JPS62292731A - 低温殺菌された免疫グロブリン製剤の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、発明の詳細な説明 本発明は病原体を不活化するために免疫グロブリンの溶
液を安定剤の存在下に加熱し、そして必要な場合は絖い
て精製することからなる、免疫グロブリン製剤の製法に
関する。

免疫グロブリン製剤を低温殺菌することによりウィルス
のような病原体を不活化せしめる方法が必要とされてお
り、その場合免疫グロブリンの活性は完全に保持されて
いなければならない。一般に、慣用の方法による免疫グ
ロブリンの調製においては、ウィルスまたはウィルス性
抗原の含量が単に用いられる試験系の検出限界以下に低
下される程度にまで、ありうる感染の危険を低下させた
ものである。しかしながら、検出限界は感染の危険を明
白に除去するには通常不充分であるか、またはある種の
夾雑するウィルスを検出するに充分な試験系は存在しな
い。

それゆえ加熱処理が好ましい。加熱による不活化により
感染性病原体が増殖できなくなるか、モして／または細
胞内でかまたはそれ以外で増殖できなくなる。

変性を回遭するために免疫グロブリンが長時間熱にさら
される期間中はそれらを安定化させることが必要である
。ウィルスを不活化させるには、許容されうる最高の温
度で長時間加熱することが不可欠である。

ヨーロッパ特許出願Ａ−０，１２４，５０６号には、免
疫グロブリン溶液に硫酸アンモニウムを添加しそしてこ
の懸濁液を６０℃で１０時間加熱する方法が開示されて
いる。しかしながら、免疫グロブリン溶液を前記特許出
願実施例１６記載のようにして処理した場合、重合体状
免疫グロブリンが形成される。筋肉内投与用の免疫グロ
ブリン溶液においては、ヨーロッパ薬局方で最高１０％
までの重合体状免疫グロブリンしか許容されない。

日−ロツバ特許出願Ａ−０．１４４，７１４号には、コ
ーン（Ｃｏｈｎ　）フラクションＩＩ　＋　ｍ　（［、
Ｔ、　Ａｍ。

Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｏ、　Ｊ　６８．４５９　（１９４６
）　）が緩和な条件でのみ、好ましくは５２°Ｃで約３
０分間で低温殺菌されうろことが開示されている。たと
え真正グロブリンを予め除去しそして溶液を透析してエ
タノールを除去した場合でも、それにも拘らず集合物が
生成する。これらの条件下で絶対的なウィルス不活化が
確実かどうかは疑わしい０ 「Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔｊ　　１９８３年１１月１９日
号、１１９８〜９９頁には、ヒト免疫グロブリンを４５
％（ｗ／ｖ）のソルビトールおよび１５％（Ｗ／ｖ）の
グリシンを含有する溶液中で６０℃で１０時間加熱する
方法が開示されている。その場合活性損失も集合物含量
の増大も観察されなかった。

糖アルコール、アミノ酸または糖類を添加してのヒト血
漿の低温殺菌法はヨーロッパ特許出願人−０，１３９，
９７５号に記載されている。血漿を低温殺菌する場合は
免疫グロブリンを他の血漿タン／ぞり質によって保護す
る。工ｇＧに対するアルブミンの安定化作用は知られて
いる。

本発明は免疫グロブリンの溶液をカルボン酸またはその
塩の１種、および／または糖類の存在下に、病ぶ体特に
肝炎ウィルスまたはＨＴＬＶ　［（「エイズ」）ウィル
スが不活化されるまで（すなわち増殖できなくなるかま
たは細胞内でもしくはそれ以外で増殖できなくなるまで
）加熱することからなる低温殺菌された免疫グロブリン
製剤の製法に関する。

かかる不活化に適当な条件は当業者に知られている。通
常約６０°Ｃで約１０時間加熱する。

そのカルボン酸は好ましくは１個またはそれ以上の他の
カルボキシル基、または１個またはそれ以上のアミ７基
、または１個またはそれ以上のヒドロキシル基で置換さ
れていることができる脂肪族カルボン酸が好ましい。こ
のカルボン酸は２〜１０個の炭酸原子を有するのが好ま
しい。このカルボン酸はグリシン、グルタミン酸、クエ
ン酸または酒石酸が好ましい。

カルボン酸の好ましい塩は溶性金属塩特にアルカリ金属
またはアルカリ土類金属塩、特にナトリウムまたはマグ
ネシウム塩である。

用いられるグルタミン酸の塩はアルカリ金属塩、特にモ
ノナトリウム塩（ナトリウム　グルタメート）が好まし
い。

カルボン酸またはそれらの塩は飽和限界までまたはそれ
を越える量、好ましくは安定化すべき免疫グロブリン溶
液に０．４二α６９／−の量で添加されつる。

糖類としては単糖類または二糖類が使用されるのが好ま
しく、特にスクロースが好ましい。

これらの糖類は好ましくは安定化すべき免疫グロブリン
溶液に０．５〜１、ｌ／−なる量にて添加される。

カルボン酸またはそれらの塩類、または糖類は安定化す
べき免疫グロブリン溶液の飽和限界までまたはそれを越
える量にて添加されうる。

これら物質を添加することにより免疫グロブリンの沈澱
が惹起されることがある。その場合でも、生成する懸濁
液は免疫グロブリンに対する有害な作用を伴うことなく
加熱される。

加熱工程においてｐＨ値は５〜８．５、好ましくは６．
５〜Ｚ５に調整される。

本発明方法により、その重合体含量が１０％より少ない
低湿殺菌された免疫グロブリン溶液を得ることができる
。好ましい態様においては、重合体含量は加熱されなか
った免疫グロブリン溶液に比較して操作の実験誤差分散
の範囲内で未変化のままである。

本発明方法の出発物質は、文献ではガンマグロブリン、
工ｇＧ　Ｎ免疫グロブリンＧまたは「Ｊ。

Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｏ、ｊ　７１．　５４１　（
１９４９）によればフラクション■と呼ばれる精製免疫
グロブリンであることができる。かかる免疫グロブリン
は血漿の分別から得られる免疫グロブリン含有フラクシ
ョンから段階的沈澱により主に導かれる。

免疫グロブリンを含有する沈澱は「Ｖｏｘ、Ｓａｎｇ、
　Ｊ７．４１４（１９６２）のフラクションＡ１または
’Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ！！１．　Ｓｏｃ、　Ｊ　　６
Ｂ　、　　４５９（１９４６）のフラクション■および
■である。

修飾された免疫グロブリンを出発物質として使用するこ
ともできる。かかる免疫グロブリンは化学的修飾例えば
スルフィトリシス、または酵素による処理例えば７〇一
部分のはプシンによる除去により修飾されうる。免疫グ
ロブリン分子をｐＨ４ではプシンを用いてタンパク分解
することにより分解させると、分子量約１００．０００
および分析用超遠心器で測定して沈降係数約５３（Ｓ＝
スベドベリ単位）を有する！Ｆ（ａｂ）２フラグメント
が主に得られる。

かかる生成物は７Ｓを有する未分解免疫グロブリン（分
子量約１５０，０００）を含有するがしかし実際上何ら
免疫グロブリン重合体を含有しない。しかしながら、５
Ｓより小さい分子量を有する、より広範に断片化された
部分が１０％以下の濃度で観察される。

驚くべきことに、本発明方法はエタノールを含有する免
疫グロブリンの溶液にも適することが見出された。

エタノールを用いて精製免疫グロブリンが得られる場合
、しばしば最終濃縮工程でエタノールにより免疫グロブ
リンが完全に沈澱されそして次に遠心分離により沈澱が
とり出される。沈澱を約１０％溶液となるように溶解さ
せろとｈ約４容量％のアルコール残存含量を有する溶液
が得られる。エタノールは通常凍結乾燥または限外濾過
により除去される。安定剤の存在下に、例えば限外−過
ののちアルコール不含の溶液を加熱する場合は、これら
の添加剤を次に除去するために限外濾過を反復する必要
があろう。従って、工程を促進させそして経済的なもの
とするにはエタノールの存在下に加熱を行うのが好都合
である。

驚くべきことに、カルボン酸を添加した場合には免疫グ
ロブリンをエタノールの存在下に６０℃で長時間、例え
ば４０時間加熱しても何ら集合増大が観察されないこと
が見出された。

エタノールは通常高められた温度で免疫グロブリンを変
性させることが知られている。従って、たとえ安定剤と
してのカルボン酸またはそれらの塩の存在下に加熱を行
うとしても、アルコールなしの操作におけるよりもアル
コールの存在下における方がたしかに重合体の含量が高
くなった。

エタノール含有免疫グロブリン溶液のｆｌｌとしてはＣ
ｏｈｎ氏他の「Ｊ、λｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊ　６８
　、４５９以下（１９４６）によりフラクションｎ　＋
　ｍ　ト呼ばれるかまたはＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ氏池、
（Ｋｉｓｔｎｓｒａｎｄ　Ｎｉｔａｃｈｍａｎｎ　、　
Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ。（１９６２）、　７．４１４）によ
りフラクションＡと呼ばれるガンマグロブリンを含有す
るフラクションがあげられる。がかるフラクションはガ
ンマグロブリンのみならず、リポタンパク質、真正グロ
ブリン、α−およびβ−グロブリンおよび少量のアルブ
ミンをも含有している。総タンパク質１００ｇ中のガン
マグ賞プリン含量は約２０〜８０．９である。フラクシ
ョンｎ＋ｍ　　１ｏｏｇを蒸留水２５〇−中に溶解した
場合、溶液のアルコール含量は４〜５−７１［１０ｄで
ある。かかるフラクション■＋■はそれゆえ本発明方法
により低温殺菌されつる。

第１表には本発明方法を適用した後の重合体状免疫グロ
ブリンの含量を従来法と比較して示す。それぞれ６０℃
で１０時間加熱が行われた。

免疫グロブリン含量は溶液１０〇−当りタンパク質１０
〜１１ｇであった。ｐＨは７であった。

この表から、本発明方法を適用した場合、免疫グロブリ
ンの望ましからぬ重合体増加が、アルコールの存在下に
おいてすらも概して非常に低いことが示される。さらに
この所見は他の試験法、例えば抗補体活性の測定によっ
ても確認される。

加熱により生ずる分子量の高まった部分の金遣は知られ
た方法によりさらに低下されつる。

この目的には添加された安定剤を、例えば限外濾過によ
り、選ばれた精製法にとって適するイオン性媒体と置換
することが好都合である。

加熱の持続時間は一定の限界内で変動されうる。

ここに記載される方法の効力を試験するには、タンパク
質９．９ｇ／１００−およびエタノール３．６ｇ／１０
０−を含有する免疫グロブリン溶液に溶液１ｒｎ！当リ
スクロース１ｇおよびグリシン０．１５ｇを加えた。ラ
ウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）を感染性Ｒ３Ｖ１Ｘ１０’
単位／ｄ（Ｕ／ｄ）なる濃度で添加したのちこの溶液を
６０℃に加熱した。一時間加熱後でウィルス含量は検出
限界以下に低下していた。

第２表には、加熱が抗体活性に何の影響も及ぼさないこ
とが明示される。

２）放射線免疫検定（国際単位／−） ３）　　Ｋ１１ａａ（酵素結合免疫吸着検定、相互力価
）以下の実施例により本発明を説明する。

実施例　１ 免疫グロブリン溶液をナトリウムグルタメートと加熱 タンパク質含量９０９／Ｌを有する免疫グロブリンの実
際上純粋な溶液２００−に攪拌下にナトリウムグルタメ
ート（グルタミン酸のモノナトリウム塩）１２０！ｉを
添加した。それにより免疫グロブリンが沈澱した。ｌ値
を７に調整したのちこの懸濁液を攪拌下に１０時間６０
℃で加熱した。混合物を室温まで冷却したのちこの沈澱
を濾過または遠心分離によりとり出した。沈澱を蒸留水
中に溶解させた。グルタミン酸塩を透析または限外濾過
により除去した。この溶液を等優性となしかつ所望のタ
ンノ（り賃金量に調整した。

タン・１り質濃度１５５９／ｌを有する溶液１１ｏ−が
得られた。重合体含量は１６％であった（未加熱で１．
２％）。

実施例　２ 免疫グロブリン溶液をスクロースおよびグリシンと加熱 塩化ナトリウム含量１９／ｌおよびタンパク質含量９７
９／ｌを有しそして３．６容量％のエタノールを含有す
る免疫グロブリン溶液８９ｔにスクロース８９神ならび
にグリシン１３．３Ｊｃ９ヲ加えた。ｐＨ値を７に調整
したのちこの混合物を攪拌下に６０℃に１０時間加熱し
た。この溶液を０、ｉ／１００−の塩化ナトリウム溶液
１００ｔで希釈しそして滅菌濾過した。安定剤を限外濾
過により知られた方法で除去した。次にこの溶液を等優
性となしそしてタンパク賃金ｆｌ　１６０９／ｌとなる
ように調整した。

２．６％の重合体含量（未加熱溶液で２％）を有する溶
液５１ｔが得られた。スクロースの残存濃度はα０４１
１／ｌであった。

実施例　３ タンツク質含量１００ｇ／ｌおよび塩化す）　ＩＪウム
含量３９／ｌを有するスルホン化された免疫グロブリン
１０〇−中にスクロース１００９およびグリシン１５９
を加えた。ｐＨを７６に調整したのちこの混合物を６０
℃で攪拌下に１０時間加熱した。

次にこの溶液を室温に冷却しそして０．３．！ｉ’／１
００−の塩化す）　ＩＪウム溶液１７０−で希釈した。

安定剤は限外濾過により除去した。溶媒をα？ｌ／１０
０−の塩化す）　ＩＪウム溶液と交換した。免疫グロブ
リンの溶液を等優性となしモしてタンパり賃金世５ｏｇ
７ｔｙｃ調整した。

この操作により重合体含量５．６％（未加熱溶液で５．
８％）を有する溶液１９５−が得られた。

実施例４ ペプシンで分解され、タンパク質含量１８０ｇ／ｌおよ
び塩化ナトリウム含量３．２ｇ／Ｌを有する免疫グロブ
リン溶液１３．７４を０．１／１０（ｌの塩化す）　Ｉ
Ｊウム溶液１３．５ｔで希釈した。次にスクロース２７
．２　ｋｇおよびグリシン４．Ｄ８ｋｓ＋を添加した。

この混合物を攪拌下にｐＨ７で６０℃に１０時間加熱し
た。次のこの溶液を室温に冷却しそして０．３ｇ／１０
０−の塩化ナトリウム溶液４５１で希釈した。滅菌濾過
したのち添加された安定剤を限外濾過により実質的に除
去した。次にこの溶液を等優性となしそしてタンパク質
濃度を５０ｇ／ｌに調整した。スクロースの残留濃度α
ａ１ｇｉｔを有する溶液４８２が得られた。所定の分子
量を有する成分の含量は分析用限外濾過器で測定して以
下のとおりであった。

出発物質　　：３５以下＝８．８％ Ｓ約５　”　７５．５％ Ｓ約７＝１５．７％ ３７以下＝０％ 加熱最終生成物　：　８５以下＝８．１　　％Ｓ約５　
＝　７７．５％ Ｓ約７＝１４．４％ ８７以上二〇％ 実施例５ 溶解されたエタノールを含有するフラクション■十ｍの
エタノールの存在下における加熱フラクションＩＩ＋ｍ
　２０ＯＮに蒸留水５００−を加えそして攪拌下に溶解
させた。この溶液（約７００ｍ）にスクロース７００１
！および０．６〜０．２モル／Ｌのグリシンを添加した
。ｐＨを約７に調整したのちこの溶液を攪拌下に６０℃
で１０時間加熱した。次にこの加熱された溶液を分別し
た。

タンパク質含量６６１／ｌを有する免疫グロブリン溶液
３０４−が得られた。重合体含量は１．１％であった。

同じ＜２００ｇのフラクション■＋■を用いて未加熱で
比較処理するとタンパク質濃度９６．８ｇ／ｌを有する
免疫グロブリン溶液２０８ｒｎｔが得られた。重合体含
量は２．０％であった。

代理人　弁理士　商　木　千　４゛　２外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）免疫グロブリンの溶液をカルボン酸またはその塩の
   １種、および／または糖類の存在下に、生存能力のある
   病原体特に肝炎ウィルスまたはＨＴＬＶIII（「エイズ
   」）ウィルスが不活化されるまで、すなわち増殖できな
   くなるかそして／または細胞内でもしくはそれ以外で増
   殖できなくなるまで加熱することからなる低温殺菌され
   た免疫グロブリン製剤の製法。 ２）前記カルボン酸が場合により置換されていてもよい
   脂肪族カルボン酸であることからなる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３）前記カルボン酸が１個または２個の他のカルボキシ
   ル基、１個または２個のアミノ基、および／または１個
   またはそれ以上のヒドロキシル基で置換された、２〜１
   ０個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸であることか
   らなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）前記カルボン酸がグリシン、グルタミン酸、クエン
   酸または酒石酸であることからなる特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ５）前記糖類が単糖類または二糖類であることからなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）前記糖類がグルコース、フルクトース、ガラクトー
   スまたはスクロースであることからなる特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ７）特許請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン製剤の
   治療または予防への使用。 ８）特許請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン製剤の
   診断試薬キットへの使用。