JPS6157857A - Tshの測定方法 - Google Patents
Tshの測定方法Info
- Publication number
- JPS6157857A JPS6157857A JP18126384A JP18126384A JPS6157857A JP S6157857 A JPS6157857 A JP S6157857A JP 18126384 A JP18126384 A JP 18126384A JP 18126384 A JP18126384 A JP 18126384A JP S6157857 A JPS6157857 A JP S6157857A
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- JP
- Japan
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- tsh
- subunit
- monoclonal antibody
- specific monoclonal
- antibody
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はホルモン類の測定方法、さらに詳しくは、TB
H(甲状腺刺激ホルモン)のモノクローナル抗体を用い
たイムノアッセイによる測定方法に関する。
H(甲状腺刺激ホルモン)のモノクローナル抗体を用い
たイムノアッセイによる測定方法に関する。
TSHO血中または体液中の濃度の測定は、原発性甲状
腺機能低下症、パセドウ病、フレチン症等の診断に広く
利用され、測定法としてEI人、R工A等のイムノアッ
セイ’tff1いることは周知である。
腺機能低下症、パセドウ病、フレチン症等の診断に広く
利用され、測定法としてEI人、R工A等のイムノアッ
セイ’tff1いることは周知である。
一般にTSHけαサブユニットおよびβサブユニットか
ら構成されており、αサブユニットの抗原性けTJ H
(黄体形成ホルモン)、a o G(絨毛性性腺刺激ホ
ルモン)、および78H(卵胞刺激ホルモン)のそれと
よく類似しているといわれて\いる。このため、従来の
ポリクローナル抗体を用いたEIA法ある”
l/’1JRIAよ=4ゆ、。わ、カヤエア□アヤ。
ら構成されており、αサブユニットの抗原性けTJ H
(黄体形成ホルモン)、a o G(絨毛性性腺刺激ホ
ルモン)、および78H(卵胞刺激ホルモン)のそれと
よく類似しているといわれて\いる。このため、従来の
ポリクローナル抗体を用いたEIA法ある”
l/’1JRIAよ=4ゆ、。わ、カヤエア□アヤ。
反応全示すことがあり特異性、再現性に問題がある。そ
こでTSH特異性モノクローナル抗体音用いたイムノア
ッセイが試みられている。例えば、 ’ 0LINIO
AL OHlltMI8TRY、 Vol、 28゜A
9. pp、 1862−1866、1982”K J
I′i、H,GarrettWada等によりこれらホ
ルモンのα−サブユニットllJ性モノクローナル抗体
およびβ−サプユニット特異性モノクローナル抗体を用
いたIIA法が報告されている。こO報告によれば、固
相としてαサブユニット特異性モノクローナル抗体全使
用し、標識コンジュゲートとしてβサブユニット特異性
モノク0−ナル抗体を用いる方法全開示している。
こでTSH特異性モノクローナル抗体音用いたイムノア
ッセイが試みられている。例えば、 ’ 0LINIO
AL OHlltMI8TRY、 Vol、 28゜A
9. pp、 1862−1866、1982”K J
I′i、H,GarrettWada等によりこれらホ
ルモンのα−サブユニットllJ性モノクローナル抗体
およびβ−サプユニット特異性モノクローナル抗体を用
いたIIA法が報告されている。こO報告によれば、固
相としてαサブユニット特異性モノクローナル抗体全使
用し、標識コンジュゲートとしてβサブユニット特異性
モノク0−ナル抗体を用いる方法全開示している。
しかしながら、本発明者等の実験によれば、これらホル
モンのαまたはβ−サプユエツシモノクレーナナル体は
その確立するクローンによっては必ずしも反応性が一様
でなく、かなりのバラツキがあることが判明した0−m
に、イムノアッセイ例えば1工A法においては、測定す
べき検体を試験管に入れ。
モンのαまたはβ−サプユエツシモノクレーナナル体は
その確立するクローンによっては必ずしも反応性が一様
でなく、かなりのバラツキがあることが判明した0−m
に、イムノアッセイ例えば1工A法においては、測定す
べき検体を試験管に入れ。
るφは、その反応順序を逆にする)後、固相吸着剤に結
合した標識化抗体全測定するいわゆるツーステップ法、
および検体、固相吸着剤、標識化抗体全同時に加え、反
応させるいわゆるワンステップ法(tたはツーサイトイ
ムノアラ七イ法)とがある。前者の方法は、反応、洗浄
全それぞれ別個に2回行う点等ではん雑で熟練全姿する
方法であるのに対し、後者の方法は、反応、洗浄ともそ
れぞれ1回で済む点で簡単であるが、それだけに感度が
悪く信頼性のないものとされている。従って。
合した標識化抗体全測定するいわゆるツーステップ法、
および検体、固相吸着剤、標識化抗体全同時に加え、反
応させるいわゆるワンステップ法(tたはツーサイトイ
ムノアラ七イ法)とがある。前者の方法は、反応、洗浄
全それぞれ別個に2回行う点等ではん雑で熟練全姿する
方法であるのに対し、後者の方法は、反応、洗浄ともそ
れぞれ1回で済む点で簡単であるが、それだけに感度が
悪く信頼性のないものとされている。従って。
高感度のワンステップ法を開発するためKは固相吸着剤
、標識化抗体ともに反応特異性が高いものを使用するこ
とが重要である。
、標識化抗体ともに反応特異性が高いものを使用するこ
とが重要である。
本発明者等は、TSHのイムノアッセイ測定において、
ワンステップ法でも高感度の測定を行い得るモノクロー
ナル抗体を開発すぺ(研究した結果、TSH″!!!た
け’1’8Hβで免疫したマウス牌臓細胞とマウスミニ
n−マ細胞とt融合することにより得られた高反応性の
TSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体、特
にt、oxi♂11□″”’/no1e 以との結合定
数(後で詳述する)全盲するTSHβ−サブユニット特
異性モノクローナルを固相または標識化抗体として使用
したとき良好なイムノアッセイ全確立することができた
。
ワンステップ法でも高感度の測定を行い得るモノクロー
ナル抗体を開発すぺ(研究した結果、TSH″!!!た
け’1’8Hβで免疫したマウス牌臓細胞とマウスミニ
n−マ細胞とt融合することにより得られた高反応性の
TSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体、特
にt、oxi♂11□″”’/no1e 以との結合定
数(後で詳述する)全盲するTSHβ−サブユニット特
異性モノクローナルを固相または標識化抗体として使用
したとき良好なイムノアッセイ全確立することができた
。
即ち、本発明は、固相としてTSHα−サブユニット特
異性モノクローナル抗体を用い、標識コンジュゲートと
してTSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体
を用いるTBHのイムノアッセイによる測定において、
標識コンジュゲートとして結合定数LOX1’0811
″”/mole 以hr有する’J’8Hβ−サプユ
ニットモノク四−ナル抗体を使用することか。
異性モノクローナル抗体を用い、標識コンジュゲートと
してTSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体
を用いるTBHのイムノアッセイによる測定において、
標識コンジュゲートとして結合定数LOX1’0811
″”/mole 以hr有する’J’8Hβ−サプユ
ニットモノク四−ナル抗体を使用することか。
らなる。
本発明で使用する高反応性のTSHβ−サブユニット特
異性七ツクU−ナル抗体は次ノ如くして確立したものか
ら選択して使用で自る・ 先ず、TEIHまたki’rs■β050μt′k1.
smlの0.9%生理食塩水に溶解し、アジュバン゛′
トとしてDIFOO社tvyaムL3−1加えて油中水
滴型としたものを基礎免疫用抗原とした。
異性七ツクU−ナル抗体は次ノ如くして確立したものか
ら選択して使用で自る・ 先ず、TEIHまたki’rs■β050μt′k1.
smlの0.9%生理食塩水に溶解し、アジュバン゛′
トとしてDIFOO社tvyaムL3−1加えて油中水
滴型としたものを基礎免疫用抗原とした。
また、ブースター用抗原としてTSIl[ま72:はT
SHβの50μyTjr1,3WLJ−の0.9生理食
塩水に以下、通常の方法、例えば′渡辺武監修「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体J 、E20〜F、2
9(株IR&Dプランニング社%19B2 の記載の
方法によりマウスミエローマ細fl (P3−工63−
Af8−Ul)と融合させ、クローニングして7種のT
SHβ特異性モノクローナル抗体全得た。
SHβの50μyTjr1,3WLJ−の0.9生理食
塩水に以下、通常の方法、例えば′渡辺武監修「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体J 、E20〜F、2
9(株IR&Dプランニング社%19B2 の記載の
方法によりマウスミエローマ細fl (P3−工63−
Af8−Ul)と融合させ、クローニングして7種のT
SHβ特異性モノクローナル抗体全得た。
L記で得72ニア種のモノクローナル抗体のり四−ン特
異性を11工標識T 8 H% ””I標識?B11−
(Is”l′!標識’fsH−βをトレーサーとして用
い、RIA法により常法で測定したO また、イムノグロブリン・サブクラスの同tた。T0n
に対する結合定数(に)は、各クローンの腹水から1免
疫実験操作法工X 、1’180年増補版、昭和55年
12月4日日本免疫学会発行の第2691〜2705頁
の抗体の結合定数測定法′記載に基づψて次のようにし
て求めた。
異性を11工標識T 8 H% ””I標識?B11−
(Is”l′!標識’fsH−βをトレーサーとして用
い、RIA法により常法で測定したO また、イムノグロブリン・サブクラスの同tた。T0n
に対する結合定数(に)は、各クローンの腹水から1免
疫実験操作法工X 、1’180年増補版、昭和55年
12月4日日本免疫学会発行の第2691〜2705頁
の抗体の結合定数測定法′記載に基づψて次のようにし
て求めた。
即ち、被検抗血清希釈液100μIK対し%種ha濃度
(0〜20OOnt/mJ ) 0標準抗原(111B
H−Whole lと、111I工標識抗原(T0n
−Whol・) li 10GμJずつ加えて、競合反
応を行わせ(37°O%2.5時間また後、生成した抗
原・抗体結合物を抗マウスイムノグロブリン抗体と反応
させる(37°OsZ時間)、さらに、この複合体i不
活化8tlLpH7LO600QullaurelLs
Oowang 工(10%、200μm1でトラップ
した後(37°0.30分1、遠心して沈渣を集め、そ
のベレットのapm’ft測定した0そのopmfi&
と、標準抗原濃度f 8cataharaブリツトし、
その切片より01出した口 結果は第2表に示したとおりで、各種ので111Hβ−
サブユニットモノクローナル抗体が得られ72:が、少
なくとも1.OX to811ta;註。
(0〜20OOnt/mJ ) 0標準抗原(111B
H−Whole lと、111I工標識抗原(T0n
−Whol・) li 10GμJずつ加えて、競合反
応を行わせ(37°O%2.5時間また後、生成した抗
原・抗体結合物を抗マウスイムノグロブリン抗体と反応
させる(37°OsZ時間)、さらに、この複合体i不
活化8tlLpH7LO600QullaurelLs
Oowang 工(10%、200μm1でトラップ
した後(37°0.30分1、遠心して沈渣を集め、そ
のベレットのapm’ft測定した0そのopmfi&
と、標準抗原濃度f 8cataharaブリツトし、
その切片より01出した口 結果は第2表に示したとおりで、各種ので111Hβ−
サブユニットモノクローナル抗体が得られ72:が、少
なくとも1.OX to811ta;註。
以すの結合定i’i有するものが良好な?8Hβ−サブ
ユニット特異性を示していることが判る。
ユニット特異性を示していることが判る。
実施例
り記で調製したクローンのうち44%5゜6′に用い、
これ全標識体とし、固相にT 811α−サブユニット
特異性モノクローナル抗体音用いてEI人測測定全行ツ
ーステップ法およびワンステップ法の画法において感度
比較を行った0 使用したTSHα−サブユニット特異性モノクローナル
抗体(以下α−クローンと略す)は、常法によりT0n
またはTSHαサブユニットで免疫しIp BALB1
0マウスとマウスミエローマ細胞(P3−I63−人t
8−Ul)との融合により得られた次の3種のものを使
用した。
これ全標識体とし、固相にT 811α−サブユニット
特異性モノクローナル抗体音用いてEI人測測定全行ツ
ーステップ法およびワンステップ法の画法において感度
比較を行った0 使用したTSHα−サブユニット特異性モノクローナル
抗体(以下α−クローンと略す)は、常法によりT0n
またはTSHαサブユニットで免疫しIp BALB1
0マウスとマウスミエローマ細胞(P3−I63−人t
8−Ul)との融合により得られた次の3種のものを使
用した。
α−り四−ン 結合定数 イムノグロカン
サブクラス(a)asxto’ 工gG。
サブクラス(a)asxto’ 工gG。
(b) 4.5 X to8
(a) a+OX lo’
これらα−クローン(a) −(0)は本出願人の本願
と同時に出願した′ホルモンの測定方法′なる名称の特
許出願明細11(特に第3表)に12一 記載され゛たもOで、それぞれ、その第3表の墓4、ム
1./ft3に相当する。このよりなα−クローンとし
てはこの出願明細書記載のものの他、前記H,Garr
ett、 WILdIL等の論文記載のものとf分使+
fTできる。
と同時に出願した′ホルモンの測定方法′なる名称の特
許出願明細11(特に第3表)に12一 記載され゛たもOで、それぞれ、その第3表の墓4、ム
1./ft3に相当する。このよりなα−クローンとし
てはこの出願明細書記載のものの他、前記H,Garr
ett、 WILdIL等の論文記載のものとf分使+
fTできる。
3種のaクローンを固定したポリスチレンピース5とを
試験管に入れ、37°0.2時間反応させ’l’to次
いで5%TWeen 20− FB&でビーズ全3回洗
浄後、ホースラデイシュパーオキシダーゼで標識した上
記A4.5および6のりシーン200Jji入れて、3
7°0.2時間反応させ、5%Tw@en 2G−PB
8でビーズを3回洗浄後、別の試験管に移し換えた〇 さらに40.1Mクエン酸と0.2Mリン酸ナトmfと
からなる液500μmを添加し、暗所で3700.1時
間反応させ、6M H,804125Jj′に−加え反
応全停止し、O,D、 492nmで測定した吸光度と
各ホルモン濃度との関係全プロットし、得られた標準曲
線より感度管求めた。
試験管に入れ、37°0.2時間反応させ’l’to次
いで5%TWeen 20− FB&でビーズ全3回洗
浄後、ホースラデイシュパーオキシダーゼで標識した上
記A4.5および6のりシーン200Jji入れて、3
7°0.2時間反応させ、5%Tw@en 2G−PB
8でビーズを3回洗浄後、別の試験管に移し換えた〇 さらに40.1Mクエン酸と0.2Mリン酸ナトmfと
からなる液500μmを添加し、暗所で3700.1時
間反応させ、6M H,804125Jj′に−加え反
応全停止し、O,D、 492nmで測定した吸光度と
各ホルモン濃度との関係全プロットし、得られた標準曲
線より感度管求めた。
結果は次のとおりであり・結合定数1.2X108次に
最良の結果が得られているA6クローンと(&)α−ク
ローンと全それぞれ標識体、固相として用いて、α−サ
ブユニットの特異性が類似する池のホルモン(L Hs
HOG s F8H1との特14性vi−前記と同様
にしてツーステップ法、ワンステップ法の両方で比較し
た。
最良の結果が得られているA6クローンと(&)α−ク
ローンと全それぞれ標識体、固相として用いて、α−サ
ブユニットの特異性が類似する池のホルモン(L Hs
HOG s F8H1との特14性vi−前記と同様
にしてツーステップ法、ワンステップ法の両方で比較し
た。
結果は第1図に示すとおりで、TSllのみに極めて高
い感度【示しており1池のホルモンとは殆んど反応して
いない。
い感度【示しており1池のホルモンとは殆んど反応して
いない。
以し%lエム法において本発明方法を説明して色たが、
Rエム法、その他のイムノアッセイにおいても十分通用
できるもので、高感度のTSHO測定方法を提供するも
のである。
Rエム法、その他のイムノアッセイにおいても十分通用
できるもので、高感度のTSHO測定方法を提供するも
のである。
第1図は、本発明の測定方法の各ホルモンに対する感度
を示すグラフである。
を示すグラフである。
Claims (3)
- (1)固相吸着剤としてTSHα−サブユニット特異性
モノクローナル抗体を用い、標識体としてTSHβ−サ
ブユニット特異性モノクローナル抗体を用いるが、ある
いは固相吸着剤としてTSHβ−サブユニット特異性モ
ノクローナル抗体を用い標識体としてTSHα−サブユ
ニット特異性モノクローナル抗体を用いることからなる
イムノアッセイによるTSHの測定方法において、 上記TSHβ−サブユニット特異性モノク ローナル抗体として結合定数が1.0×10^8lit
ers/moles以上のものを使用することを特徴と
するTSHの測定方法。 - (2)上記TSHβ−サブユニット特異性モノクローナ
ル抗体がTSHまたはTSHβ−サブユニットで免疫さ
れたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合に
由来する特許請求の範囲第(1)項記載の測定方法。 - (3)上記TSHα−サブユニット特異性モノクローナ
ル抗体がTSHまたはTSHα−サブユニットで免疫さ
れたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合に
由来する特許請求の範囲第(1)項記載の測定方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18126384A JPS6157857A (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | Tshの測定方法 |
EP85110915A EP0173973A3 (en) | 1984-08-29 | 1985-08-29 | Method for the determination of thyroid-stimulating hormone |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18126384A JPS6157857A (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | Tshの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6157857A true JPS6157857A (ja) | 1986-03-24 |
Family
ID=16097640
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18126384A Pending JPS6157857A (ja) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | Tshの測定方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0173973A3 (ja) |
JP (1) | JPS6157857A (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6157856A (ja) * | 1984-08-29 | 1986-03-24 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ホルモンの測定方法 |
DE69228817T2 (de) * | 1991-07-26 | 1999-09-23 | Dade Chemistry Systems Inc., Deerfield | Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger |
WO2012166200A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Abbott Point Of Care Inc. | Tsh immunoassays employing scavenging reagents for cross-reacting endocrine glycoprotein hormone analogues |
WO2012166198A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Abbott Point Of Care Inc. | Tsh antibodies for point-of-care immunoassay formats |
EP2715368B2 (en) | 2011-05-27 | 2021-01-20 | Abbott Point Of Care, Inc. | Tsh immunoassays and processes for performing tsh immunoassays in the presence of endogenous contaminants in restricted wash formats |
-
1984
- 1984-08-29 JP JP18126384A patent/JPS6157857A/ja active Pending
-
1985
- 1985-08-29 EP EP85110915A patent/EP0173973A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0173973A3 (en) | 1988-08-10 |
EP0173973A2 (en) | 1986-03-12 |
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