JPS6281567A - 粒子凝集反応を用いる定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、物質同志の特異的な結合、例えば、抗原抗体
反応などを利用した定量方法に関する。

（従来の技術） 免疫学的反応を利用した免疫測定法は、特異性、感度に
すぐれ、医療分野などにおいても、頻繁に利用されてい
る。中でもラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）　、エン
デイムイムノアノセイ（ＥＩＡ　）は感度、精度に優れ
、微量分析の分野では代表的なものである。ＲＩＡにつ
いては、１９５９年パーンンとヤロウがインスリン測定
法として用いたのをきっかけに世界中に広まシ、現在で
はタンパク質はもちろんホルモン、ウィルス、薬剤等に
も広く応用されている。しかし、その一方で、ＲＩ用の
特殊設備の必要性、ＲＩ汚染物の廃棄問題、ＲＩ標識物
の減衰などの問題があり、非放射性標識物の研究もさか
んに行われてきている。ＥＩＡは、こうした研究の中か
ら生まれてきたもので、発表された当時は、数年後には
、すべてＲＩＡとおきかわるだろうとさえ言われていた
方法である。たしかに安全であシ、標識物の安定性が比
較的良く、抗原抗体結合型と遊離型との分離、いわゆる
Ｂ／Ｐ分離のいらないホモジニアスな系での測定が可能
であるといった長所もあるが、検出に酵素反応という生
物学的なものを利用しているといった不安定な要素もあ
る。また感度についても、測定物質によってはＲＩＡ以
上といった例はあるが、一般的にはＲＩＡよシ落ちると
言われておシ今一つＲＩＡにとって代わるに至らないの
が実情である。

一方、抗原（又は抗体）を担持した微粒子、例えばラテ
ックス粒子に、抗体（又は抗原）を作用させた際に起こ
る凝集をプレート上で肉眼的に判断する゛ラテックス凝
集法”というものかあシ、その簡便性、迅速性も手伝っ
て、近年繁用されている。これについては、視覚に頼る
という定性的な面や感度が落ちる面などから、微量分析
にはむいていないとされているが、最近このラテックス
凝集を数値化する測定法が開発され、注目されている。

例えば、凝集塊の生成を透過率の変化としてとらえたＬ
ＰＩＡ　（Ｌａｔｅｘ　Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｉｍ
ｍｕｎｏ　−ａｓｓａｙ　）について、「検査と技術」
誌第１２巻第７号第５８１頁（１９８４年）に、ＬＡ　
（ＬａｔｅｘＡｇｇｌｕｐｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ　）について、「医用電子と生体工学」誌
第２２巻第４号第３９頁（１９８４年）に紹介されてお
シ、また未凝集の粒子を計測するＰＡＣＩＡ　（Ｐａｒ
ｔｉｃｌｅ　ＣｏｕｎｔｉｎｇＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
　）が、ｒ　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈ、　Ｊ
誌の第１８巻第３３頁（１９７７年）に紹介されている
。

その他、特開昭５８−１９０７６０．特開昭５９−１７
３７５９゜特開昭５６−１５１３５７などにも、ラテッ
クスを利用した技術が公開されておシ、これらの技術は
、測定対象によってはＲＩＡの感度に匹敵するといわれ
ている。

医療分野において、生体内の物質の変化によって病変等
を知ることはよく行われるが、この際一つのパラメータ
ーの変化のみから正確な判断を下すことは困難な場合が
多い。例えば、腫瘍マーカーとじては代表格のＣＥＡに
ついても、臓器に対する特異性、あるいは良性疾患での
偽陽性などの未解決の問題があるといわれている。こう
した問題の解決のためには、いくつかのノソラメーター
を見て総合的に判断することが必須である。しかし、現
状では知りたい・ぐラメ−ターの数だけ測定を繰シ返・
すか、あるいは各・ぐラメ−ターの総和としての変化を
とらえることができるだけで、同時多項目の測定が可能
になった例がない。そのため、医師の労力はもちろんの
こと採血等による患者の負担、あるいは結果が出るまで
の時間も無視できないものがあった。また測定対象が血
液成分の場合、不純物、妨害物質等の影響で感度が落る
ことも多条あるとされている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上に述べた問題点を解決するためになされた
ものであり、いわゆる”ラテックス凝集法″に代表され
る物質同志の特異的な結合反応により、感応物質を担持
した微粒子の凝集状態を測定する方法を改良して一締体
中の複数の榊溜Ｉ窒物質の量を、同時にかつ正確迅速に
測定する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段と作用）前記目的を達成
するためのこの発明の概要は、検体中のｎ種の被測定物
質のそれぞれの量を、被測定物質のそれぞれと特異的に
結合するｎ種の感応物質をそれぞれ担持させた粒径のそ
ろっている微粒子を利用して測定する方法であって、粒
径の大きさによって、及び／又は螢光物質あるいは染料
による標識づけによって、ｎ種に判別できる該微粒子を
用い、各々の種類の粒子にそれぞれの被測定物質と特異
的に結合する前記ｎ種の感応物質をそれぞれ担持させた
ものを試薬とし、試薬と検体とを接触させ、その結果生
じた微粒子の凝集状態を測定し、測定結果を微粒子の種
類ごとにグループ分けして集計して、ｎ種の被測定物質
のそれぞれの量を測定することを特徴とする粒子凝集反
応を用いる定量方法である。ここで、ｎは、２以上の自
然数である。

物質同志の特異的な結合反応の代表的なものは、抗原抗
体反応であるが、それ以外にも、ホルモンとレセプター
、糖とレクチンなどの反応も利用が可能である。

抗原抗体反応を例にとシ、本発明の内容をさらに詳しく
説明する。測定対象が抗原となシ得るもの（ハシラン等
も含む）であれば、それに対応する抗体を微粒子に担持
させておく。測定対象によっては、抗原・抗体が逆の組
み合わせであってもよい。

本発明では、複数の物質を、同時に定量する為に、微粒
子（０，１〜３０μ程度の粒径のそろったもの）を予め
、複数のグループに判別できるように構成しておく。例
えば、粒子の径を複数のレベルにそろえておくこともで
きるし、螢光物質あるいは染料によって標識づけするこ
ともできる。また、これらの組合わせによって、より多
くのグループ分けができる。粒子を螢光物質で標識づけ
する場合、螢光物質の有・無又は濃度、螢光の種類（例
えば、フルオレッセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　）
とＰＩ　（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ　）を使
用）などによシ、複数のグループに判別できる。そして
、既述のように粒径を組み合わせることによシ、さらに
多くの粒子群の判別が可能である。

微粒子としては例えば赤血球などの細胞、金属、リポソ
ーム等のマイクロカプセル、ポリスチレン等のラテック
ス粒子等が利用できる。

微粒子に所定の感応物質、例えば抗体を担持させるには
物理的に吸着させる方法、微粒子上の官能基を利用して
化学的に結合させる方法などが知られている。

感応物質とは、被測定物質と特異的に反応する物質をい
い、被測定物質が抗原である場合には、その抗原と特異
的に反応する抗体である。前述のように、被測定物質の
種類によシ、ホルモンとレセプター、糖とレクチンなど
も利用できる。

抗体−抗原反応利用を例に、本発明の詳細な説明する。

抗体を担持した微粒子を含む試薬を、抗原を含む検体と
接触させると、抗原・抗体反応によシ、粒子が凝集する
。検体中の抗原（即ち、被検定物質）の濃度が高い程凝
集の機会が大きく、凝集の程度が犬となる。従って、凝
集の程度、即ち凝集状態を測定すれば、検体中の抗原即
ち、被測定物質の量を知ることができる。但し、被検定
物質の濃度が一定以上高くなるといわゆる地帯現象がお
こシ凝集の程度は低くなる。従って精度よく測定するに
は、検体の濃度を適当にコントロールすることが必要に
なる。

凝集の状態の測定法としては、凝集粒子をプレノやラー
ドにし、又は、その顕微鏡写真をとるなどして視覚によ
り観察計数する方法、凝集粒子を含む溶液の吸光度や散
乱光を測定する方法などがあげられる。しかし、これら
の方法は精度の問題や、粒子の種類を区別することは一
般的には容易でない。

従って、好ましい実施態様としては、これらの粒子又は
凝集した粒子を一つずつ、フローサイトメトリー法で測
定する方法を挙げることができる。

フローサイトメトリー法とは、主として光学機器分析に
関するものであり粒子を１個ずつ流し、粒子にレーザー
光などをあてて、その散乱光を測定することによシ、粒
子の大きさ、色、或いは、予め粒子を螢光物質等で標識
づげしておき、その螢光強度測定等によシ粒子の形質を
測定するものである。又、いわゆるコウルターの原理に
よシ、粒子の容量（コウルターゴリウムという）を電気
的に測定する方法によるもの、これと光学測定とを合わ
せたものも利用されている。

凝集状態は、粒子又は凝集粒子塊を一つずつ、その大き
さ又は粒子が螢光等で螢光活性をもっている場合はその
螢光強度等を測定して、その各々について、粒子の凝集
状態（即ち、非凝集粒子か２．３，４，５．・・・個の
粒子が凝集しているか？）を判定することによシ測定す
る。ある１種の粒子群について凝集反応の、粒度分布の
測定例を模式的に第１図に示す。ｎ種の粒子群（ｎ種の
被測定物質）を測定する場合には、第１図に相当するグ
ラフがｎ個得られる。

粒子をｎ個のグループへ判別するには、例えば粒子径で
２グループ、螢光色素を２種類使用すれば、４グループ
の粒子を調整できる。さらに螢光色素を付着させない粒
子も調整すれば合計グループの粒子を調整できる。この
場合、６種の抗体を各グループの粒子にそれぞれ担持さ
せた試薬を、検体溶液と混合した測定液を、コウルター
＆　リウム測定機能と螢光強度測定機能とを併せもった
公知のフローサイトメーターで測定すると、粒子径と特
定波長の螢光の有無とによシ粒子のグループ分けが出来
、これに基づきグループ毎の粒径分布が得られる。

との粒径分布により、被測定物質毎の濃度が計算できる
。

尚このグループ分けには、特願昭６０−１３０８８２に
示されている弁別回路が利用できる。

ここに、１種類の粒子を使用して、ヒト血清アルブミン
（ＩＳＡ　）の測定用検量線を作成した、参考例を示す
。

（１）試薬の調整 粒径２．０２μｍの螢光色素含有のポリスチレンビーズ
（固型分１ｍ９）をホウ酸等張緩衝液（ＢＢＳ　）　（
ｐＨ８，２）にて洗浄、遠心分離した後、１０倍希釈し
た抗Ｈ８Ａヤギ抗血清を５　ｍｌ加え懸濁する。室温で
２時間、４℃で１晩沈降しない程度に攪拌し、抗体のビ
ーズへの吸着を十分に行った後洗浄しｐＨ７，４のリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）　（保護コロイドとして１１
　ＢＳＡを含有）１．２５ｍ１に懸濁する。２０分程度
超音波をかけ、再分散を促した後１％懸濁液として試薬
に供す。

（１１）検量線の作成 異なった濃度のＩＳＡを含む標準ｉ　（ＰＢＳ溶液）５
０μｌと上記の試薬５０μｌを混合し、しばらく静置し
た後、５　ｍｌのＰＢＳを加え希釈する。これをフロー
サイトメーターで分析する。分析結果は第２図に示す。

凝集状態の評価方法として、パラメーターとしてａ・・
・平均粒子体積、ｂ・・・単量体の個数／分析した個数
（チ）、Ｃ・・・二量体の個数／単量体の個数（％）な
どを計算して評価する方法があるが、測定条件によって
最も精度のよいものを選べばよい。第２図よシいずれの
パラメーターでも定量可能のことがわかるが、ａが最も
変化率が大きく、この測定に適していることがわかる。

（実施例） ヒトＩｇＧ　、　ＩｇＭの同時測定 （ｉ）試薬の調整 螢光色素を含むポリスチレンビーズ（２，９８μｍ）及
び含まないポリスチレンビーズ（２，９５μｍ＞各々に
、ＢＢＳ（ＰＨ８，２）中４℃でアフィニティー精製の
抗ヒトＩｇＧ　、抗ヒ）ＩｇＭ抗体を別々に担持させる
。十分に担持させた後洗浄し、　ＰＢＳ　（１％ＢＳＡ
含有）に懸濁させ、超音波処理し、各々を等景況合する
。こうして得られた両ビーズ各々１チの懸濁液を試薬と
して供す。

（１１）検量線の作成 ＩｇＧ　、　ＩｇＭの各濃度を含む標準液５０μｌと上
記試薬５０μｌを混合し、しばらく静置した後５　ｍｌ
のＰＢＳで希釈する。これをフローサイトメーターで螢
光色素の有無によって区別される各々の粒子ごとに凝集
状態を分析する。第３図に分析結果を示＋− この結果よシ本発明の方法により複数の被測定物質が、
同時に正確に定量できることがわかる。

（効果） 本願発明の方法によれば、検体中に含まれる、複数の被
測定物質を同時に正確に定量できる。

本発明は、物質どうしの特異的な結合、例えば抗原抗体
反応を利用した測定法、すなわち抗原（抗体）を担持し
た粒子に抗体（抗原）が接触した際に起こる粒子の凝集
という現象を利用した免疫測定法に関してであり、特に
粒子あるいは凝集塊一つ一つを分析することによって、
既存の方法では読み取れ匁い様なわずかな変化を察知し
、その結果として測定感度を上げ、同時多項目の測定を
可能にしたものである。この方法は、各種研究用の微量
分析をはじめとして、臨床検査、薬物の定量など広い分
野で利用できる。測定対象が、抗原となシ得るもの（ハ
シテン等も含む）、あるいは抗体であれば、どのような
分野でも応用可能であり、また抗原抗体以外にも、ホル
モンとレセプター、糖とレクチンにも応用できる。粒子
一つ−つを分析するには、例えば顕微鏡のような手段も
可能であるが、よシ好ましいのはフローサイトメ）　＋
７−（ＦＣＭ　）の応用である。抗原抗体反応による粒
子の凝集をＦＣＭで分析することによってホモジニアス
な系で未凝集粒子数、粒度分布、平均粒子容積などの／
ＩＰラメーターが測定可能で、ＬＰＩＡ。

ＬＡ　、　ＰＡＣＩＡ等に比べ、パラメーターの数が多
く、精度、感度、共によくなっている。また、ＦＣＭの
特性である螢光活性での測定を利用しているため、色素
の有無、量の変化、種類（螢光波長の差）などによる粒
子の区別が可能になシ、同時多項目の測定も容易である
。この方法によって、多項目よシの総合的な判断が必要
な疾患、例えば、心疾患、肝疾患、腎疾患、あるいは凝
固線溶系異常、悪性腫瘍等の診断が大いに簡便、迅速に
なると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、凝集反応の粒度分布曲線、 第２図は、Ｈ８Ａ濃度とａ・・・平均粒子体積、ｂ・・
・単量体の個数／分析した個数、Ｃ・・・二量体の個数
／単量体の個数、 の関係を示す検量線、 第３図は、実施例にあげた、ＩｇＭ　、　ＩｇＧの濃度
と平均粒子体積との関係を示す検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体中のｎ種の被測定物質のそれぞれの量を、被測
   定物質のそれぞれと特異的に結合するｎ種の感応物質を
   それぞれ担持させた粒径のそろっている微粒子を利用し
   て測定する方法であって、粒径の大きさによって、及び
   ／又は螢光物質あるいは染料による標識づけによって、
   ｎ種に判別できる該微粒子を用い、各々の種類の粒子に
   それぞれの被測定物質と特異的に結合する前記ｎ種の感
   応物質をそれぞれ担持させたものを試薬とし、試薬と検
   体とを接触させ、その結果生じた微粒子の凝集状態を測
   定し、測定結果を微粒子の種類ごとにグループ分けして
   集計して、ｎ種の被測定物質のそれぞれの量を測定する
   ことを特徴とする粒子凝集反応を用いる定量方法。 ２、特異的な結合が抗原・抗体反応であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、微粒子の凝集状態を、フローサイトメトリーによっ
   て測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の方法。