５
３＋　３７５　；　ＳｏｍｏｇＹ　ｉｇ　１９５２　：
Ｊ　−８−ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１９５，１９　）によ
り糖分の減少量を決定した。上述の分析において、α−
アミラーゼ若しくはプルラナーゼ酵素１単位により遊離
された砂糖の減少量は、無水グリコースの１０億分の１
モルに対応する。アミロースをＨＣＩで中和された１モ
ルＮａ０ｔ（溶液に導入し、上記緩衝剤を添加し、最後
に１．２　μｎ　ＲＡＷＰ膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ　Ｃｏｒｐ、。
Ａｓｈｂｙ　Ｒｏａｄ　Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡＯ１７３
０，ＵＳＡ　）を用いて濾過した。
蛋白質をＬｏｗｒｙの方法（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、
、１９５２　；　Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎａ、、耳＋３，２５６）によりオヴ
アルブミン（Ｓｉ−ｇｍａから提供）を標準として同定
した。
使用媒体の組成 成分　　　　　　　　　　　　　　　　　ｔ／Ｑ可溶性
澱粉（Ｚｕｌｋｏｗｓｋｙによる）　　　　　　　２０
．０（Ｅ、＋ｎｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｆｅｄ
ｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍ−ａｎｙ
） 抽出酵母菌（Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）　　　　　
　　　５．０（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）トリプ
トン　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０（Ｄｉ
ｆｃｏ） 抽出肉（Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ）　　　　　　　　　　　
　５．０（Ｏｘｏｉｄ　　Ｌｔｄ、、Ｂａｓｉｎｇｓｔ
ｏｋｅ＋Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）ＫＨ２
Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．８
に２ＨＰ０４・３Ｈ，０１１，４ ＦｅＳＯ，・７Ｈ２０Ｑ、０２ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０１ ＣａＣ１ｚ　・ｚｏ、ｏ　　　　　　　　　　　　　　
　　　ｏ、ｏｔＰＨ６，８ 生酵素（ｒａｗ　ｅｎｚ　ｍｅ）の特性化ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）変種ＥＩＯＩ−６９を、レザズ
リン１■／Ｑ及びチオグリコール酸２００μＱ／ｆ２を
事前に加えた上記媒体上で、６８℃非酸化条件下（ａｎ
ａｅｒｏｂｉｃ　ｃｏｎｄｉｔ−ｉｏｎｓ　）３０時間
、攪拌なしで２Ｑフラスコ中で培養した。細胞を遠心分
離により取り除き、その後硫酸アンモニウムに７０％飽
和させることにより、α−アミラーゼ−プルラナーゼの
生製剤が表面に浮いた培養媒体から分離沈殿し、そのα
−アミラーゼの活性基は５２０単位／ｍ２　（Ｕ　ｍＱ
　−”）及びプルラナーゼ活性基は１５５０単位／ｍＱ
　　となった、該酵素の本来的性質のいくつかは、１２
０００単位／　ｒｍ　Ｑのα−アミラーゼの活性基及び
３７０００単位／ＩＩＱのプルラナーゼ活性基を有する
この生製剤を用いることにより特徴付けられた。
酵素の雨活性基共、希釈した生酵素（１２００単位／　
ｍ　Ｑのα−アミラーゼ及び３７００単位／　ｍ　Ｑの
プルラナーゼのα−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性基
を上述のり方法（Ｐ１０〜１１）により異なった温度で
決定すると、最適温度は８５℃（第１図）となった。
両活性基の最適ＰＨは、８５℃で同定した場合（第２図
Ａ）いずれも５．６であり、６０℃で同定した場合（第
２図Ｂ）であった、ここで図中数値１００は面温度条件
におけ最も高い活性基数を示す。
希釈された生酵素（３０単位のα−アミラーゼ及び９０
単位のプルラナーゼ）２５μＱを、ＰＲが異なった値に
調整され且つ０．５％のアミロース若しくはプルラン５
０ミリモルのＮａＣ１及び１０ミリモルのＣａＣ１□含
む１００ミリモルのクエン酸ナトリウム１ｍＡに添加し
た。その後チューブを８５℃若しくは６０℃で１５分間
保温し、遊離した糖分の減少度を同定した。
両活性基は６０℃で安定であるが、１００ミリモルの酢
酸ナトリウム緩衝剤中、ＰＨ５，６、異なった温度で保
温した時には両者共高温の同条件では不活性となり、α
−アミラーゼ及びプルラナーゼの最終濃度は夫々８００
単位／　ｍ　Ｑ及び２４００単位／　ｍ　Ｑとなる。残
余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性基は、上述
の方法（Ｐ１０〜１１）により図に示さ゛れた時間に採
取されたサンプル５０μＱを用いて同定した。
カルシウムイオンは、高温で同様に両活性基を安定化し
た（第４図）。生酵母を、ＰＨ５，６で異なった量のカ
ルシウムを含む１００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤
中に添加し、α−アミラーゼの最終濃度８００単位／　
ｍ　Ｑ　　及びプルラナーゼの最終濃度２４００単位／
ＩＩＩＱ　　を得た。これを８５℃、９０℃及び９５℃
で２時間保温した。残余のα−アミラーゼ及びプルラナ
ーゼの活性基を上述の方法（Ｐ１０〜１１）により５０
μ２のサンプルを用いて同定した。
酵素の精糖 可溶性のα−アミラーゼ−プルラナーゼ酵素を変種ＥＩ
ＯＩ−６９の流体培養基から以下の如く情調した。該変
種を、１１頁で述べた媒体中２２８フラスコ内で攪拌せ
ずに６８℃、４０時間非酸素雰囲気下（ａｎａｅｒｏ　
ｂｉｃａｌｌｙ）で培養した。細胞を遠心分離により取
り除いた後、小麦澱粉（ＢＤＩＩ　Ｃｈｅｍｉｃ−ａｌ
ｓ　Ｌｔｄ、＋Ｂｒｏｏｍ　Ｒｏｏｄ、Ｐｏｏｌｅ　Ｂ
Ｈ１２４ＮＮ、Ｅｎｇｌａｎｄ）１５ｇ／Ω及びナトリ
ウムアジド２００ｍｇ／Ｑを冷たい表面浮遊物質に添加
し、次いで冷間で９０時間攪拌し酵素を澱粉に吸収させ
た。その後澱粉を２４時間静置し、表面浮遊物質を除去
し、更に底に溜った澱粉ケーキを２１２の氷冷水に懸濁
させ且つ遠心分離することにより洗浄した。吸収酸素を
、ホットバス中で抽出し、２・１／２Ｑの６０℃温水と
混合し、且つ遠心分離すことにより澱粉から脱離した。
抽出物はＰＨ５，６に調整された強酢酸ナトリウムを用
いることにより２０ミリモル調製され、同じ緩衝剤を用
いて平衡化された２、６Ｘ１５ｃｍのＤＥＡＥセルロー
スカラム（ＤＥ５２　；　Ｖｈａｔｍａｎ　ＬｔｄｖＳ
ｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ　Ｍｉｌｌ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ
＊ＫｅｎｔｔＥｎｇｌａｎｄ）に作用せしめた。該カラ
ムを上記平衡化された緩衝剤で洗浄し、次いで最初に１
００ミリモルの塩化ナトリウムでその後２００ミリモル
の塩化ナトリウムにより同緩衝剤中で溶出させた。強塩
（ｓｔｒｏｎｇ−ｅｒｓａｌｔ　）を用いて得られた溶
出液を合体させ、ＰＭＩＯ薄膜を備えた限外濾過室（Ａ
ｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、Ｄ−ａｍｖｅｒｓ　Ｍａｓｓ
ａｃｈｕＳｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて２１１ＩＩＱに
濃縮した。
サンプルをＰＨ７，０のリン酸カルシウム緩衝剤１０ミ
リモルに接触的に（ａｇａｉｎｓｔ）透析しくｄｉａ−
１ｙｚｅｄ）、同緩衝剤を用いて平衡化された２、６×
１３ｃｍの水酸化リン灰石カラム（Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｈ
Ｔ、Ｂｉ。
Ｒｅｄ、１４１４　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｗａｙ　５ｏｕｔ
ｈ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒ−ｎｉａ　９４
８０４．ＵＳＡ　）に作用せしめた。該カラムは最初に
平衡化された緩衝剤で洗浄し、次いでＰＨ７の１ｏ−４
００ミリモルのリン酸カルシウムを用いて徐々に溶出さ
せた。酵素を溶離した結果、活性度のピーク部に連なっ
てそれより明らかに活性度の低い肩部が所見された。ピ
ーク部で溶出された成分（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　）は上
記の如く合体され、濃縮されて容積１ｍＱとなる。
濃縮サンプルを、ＰＨ６，５，５０ミリモルの酢酸アン
ムニウム緩衝剤中で５ｕｐｅｒｏｓｅ　”　１２及び６
ゲルを結合した濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ
ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、υｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄ
ｅｎ　）中、６ｍＱ／１１の速度で２００μΩのバッチ
毎に通過させた。酵素は２つの隣接するピークを持って
溶離され、これらピークに対応する物質（Ｉ及び■）は
凍結乾燥される。この段階における製剤工の明確なα−
アミラーゼ活性基は３９キロ単位／■（ＫＵ■−１）で
あり、またその明確なプルラナーゼ活性基は１０１キロ
単位／■、更に製剤Ｈの明確な活性基は夫々３６キロ単
位／■及び９０キロ単位／■であった。
両展剤をその後６モルのグアニジンハイドロクロライド
及びβ−メルカプトエタノールの存在する変性条件下で
、５ｕｐｅｒｏｓｅ　丁Ｍ６カラムを用いてゲル濾過し
た。これらの条件下では一般の蛋白質はその全ての非共
有結合構造を消失しＲつそのサブユニットに分離される
ことが観察され（Ｔａｎｆｏｒｄ。
１９６ｇ、Ａｄｖａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、、
２３，１２１）でいる。ゲル濾過の前に上記サンプルを
次のような組成、即ち、７．３モルのグアニジンハイド
ロクロライド、０゜１モルの酢酸ナトリウム、０．０２
モルのＥＤＴＡ、０．５モルのβ−メルカプトエタノー
ルを有するＰＨ８，１の緩衝剤サンプルに溶解した。こ
れらサンプルを５０℃、４時間保温し、ＰＨを５゜０に
調整し且つ該サンプルを６モルのグアニジンハイドロク
ロライト、１００ミリモルの酢酸ナトリウム、２０ミリ
モルのβ−メルカプトエタノールより成るＰＨ５，０の
緩衝剤中１＋ｎＱ／ｈ　の流速で２００μ悲のバッチ毎
に通過させた。酵素が溶出された成分を合体し、ＰＨ７
，９の２０ミリモル炭酸水素アンモニウム緩衝剤に接触
的に透析した。斯くして得られた復元酵素製剤は、ドデ
シル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）−ポリアクリルアミ
ドの勾配ゲル電気泳動（参、リーフレット、Ｃａ１ｉ−
ｂｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔｓ　ｆｏｒ　＋ａｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ−ｔｉｏｎ　
ｕｓｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　：”Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅａ＊１ｃａｌｓ、　
Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ＋１９８２　）により均
一化され、グアニジンハイドロクロライド中でゲル濾過
が遂行され、その結果酵素の特性化に用いられた。
酵　に・する　水化物の結合 精製されたα−アミラーゼ−プルラナーゼは炭水化物を
含有していた。加水分解後、該酵素は、０．２モルのＮ
ａＨｚＰＯ４と、ノルマルブタノール、アセトン及び水
の溶離剤としての混合液（４：　５　：１、Ｖ／Ｖ）と
により湿潤されたシリカゲル６０プレート（Ｎｕ　５５
５３．Ｅ、Ｍｅｒｃｋ　）上で薄層のクロマトグラフィ
ーにマンノース、グルコース、ガラクトース及びラムノ
ース（ｒａｍｎｏｓｅ　）と同じ移動度を有する糖分を
分離した。マンノースを標準としてＡ−ｎｔｒｏｎ法（
Ｓｐｉｒｏ、１９６５　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｔｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙｙＶｏ１．８．ｐ、３）により
中性ヘキソースを同定したところ、中性ヘキソースの量
は蛋白質と中性ヘキソースの全量の１０％と算出された
。
酵母の分子量 ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）４／３０ゲル（ｐｈ−ａ
ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）との
５ＤＳ−ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動は、α
−アミラーゼ−プルラナーゼが異常に高い分子量を有す
る唯一のサブユニットから成ることを示した。酵素サブ
ユニットについて得られた相対的（ｒｅｌａｔｉｖｅ　
ｍ−ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｖｅｉｇｈｔ）は、製剤Ｉを用
いた場合１９００００±３００００　、製剤■を用いた
場合１８００００±３００００であった。自然の（ｎａ
ｔｉｖｅ）操作条件で、同じゲルを用いた場合、変性の
α−アミラーゼ−プルラナーゼについて得られた相対的
分子量は、製剤Ｉを用いた場合３７００００±８５００
０　、製剤■を用いた場合３３００００±５ｓｏｏｏで
あった。勾配ゲル電気泳動により酵素から得られる帯（
ｂａｎｄｓ）は非常に拡がっていた。
一方、グアニジンハイドロクロライドのゲル濾過によ場
合は、シャープで対称なピークが相対的分子量２７５０
００±５ｏｏｏｏに対応する点で得られた。この方法は
製剤■及び製剤■の両方を含むサンプルではその区別が
つかなかった。
異なった温度での澱粉の加水分解 基質が存在するとα−アミラーゼ−プルラナーゼが安定
化され、６０℃ばかりでなく８０℃でも澱粉を加水分解
するのに該酵素を用いることが可能となった（第５図）
、１００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中に０．５％
のコーンスターチ（Ｓｉ−ｇｍａ）、２ミリモルのＣａ
Ｃ１，，０，１ミリモルのＮａ２−、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
、５０ミリモルのＮａＣ１を含み且つＰＨ５，６のチュ
ーブ内に精製化されたα−７ミラーゼープルラナーゼを
α−アミラーゼが４８０単位／　ｒｍ　Ｑ及びプルラナ
ーゼが１１００単位／ｍＱの状態で添加した。該チュー
ブを６０’Ｃ，７０℃及び８０℃の温度で保温し、これ
らの還元糖分は図に示す時間毎に採取したサンプルから
同定した。加水分解率（％）は、希釈酸を用いて（０，
５Ｎ　ＨＣＩ、１００℃、３時間）グリコースに加水分
解された基質中に存在する還元糖分量に対し、サンプル
中に存在する還元糖分量を比較することにより算出した
。
酵素により形成される　終生酸物 α−アミラーゼ−プルラナーゼにより形成された最終生
成物を次の如く同定した。緩衝剤（１００ミリモルの酢
酸ナトリウム、２ミリモルのＣａＣｌ２．０．１ミリモ
ルのＮａ、−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、５００ミリモルのＮａＣ
１、ＰＨ５，６）中央々アミロース（ポテトによるタイ
プ■）、プルラン及びコーンスターチ（全てＳｉｇｍａ
による）の０．５％溶液を調製し、精製化されたα−ア
ミラーゼ−プルラナーゼの製剤Ｉ若しくは■を該溶液に
添加し、これらを８０℃に保温した。酵素は２種の濃度
、即ちα−アミラーゼが４８０単位／　ｍ　Ｑ　　及び
プルラナーゼが１１００単位／ｍＱの場合（＝　Ｉ　Ｘ
）と、その１０倍強の場合（＝１０Ｘ）とを用いた。２
４時間後及び４８時間後の加水分解物から採取したサン
プルをシリカゲル６０プレート（Ｎ＋１５５５３．Ｅ、
Ｍｅｒｃｋ）上で滴定し、２−プロパツール、アセトン
及び水（２：２：１、Ｖ／Ｖ）の混合液で溶離させた。
精製化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ（ＩＸ）は
、プルランをマルトトリオースに分解するが、一方ポテ
トアミロース及びコーンスターチは両者共マルトースと
マルトトリオースに分解された（第６図）。高濃度の酵
素（１０Ｘ）を用いたときには、マルトトリオースは更
に分解されことが観察された（第６図）、この場合、７
７％のマルトース、１５％のグルコース及び４％のマル
トトリオースが４８時間の加水分解でコーンスターチか
ら生成された。マルトース及びマルトトリオースは、ニ
ュークレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　５　Ｃ１，の
逆相物質（ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｍａｔｅｒ
ｉａｌｓ）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇ−ｅｌ、Ｄ−５
１６０Ｄｕｒｅｎ、Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ
　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）及び溶離剤として水を充填し
たカラム中液体クロマトグラフィーにより定量した。ま
た、グルコースは酵素活性を利用して（ＬＩＶ　ｔｅｓ
ｔ　ｋｉｔ　Ｎａ　７１６２５１゜Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｆｅｄｅ
ｒａｌ　Ｒｅｐｕｂ−１ｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒ＋５ａｎｙ
　）定量した。加水分解生成物のパーセンテージは、希
釈酸を用いて（０，５Ｎ　ＨＣＩ、１００℃、３ｈ）グ
ルコースに加水分解された基質の量に対するこれらの量
を比較すことにより算出した。
変種Ｅ　１０１−６９及びＥ　１００−６９の比較変種
Ｅ　１０１−６９及びＥ　１００−６９を、レザズリン
１ｍｇ／Ｑ及びチオグリコール酸２００μＱ／Ｑを添加
した前述の媒体上で６８℃、２４時間、振とうさせるこ
となく非酸化性条件下で培養した。細胞を遠心分離によ
り取り除き、その表面より部分的に精製されたα−アミ
ラーゼ−プルラナーゼ製剤が生成した。該α−アミラー
ゼ−プルラナーゼは変種Ｅ　１０１−６９の場合２１キ
ロ単位／ｍｇの明確なα−アミラーゼ活性基及び６３キ
ロ単位／ｍｇの明確プルラナーゼ活性基を、変種Ｅ　１
００−６９の場合２０キロ単位／Ｂのα−アミラーゼ活
性基及び５６キロ単位／ｍｇのプルラナーゼ活性基を夫
々有している。
これら製剤を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに通した
後、両者共わずかな弱い帯と、加えて事前に均一状態に
精製された変種Ｅ　１０１−６９のα−アミラーゼプル
ラナーゼと同程度の移動度をもって移動する強い拡散し
た帯とを示した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基の温度
特性を、第２図は８５℃（Ａ）及び６０℃（Ｂ）におけ
α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性を、第
３図は基質及びカルシウムを含まない緩衝剤中での異な
った温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼの不活
性度を、第４図は高温度でのカルシウムによるα−アミ
ラーゼ−プルラナーゼの安定性を、第５図は異なった温
度における精製α−アミラーゼープルラナーゼによる澱
粉の加水分解塵を、第６図は異なった温度におけα−ア
ミラーゼ−プルラナーゼによって形成された最終生成物
の薄層クロマトグラムを、夫々示す。 （”Ｃ） ＦＩＧ、　　１ ＦＩＧ、　　２ 保温時間（ｍｉｎ） ・α−アミラーゼの活性基 ０プルラナーゼの活性基 ・　温度　８０・Ｃ ＦＩＧ、５ Ｇ１　　　　　ψ　　　　　　　　　　　　　　　　争
　　Ｉ　　ΦＧ２　　　・　嗜　　・　拳・　Φ　・Ｇ
３　　　　・　響　１＊＠ｅ　　　　ゆＧ４　　　Ｉ　
　　　　　　　　　　　　　　　・１２３４．５６７８ ４）コーンスターチ＋ＩＸ　　１．２４ｈ；ＦＩＧ、　
　６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、１個且つ同質（ｏｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ
    ）の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性基及びプルラナー
    ゼ活性基を備え、これら活性基の作用によって澱粉をマ
    ルトース及びマルトトリオースに分解し、その酵素即ち
    該酵素の遺伝情報を取り込むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
    ）の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がクロストリジウム属の
    変種（ｓｔｒａｉｎ）に依拠していることを特徴とする
    アミラーゼ酵素。 ２、ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動により決定
    された相対分子量が、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下
    では１８５０００±４００００である特許請求の範囲第
    １項記載の酵素。 ３、両酵素活性基の適性温度は略８０乃至９０℃、望ま
    しくは略８５℃であり、適性ＰＨは８５℃のときＰＨ５
    −６、望ましくは５．６、６０℃のとき４．５−５．５
    、望ましくは５．２である特許請求の範囲第１項又は第
    ２項記載の酵素。 ４、酵素がクロストリジウム属サーモハイドロサルファ
    リキュム変種を用いて生成される特許請求の範囲第１項
    、第２項及び第３項いずれか記載の酵素。 ５、クロストリジウム属サーモハイドロサルファリキュ
    ム変種を、澱粉若しくは澱粉加水分解物上で、温度４２
    ℃−７８℃望ましくは５５℃−７５℃、ＰＨ６−８望ま
    しくは略ＰＨ７で培養し、酵素を復元させるようにした
    ことを特徴とするアミラーゼ酵素の生成方法。 ６、１個且つ同質の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性基
    及びプルラナーゼ活性基を備え、これら活性基の作用に
    よって澱粉をマルトース及びマルトトリオースに分解し
    、その酵素即ち該酵素の遺伝情報を取り込むデオキシリ
    ボ核酸の配列がクロストリジウム属の変種に依拠してい
    るアミラーゼ酵素を温度６０℃以上、ＰＨ４−６．５で
    澱粉若しくは澱粉加水分解物に反応せしめることを特徴
    とする澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及び
    マルトトリオースを生成する方法。 ７、ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動により決定
    された相対分子量が、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下
    では１８５０００±４００００である特許請求の範囲第
    ６項記載の生成法。 ８、両酵素活性基の適性温度は略８０乃至９０℃、望ま
    しくは略８５℃であり、適性ＰＨは８５℃のときＰＨ５
    −６、望ましくは５．６、６０℃のとき４．５−５．５
    、望ましくは５．２である特許請求の範囲第６項又は第
    ７項記載の生成法。 ９、酵素がクロストリジウム属サーモハイドロサルファ
    リキュム変種を用いて生成される特許請求の範囲第６項
    、第７項及び第８項いずれか記載の生成法。
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