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JPS62212568A - 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 - Google Patents

糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法

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Publication number
JPS62212568A
JPS62212568A JP61057772A JP5777286A JPS62212568A JP S62212568 A JPS62212568 A JP S62212568A JP 61057772 A JP61057772 A JP 61057772A JP 5777286 A JP5777286 A JP 5777286A JP S62212568 A JPS62212568 A JP S62212568A
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JP
Japan
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sugar chain
assay plate
specific antibody
antibody assay
producing
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JP61057772A
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Ikuo Yamashina
山科　郁男
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • G01N33/5304—Reaction vessels, e.g. agglutination plates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S436/822—Identified hapten
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、複合糖質糖鎖に特異的な抗体を検出検定する
ためのアッセイプレートに関し，このプレートを利用す
ることによって糖鎖特異釣車クローン抗体を産生ずるハ
イブリドーマを効率的に作製することができる。
［従来の技術コ 自然界に広く存在する糖タンパク質、糖脂質、ムフ多糖
などの複合糖質の糖鎖を認識する特異的な抗体の作製に
ついては多くの試みがなきれてきたが、一般には作製し
難いときれている。現在作製されているもののほとんど
は，Ａ，Ｂ，Ｈ、Ｌｅ“、Ｌｉ２、■等のごとき各種の
血液型活性物質に対するもので、これらはそれなりに価
値あるものではあるが、例えば細胞のガン性変化を認識
し得るようなものは少ない。ガン化に伴って細胞表面の
複合糖質糖鎖に変化が起こることが予測されており、そ
の変化が多様であることから，多数の糖鎖特異的抗体の
作製が強く要望されている。この要望に応えるため、細
胞またはそれをホルムアルデヒドなどで処理したもの、
あるいは細胞から調製した複合糖質標品を、単独または
アジュバントと共に血流、腹腔、皮下、皮内等に投与し
て生物を免疫し、血清中の抗体と、免疫に用いた細胞ま
たはその修飾物との結合力を指標として血中抗体価を検
定するのが通常であった。
［発明が解決しようとする問題点］ 上述のような検定法を用いるばあい、血中の抗体のほと
んどが細胞表面のタンパク質成分に特異的であるため、
これらの抗体の中から糖鎖に対する抗体を選択すること
は事実上不可能であった。
本発明の目的は、血中の多種の抗体の中から糖鎖に特異
的なものの力価のみを検定しうるアッセイプレートを提
供し、これを基にして糖鎖特異的抗体を産生ずるクロー
ンの分離を可能にしようとするものである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は，ムチン型機ペブテドをアルキレンジアルデヒ
ド及び塩基性ポリペプチドもしくは塩基性合成ポリマー
の存在下に固相化せしめた糖鎖特異抗体アッセイプレー
ト及び血清型糖ペプチドを高級脂肪酸でアシル化して固
相化せしめた糖鎖特異抗体アッセイプレート，並びにそ
れらの製造法を提供する。
本発明に係わるアッセイプレートを調製するには、細胞
またはそれに由来する生物標品、単離した糖タンパク質
等より、プロテアーゼ等による消化等を徹底的に行なっ
て，ペプチド部分を出来得る限り除去して糖ペプチドを
調製した後、これを抗原抗体反応のアッセイ用プレート
上に固相化吸着させる。
本発明アッセイプレートを用いることによって糖鎖特異
的抗体を検出および力価検定し、抗体産生ハイブリドー
マを選択し、糖鎖特異的抗体を産生ずるクローンを単離
することが可能となる。
糖鎖特異的抗体を検出および力価検定するにはまず、糖
鎖を糖ペプチドの形で調製し、これを吸着させたプレー
トに、検定すへき、例えば血清または細胞培養液を加え
、さらに一次抗体に対する二次抗体またはプロティンＡ
（例えば、牛丼化学社製）を加え、これに予め結合させ
てある放射標識または、容易に活性測定可能な酵素を指
標として測定するものである。
本発明では糖ペプチドの起源として、ガン細胞および各
種のムチン型糖タンパク質を用いているが、この方法は
当然他のいかなる動植物細胞、微生物細胞、さらには各
種の単離した糖タンパク質にも適用し得るものである。
糖ペプチドの調製には、ストレプトマイセス・グリセウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）より
分離した非特異的ブロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅ）である１例えばプロナーゼＰ　（Ｐｒｏｎａｓｅ　
Ｐ；科研製薬製品）またはこれと同等のタンパク質分解
酵素を用いうるが、その分解は可能な限りのアミノ酸を
除去する徹底的な分解が必要である。
糖ペプチドの分画に用いるセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア社製）は、通常粒子サイズのもの、あるいは
「ファイン」と呼ばれるもののいずれをも用いることが
できる。勿論、これと同等の効果を有する、例えば米国
バイオラッド社製のハイオーゲルＰ−４またＰ−６の使
用も可能である。セファデックスＧ−５０についてはパ
イオーゲルＰ−６またはＰ−１０も同等に使用できる。
カラトのサイズは試料量に応じて適宜定め、例えば試料
量が１０ｍ１程度であれば１．３Ｘ６０ｃｍのカラムが
適当である。
オルシノール−硫酸反応は糖ペプチドの一般的な糖成分
である中性糖（ガラクトース、マンノースなど）の定量
に用いる簡便な方法であるが、比較的少量の細胞を出発
材料とする場合は、培養の際、放射標識をもつ単糖（通
常”Ｈ−または＋ＡＣ−グルコサミン）を加えた培地を
用いて糖ペプチドの糖鎖部分を代謝的に標識しておき、
カラムからの溶出画分をモニターする方法もある。
セファデックスＧ−５０による分画によって得られる２
つの画分は抗体力価の検定に用いるだけの抗ぶとしては
、それ以上の分画精製は必要ないが、抗原決定基の決定
に用いる場合にはさらにセファデックスＧ−２００また
は他の同等のゲル濾過効果を有する手段により精製する
ことが望ましい。ムチン型糖ペプチドに混入したムコ多
糖体は検出用プレートを製造するためには何らの支障も
無い。
固相化用プレートとしては１合成樹脂、セルロース類、
ガラス、木片、繊維９紙などを使用することができる。
合成樹脂とは２例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン
、ポリブタジェン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリビ
ニルアルコール、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレ
タン。
ポリエーテル、ナイロンなど、及びこれらにアミン基、
カルボキシル基等の官能基を付与せしめたものを例示す
ることができる。また、セルロース類とは、セルロース
、酢酸セルロース、エチルセルロース、硝酸セルロース
などを意味する。就中ポリ塩化ビニル製ミクロタイター
プレート［例えは、コースタ−２５９５（米国コースタ
−社製）コの使用が便利である。
ムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着は、アルキレン
ジアルデヒド及び塩基性ポリペプチドもしくは塩基性合
成ポリマーを介して行なう。アルキレンジアルデヒドと
しては、一般式 ０式％） （但し１式中ｎは１〜８の整数を表わす、）で表わされ
るアルデヒドが好ましい。とりわけ、ｎが２〜５のジア
ルデヒド、特に、グルタルアルデヒドが好ましく用いら
れる。塩基性ポリペプチドとしては、特にポリリジンが
好ましく用いられ、塩基性合成ポリマーとはビニルピリ
ジンポリマー。
ビニルアミンポリマーなど、ポリマー鎖上にアミノ基ま
たはイミノ基を有するポリマーを意味する上記固相化剤
の中、グルグルアルデヒドとポリリジンを用いる吸着法
は、従来は細胞をプレートに吸着させるために用いられ
ており（例えば、Ｒ１５、ｌ’ｌｅｔｚｇａｒら、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８１
　、５２４２−５２４６　（１９８４））、これを糖ペ
プチドに対して用いたのが本発明の特徴である。この吸
着反応においては糖ペプチドのアミノ基とポリリジンの
アミノ基の間にグルタルアルデヒドがシッフ塩基形成に
よる架橋を形成するものと推定され、この結合は、還元
剤１例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ，）等に
よる還元によって、より安定な結合に変更できるが、中
性付近の操作においては特に還元安定の必要は無い。
血清型糖ペプチドのプレートへの吸着には、糖ペプチド
に脂溶性を持たせることが必要である。
この脂溶性付与のために９本発明においては、高級脂肪
酸１例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸。
パルミチン酸、ステアリン酸、アラキシン酸、ベヘン酸
、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸、またはオレイン酸
、リノール酸、リルン酸、アラキドン酸などの不飽和脂
肪酸を結合せしめる。これらの脂肪酸を糖ペプチドに結
合せしめるには９通常のカルボン酸によるアシル化法１
例えば、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）などの縮合
剤を用いる方法、酸無水物による方法、酸ハロゲン化物
による方法、活性エステル法などを適用すればよい。こ
の様にして得られる脂溶性糖ペプチドをプレートに吸着
きせるには、糖ペプチドを適当な溶媒９例えばピリジン
、ジメチルホルムアミドなどに溶解し、要すれば水を加
えて得られる溶液で上記のプレートを処理すればよい。
糖ペプチドを吸着したプレートは、要すれば減圧下に、
五酸化リン、酸化カルシウムなどの乾燥剤の存在下に乾
燥すればよい。
［実施例］ 以下、本発明を参考例及び実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１ （がん細胞よりの糖ペプチドの調製） ヒト腸カン株化細胞（ＳＷ１１１６．　ＬＳ１８０．　
ＨＣＴ８など、いずれもＡＴＣＣより入手）を１０％子
牛脂児血清を含むダルベツコの培地で培養した。収穫し
た細胞は、リン酸緩衝食塩水（以下ＰＢＳと略記する；
食塩１３７　ｍＭ、塩化カリウム２−７　ｍ　Ｍ　％リ
ン酸−水素ナトリウム８．１ｍＭ、リン酸二水素カリウ
ム　１５ｍＭ、塩化カルシウム１．０ｍＭ１塩化マグネ
シウム０．５ｍＭ、ｐＨ７，４）で繰返し洗浄したのち
、１％トライトンＸ−１００（ロームアンドハース社製
）を含むＰＢＳを加えて、水冷下に攪拌し、遠心分離に
より上清を得、この上清を透析の後凍結乾燥した。これ
をクロロホルム／メタノール（２：１、容量比）で充分
に脱脂し、０．ＯＩＭの酢酸カルシウムを含む酢酸緩衝
液に懸濁して、プロナーゼＰ（科研製薬社製品）を１１
５０　（乾燥物に対する重量比）加え、３７°Ｃで３日
間放置してタンパク質分解を行なった。この間、防腐の
ために少量のトルエンを加えた。はぼ透明となった可溶
化消化液に等容の１０％トリクロロ酢酸を加えて生じた
不溶物を遠心分離して除いた。上清の糖ペプチド溶液か
らトリクし１０酢酸を除去するために、等容のエチルエ
ーテルを加えてよく混和し、遠心分離してエーテル層を
除いた。このエーテル抽出を約３回繰返し、水層のｐＨ
が約５になったことを確かめたのち、予め０．５Ｍピリ
ジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５を充填したカラム（１，５Ｘ６０ｃｍ）
に注入し、同じ緩衝液により展開して流出液をフラクシ
ョンコレクターにより採取し、オルソノール−硫酸に陽
性の両分を集めて凍結乾燥した。これを０．５Ｍピリジ
ン−酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解ののち、セファデ
ックスＧ−５０を用いて同様にゲル濾過し、フラクショ
ンコレクターで５ｍｌずつの画分に分けた（第１図）、
この分画によってＧ−５０を素通りした画分（Ｇ−５０
−Ｉ）と遅れて溶出される画分（Ｇ−５０−１ｆ）が得
られ、前者には通常ムチン型（０−グリコシド型）糖タ
クパク質由来の糖ペプチド、後者は血清型（Ｎ−グリコ
シド型）糖タンパク質由来の糖ペプチドが含まれる。す
なわち、第１図は、上記のことを、フラクション番号（
横軸）と［１“Ｃ］グルコサミン放射活性（ｄｐｍＸｌ
Ｏ−”／２０μｍ、縦軸）との関係で示したグラフであ
る。
フラクション番号２０〜２９までの両分を集め凍結乾燥
し、これをセファデックスＧ−２００を用いてゲル濾過
することによって血清型糖ペプチドを含まないムチン型
糖ペプチドを得た。
参考例２ （顎下腺よりのムチン型糖タンパク質の調製）ウシ、ブ
タ、ヒツジ等の顎下腺よりのムチン型糖タンパク質の調
製は文献記載の方法によって行なった。
ウシ、ヒツジの場合はＧ、　Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉら、
Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１２４．４１〜
５０．１９６Ｂ、　ブタの場合はＭ、Ｄｃ　Ｓａｌｅｇ
ｕｉら、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　１２９．４９〜５６．１９６９　、にそれぞれ依
拠した。
これらの糖タンパク質よりプロナーゼ消化によって糖ペ
プチドを調製することができるが、後述のプレートへの
吸着には糖ペプチドとする必要がなく、糖タンパク質そ
のままの方が好ましい。
実施例１ （ムチン型糖ペプチドまたは糖タンパク質のプレートへ
の吸着） 細胞由来のムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着は次
のようにして行なう。
ムチン型糖ペプチド１ｍｇを水１ｍｌに溶かす、吸汗の
ための試薬として以下の溶液を用意する。
０．９％食塩および０．０２％のアジ化ナトリウムを含
むＰＢＳ、０．２５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ
、１ｍ１ＰＢＳ当り　０．２５ｍｇのポリリジン（シグ
マ社製Ｐ１２７４、平均分子量９０．０００）を含む溶
液である。プレートへの吸着には、ムチン型糖ペプチド
溶液１００μｍ、ＰＢＳ１．９ｍｌ、グルグルアルデヒ
ド溶液３３μｍを混じ、ポリ塩化ビニル製ウェル数９６
のミクロタイタープレートの１ウェル当り、この混合液
を２０μｍ分注し、室温で約１時間放置する。次いで、
ポリリジン溶液を１ウェル当り１０μｍずつ注入し、プ
レートを適宜振盪してウェル内容液を素早く混合したの
ち、４℃で２日間放置する。この方法により糖ペプチド
の約５０％がプレートに吸着される。
ムチン型糖タンパク質のプレートへの吸着にはウシ、ブ
タ、ヒツジ等の顎下腺より調製したムチン型糖タンパク
質を水１ｍｌの濃度で溶かした溶液を用いる以外は、細
胞由来のムチン型糖ペプチドに対して用いたと同じ条件
を用いる。ムチン型糖タンパク質の場合には、グルタル
アルデヒドを用いずに、ポリリジンのみを吸着助剤とし
て用いても、また、きらに吸着助剤を全く用いない場合
でも９プレートへのかなりの吸着が見られるが、グルタ
ルアルデヒドとポリリジンを用いた場合に吸着の割合は
最高となる。
実施例２ （血清型糖ペプチドのプレートへの吸着）細胞由来、あ
るいは他の生物材料に由来する血清型糖タンパク質より
調製した糖ペプチドのプレートへの吸着は以下の様にし
て行なう。
血清型糖ペプチド２．５ｍｇを８０μｍの水に溶解し、
これに２００μｍのピリジンを加え、次いでパルミチン
酸無水物９．９１５ｍｇをピリジン１ｍｌに溶かした溶
液を加えて攪拌し、３７℃で６時間反応させる。反応液
をロータリーエバポレーターで乾固し、エーテルで洗浄
ののち再び乾固してバルミトイル化糖ペプチド（以下、
ｐａｌ−Ｇ　Ｐと略記する）の乾燥物を得る。糖ペプチ
ドとして２．５ｍｇ相当のｐａｌ　−Ｇ　Ｐを２．０４
ｍ１の９８％ピリレンに溶解し、水１．８３７ｍ１を加
えたのちミクロタータブレートに１ウェル当り２０μｍ
を分注する。プレートはデシケータ−中五酸化リンの存
在下で乾固したのち、１％牛血清アルブミン（１％ＢＳ
Ａ）を含むＰＢＳ１５０μｍで３回洗浄して、付着しな
かった糖ペプチドを除去し、再び乾固する。この方法に
より糖ペプチドの約１０％がプレートに吸着される。
参考例３ （′Ｗ１鎖特異的抗体の検出及び力価検定）細胞、ある
いは糖タンパク質標品をマウス等に投与することによっ
て作製された免疫血清を０．１ｘＢＳＡ、０．０２Ｘア
ジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液で希釈し、その２０μ
ｍを、糖ペプチドを吸着きせたプレートに加えて４℃で
一夜放置した。次いで１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し
たのち、１１８１で！識したｌｔ″Ｉ−プロティンＡ（
１０万ｃｐｍ　）のＰＢＳ溶液５０μｍを加えて２時間
室温に放置した。次いで、ＰＢＳ１５０μｍを用いた洗
浄を繰返し、洗浄後の放射性が消失したのち、プレート
のカウントを測定した。
［発明の効果］ 以上詳細に説明したように、本発明により作製した固相
化糖ペプチド（または糖タンパク賃）を使用することに
よって、糖鎖特異的抗体の検定が可能となり、このこと
によって糖鎖特異的抗体を産生ずるハイプリドーマの作
製も可能になった。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で使用する糖ペプチドの分離結果をフラ
クション番号と［”Ｃ］グルコサミン放放射性との関係
で示したグラフである。 特許出願人　　山　科　　郁　男 代　理　人　　弁理士　潮田雄− ！ し、−一−１ 第　　　１　　　図 で も フラクション番号

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ムチン型糖ペプチドをアルキレンジアルデヒド及
    び塩基性ポリペプチドもしくは塩基性合成ポリマーの存
    在下に固相化せしめたことを特徴とする糖鎖特異抗体ア
    ッセイプレート。
  2. （２）アルキレンジアルデヒドが ＯＨＣ（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨＯ ［但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。］で表わされ
    ることを特徴とする特許請求の範囲（１）記載の糖鎖特
    異抗体アッセイプレート。
  3. （３）アルキレンジアルデヒドがグルタルアルデヒドで
    あることを特徴とする特許請求の範囲（１）記載の糖鎖
    特異抗体アッセイプレート。
  4. （４）塩基性ポリペプチドがポリリジンであることを特
    徴とする特許請求の範囲（１）記載の糖鎖特異抗体アッ
    セイプレート。
  5. （５）ムチン型糖ペプチドをアルキレンジアルデヒド及
    び塩基性ポリペプチドもしくは塩基性合成ポリマーの存
    在下、固相化用プレートに固相化せしめることを特徴と
    する糖鎖特異抗体アッセイプレートの製造法。
  6. （６）アルキレンジアルデヒドが ＯＨＣ（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨＯ ［但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。］で表わされ
    ることを特徴とする特許請求の範囲（５）記載の糖鎖特
    異抗体アッセイプレートの製造法。
  7. （７）アルキレンジアルデヒドがグルタルアルデヒドで
    あることを特徴とする特許請求の範囲（５）記載の糖鎖
    特異抗体アッセイプレートの製造法。
  8. （８）塩基性ポリペプチドがポリリジンであることを特
    徴とする特許請求の範囲（５）記載の糖鎖特異抗体アッ
    セイプレートの製造法。
  9. （９）固相化用プレートが合成樹脂、セルロース類、ガ
    ラス、木片、繊維または紙であることを特徴とする特許
    請求の範囲（５）記載の糖鎖特異抗体アッセイプレート
    の製造法。
  10. （１０）血清型糖ペプチドを高級脂肪酸でアシル化して
    固相化せしめたことを特徴とする糖鎖特異抗体アッセイ
    プレート。
  11. （１１）高級脂肪酸がパルミチン酸、ステアリン酸また
    はオレイン酸であることを特徴とする特許請求の範囲（
    １０）記載の糖鎖特異抗体アッセイプレート。
  12. （１２）血清型糖ペプチドを高級脂肪酸でアシル化して
    固相化用プレートに固相化せしめることを特徴とする糖
    鎖特異抗体アッセイプレイトの製造法
  13. （１３）高級脂肪酸がパルミチン酸、ステアリン酸また
    はオレイン酸であることを特徴とする特許請求の範囲（
    １２）記載の糖鎖特異抗体アッセイプレートの製造法。
  14. （１４）固相化用プレートが合成樹脂、セルロース類、
    ガラス、木片、繊維または紙であることを特徴とする特
    許請求の範囲（１２）記載の糖鎖特異抗体アッセイプレ
    ートの製造法。
JP61057772A 1986-03-14 1986-03-14 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 Expired - Lifetime JPH0792458B2 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61057772A JPH0792458B2 (ja) 1986-03-14 1986-03-14 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法
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