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JPS6270399A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

モノクロ−ナル抗体

Info

Publication number
JPS6270399A
JPS6270399A JP61110233A JP11023386A JPS6270399A JP S6270399 A JPS6270399 A JP S6270399A JP 61110233 A JP61110233 A JP 61110233A JP 11023386 A JP11023386 A JP 11023386A JP S6270399 A JPS6270399 A JP S6270399A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amylase
amy
monoclonal antibody
antibody
human pancreatic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP61110233A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0346116B2 (ja
Inventor
Shigeru Kurooka
黒岡 繁
Shingo Hiroishi
広石 伸互
Shigeyuki Matsuyama
松山 茂之
Toshiaki Kaneko
金子 利明
Noriyuki Sunahara
砂原 憲之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Shiraimatsu Shinyaku KK
Original Assignee
Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Shiraimatsu Shinyaku KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dainippon Pharmaceutical Co Ltd, Shiraimatsu Shinyaku KK filed Critical Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPS6270399A publication Critical patent/JPS6270399A/ja
Publication of JPH0346116B2 publication Critical patent/JPH0346116B2/ja
Granted legal-status Critical Current

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 n=”I= lの利用分野 本発明は、抗ヒ【膵ヤjα−アミーン−−[・(ツク1
−−Jル抗体(VJ +−1L’+: l’ −A m
 y (−ツク1−−lルli”1、体という)に閏4
゛る。
本イと明の4i’l、p−Anl Vモノク【I−リー
ルl’+’l、’体Cよヒト膵J(Iα−)′ミラー七
(以上、p  A m Vという)−二【二1呻戚4町
i−型α−アミリ−g<tノ干、S−Amyという)と
の分別定i1Fにイ1用である。血清の如きヒト体i1
に中の+1、− Anl VとS−Amyを分別定量す
れば、仲々の疾患、特に膵疾患の診断ができる。
従来技術および本発明か解/J! lんとする問題点血
清の如きヒト体液中のα−アミラーセの増減を知ること
は種々の疾患、特に膵疾し口の診断じず1141である
のてα−アミラー[の測定は高頻1!llテに実施され
る臨床検査JCIIIの・つとなっでいる。ヒトα−ア
ミつ一セには2神のアイソザイム、4゛なわちI’−A
 m yとS −A m yか知られでおり、総α−ア
ミラー1;話1メ1を測定するたけては1[硫な診m1
かできないこともあるので1記2(Iliのアイソザイ
l、の分別定1,1か行われでいる61η来の分別定1
11法としては、例えば電気泳動7〕、や阻害性などが
ある。
電気体ff1l+ iJ: lよ、各仲の支llf体1
に検体をス、1′ツトして泳動を?iい、分離]7たア
イソザイム・を染色し7、そノIh&さからl’−A 
+n yとS−ΔIn Vの活V1を2月るJ、法であ
る。(7か]7、このノノンノ、は、1)−八my、I
:S−Δm Vの分−1か′ゾ、二全でないのでjI碑
な分別定h1かできない。しかも、このiJ法は仝操4
1にI\待時間要するので多数の検体庖処理するしは全
く不都合である。
−・ノJ1ドIt :’; ’tノ、は、小麦由来のS
−A口]y tlll害剤を用い、その1111害率の
Z“からS−Δm Vと1)−Amyのi+% PI比
を、!l ’S’)’−Jるjノ7ノ、でアル。i h
)L、この勾法Let S−A m yに対する特:A
!的1!+1害度か低いために厳密な定7.1法である
とはいえない。更にこの1j法ではpi ;’;剤のド
]l害(lj:にIIソト間のX″かあるのでセ?f 
11” +lb腺をイ′11戊りなければなら1、その
イ′1成ζご[間かかかる。
との31うに従来f)、(j迅18Ii (i: 、定
j11. li′:’iの要、l’lりI角Ji!−J
るものではIルい。
ところで、!’ −A m yとS −A m y 、
!−LJ極めて再似したアミノ酸内11列庖イI’−J
ることか)11られており、その相同↑’l’ (h(
u+olo(Hy )は)(4% に達することか+v
 <’、されでいる[シーン(Gene) 28−21
i3−270(14184>]、、−!lなわち両名の
アミノ酸へ;列の1!古いは6%に1ぎない。従って、
このようなP−A m yまた(よS−AInyに対す
る[ツク1.’l−リル(起体は、これら個々の抗■巾
のわずかな違いを区別しで;jj識し得るものでな目れ
ばならない。またS−Amyと特異的に結合する抗S 
−A m yモ7り[I−リル抗体か7.・イ1する場
合、抗1’ −A m y七ツクI+ −−1ルi’1
’、体か認識jべき−Lピ1−ブ(1+i−、除法−」
′括)は更に狭い[i Dtlから選択されなければな
らないこJ−になる。このようにP−Amyと特異的に
L’i合一4るIA: l’ −A m yそツク■2
−リル(ん体を得ることば極めτ[ト1難である。
さらに、S −A m y 1.j市1しされているか
1)−八m y lよ山1股されていないため■) A
nlyの人工はS−Amyの’1! A J、りも容易
でな(、シ、h)0本発明者らの研究にJ、れげフロイ
ツト完全アジ1ノ1ントJ: :j(にヒl膵itkそ
のものを動物に投!)しても−1分免疫されないととか
見い出された。以1のことは抗1’ −A m yモノ
ク11−づル1!1、体の製ij’iをより−・層困難
なものにしている。
問題を解決−4るための■゛段 本発明はl・記の171竹庖イ1する抗1’ −A m
 yモ/り11−づル抗体に閏する゛ OP −A m yを認識する、 ■ 実質的に5−AInyを認識しない、@  f、’
A’、I!iiたる1)−Δrn yとの免役反応後に
わいても該酵素か失活しない。
本発明のモ7りI+−リル(61体11 、細胞融合技
7)、にJ、り製造できる。史に詳細には、本発明のモ
ノクr+ −−)ル抗体は次ノ(1) 〜(4) ノT
l’j 1す/、qわら、0) 抗ハ2ならびにB細胞
コ、+1製丁稈、(2)  融合・スクリー二/グ・り
u −、=、7り[稈、(H()  ・1イブリド〜マ
培養「稈、よjよび(・1)  心霊にW・じて?iわ
れる精製I稈、を実施覆ることにより得られる。以ト、
各1稈について説明する。
(1)  抗原ならびにB細胞コ、′J製I゛程13細
胞は坑外たるI” −Anlyで1分免疫した動物のl
l’l’臓より採取できる。
抗ハ;ミたるl’ −A m y lj高純度のものを
人1.」に用いるのか最も好ま[7い。しかし、P−A
myの純度+、1それ稈旨いものでなく?−も1分に[
I的は]仝成できる。例えば、ヒト膵液の部分精製物か
抗11;1として用いられる。ヒ1膵液からのP −A
 m yの部分精製は、例えば、硫安分画法にt)−F
)行える。
免疫は、抗1jiiたるf’ −A m yをマウスや
ラソ]の如き哺乳動物に投!Jすることにより?■える
。免疫条イノ1、例えばtji’、 b’、jたるp 
−A nl Vの使用lit s捺り部位、アジュ・凡
/トの種類やその使月目j) ”6の条(’lは、GY
来の抗血l−1を得る場合の条イ′1か採用される。通
常、免疫は、)11イツト完全アゾユ/1ノト、”: 
I” −A口]yり八む乳濁l(釜をマウスの如きll
l1iテ1.動物にJllfYII投すし、同様に12
て約1週間の間h′Aをわいて追加免疫をするととによ
り7■わねる。この111加免疫は、1〜7同行われる
。7.4柊免疫後11−511に1分q・疫した吐乳動
物の胛&、Yから13細胞を採取する。
(2)  融合・スクリーニング・り「1−、:ツク−
1″稈融合(j1融合促進剤の71貞1・、L、 Ri
’、 11細胞/jらびに公知のi′1髄1111′1
細胞(以十ミーr、 ++−マ細ポリという)を公知の
融合用無面清培111!にワそ濁し、これを〆1を合す
ることによりj1λる。
一般的にミニr、 TI−マ細胞は、−1稈(1)で用
いた被免疫動物と同秤の動物111来のものであ−うて
ハイブリトーマ選択培地でノ1: ?+できず、かつ、
それ自!′[か(il、体を分tjつしないものか好」
1.い。このようなミーT−r+−マ細胞としてζJ1
例えば市販されているマウスミニr、 r+−マ細胞1
署ト×63−八g8−旧あるいはこれ41−同等物か挙
げられる。
両細胞のikj合比は、通7:f 、  ミニr、 +
1−マ細胞1に対[711細胞1〜:)0である。細胞
融合<+r1准剤Jl、ては、例えばポリエヂレノクリ
:1−ルか用いられ、分(1+f 1,000〜7.5
(100J) 0 (Db”)f 1−L イ。
融合細胞、すなわちハイブリトーマの培養は、融合イ1
1准剤を洗11i除去しミコーローマ細胞用培地に9!
濁したハイブリドーマの0.1〜0.2 ml−J’っ
を≦)6穴培養冊(以下穴というこ吉もある)にまき、
約7(7°Cにおいて5%炭酸ガス−空気中でtA置す
るととによりtlえる。 培養中、IIAT tΔ地の
如き公知のハイシリトーマ選択培地を添加し、その割合
を徐々に高める。このような培地交換に、Lリハイブリ
ト−マ以外の細胞は死滅する。Ail?的には同様に【
7て、再びハイブリトーマ選択培地をミニ1−マ細胞用
培地、すなわちハイプリトーマ用培地と交換する。
]−1的とするハイブリt′−■のスクリーニングは、
’F’f 6 ’dk中の抗体価および交差10゛を調
べることにより行Aる。ずなわち、培谷液の一部に1’
 −A m yまたはS−Amyおよび後述の不溶化第
゛抗体を加え−C装置し、遠心し、得られるベレット中
の酵);活Mを後述の定h1法て測定することに、1−
りその抗体価および1)−八〇]yとS−Amyに対す
る交差の程度を知ことかできる。
スクリーニングしたハ・イゾリt−マについて限界孔部
1ノ、を適用することによりII的、lする実り1的に
1’ −A m yのみを認識するハイブリl−マが創
製できる。、:のハイブリ1−マは継代培養または律等
−1により丁永久的ζご保7/てきる。
(33)・入イブリトーマの培養r’、11前l稈て?
1またバイアfリトーマをinV己rOまたは10日V
(lて培養ずれば[I的のモノク1−リル抗体か’IP
rできる。
illν1troでの培養は、数個のハイ/すi・−マ
の91i穴培養皿中での培養から始め、徐)Zにスリー
ルアノブすることにより7Iえる。またin ViVO
での培Δは、融合細胞の増殖を容易にさせるためのブリ
スタ7 (pristane)処理をしたマウスにハイ
ブリl−マを蝮腔内に接種することにJ、り実施でき、
10〜20[1後にはモノクII−づル(41体を含む
腹水か諮積される。
一般に、+n v+troでの培養は高純度の千7り1
−リル抗体を得たいときに行われ、i II V i 
V (+での”M aはモノク1z−リル抗体を人けに
?1.またいときに9Iわれる。通常in ViV(l
での培養により、マウス1匹あたり10−100mgの
抗1’ −A m y モノク1−リル(41体か得ら
れる。免疫分掛にはiII  ViV(lでの培養で県
債された腹水をそのまま利用することもてきるが、必要
に応じ更に精製してもよい。
(1)  精製【稈 必要に応じで行われるリー枦1υ門での培養物または目
IViV(1の培養τ諮積された腹水からの千7り「1
−リル抗体の分111!E精製は、通常の物理化ぐi的
丁段、例Aば山折、遠心分F11t 、透析、不溶t’
l担体表結合しているブ1ティンAを用いるアフィニi
イーク【Jマドクラフィーの如き各種カラムラ11フ1
グシフイー等の1段を合理的に絹み合(することにより
行える。
かくして得られる本発明の抗r’ −A rn yモノ
ク「オーリル抗体は、I)−A m yとS−Amyと
を確実に識別できる。また、P−Amyは、本発明のモ
ノク11−リル抗体との免疫反応後においても、(氏分
子のl)−二) II 7−rニルマル)・\ブタ詞ン
1(以1−’ l’NI’という)(ベーリンガー マ
ノハイ18IJI旧1)や、!シ1分子の不溶t’l 
I’j色デ/プンボリマ−(第−化学薬品株式会ンりの
如き仲々の分子(,1の基質を分解することかできる。
本発明のモノク11−リール(1°L体はl” −A 
m yとS−A m yの分別定1.f川試檗と第2て
6用である。
1’ −A m yの定;、1は、 (D 検体に本発明のモ7りII−リールI;C(+を
加天で装置する「稈(免1才反L1′、−1t′lり、
■ II成する抗1j;i抗体沖合物とそ11以外のも
のを分離(コ111′畠工・k心分離)−4る1F′−
(IA□1(;」抗体?V合物分田117)、および ■ 分#t したI+’+’、 I!;!抗体複合物(
J!It常沈殿)中のα−アミシーセ’b”+ Mを測
定する1稈(α−ア  ミ  シ  −し +1111
  定  1  (“lり   、を実施することにJ
、す11λる。このよ^に本Jj法では的(と1)−A
myの活Iノ1夜知るこ↓−かできる。
p−−AIll VとS  rへIn Vとの分別定1
.1は、+jit記■のI稈で分離したト1゜19卜1
1体複合物およびそれ以外の0の(通′;:ζは1清)
のα−アミン I;話t’lを測定するたか、別に求め
た化α−アミー1−ゼ活P1から一1記のjJ′11.
により求めたI’ −A m y v)活t4’ 4差
し引くことにJ、り実施できる。
1” −A m yの定fit 1’、’稈(D〜■は
、4′へて約3’7″C゛前後て?1われる。1稈■に
おける抗1’ −Am yモノク【I−リル抗体は般に
、検体中の1)−Amyに対応するtjt J、す0過
剰に用いられる。、11′IIC)は、1−ンザイム 
イ!、7 アノ−トイ1大におけるII / 11分−
1の(k術を応111するととにJ、り行える。例λば
r Il:■において抗■)−Aロ1yモノクu −−
)ル1fi1体0)代わり1ご不溶化抗1’ −A m
 yモノ)ll+ −“lルl’(’、体を用い免疫反
応後にIJ′Lli、’−H抗体袢合物を遠心性y1]
するたか、抗l111抗体楔i″7物に対する抗体を不
溶化しまたもの、Jなわち不liI化第゛、抗体をI稈
Q)においで更に反I?、(lしめ生ずる捏合物を遠心
性l+tlt−Jるこ4)−にJ、り行える。ここにお
ける抗体の・イ・溶化は、畠゛法により不溶M: li
体と抗1’ −A口1y、Fツク1−)フレ(;10体
もL <は第′1h1体とを結合さ11るこ髭にJ、す
11λる。不溶(11: in体としては公り11のも
のかいずれも使えルカ、木IFI 特7F m 4. 
l6fl、71+7 ’6 記JJi 〕5lll菌細
胞壁四1か好よ1.<用いられる。−1″稈■おJ、び
総α−アミシー12活v1の測定は公知のプi 7J:
 、例えば市叫されているα−アミシーゼ定II!用1
ソtを用いるこきζご上り実施できる。そのような4〜
ツ1の例きしてはベーリンガーマ/ハイムー山之内株式
会月から発売されている詞−lバックα−アミラーセ4
−ットか挙げら第1る。この1ソトではP N 11お
よびα−グル丁lシダー1!を含む18iffl(以ト
 1’ N +1試薬という)を基質として用いている
1’ −A m yとs−A m yを分−1する試i
・は市販されている総てのα−アミラーセ定1□」用土
ノド、と1丁、へに811み合わせる乙とができる。P
 −A m yとS−Amyとを9絹t−Jるための試
檗は、少くとも(1)  不iFN’Nit体ト結合り
、りti’+:l” −A m y (−ツク「1−づ
ル抗体、または (2)  ■抗P −A m yモノク[トリル抗体お
よび0不溶1’目1’j体と結合17た第一」に体(不
溶化第−抗体) を含むものである。この拭清には史にぼ衝剤、FIJ腐
剤、安定化剤、賦形剤等がaまれ得る。t: Si’、
、 (:’、)の場合には+−2トの形にするのが好ま
しい。
具体例 次に実施例を挙げて史に詳細に説明する。
なお、以l・では次の培地をIIIいた。
■ 細胞融合用無血清培地、JなわちRPMI  If
140培地(4! /:r  ラボフlリ−)■ 主1
11畳細胞(またはハイフリFl)用培地1記■培地に
以Fのものを添加した培地。
10%0%ラン血清(IIcs)、 4■Mグルタミノ、 50/1Mβ−メルカゾトエタノール、1001J/i
1ペニシリンG1および100μg/IIlストレプト
マイン/。
■ 11^7培111!(ハイ/リト−マ選択培地)I
4記■jετ地に以Fのものを添加した培地。
0、ImMヒボキ→Jノヂノ、 0.4μMアミノプテリン、および 1(i7zMデミジン。
また、以ドではリン酸双衝液はP 114;と、l +
fu清アル、/ミノは++ !; Aと略称する。
実施例1 1A、’P−A車yモノク1−リールi’l
’、体の製1i1i(1)   ハイ/す1−マの創製 抗1!;Iならびに細胞のrJ−J製 4℃にjiいτヒト肝戚づ≧−p1ごM1安554Bを
J川え< ++:・+和1145%)、0°Cで313
.’i lfl 11’(以後、11するベレットを1
重心分Ill (1i(1(lilx lr 、 :J
Q分)]1、このべ1ノツlをノI理食14a水0.5
II(’にllI解Aる。
この溶イkに等1.fの)IIイ:’ l′i’j令ア
ゾ9.ハント(T)1化パγ檗品(1、弐会ネ1)庖加
λて乳化したもの0.5ipヲIIALI+/ (1’
Q’ +7 X (静岡実験%!l Q’A 協同用、
′1)の腹r・内に投Iノ、 (、、] i17.j間
後に同様に1.τ免疫する。史に1週間後に+11加免
;う、(静11)L、以後同様に(+ IIりのJL1
加免疫をjlい:Z+Vに胛1)1vを11’/り出し
τB細胞を()で取する。
スクリー二/ヅ暢り1−二/り 対数増殖間にあるマウスミコー1−マ細胞P :] −
X j’+ :1−へg8−1目 (ATCCカ タ 
1 グ番5.;C旧、   IIi97  )  の 
1 ×10′個と胛臓細胞のlXl0’個を混i′1シ
、■k”、 11ハで遠心(4011X g、 10分
)洗浄後、丁(7°Cに保7+、A した50%ポリ:
rテレ/グリ;J−ル1500 (和尤純古l業株式会
?t) 1  ml(!を1分間かけて加メ、ゆ−1く
り撹(1゛する。1分後、;17℃に保温した11jp
のCD培地を同様にして加える。史シご20sl!の0
)I8地を;10秒毎に1mlずつ加えた後、遠心(4
00X  lr、 10分)Ll、11+’iを除去す
る。得られるぺ1ノツトに12w+1の■培地を徐々に
加λる。この0.1 mlずつを1(0穴培養皿にまき
、37℃において5%炭酸ガス−空気中て培養する。2
0時間後、■培Jl!IQ、I  mpずつを穴に加え
る。2[1、?)11.5 r”I 、81’l、11
[(,13[1お、Lび15]1後の51°7回にわた
ってO1■pの培地を捨で新しい■培地0.1mj!を
加える。この培地交換によりハイ/リト−マ以外の細胞
は死滅する。I [i II以降は内び■培地に交換し
1培養する。
培養開始後71−11’lにバイブリド マの牛fIか
始り、+51111には80%の穴に生育か認められる
抗体価および交Z′度の検定 培養15[1後の培養di 0)抗体価および交X′一
度を次のようにして調べた。
検定用試薬 (IIP−A口]y溶I(紮 HA斧2りOIl/(92,0(101LI//)  
イ 1・記緩衝戚へτ布釈【7、全jilを50m 1
と41シたもの。
f2)   S  −A m  V Ill 1nk1
峠のS−Amy(ソグマ//ミヵ/l/C(+、)をI
・tfl’、 IW衝HA でIN解・石状j全111
ヲ5(l m N 、’: すL タもの。
+31  rJ衝t(釜A (r) 117.(1)0
.1%BS、へ−0,)1%N、C1−(+、f14M
−PIIs(P II 7.0 )からなる緩衝+1し
(4)  不溶化第二抗体の門濁戚 米II’l特11第4.Il’1J7(i’/弓111
0Ill i’iの実施例1のII法にJ、り調製した
もの。Jなわち、;)クトハヂルスゾうンタルl、AT
CCI’1(114の細胞壁1’+’125−gを水2
.5m l!に懸濁し、これ(こフィルス−イー1ダ 
1.td。
社製の抗マウスIgGウーリギ抗体Mil&[タ、/バ
タ25mg / 0.05M −P II S (P 
117.11) 2.5+j! ] 、水2.5m l
および0.I M −P 11 S (P 117.0
 ) 2.5mpを加えでよく混和する。これ2ごに!
l↑ド、2.5%の時間段(1゛後、遠心(2,000
X g、 lr1分)し、沈殿を5■pの 09%Na
C] −0,02M )リス緩衝液(p 117.0 
)で3回洗浄し7、[I的とする不溶化第二(起体を得
る。 これを52IIνの0.2%I SA −0,9
%NaCl0.1%NaNa) リス緩衝液(r) 1
17.0 )に!!!濁し、さらに超f1波処I’ll
をする。
検定操作 141体価は次のようにして検定した。
すなわち、ハイプリトーマ培養液50 tt7!、  
P−Amy溶液25Ilp、不溶化第−゛、抗体!#:
濁45011pを混合し、37°にで:(0分間温置後
、4mlの牛理食III水を加え遠心(:]II1In
 X g、 5分)して十清をすてる。ペレットにl’
 N 11試薬1mlを加え撹(↑後37°Cて’/A
A II’!、する630分後、21pの反応停+l−
it葵[0,1M−P 11 S Cp II1 )]
を加えて遠心し、1清の吸光度(405n■)をjll
ll定する。吸光度か高い穴に高抗体価をイー[するf
A’、 P −A m yモノク1.1−づル抗体か含
まれていると判定した。
交差度は抗体価か高い培養液でついて検a、f シた。
すなわち、I’ −A m y溶液の代わりにS−Am
y溶、(kを用いるほかは(4、体価倹定の場合と同U
、操イ′1により交差度を検定【7た。405 nmi
、ておける吸光度か低い検体はど交Mj 1.E=か低
いと判)j±Lまた。
特に抗体価か高く、かつ、交?:’ IQ’か低い抗1
’ −A m y−Eツク11−リJl/ 15;体i
’?ノI株を選び、;11i穴培養1111に1個ノ穴
になるようにハイブリトーマを■培地で石状【7、培養
する。このような限界希釈培養をくりかえずこきにJ、
リクl’1〜ニングを行い、II的のハイ/すl−マを
1する。
このハイプリトーマは凍1.′、または継代培養により
保rfできる。
(2)   モノク1’+−リルIA1体の製逓予めシ
リスタ7 (prtslanLり  fl、5 mlを
l1jj腔内lq !)した 11八1. II / 
c マウスのl11JIf!内に、前項で得たハイブリ
トーマ lXl0′個を接(小する。151−11’1
に]1的とするモノク【1−リル抗体を含むIt!j水
3■p/マウスを得る。次に4℃において、肋木に”I
 Mの飽和硫安病i1kを加え30分間撹IT後、遠心
(511011X 1.1:10分)し1清をずτる。
ベレットを0 、0 !i M−Pl(S(p117.
4)−(1,14M塩化−1トリウノ、1古Ak r、
−、溶解後、4°Cで−・仕透析し、30分1・)r心
(5000X f: ) L、11−1ろ一凍結乾燥し
て目的の111]−ツク【1−リル抗体を得る。
免疫拡散法に3する検定によれば、このモノクローリル
抗体は+にGi!Iブクζノスに屈l2、その1.鎖は
カッパーに属するものであ−、た。
実施例2    分別室(ij P −A m yとS−A m yを等f1を含む溶液
をG’f I’1界釈孔部たものを検体と【2、以I・
の)j ?L lご、1、り分別定I誹を行う。
総α−アミラーセ活illの定11」 検体25u/!にP N l’試11m1を加え:(7
°Cて1.L置U730分後、21N/のfl、+  
M−PIF S  (ρ1111)(反応停+l i&
 )を加え4051■における吸光度を測定する。
1’ −A m yの定11」 検体251111抗P −A m yモノク「オーリル
抗体[実施例1のf2) :IJ″jで得た股木をtv
衝戚7へで1000倍苗釈したもの]50ttlおよび
不溶化第−′抗体懸濁液50u1を混合し 37°Cで
渦置し、30分後に牛理食Ii!水4 璽Iを加え−c
 4心(’:1O(lox IH15分) −Jる。得
られるペレットにl’ N I’試拭清mpを加え37
°Cで温間し、30分後、2ml!の反応停止l’、 
llkを加え不lIg化第二抗体を遠心性IQIt (
3oonx lrs 5分) l、、その上清について
405n−における吸光度を光路1c’sのキュベツト
中でi’lPl定する。
S−Amyのq出 総α−アミリーゼ活性からI’ −A m y活t11
を差し引いたものをs−Amy活V1とした。
定量結果 第1表に定量結果を示す。
(以下、余白) 第1表 昂釈倍数   tゝ−Amy話t’l (a、)  S
−Amy活M(1))  b/a(011/m e )
         (OD/m 1 )1      
    (1,8000,8(111、nO20,41
50,401(1,97 40,2000,2031,02 B           0.100        
   0.+01      1゜01111    
      O,(1510,0480≦]4:(2(
1,02↓          0.025     
  I 、04f14         0.011 
         11.(’112      1 
、fl!+第1表に示すように1’ −A m yとS
−Amyとの比、すなわちb / aは常にほぼ1.0
0であり、本I]、は両者の分別室fit yT:とし
て極めて優れている。
実施例3      分別定IHj r’−Amy中独、S−Amy単独および両者の混合物
(混合比は後記第2表に示す)を検体とし以下の方法に
より分別室L1を行い第2表に小ず結果を得た。
総α−アミラーゼ活性の定量 40ttlの検体に緩衝e:AのIFiOulを加え3
7°Cで10分間d1Δ置4る。そθ)25111をと
り、とれにI’ N +1試’j−1m l ’a、・
加λ37°Cテif、装置し、:(0分後、2ipの反
応(V 1. ilkを加fi、 405na ニオ+
t ル吸毘ICL’ ヲ、t 路1 t:mの一1ユベ
ソト中でi’1lll定゛4゛る。
S−Amyの定1.( 4n tt iの検体に、(41体価検定のJff =
′述べたのと同じjj法てコ−J製し7たイ・溶化(1
゛1゜I’ −A m y T:7りu−−)ル’r;
L<4’!!、h’3dl!Iりntil ヲ+Ill
工:17℃テ゛lo分間渦置後遠心(3000X )、
、 5分)する。l清の25/71?をキリ、e JL
 I’m I’Nl’ 試M I m /! ヲ加工1
7°C−(’ i’i’1A iI’? L 30分後
、2111の反応停+l ilkを加え4115 nm
における吸光度を電路+ c++のトユベソl中で測定
する。
定j;l、L−宋 第2表に定jii結果を示す。
(以トー1余白) 第54表 検     体     総α−γミンーti+’+!
牛 (a )    Lt/11+も(’I(I])本
h:   t、+/a(Of)7m I? )    
   (叩/ll(り(11P−Amy   11.+
65     0   0.00(2)S−AmyO,
:17:20.3751.01(81S   +   
P本     0.550            0
.:1−10     0.li7[:V (I’ +
S)  二〇、7](4) I’−Amy   O,:
[4400,(IQ(5t S −A m y   O
,:l:to      0.3:12  1.01(
1”+l S + P   O,f;fill    
  O,:’137  0.51[S/(Il+5)=
0.5] (7) l)−Amy   O,41300,00(8
)S−AmyO,17!]0、+730.97(91S
 + P   O,1ilfl      O,I8n
   O,29[S/(1” +5)=0.:1] *P−AmyとS−A m yのiQ合物。この場合、
総α−ア三ラード(P+S)とS−Amyの比[S/(
P+s月か0.lなるように混合[7た。以■・同様。
* (S −A m y t+’; t’lに相当。
検体中のP −A tn yは不溶化抗P −A m 
yモノク1」−リール抗体によ−、て系から沈殿−二し
て除かれている。従って第2表に示すようにP−A m
 yのみを含有する検体(1)、(4)および(7)の
(+1)値(!3− A m y話1!1に相当)は総
て(Jぼセl−1である。・力、S−A口1yは系から
除かれないのでS−Amyのみを含r+’−Jる検体(
す)、(5)よiJ、び(8)の(b)イー°1(S 
−A m y活t’lに相当)は、(a)イn’f (
総α−アミリーp話↑t1)とほぼ等j7い。また第5
2表に小Jよう(ご、l’ −A m yとS −A 
m yのjllj ’i’7比[P/(1” +s )
1とb / ilのf!’iはほは ・致Lτいる。
このように本法の分別定1,171、は極めて佼ねτい
る。
実施例4     ヒト血清の分別定111膵1、ジ1
々名および健后人の血1+’iを検体とし、実施例2と
同様にしでP−A m yの定17.)を11い第3表
の結果を得た。
(以ド、余白) 第3表 +2       体    総α −γミンーf++
’iPc  (a )    P    A m y 
itちt’I(b )   b / ;1(OD/m 
(! )     (00/m e )出質面漬 NO(膵炎)0.:115        0.251
     0.FlOGo(膵炎)     0.9G
O0,80:l      O,F14Nl(膵炎) 
    0.175        0.121   
  0.(i9SN(唾dk腺炎)(1,8700,1
1ニジl     (+、0:1健常人 I・’ OO,1750,0550,310N    
     O,I41i         0.flf
il      0.42T II         
O,HIO11,I141     0.:[シ第?(
人に示すように、総α−アミシーゼに対するP −A 
m yの割合(b / a )は、膵炎患名面清(No
、Go、N I)のjノが健常人よりも高く、また唾液
腺炎声者(SN )では逆に低い成績が得られた。
特j出願人  人目本製薬株式会ン1 白ノ1松υ「薬株式会11

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)下記の性質を有することを特徴とする抗ヒト膵型
    α−アミラーゼモノクローナル抗体: [a]ヒト膵型α−アミラーゼを認識する、[b]実質
    的にヒト唾液型α−アミラーゼを認識しない、 [c]抗原たるヒト膵型α−アミラーゼとの免疫反応後
    においても該酵素が失活しない、
  2. (2)不溶性担体が結合した特許請求の範囲第1項記載
    の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル抗体。
  3. (3)不溶性担体が細菌細胞壁片である特許請求の範囲
    第2項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル
    抗体。
  4. (4)不溶性担体がラクトバチルスプランタラムの細菌
    細胞壁片である特許請求の範囲第2または3項記載の抗
    ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル抗体。
  5. (5)細胞融合技法によって製造された特許請求の範囲
    第1項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼモノクローナル
    抗体。
JP61110233A 1985-05-17 1986-05-13 モノクロ−ナル抗体 Granted JPS6270399A (ja)

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JP60-106573 1985-05-17

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US4166767A (en) * 1976-03-25 1979-09-04 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Insolubilized antibody

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