JPS6259299A - 新規なｃｓｆおよびその取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は骨髄細胞の分化増殖を促進する因子（Ｃｏｌｏ
ｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　Ｆａｃｔｏｒ）（
以下ｒＣＳＦＪとする）に関し、特にヒト好中球への分
化増殖促進作用を有する新規なＣＳＦおよびその取得方
法に関する。

［産業上の利用分野コ 本発明のＣＳＦは白血球減少症等の治療薬としてその効
果が期待される他、臨床検査用試薬や研究用試薬として
使用しうる。

［従来の技術］ ＣＳＦは動物の骨髄細胞に作用してマクロファージまた
は顆粒球への分化増殖を促進する物質であり、今までに
数種のものが報告されている。例えば５ｔａｎｌｅｙ　
　Ｅ、Ｒ，等は、健常人尿より分子量４５，０００の糖
蛋白質でマウスの骨髄細胞に対してはコロニー形成促進
活性を示すが、ヒト骨髄細胞に対してはコロニー形成促
進活性が認められないＣＳＦを純化したと報告している
（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、３５巻、２２７２〜２２７８頁、
１９７５年）。またＢｕｒｇｅｓｓ　　Ａ、Ｗ。

等はヒト胎盤から（Ｂｌｏｏｄ　　４９巻　５７３〜５
８３．１９７７年）（Ｂｌｏｏｄ　　５４巻６１４〜６
２７頁、１９７９年）、５ｈａｈ　　Ｒ。

Ｇ１等はヒト末梢血単球、ＰＨＡ刺激リンパ球か＝５− ら（Ｂｌｏｏｄ　　５０巻　８１１頁、１９７７年）、
Ｆｏｊｏ　　Ｓ、Ｓ、等はヒト肺の培養上清から（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒＶ　　１７巻　３１０９〜３１１６
頁、１９７８年）それぞれヒトに有効なＣＳＦを部分精
製したことを報告している。これらのＣＳＦは、いずれ
も分子量２５．０００〜４１．０００の範囲の糖蛋白質
であり、ヒト骨髄非付着性細胞に直接作用して好中球、
マクロファージ、好酸球のコロニーを形成する。しかし
いずれの場合も材料に制約があることから、いまだ完全
に純化されたＣＳＦを得るには至っていない。

以上はヒト正常組織由来のＣＳＦであるが、近年ある種
のヒト腫瘍細胞において、ＣＳＦを産生ずるものが報告
されている。例えばＡｓａｎｏＳ。

等はヌードマウス移植肺癌細胞から（Ｂｌｏｏｄ４９巻
　８４５〜８５２頁、１９７７年）、０ｋａｂｅ　　Ｔ
、等は下顎部扁平上皮癌株化細胞、甲伏線癌株化細胞か
ら（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ。

３８巻　３９１０〜３９１７頁、１９７８年）（ＪＮＣ
Ｉ　　８９巻　１２３５〜１２４３頁、１９８２年）（
Ｊ、Ｃｅ１ｌ　　ＰｈＶｓｉｏｌ、１１０巻　４３〜４
９頁、１９８２年）、ＷｕＭ。

Ｃ０等はすい臓癌株化細胞から（Ｊ、　Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ
。

Ｃｈｅｍ、２５４巻　８２２６〜６２２８頁、１９７９
年）（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６５巻　７７２〜
７７５頁、１９８０年）、Ｄｉｐｅｒｓｉｏ　　Ｊ、、
Ｆ、等は、ＭａｌｉｇｎａｎｔＨｉ　ｓ　ｔ　ｔｏｃｙ
ｔｏｍａ　　患者から樹立したＧ　　ＣＴ　　Ｃｅ１ｌ
　　Ｌｉｎｅから（Ｂｌｏ。

ｄ　　５１巻　１０６８頁、１９７８年）（Ｂｌ。

ｏｄ　　５６巻　７１７〜７２７頁、１９８０年）、ま
たＧｏｌｄｅ　　Ｄ、Ｗ、等はＨａｉｒｙ　　Ｃｅ１１
　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　患者から樹立したＭＯＣｅ１
ｌ　　Ｌｉｎｅから（Ｂｌｏｏｄ　　５２巻　１０６８
〜１０７２頁、１９７８年）（Ｂｌｏｏｄ　　５７巻　
１３〜２１頁、１９８１年）、それぞれＣＳＦを得たこ
とを報告している。いずれの場合もヒトに有効なＣＳＦ
は分子量が２７゜０００〜３４．０００の範囲に含まれ
る糖蛋白質であり、等電点はｐＩ＝４．５〜５．７の間
の値を有するものである。これらのうちＧＣＴ　　Ｃｅ
１１　　Ｌｉｎｅの培養上清から得られるＣＳＦは比活
性１．１２Ｘ１０６Ｕ／−ｇｌＭＯＣｅ　ｌ　１Ｌｉｎ
ｅの培養上清からのＣＳＦは３．５×１０６Ｕ／■の純
度までそれぞれ精製が進められているが、この他の上記
ＣＳＦも含めいずれも完全純化には至っていないのが現
状である。

［発明の開示コ 本発明者等は口腔底癌患者の腫瘍細胞から、Ｃ３Ｆの極
めて高い産生能を有し、かつ良好な増殖能を示す細胞株
の樹立に成功した。この細胞株はｒＣＨＵ−ＩＪと命名
され、フランス国のパスツール　インスチチュート　コ
レクション　ナショナレ　デ　カルラレス　デ　ミクロ
オルガニズムス（ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ　　ＮＡＴＩＯ
ＮＡＬＥＤＥ　　ＣＵＬＴＵＲＥＳ　　ＤＥ　　ＭＩＣ
ＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ）（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ）に１９
８４年７月１１日付受託番号ｒｌ−３１５Ｊとして寄託
されている。

本発明者等はこのＣＨＵ−１をイン−ビトロで培養し、
その培養上清から、ヒト好中球のコロニー形成促進活性
を示し、分子量約１８，０００　（ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による定量）
、比活性が３．９４Ｘ１０７　Ｕ／＋ｎｇ≦の極めて純
度の高いＣＳＦを得ることに成功した。すなわち本発明
は次の理化学的性質を有するＣＳＦであり、これは文献
未載の新規なものである。

「理化学的性質」 １）分子量ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によ る測定で１９．０００±１，００ １１）等電点：１）Ｉ＝５．５±０．１、ｐＩ＝５゜８
±０．１、ｐＩ＝６．１±０゜ １の三つの等電点のうち少なくと も１つを有する。

ｉｉｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
５０ｎｍに極小値をもつ。

ｉｖ）　Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の
如くである。

一 更に本発明はヒドロ腔底癌細胞より樹立されたヒトＣＳ
Ｆ産生能を有する細胞株を血清無添加培養液にて培養し
、その培養上清を次の（１）〜（３）処理に付し、更に
必要に応じ（４）または（５）の処理を付してなる前記
理化学的性質を有するＣＳＦの取得方法である。

■　培養上清を５．０００〜７０，０００ダルトン実効
分画範囲を有するゲルを用いたゲル濾過に付し、好中球
優位のコロニー形成促進活性（以下「ＣＳＡ」という）
を有する画分を回収する。

■　■の画分を逆相系高速液体クロマトグラフィ担体に
吸着せしめ、水とを機溶媒の混液の濃度勾配により溶出
し好中球優位のＣＳＡを有する画分を回収する。

■　■の画分を高速分子篩クロマトグラフィに付し好中
球優位のＣＳＡを有する画分を回収する。

■　■の画分を等電点電気泳動に付し、好中球優位のＣ
ＳＡを有する画分を回収する。

■　■の画分にシアル酸除去操作を施したのち、好中球
優位のＣＳＡを何する画分を回収する。

上記取得方法の概要を具体的に述べると例えば次のとお
りである。

ｒＣＨＵ−ＩＪをウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０培
養液に浮遊させてガラスローラーボトル中で一定速度で
回転培養を行なう。ｒＣＨＵ−ＩＪがローラーボトルの
内壁に完全に密に増殖した時点で培養液をウシ胎児血清
を含まないＲＰＭＩＩ６４０に交換し４日間培養したの
ち、培養上清を回収し、次いて再度ウシ胎児血清を含む
Ｆ−１０培養液を加えて３日間培養する。再びウシ胎児
血清を含まないＲＰＭ１１６４０培養液に液替えし４日
間培養したのち培養上清を回収する。このようなスケジ
ュールで「培養−無血清培養の上清の回収」を（り返し
行うことにより、ｒＣ）（Ｕ−ＩＪの培養上清を得る。

このようにして得た培養上清を限外濾過器にて約１００
０〜２０００倍位に濃縮したのちゲル濾過し、好中球優
位のＣＳＡを有する画分を回収する。次いでこの画分を
更に高速液体クロマトグラフィーによる精製をくり返し
行なったのち、好中球優位のＣＳＡを有する部分を回収
し凍結乾燥する。

尚、本発明において用いたＣＳＡの測定方法は次のとお
りである。

ｒＣＳＡの測定方法」 （ａ）　　ヒト骨髄細胞を用いる場合：Ｂｒａｄｌｅｙ
　　Ｔ、Ｒ，＋　ＭｅｔｃａｌｆＤｌ等の方法（Ａｕｓ
ｔ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｉ。

１、Ｍｅｄ、ｓｃｉ、　　４４巻　２８７〜３００頁、
１９６６年）に準じて単層軟寒天培養法により行なった
。すなわちウシ胎児血清０．２ｍｌ、被検体０−　１ｍ
ｌ、　　ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液０．１ｍｌ　（１
〜２Ｘ１０５有核細胞）、改変Ｍｅ　Ｃｏ　Ｖ’　ｓ　
５Ａ培養液０．２ｍ１１寒天を０．７５％含む改変Ｍｃ
ＣｏＶ’　ｓ５Ａ培養液０．４ｍｌを混合して直径３５
關の組織培養プラスティックディツシュに入れて固まら
せたのち、３７°Ｃ，５％炭酸ガス／９５％空気、１０
０％湿度の条件で培養を行ない、１０日後に形成された
コロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１コロニ
ーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１
単位（Ｕｎｉｔ）としてＣＳＡを求めた。

（ｂ）　　マウス骨髄細胞を用いる場合：ウマ血清０．
４ｍｌ＋被検検体０．１ｍｌ＋Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　（メス）
マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｍｌ　（０，５〜ｌＸＩ
Ｏ３有核細胞）。

寒天を０．７５％含む改変ＭｃＣｏＶ’　ｓ５Ａ培養液
０．４ｍｌを混合し直径３５ｍ！１の組織培養用プラス
ティックディツシュに入れて固まらせたのち、３７°Ｃ
，５％炭酸ガス／９５％空気。

１００％湿度の条件下にて５日間培養し、形成されたコ
ロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１コロニー
とする）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１単
位（Ｕｎｉｔ）としてＣＳＡを求めた。

尚、上記（ａ）、（ｂ）の方法において用いた「改変Ｍ
ｃＣｏＹ’ｓ５Ａ培養液および（ａ）で用いたヒト骨髄
非付着性細胞浮遊液は次の如くして作製した。

「改変ＭｃＣｏｙ’　ｓ５Ａ培養液」 ＭｃＣｏＶ’ｓ５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２ｇ、
ＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（日永製薬社製）２．５５
ｇ重炭酸ナトリウム２．１８ｇ。

ペニシリンＧカリウム５０００単位を２回蒸留水５００
ｍ１に溶解後、０．２２μｍのミリポアフィルタ−にて
濾過滅菌を行なった。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭ１１６４０
培養液にて５倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌ−ＰａＱｕｅ液（
ファルマシア社製）に重層し、４００Ｘｇ、３０分、２
５℃にて遠心を行ない、界而の細胞層（比重＜１．０７
７）を回収する。この細胞を洗滌後、２０％ウシ胎児血
清を含むＲＰＭＩＩＥ３４０培養液にて５Ｘ１０６　Ｃ
ｅ　ｌ　ｌ／ｍ１の濃度に調整し、２５ＣＩＴＦの組織
培養用プラスティックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器
にて３０分間インキニーベートしたのち、上清の非付着
性細胞を回収し、再度２５ｃ♂プラスチツクフラスコに
入れ、２時間３０分位インキュベートしたのち、上清の
非付着性細胞を集めて用いた。

本発明のＣＳＦを後述の実施例（７）の如くしてマウス
の骨髄細胞およびヒトの骨髄細胞にそれぞれ作用させた
結果、いずれの場合も好中球コロニーの形成促進が認め
られた。このことから本発明のＣＳＦは骨髄細胞の好中
球への分化増殖を促進するタイプのＣＳＦであることが
明らかである。

次に実施例によって本発明の詳細な説明する。

［実施例］ 実施例（１）ｒＣＨＵ−ＩＪの樹立 （１）腫瘍 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕマウスに移植した。この腫瘍は移植
約１０日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認めら
れた。この腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜
２ｍｍ”角に細切し、これを以下の如く培養した。

（１１）　　初代培養 上記細切した腫瘍塊１０〜１５片を５０ｍ１のプラスチ
ック遠心管に入れ、５ｍｌのトリプシン溶液（トリプシ
ン０．２５％、ＥＤＴＡｏ、０２％含む）を加え、３７
℃の温浴中で１０分間振とうしたのち上清を捨て、再度
、同トリプシン溶液５ｍｌを加え、３７°Ｃで１５分間
攪拌しながらトリプシン消化を行なった。上清の細胞浮
遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ｍｌ加えてトリプシン
の作用を止めたのち水中に保存した。

以上の操作を再度行ない細胞浮遊液を回収し、前回の分
と合わせて１．５０Ｏｒ、　ｐ、ｍ、１０分間の遠心に
より細胞ペレットを得た。この細胞ペレットをウシ胎児
血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗滌したのち、２５
ｃ／のプラスティック培養フラスコに細胞濃度５Ｘ１０
６個／フラスコになるようにして植え込んだ。ウシ胎児
血清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、炭酸ガス
インキュベーター（炭酸ガス濃度５％、湿度１００％）
中にて一晩インキユベートしたのち、上清を非付着性細
胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継続した
。培養開始後６日日に細胞がいっばいに増殖したので、
この時点で培養液を新しいものに替えた。翌日、この培
養液を捨て、ＲＰＭＩＩＥ３４０で５倍希釈した抗マウ
ス赤血球（Ｃａｐｐｅ１社製）２ｍｌと同じ＜ＲＰＭ１
１８４０で２．５倍希釈したモルモット補体（極東製薬
社製）２ｍｌを加えて３７℃、２０分間インキュベート
した。インキュベーション終了後ウシ胎児血清を１０％
含むＦ−１０にて２回洗滌しｎｕ／ｎｕマウス由来のフ
ィブロブラストを除去し、引き続きウシ胎児血清を１０
％含むＦ−１０培養液を加えて培養を行なった。

（ＩＩＩ）　　継代培養 初代培養において細胞が完全に密に増殖した時１７一 点で再度ウシ胎児血清１０％を含むＦ−１０培養液にて
液替えを行ない、翌日継代を行なった。駒込ピペットに
て培養液を除去したのち、あらかじめ３７℃に加温した
ＥＤＴＡを０．０２％含む生理食塩水を２ｍｌ加え、ホ
ットプレート上で３７℃２分間加温後、ピペッティング
にて細胞をはく離せしめた。ウシ胎児血清０．５ｍｌを
添加後、１５ｍ１の遠心管に細胞浮遊液を移し、１．５
０Ｏｒ、ｐ、ｍ、１０分間の遠心により細胞ペレットを
得た。１ｍｌのＦ−１０培養液に細胞を浮遊せしめ、１
／１０に分割して継代を行なった。以後、同様の操作に
より４〜５日間隔にて継代を行なった。、このようにし
て得た細胞の増殖能を調べるため、５Ｘ１０　　Ｃｅ　
ｌ　ｌ　ｓ／ｍｌの細胞浮遊液を作成し、直径３．５　
ｍ＋＝のプラスティックプッシュに１ｍｌずつ植え込み
を行ない（２０枚）炭酸ガスインキュベーターにて培養
し、一定時間の経過毎にディツシュをとり出し、接着細
胞を回収して細胞数を算定した。この結果は第４図に示
した。

細胞植え込み後、約２０〜２４時間後に増殖が始まり、
平均倍化時間（ＰＤＴ）は約２０時間であった。

実施例（２）ＣＳＦの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０ｃ＋／の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これ
をウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５００
ｍ１に浮遊させたのち、１５８０ｃぜのガラス製ローラ
ーボトル（Ｂｅｌｃ。

社製）に移し、０．５ｒ、ｐｏｍ、の速度で回転培養を
行なった。細胞がローラーボトルの内壁に完全に密に増
殖した時点で培養液を血清を含まないＲＰＭ１１６４０
に交換し、４日間培養したのち培養上清を回収し、ウシ
胎児血清を１０％含有するＦ−１０を加えて培養を続行
する。３日間培養したのち再び血清を含まないＲＰＭ１
１ｅ４０に演習を行ない、４日後に培養上清を回収した
。

以下同様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り５００ｍ１ずつの血清を含まない培養上清が得られ、
しかもこの方法によりかなり長期間にわたって細胞を維
持し、培養上清を回収することが可能であった。

得られた培養上清５ｋを１バツチとし、これに０．０１
％ツイーン２０を添加後Ｈｏ　ｌ　ｌ　ｏｗＦｉｂｅｒ
ＤＣ−４およびＡｍ１ｃｏｎ　　ＰＭ−１０（アミコン
社製）を用いた限外濾過法により約１０００倍に濃縮し
たのち、これを以下の順序で精製した。

（１）　　直径４．８ｃｍ、長さ９０ｃＩｌのＵｌｔｒ
。

ｇｅｌ　　ＡｃＡ　　５４カラ′ム（ＬＫＢ社製）を用
い、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１および０．０１％ツイーン
２０（半井化学社製）を含む０．ＯＩＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）を用いて前記濃縮した培養上清５ｍｌ
を流速約５０ｍ１／時間でゲル濾過した。尚カラムはあ
らかじめウシ血清アルブミン（分子量８７，０００）、
オボアルブミン（分子量４５．０００）、チトクローム
Ｃ（分子量１２．４００）にてキャリブレーションを行
なった。ゲル濾過終了後金フラクションより０．　１ｍ
ｌずつを採取し、１０倍に希釈した後、前述したｒｃｓ
Ａの測定方法（ｂ）」により活性を示す画分を調べた。

この結果、先ずＶｅ＝４００〜７００ｍ１の画分がマク
ロファージ優位のＣＳＡを示し、Ｖｅ＝８００〜１２０
０ｍ１の画分が顆粒球優位のＣＳＡを示すことがわかっ
たので、後者の画分を集めＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いる限外濾過器によって約５ｍｌに濃縮した。

（＋１）　　上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化
成社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置
したのち、１５，０ＯＯｒ、　ｐ。

ｍ、１０分の遠心により沈殿を除去した。次いで先のｎ
−プロパツールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で
平衡化したμＢｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ１８カラム（Ｗａ
ｔｅｒｓ社製、セミ分取用、８龍Ｘ３０ｃｍ）に吸着後
、３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツールを含
む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高
速液体クロマト装置は日立Ｅ！８５−５０型を、検出は
日立６３８−４１型検出器（いずれも日立製作新製）を
用い、２２０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測２１一 定した。溶出後、各画分より１０μｌを分取１００倍希
釈したのち、前述のｒＣＳＡの測定方法（ｂ）Ｊにより
活性を示す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパツール
４０％に溶出されるピークに活性が認められたので、こ
のピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行ない上記
と同様にしてＣＳＡを調べたところ、やはりｎ−プロパ
ツール４０％の位置のピークに活性が認められたので、
このピークを集め（４フラクション＝４ｍｌ）凍結乾燥
した。

（ｉｉｌ　）　　上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツール
を４０％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２００μ
ｌに溶解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋曹達
社製＋　２．５ｍｍＸ６０ｃｍ）を用いた高速液体クロ
マトグラフィにかけた。溶出は同水溶液により０．４ｍ
ｌ／分の流速で行ない、フラクションコレクターＦＲＡ
Ｃ−１００（ファルマシア社製）により０．４ｍｌずつ
分取した。分取した各画分についてＣＳＡを前記と同様
にして調べた結果、保持時間が３７〜３８分の画分（分
子量約２万に相当）に活性が認められたので、この画分
を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋＣ１８カラム
（４，Ｅｔｍ＋ａＸ３０ｃｍ）による精製を施したのち
、メインピークを回収し凍結乾燥した。

実施例（３）理化学的性質 実施例（２）で得た本発明のＣＳＦの理化学的性質を調
べるため次の分析、試験を行なった。

（１）　　分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行なった。電気泳動装
置はＰＲＯＴＥＡＮＴＨ１μｃｍ（バイオラッド社製）
、ゲルはＴ＝１５％、Ｃ＝２．６％のポリアクリルアミ
ドスラブゲル（１４０酊×１６０璽■×１．５關）およ
び濃縮ゲル（Ｔ＝３％、Ｃ＝２０％）を用いた。試料は
あらかじめ０．６４Ｍ２−メルカプトエタノールにドデ
シル硫酸ナトリウムを濃度が２％になるように加えた溶
液中で３分間煮沸し変性させておいたものを４μｇ用い
た。３０ｍＡ定電流で４時間泳動したのちゲルを取り出
し、０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０
（シグマ社製）による染色にてバンドを検出した。分子
量マーカーとしてホスホリラーゼＢ　（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙ１ａｓｅＢ１分子量９２．５００）、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ、８７，０００）オボアルブミン（ＯＶ
Ａ、４５．０００）、カルボニック　アンヒドラーゼ（
Ｃ，ａｒｂｏｎｉｃ　　Ａｎｂｙｄｒａｓｅ＋３１．０
００）、ソイビーン　トリプシン　インヒビター（Ｓｏ
ｙｂｅａｎ　　Ｔｒｙｐｓｉｎ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
、２Ｌ　　５００）、リゾチームＣＬｙｓｏｚＶｍｅ＋
　　　１４＋　　４００）を同様に処理して用いた。こ
の結果、分子量約１９，０００の単一バンドが認められ
た。測定結果は第１図に示す。

本発明の如き蛋白質の分子量を測定する場合、その値は
測定方法の如何にかかわらず、一般に若干の巾をもって
異なった値が得られるのが常であり、本発明のヒトＣＳ
Ｆにあっては、上述の方法によって５回測定した結果１
９，０００±１，０００であった。

（ＩＩ）　　等電点 フラットベッド型等電点電気泳動装置ＦＢＥ−３０００
（ファルマシア社製）を用いた。ｐＨ４〜６．５のＰｈ
ａｒａｍａｌｙｔｅ　（ファルマシア社製）を含むポリ
アクリルアミドゲル（Ｔ＝５％、６２３％、１１５關×
２３０關）にて３０Ｗ定電力（最大電圧２０００Ｖ）で
２時間泳動を行なったのち、３０％メタノール／１０％
トリクロル酢酸７３５％スルホサリチル酸により固定し
、次いでクマーシーブリリアントブルーＲ−２５０染色
を行なった。等電点マーカーとしてＬｏｗｌ）Ｉ　　Ｋ
ｉｔ　　ｐＨ２，５〜６．５（ファルマシア社製）を用
いた。

ｐＨ４〜６．５の間で分離を検討したところｐＩ＝５．
５２．５．８０，６．１３の３本のバンドが認められた
。このうち１）Ｉ＝５．５２および５．８０の２本のバ
ンドが主たる成分であった。

この結果は第２図に示す。図中のＣ３ＦＱ、ＣＳＦ、。

ＣＳ　Ｆ２　は等電点の異なる本発明のＣＳＦを示す。

（上記した方法に従って別途、本発明のＣＳＦの等電点
を５回測定した結果、その値はそれぞれｐＩ＝５．５±
０．１．ｐＩ＝５．８±０．１゜ｐＩ＝８．１±０．１
であった。） この３本のバンドとＣＳＡとの相関をみる目的で実施例
（２）　−（［１）におけるＴＳＫ−Ｇ３ｏ　ｏ　ｏ　
ｓｗカラムにより精製した段階のＣＳＦを、調整用等電
点電気泳動装置（ＦＢＥ−３０００゜ファルマシア社製
）を用いて分離した。尚、分離条件は以下の通りである
。

資　　料：凍結乾燥粉末５００μｇを４Ｍ尿素を含む０
．０５Ｎリン酸１ｍｌに溶解。

支持体：１５ｇの５ｅｐｈａｄｅｘ−ＩＥＦ（ファルマ
シア社製）に、４Ｍ尿素、０゜１％ツイーン２０を含む
２回蒸留水２２５ｍ１を加えたのち、更に１２ｍ１のフ
ァルマライト４−８．５　（ファルマシア社製）を加え
室温にて一晩放置して膨潤せしめた。膨潤後、吸引びん
を用いて充分脱気を行ったのち２３０ｍｍＸ２３０關の
ガラスプレート上に５市厚の均一なゲル層を作成した。

プレート上最も均一な部位を選んで５０　ｍｍ　ｘ　２
３０　ｍｍのゲルを残し、他の部分のゲルは除去した。

電極液：（陽極）０．１Ｍリン酸、（陰極）０゜１Ｍ　
　ＮａＯＨを電極ストリップ（６×１０吐、ファルマシ
ア社製）に含ませ、ゲルの両端に接して平行に置く。パ
ワーサプライ（ＥＣＰＳ　　２０００／３００゜ファル
マシア社製）を用いて定電力。

前泳動：８Ｗ４５分間泳動を行なった。

試料添加：陽極から５ｃｍの位置にて、１ｃｍ巾にゲル
をかき取り、試料液と混合したのちもとの位置にもどし
た。

本泳動：前述のパワーサプライを用い、５０Ｗ定電力４
時間泳動を行なった。

泳動終了後、ゲルプレートをとり出し、分画格子を用い
て２６分画に分け、各分画のｐＨを測定後、各分画のゲ
ルをかき取りポリプロピレン製ミニカラム（ムロマック
、室町化学社製）中に移し４ｍ■の４Ｍ塩酸グアニジン
を含む０．１％トリフルオロ酢酸−水溶液により抽出を
行った。各抽出画分より５μｍをとり２ｍｌの１％ウシ
血清アルブミンを含むＲＰＭ１１６４０培養液にて希釈
したのち、前述したｒＣＳＡの測定方法（ｂ）」に従っ
てＣＳＡを調べた。この結果溶出全画分中に三つの活性
ピークが存在し、各活性ピークの位置は前述の等電点ｐ
Ｉ＝５．５２．５．８０．６゜１３とよく一致した。こ
こでみられた等電点の違いが、ペプタイド部分に起因す
るのか、あるいは糖鎖（特にシアル酸の付加数）に起因
するのかを明らかにする目的で、ノイラミニダーゼ処理
した試料と未処理の試料について等電点電気泳動を行っ
たところ、後者には３本のバンドが認められたのに対し
、前者はｐＩ＝８．１３のバンドのみが観察された。ま
たノイラミニダーゼ処理の代りに６Ｍグアニジン塩酸水
溶液に試料を溶解し、ＩＮ塩酸でｐＨを１．５としたの
ち、８０℃、１２０分の処理を行なった試料について同
様に等電点電気泳動を行なったところ、同様なバンドの
移動が認められた。尚、ノイラミニダーゼ処理を行なっ
てもＣＳＡは全く損われなかった。この結果から等電点
の違いはシアル酸の付加数の違いによるものと推定され
る。

（目Ｉ）　紫外部吸収 試料をｎ−プロパツールを４０％含む０．１％トリフル
オロ酢酸をレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とし、
分光光度計を用いて紫外部吸収を調べた結果、第３図に
示した如＜２８０ｎｍに極大吸収、２５０　ｎ　ｍに極
小値を示した。

（１ｖ）　　蛋白質部分のアミノ酸組成試料を常法によ
り加水分解し、その蛋白質部分のアミノ酸組成を日立８
３５アミノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用いて
特殊アミノ酸分析法により分析した。この結果を表−■
に示した。

尚、加水分解条件は次の如くである。

■　Ｅ３Ｎ　　ＭＣ１，１１０℃、２４時間、真空中 ■　４Ｎ　メタンスルホン酸＋０．２％　３−（２−ア
ミノエチル）インドール、１１０℃、２４時間、４８時
間、７２時間、゛真空中 試料は、４０％ｎ−プロパツールと０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含む溶液（１，５ｍ１）に溶かした後、各々０
．１ｍｌをとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、■
または■の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した
。

表中、実測値は■の２４時間値と■の２４．４８．７２
時間値の合計４回の平均値である。但し、Ｔｈｒ、Ｓｅ
ｔ＋　　１／２Ｃｙｓ、Ｍｅｔ＋　Ｖａｌ＋１１ｅおよ
びＴｒｐは以下の方法で算出した。（生化学実験講座、
タンパク質化学■（東京化学同人出版）を参照） ・Ｔ　ｈ　ｒ　＋　　Ｓ　ｅ　ｔ　＋　　１　／　２　
ＣＶ　ｓ　；　Ｍ　ｅ　ｔは■の２４．４８．７２時間
値の経時変化をとり、零時間に補外 ・ｖａｌ、ｌｌｅは■の７２時間値 ・Ｔｒｐは■の２４．４８．７２時間値の平均値表中の
アミノ酸残基数はＬｅｕを３３個と仮定して算出した予
測値である。一般に上記の如き補正が必要なアミノ酸は
、加水分解時に一部又はかなりの部分が破壊されるか、
あるいは加水分解を受は難いものであり、更にＰｒｏは
発色率が低い等のことからそれ等のアミノ酸の実測値（
ｎｍ。

ｌ）、従ってそれから算出される残基数は実際よりも低
い値を示す傾向がある（例えば前述の生化学実験講座を
参照）。

表−Ｉ （ｖ）　　温度安定性 試料（凍結乾燥粉末）１−ｇをｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸４ｍｌにて溶解し、そ
の１ｍｌを分取し、１％ウシ血清アルブミンを含むＯ，
ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１０ｍｌにて希
釈してＣＳＦ濃度を２５ｎｇ／ｍｌとした。この試料を
０℃、３７℃。

４５℃、５６℃、６５℃および１００℃にてそれぞれそ
４０分間処理したのち、残存するＣＳＡを検討した。こ
の結果、０〜４５°Ｃで安定であり、５６℃で失活した
。

（ｖｌ）　　ｐＨ安定性 試料（凍結乾燥粉末）１ｍｇをｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸４ｍｌに溶解し、その
１ｍｌを分取し、１％ウシ血清アルブミンを含むｐＨ１
，３，５，７，９，１１，１３の各緩衝液１０ｍ１にて
希釈し、ＣＳＦ濃度を２５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌとしてそれ
ぞれ水中で２４時間処理した。処理終了後、それぞれ２
ｍｌを０．０１Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に
て透析してｐＨをもどしたのち、残存するＣＳＡを検討
した。

この結果、ｐＨ１〜１１の広い範囲で安定であった。

（ｖｉｉ）　　酵素に対する安定性 試料（凍結乾燥粉末）をｎ−プロパツールを４０％含む
０．１％トリフルオロ酢酸に、溶解し、０゜６７μｇを
０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）を加えて全
量を１ｍｌとした検体を４つ、および同じ＜０．６７μ
ｇを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）を加えて全量
を１ｍｌとした検体を１つ用意し、前者には各々ＲＮａ
ｓ　ｅ、）リプシ：ｚ（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、プロナーゼ
（Ｐｒｏｎａｓｅ）を１μｇ添加し、残る１つはコント
ロールとした。後者にはノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａ
ｍｉｎｉｄａｓｅ）ｔμｇを添加し、それぞれ３７℃で
２時間反応させた。反応終了後、各々０゜１ｍｌをとり
１％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ　１６４０培養
液１ｍｌにて希釈後、それぞれＣＳＡを検討した。この
結果、本発明のＣＳＦはＲＮａｓｅ、　　ノイラミニダ
ーゼでは失活しないが、トリプシンおよびプロナーゼで
失活した。（ｖＮＩ）糖組成 試料１１　ｎｍｏ　ｌに内部標準としてイノシトール２
５ｎｍｏｌを加えた後、１．５ＮＨＣ１を含むメタノー
ル溶液（５００μｍ）を加えて窒素ガス置換した封管中
、９０℃で４時間反応させた。

開管後戻酸銀（Ａｇ２　ＣＯ３）を加えて中和したのち
、無水酢酸５０μｌを加え振とう後、室温にて暗所に一
晩放置した。上層をサンプルチューブにとり、窒素ガス
にて乾燥した。沈殿にメタノールを加え洗浄後軽く遠沈
し、上層を同じサンプルチューブに加え乾燥した。これ
に５０μｍのＴＭＳ化試薬（ピリジン：へキサメチルジ
シラザン：トリメチルクロロシラン＝５：１：１に混合
したもの）を加え４０℃で２０分反応させたのち、Ｄｅ
ｅｐ　　Ｆｒｅｅｚｅｒに保存した。尚、スタンダード
としてガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクト
サミン（Ｇａ　ｌ　　ＮＡｃ）　、シアル酸等、各種糖
を各５０ｎｍｏｌ及びイノシトール２５ｎｍｏｌを合わ
せ同様の操作を行なった。

このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマド分
析を行なった。

（分析条件） カラム＝２％０Ｖ−１７Ｖｉｎｐｏｒｔ　　ＨＰ６０〜
８０メツシュ、３ｍ、ガラス 温　度＝１１０℃〜２５０℃まで４℃／分の昇温キャリ
ヤーガス：最初は１．２〜１．８ｋｇ／ｃｔｌ（窒素圧
）終了時は２〜２．５ ｋｇ／ｃぜ 感　度＝１０３ＭΩ　レンジ０．１〜０．４ｖ圧　　：
水素ガス０．８ｋｇ／ｃＩＴＩ′、空気０．８ｋｇ／Ｃ
ぜ サンプル量：２．５〜３．０μ１ 分析の結果　本発明のＣＳＦの構成糖はガラクトース、
Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸の３種類で
あることがわかった。

（１ｘ）　　アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエネーター（アプライドバイオシス
テム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得
られたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装
置（ベックマン拳インストルメンツ社製）およびＵｌｔ
ｒｏｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラム（ベックマン・インスト
ルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム（
５μｍ。

直径４．６．、、長さ２５ｏｍｍ）を開始緩衝液（１５
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５，４０％アセニト
リルを含む水溶液）にて平衡化したのち、検体（２０μ
ｌの開始緩衝液にて溶解）を注入して開始緩衝液による
インクラティック溶出により分離を行なった。流速は１
．４ｍｌ／分、カラム温度は４０℃に保持した。ＰＴＨ
アミノ酸の検出は２８９ｎｍと３２０ｎｍの紫外部吸収
を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ酸（シグマ社
製）各２ｎｍｏｌを同一の系で分離して保持時間を決定
し、被検検体の保持時間から同定を行なった。

この結果、Ｎ末端から２１残基目までのアミノ酸配列は
次の如く決定された。

実施例（２）で得た本発明のＣＳＦのヒト骨髄細胞に対
する比活性値を前述したｒＣＳＡの測定方法（ａ）」に
従って測定した結果３．９４Ｘ１０７Ｕ／璽ｇ≦であっ
た。

実施例（５） 実施例（２）の方法で得たＣＳＦの凍結乾燥粉末を以下
の条件で調整用等電点電気泳動により等電点の違いによ
るＣＳＦの分離を行なった。

装　　　置：　ＦＢＥ−３０００ （ファルマシア社製） 試　　料：凍結乾燥粉末１０−ｇを４Ｍ尿素を含む０．
０５Ｎリン酸２ｍｌに溶解。

支持体：１５ｇの５ｅｐｈａｄｅｘ−ＩＥＦ（ファルマ
シア社製）に、４Ｍ尿Ｌ　０゜１％ツイーン２０を含む
２回蒸留水２ ２５ｍ１を加えたのち、更に１２ｍ１ のファルマライト４−６．５　（ファルマシア社製）を
加え室温にて一晩放置 して膨潤せしめた。膨潤後、吸引びん を用いて充分脱気を行ったのち２３０ ｍｍＸ２３０ｍｍのガラスプレート上に５酊厚の均一な
ゲル屑を作成した。

電極液＝（陽極）０．１Ｍリン酸、（陰極）０゜１Ｍ　
　ＮａＯＨを電極ストリップ（６Ｘ１０ｍｍ、　　ファ
ルマシア社製）に含ませ、ゲルの両端に接して平行に置
く。

パワーサプライ（ＥＣＰＳ　　２０００／３００．　フ
ァルマシア社製）を用いて定電力。

前泳動：８Ｗ４５分間泳動を行なった。

試料添加：陽極から５ｃｍの位置にて、１ｃｍ巾にゲル
をかき取り、試料液と混合したのち、もとの位置にもど
した。

本泳動：前述のパワーサプライ用い、５０Ｗ定電力、４
時間泳動を行なった。

泳動終了後、ゲルプレートをとり出し分画格子を用いて
２６分画に分け、各分画のｐＨを測定後、各分画のゲル
をかき取りポリプロピレン製ミニカラム（ムロマック、
室町化学社製）中に移し１０ｍ１の４Ｍ塩酸グアニジン
を含む０．１％トリフルオロ酢酸−水溶液により抽出を
行った。各抽出画分より５μｌをとりＩＥｉｍｌの１％
ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩＩθ４０の培養液に
て希釈したのち、前述したｒｃｓＡの測定方法（ｂ）」
に従ってＣＳＡを調べた結果、三つの等電点（ｐＩ＝５
．５２．５．８０，８．１３）にほぼ一致して活性のピ
ークが認められた。次いでそれぞれの活性画分をｎ−プ
ロパツールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡
化したμＢｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅ
ｒｓ社製、セミ分取用、８＋＋ｍＸ３０ｃｍ）に吸着さ
せたのち、３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツ
ールを含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で溶出し、
ｎ−プロパツール４０％で溶出されるピークをそれぞれ
回収し凍結乾燥した。これらについて実施例（３）の（
ｉｖ）および（１ｘ）の方法に従ってアミノ酸組成およ
びアミノ酸配列を調べた結果、いずれも実施例（３）の
結果と一致した。

実施例（６） 実施例（２）で得たＣＳＦの凍結乾燥粉末１０ｍｇを２
ｍｌのＯ，１Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム（ｐ
Ｈ９，０）に溶解したのち、ＩＮ塩酸を用いてｐＨを５
．０に調整した。これにノイラミニダーゼ１００μｇを
添加後３７℃で２時間反応させたのち、反応液をｎ−プ
ロパツールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡
化したμＢｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅ
ｒｓ社製、セミ分取用、８ｍｍＸ３Ｑｃｍ）に吸着後、
３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツールを含む
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で溶出し、ｎ−プロパ
ツール４０％にて溶出されるピークを回収し凍結乾燥し
た。この一部を採り分析用等電点電気泳動に付した結果
、等電点ｐＩ＝６．１３の単一バンドであることを確認
した。

実施例（７）　コロニーの分類 前述のｒｃｓＡの測定方法（ａ）」に基づいて形成され
たコロニーをＫｕｂｏｔａ、に、らの方法（Ｅｘｐ、Ｈ
ｅｍａｔ、＊　８巻、３３９〜３４４頁、１９８０年）
に従って、寒天層ごとスライドグラス上にとり出し乾燥
させフィルム状標本を作成した。次にこの標本をＫｏｎ
ｗａｌｉｎｋａ。

Ｇ、らの方法（Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔ、＋　８巻、４３４
〜４４０頁、１９８０年）に従ってエステラーゼ三重染
色及びビーブリッヒスカーレット染色の三重染色を行っ
てコロニーの分類を行った。方法の詳細については以下
に示す。

■固定液：緩衝ホルマリン自アセトン液（ｐＨ６゜Ｎａ
２　ＨＰＯ４２０ｍｇ ＫＨ２ＰＯ４１００ｍｇ Ｈ２０３０ｍ　ｌ アセトン　　　　４５ｍ１ ホルマ１ン 全　量　　　１００ｍ１　４℃にて保存■非特異的エス
テラーゼ染色反応液（用時調整）（Ａ）　　１／１５ｍ
ｏｌ／ｌ、　　リン酸緩衝液（ｐＨｅ、３）９．５ｍｌ
ファスト、ガーネットＧＢＣ塩　　　　　１０−ｇ （Ｂ）　　α−ナフチルブチレート　１０−ｇエチレン
グリコールモノメチルエーテル０．５ｍ１ （Ａ）液と（Ｂ）液を混和後濾過して使用Ｏ ■クロロアセテートエステラーゼ染色反応液（用時調製
） （Ａ）　　ｌ／１５ｍｏ　ｌ／１．　　リン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）　　　　　　　　９．５ｍｌファストブル
ーＲＲ塩　　　　５１Ｉｇ（Ｂ）　ナフトールＡｓ−Ｄ
クロロアセテート１■ 、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド ０．５ｍ１ （Ａ）液と（Ｂ）液を混和後濾過して使用。

■ビーブリッヒスカーレット染色反応液（Ａ）　　ビー
ブリッヒスカーレット（Ｍ　Ｃ／　Ｂ　社製）　　　　
　　　　　　　　　５ｇ ジメチルスルフォキサイド１００ｍ１ （Ｂ）０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）（Ａ
）液２ｍｌを（Ｂ）液９８ｍ１に混和して使用。

上述の如く調製した固定液および反応液を用いて以下の
如き順序でコロニー染色を行なった。

（ｉ）　　■の固定液（４〜１０℃）にて３０秒間固定
後蒸留水にて３回水洗し室温にて１０〜３０分間乾燥。

（１１）　　■の反応液に浸し室温に２０〜３０分間放
置後蒸留水にて３回水洗。

（１目）■の反応液に浸し室温に１５分間放置後蒸留水
にて３回水洗。

（ｉｖ）　　■の反応液に浸し室温に２時間放置後流水
にて水洗。

（ｖ）　　乾燥後観察。青色の顆粒を含む細胞を好中球
、茶褐色の顆粒を含む細胞を単球−マクロファージ、赤
色の顆粒を含む細胞を好酸球として分類した。

この結果、本発明のＣＳＦを用いて形成されたコロニー
は、培養７．１０．１４日口のいずれの時点においても
全てクロロアセテートエステラーゼ陽性の好中球コロニ
ーで、他系統のコロニーは全く認められなかった。

［発明の効果コ 本発明のＣＳＦは次の■〜■の実験結果から明らかな如
くほぼ完全に純化されたものである。即ち■逆相系およ
び分子ふるいに基づく高速液体クロマトグラフィーにお
いて単一のピークを示し、活性ピークもこれと一致する
。■５ＤＳ−ＰＡＧＥにて単一のバンドを与える。■等
電点電気泳動法により３つの異なる等電点を持った成分
に分離されるが、各成分はいずれもＣＳＡを示す単一成
分である。また、酵素的あるいは化学的に末端シアル酸
の除去を行なうと、等電点電気泳動法においても単一の
バンドとなる。■Ｎ末端２１残基迄のアミノ酸配列分析
において、各ステップで出現するＰＴＨアミノ酸は、常
に一種類である。■従来報告されているヒトに有効なＣ
ＳＦの純度と比較すると、比活性において約１０倍高い
値が得られている。

このように純化された形のＣＳＦは未だ例を見ないもの
であり、本発明のＣＳＦは遺伝子工学技術等を用いたＣ
ＳＦの大量生産技術の確立のための材料として極めて好
適であるほか、臨床検査用試薬として、あるいは研究用
試薬として使用しつる。また骨髄移植時の骨髄細胞の増
殖促進、放射線被爆時の骨髄組織の回復促進、制癌剤使
用後の白血球レベル回復促進あるいは本発明のＣＳＦが
骨髄細胞の好中球への分化増殖促進作用を有することか
ら、抗生物質で治療できない重症感染症等の治療薬とし
ての効果等が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＣＳＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示
す。図中・が本発明のＣＳＦである。 第２図は本発明のＣＳＦの等電点電気泳動の結果を示す
。 第３図は本発明のＣＳＦのＵＶ吸収スペクトルである・ 矛１図 をモミ（Ｊ） 手続補正書（方式） 昭和６１年７月３日 特許庁長官　　　宇　賀　　道　部　殿１、事件の表示 昭和８１年特許願第７７５７９号 ２、発明の名称 新規なＣＳＦおよびその取得方法 ３、補正有する者 事件との関係　　特許出願人 東京都北区浮間５丁目５番１号 ４、補正命令の日付 昭和６１年６月３日 （発送日昭和６１年６月１７日） （注）書類送付先及び連絡先 ５、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の理化学的性質を有するＣＳＦ。 ｉ）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポ リアクリルアミドゲル電気泳 動法による測定で１９０００ ±１０００。 ｉｉ）等電点：ｐＩ＝５．５±０．１、ｐＩ＝５．８±
   ０．１、ｐＩ＝６． １±０．１の三つの等電点の うち少なくとも１つを有する。 ｉｉｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
   ５０ｎｍに極小値を もつ。 ｉｖ）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
   くである。 【アミノ酸配列があります】 （２）等電点ｐＩが５．５±０．１である特許請求の範
   囲第１項記載のＣＳＦ。 （３）等電点ｐＩが５．８±０．１である特許請求の範
   囲第１項記載のＣＳＦ。 （４）等電点ｐＩが６．１±０．１である特許請求の範
   囲第１項記載のＣＳＦ。 （５）ヒトＣＳＦ産生能を有する細胞株を血清無添加培
   養液にて培養し、その培養上 清を次の（１）〜（３）処理に付し、更に必要に応じ（
   ４）または（５）の処理を付してなる下記理化学的性質
   を有するＣＳＦの取得方法。 （１）培養上清を５０００〜７００００ダルトン実効分
   画範囲を有するゲルを用いたゲ ルろ過に付し、好中球優位のコロニー形 成促進活性（以下「ＣＳＡ」という）を 有する画分を回収する。 （２）（１）の画分を逆相系高速液体クロマトグラフィ
   担体に吸着せしめ、水と有機溶媒の 混液の濃度勾配により溶出し好中球優位 のＣＳＡを有する画分を回収する。 （３）（２）の画分を高速分子篩クロマトグラフィに付
   し好中球優位のＣＳＡを有する画分 を回収する。 （４）（３）の画分を等電点電気泳動に付し、好中球優
   位のＣＳＡを有する画分を回収する。 （５）（３）の画分にシアル酸除去操作を施したの、好
   中球優位のＣＳＡを有する画分を回収 する。 「理化学的性質」 ｉ）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動 法による測定で１９０００±１ ０００。 ｉｉ）等電点：ｐＩ＝５．５±０．１、ｐＩ＝５．８±
   ０．１、ｐＩ＝６．１ ±０．１の三つの等電点のうち 少なくとも一つを有する。 ｉｉｉ）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２
   ５０ｎｍに極小値を もつ。 ｉｖ）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
   くである。 【アミノ酸配列があります】 （６）ヒトＣＳＦ産生能を有する細胞株がＣＨＵ−１で
   ある特許請求の範囲第５項記載の 方法。