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JPS6157857A - Tshの測定方法 - Google Patents

Tshの測定方法

Info

Publication number
JPS6157857A
JPS6157857A JP18126384A JP18126384A JPS6157857A JP S6157857 A JPS6157857 A JP S6157857A JP 18126384 A JP18126384 A JP 18126384A JP 18126384 A JP18126384 A JP 18126384A JP S6157857 A JPS6157857 A JP S6157857A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tsh
subunit
monoclonal antibody
specific monoclonal
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP18126384A
Other languages
English (en)
Inventor
Toshihiro Nakajima
敏博 中島
Haruo Fujita
藤田 春雄
Ichiro Tsuji
一郎 辻
Masanori Unoki
宇野木 正憲
Yasuyuki Eda
江田 康幸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Original Assignee
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken filed Critical Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority to JP18126384A priority Critical patent/JPS6157857A/ja
Priority to EP85110915A priority patent/EP0173973A3/en
Publication of JPS6157857A publication Critical patent/JPS6157857A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
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  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はホルモン類の測定方法、さらに詳しくは、TB
H(甲状腺刺激ホルモン)のモノクローナル抗体を用い
たイムノアッセイによる測定方法に関する。
TSHO血中または体液中の濃度の測定は、原発性甲状
腺機能低下症、パセドウ病、フレチン症等の診断に広く
利用され、測定法としてEI人、R工A等のイムノアッ
セイ’tff1いることは周知である。
一般にTSHけαサブユニットおよびβサブユニットか
ら構成されており、αサブユニットの抗原性けTJ H
(黄体形成ホルモン)、a o G(絨毛性性腺刺激ホ
ルモン)、および78H(卵胞刺激ホルモン)のそれと
よく類似しているといわれて\いる。このため、従来の
ポリクローナル抗体を用いたEIA法ある”     
 l/’1JRIAよ=4ゆ、。わ、カヤエア□アヤ。
反応全示すことがあり特異性、再現性に問題がある。そ
こでTSH特異性モノクローナル抗体音用いたイムノア
ッセイが試みられている。例えば、 ’ 0LINIO
AL OHlltMI8TRY、 Vol、 28゜A
9. pp、 1862−1866、1982”K J
I′i、H,GarrettWada等によりこれらホ
ルモンのα−サブユニットllJ性モノクローナル抗体
およびβ−サプユニット特異性モノクローナル抗体を用
いたIIA法が報告されている。こO報告によれば、固
相としてαサブユニット特異性モノクローナル抗体全使
用し、標識コンジュゲートとしてβサブユニット特異性
モノク0−ナル抗体を用いる方法全開示している。
しかしながら、本発明者等の実験によれば、これらホル
モンのαまたはβ−サプユエツシモノクレーナナル体は
その確立するクローンによっては必ずしも反応性が一様
でなく、かなりのバラツキがあることが判明した0−m
に、イムノアッセイ例えば1工A法においては、測定す
べき検体を試験管に入れ。
るφは、その反応順序を逆にする)後、固相吸着剤に結
合した標識化抗体全測定するいわゆるツーステップ法、
および検体、固相吸着剤、標識化抗体全同時に加え、反
応させるいわゆるワンステップ法(tたはツーサイトイ
ムノアラ七イ法)とがある。前者の方法は、反応、洗浄
全それぞれ別個に2回行う点等ではん雑で熟練全姿する
方法であるのに対し、後者の方法は、反応、洗浄ともそ
れぞれ1回で済む点で簡単であるが、それだけに感度が
悪く信頼性のないものとされている。従って。
高感度のワンステップ法を開発するためKは固相吸着剤
、標識化抗体ともに反応特異性が高いものを使用するこ
とが重要である。
本発明者等は、TSHのイムノアッセイ測定において、
ワンステップ法でも高感度の測定を行い得るモノクロー
ナル抗体を開発すぺ(研究した結果、TSH″!!!た
け’1’8Hβで免疫したマウス牌臓細胞とマウスミニ
n−マ細胞とt融合することにより得られた高反応性の
TSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体、特
にt、oxi♂11□″”’/no1e 以との結合定
数(後で詳述する)全盲するTSHβ−サブユニット特
異性モノクローナルを固相または標識化抗体として使用
したとき良好なイムノアッセイ全確立することができた
即ち、本発明は、固相としてTSHα−サブユニット特
異性モノクローナル抗体を用い、標識コンジュゲートと
してTSHβ−サブユニット特異性モノクローナル抗体
を用いるTBHのイムノアッセイによる測定において、
標識コンジュゲートとして結合定数LOX1’0811
″”/mole  以hr有する’J’8Hβ−サプユ
ニットモノク四−ナル抗体を使用することか。
らなる。
本発明で使用する高反応性のTSHβ−サブユニット特
異性七ツクU−ナル抗体は次ノ如くして確立したものか
ら選択して使用で自る・ 先ず、TEIHまたki’rs■β050μt′k1.
smlの0.9%生理食塩水に溶解し、アジュバン゛′
トとしてDIFOO社tvyaムL3−1加えて油中水
滴型としたものを基礎免疫用抗原とした。
また、ブースター用抗原としてTSIl[ま72:はT
SHβの50μyTjr1,3WLJ−の0.9生理食
塩水に以下、通常の方法、例えば′渡辺武監修「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体J 、E20〜F、2
9(株IR&Dプランニング社%19B2  の記載の
方法によりマウスミエローマ細fl (P3−工63−
Af8−Ul)と融合させ、クローニングして7種のT
SHβ特異性モノクローナル抗体全得た。
L記で得72ニア種のモノクローナル抗体のり四−ン特
異性を11工標識T 8 H% ””I標識?B11−
(Is”l′!標識’fsH−βをトレーサーとして用
い、RIA法により常法で測定したO また、イムノグロブリン・サブクラスの同tた。T0n
に対する結合定数(に)は、各クローンの腹水から1免
疫実験操作法工X 、1’180年増補版、昭和55年
12月4日日本免疫学会発行の第2691〜2705頁
の抗体の結合定数測定法′記載に基づψて次のようにし
て求めた。
即ち、被検抗血清希釈液100μIK対し%種ha濃度
(0〜20OOnt/mJ ) 0標準抗原(111B
 H−Whole lと、111I工標識抗原(T0n
−Whol・) li 10GμJずつ加えて、競合反
応を行わせ(37°O%2.5時間また後、生成した抗
原・抗体結合物を抗マウスイムノグロブリン抗体と反応
させる(37°OsZ時間)、さらに、この複合体i不
活化8tlLpH7LO600QullaurelLs
 Oowang 工(10%、200μm1でトラップ
した後(37°0.30分1、遠心して沈渣を集め、そ
のベレットのapm’ft測定した0そのopmfi&
と、標準抗原濃度f 8cataharaブリツトし、
その切片より01出した口 結果は第2表に示したとおりで、各種ので111Hβ−
サブユニットモノクローナル抗体が得られ72:が、少
なくとも1.OX to811ta;註。
以すの結合定i’i有するものが良好な?8Hβ−サブ
ユニット特異性を示していることが判る。
実施例 り記で調製したクローンのうち44%5゜6′に用い、
これ全標識体とし、固相にT 811α−サブユニット
特異性モノクローナル抗体音用いてEI人測測定全行ツ
ーステップ法およびワンステップ法の画法において感度
比較を行った0 使用したTSHα−サブユニット特異性モノクローナル
抗体(以下α−クローンと略す)は、常法によりT0n
またはTSHαサブユニットで免疫しIp BALB1
0マウスとマウスミエローマ細胞(P3−I63−人t
8−Ul)との融合により得られた次の3種のものを使
用した。
α−り四−ン    結合定数    イムノグロカン
サブクラス(a)asxto’      工gG。
(b)     4.5 X to8 (a)    a+OX lo’ これらα−クローン(a) −(0)は本出願人の本願
と同時に出願した′ホルモンの測定方法′なる名称の特
許出願明細11(特に第3表)に12一 記載され゛たもOで、それぞれ、その第3表の墓4、ム
1./ft3に相当する。このよりなα−クローンとし
てはこの出願明細書記載のものの他、前記H,Garr
ett、 WILdIL等の論文記載のものとf分使+
fTできる。
3種のaクローンを固定したポリスチレンピース5とを
試験管に入れ、37°0.2時間反応させ’l’to次
いで5%TWeen 20− FB&でビーズ全3回洗
浄後、ホースラデイシュパーオキシダーゼで標識した上
記A4.5および6のりシーン200Jji入れて、3
7°0.2時間反応させ、5%Tw@en 2G−PB
8でビーズを3回洗浄後、別の試験管に移し換えた〇 さらに40.1Mクエン酸と0.2Mリン酸ナトmfと
からなる液500μmを添加し、暗所で3700.1時
間反応させ、6M H,804125Jj′に−加え反
応全停止し、O,D、 492nmで測定した吸光度と
各ホルモン濃度との関係全プロットし、得られた標準曲
線より感度管求めた。
結果は次のとおりであり・結合定数1.2X108次に
最良の結果が得られているA6クローンと(&)α−ク
ローンと全それぞれ標識体、固相として用いて、α−サ
ブユニットの特異性が類似する池のホルモン(L Hs
 HOG s F8H1との特14性vi−前記と同様
にしてツーステップ法、ワンステップ法の両方で比較し
た。
結果は第1図に示すとおりで、TSllのみに極めて高
い感度【示しており1池のホルモンとは殆んど反応して
いない。
以し%lエム法において本発明方法を説明して色たが、
Rエム法、その他のイムノアッセイにおいても十分通用
できるもので、高感度のTSHO測定方法を提供するも
のである。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の測定方法の各ホルモンに対する感度
を示すグラフである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)固相吸着剤としてTSHα−サブユニット特異性
    モノクローナル抗体を用い、標識体としてTSHβ−サ
    ブユニット特異性モノクローナル抗体を用いるが、ある
    いは固相吸着剤としてTSHβ−サブユニット特異性モ
    ノクローナル抗体を用い標識体としてTSHα−サブユ
    ニット特異性モノクローナル抗体を用いることからなる
    イムノアッセイによるTSHの測定方法において、 上記TSHβ−サブユニット特異性モノク ローナル抗体として結合定数が1.0×10^8lit
    ers/moles以上のものを使用することを特徴と
    するTSHの測定方法。
  2. (2)上記TSHβ−サブユニット特異性モノクローナ
    ル抗体がTSHまたはTSHβ−サブユニットで免疫さ
    れたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合に
    由来する特許請求の範囲第(1)項記載の測定方法。
  3. (3)上記TSHα−サブユニット特異性モノクローナ
    ル抗体がTSHまたはTSHα−サブユニットで免疫さ
    れたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合に
    由来する特許請求の範囲第(1)項記載の測定方法。
JP18126384A 1984-08-29 1984-08-29 Tshの測定方法 Pending JPS6157857A (ja)

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EP85110915A EP0173973A3 (en) 1984-08-29 1985-08-29 Method for the determination of thyroid-stimulating hormone

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JPS6157856A (ja) * 1984-08-29 1986-03-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst ホルモンの測定方法
DE69228817T2 (de) * 1991-07-26 1999-09-23 Dade Chemistry Systems Inc., Deerfield Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger
WO2012166200A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Abbott Point Of Care Inc. Tsh immunoassays employing scavenging reagents for cross-reacting endocrine glycoprotein hormone analogues
WO2012166198A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Abbott Point Of Care Inc. Tsh antibodies for point-of-care immunoassay formats
EP2715368B2 (en) 2011-05-27 2021-01-20 Abbott Point Of Care, Inc. Tsh immunoassays and processes for performing tsh immunoassays in the presence of endogenous contaminants in restricted wash formats

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Publication number Publication date
EP0173973A3 (en) 1988-08-10
EP0173973A2 (en) 1986-03-12

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