JPS61260897A - 胆汁酸の分析方法 - Google Patents
胆汁酸の分析方法Info
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- JPS61260897A JPS61260897A JP60102866A JP10286685A JPS61260897A JP S61260897 A JPS61260897 A JP S61260897A JP 60102866 A JP60102866 A JP 60102866A JP 10286685 A JP10286685 A JP 10286685A JP S61260897 A JPS61260897 A JP S61260897A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は遊離型、アミノ酸抱合型など各種の胆汁酸を含
有する試料溶液中の各胆汁酸を分析する方法に関する。
有する試料溶液中の各胆汁酸を分析する方法に関する。
（従来の技術）
胆汁に含有される胆汁酸は遊離型、グリシン抱合型など
種々の胆汁酸の混合物である。肝胆道系疾患においては
胆汁酸の分画パターンが変化したり、血清中の胆汁酸量
が変化することが多い。そのため、各胆汁酸を検出もし
くは定量することにキー疾病の検出もしくはその病態を
知ることが行われている。試料溶液に含有される胆汁酸
混合物を各胆汁酸成分に分離して、その各々の成分につ
いて分析する方法は１例えば特公昭５６−３８２００号
公報に開示されている。それによれば、まず、胆汁酸混
合物を含む試料溶液を逆相系のポリマーゲルやシリカゲ
ルを充填した分離カラムを用いて液体クロマトグラフィ
ー法にキー各胆汁酸成分に分離する。次に２分離された
胆汁酸を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ” ）を加えて、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｉｓ口）を固定化
したカラムに通じる。３α−Ｈ３Ｄの触媒作用で胆汁酸
はケト型に酸化され、 ＮＡＤ”は還元されて還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に
変化する。
種々の胆汁酸の混合物である。肝胆道系疾患においては
胆汁酸の分画パターンが変化したり、血清中の胆汁酸量
が変化することが多い。そのため、各胆汁酸を検出もし
くは定量することにキー疾病の検出もしくはその病態を
知ることが行われている。試料溶液に含有される胆汁酸
混合物を各胆汁酸成分に分離して、その各々の成分につ
いて分析する方法は１例えば特公昭５６−３８２００号
公報に開示されている。それによれば、まず、胆汁酸混
合物を含む試料溶液を逆相系のポリマーゲルやシリカゲ
ルを充填した分離カラムを用いて液体クロマトグラフィ
ー法にキー各胆汁酸成分に分離する。次に２分離された
胆汁酸を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ” ）を加えて、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｉｓ口）を固定化
したカラムに通じる。３α−Ｈ３Ｄの触媒作用で胆汁酸
はケト型に酸化され、 ＮＡＤ”は還元されて還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に
変化する。
ＮＡＤＨの螢光もしくは光吸収を測定することにキー各
胆汁酸の検出もしくは定量がなされる。特に。
胆汁酸の検出もしくは定量がなされる。特に。
螢光を測定すると比較的感度良（ＮＡＤＨを検出するこ
とが可能である。しかし、螢光光度計が高価であること
に加えて、生じたＮＡＤＨが不安定であるため化学変化
を起こし、螢光測定を行ったときのチャートのベースラ
インが次第に高くなり、正確な分析ができないという欠
点を有する。
とが可能である。しかし、螢光光度計が高価であること
に加えて、生じたＮＡＤＨが不安定であるため化学変化
を起こし、螢光測定を行ったときのチャートのベースラ
インが次第に高くなり、正確な分析ができないという欠
点を有する。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。
その目的とするところは、各種胆汁酸を高感度で安価で
分析することの可能な胆汁酸の分析方法を提供すること
にある。
分析することの可能な胆汁酸の分析方法を提供すること
にある。
（問題点を解決するための手段）
本発明の胆汁酸の分析方法は、（ａ）胆汁酸混合物を含
有する試料溶液を液体クロマトグラフィーにキー各胆汁
酸成分に分離する工程、［有］）該分離された各胆汁酸
成分を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドとテトラゾリウム塩とを含有する反応用溶液を
混合させる工程、（Ｃ）（ｂ１項で得られた混合液を固
定化胆汁酸脱水素酵素および固定化ジアホラーゼを同一
または個別に充填したカラムに導く工程、および（ｄｌ
＋０１項のカラム内でテトラゾリウム塩がジアホラ
ーゼの存在下で還元されて生成し、該カラムからの溶出
液中に含まれるホルマザンの可視部の吸光を測定する工
程、を包含し、そのことにキー上記目的が達成される。
有する試料溶液を液体クロマトグラフィーにキー各胆汁
酸成分に分離する工程、［有］）該分離された各胆汁酸
成分を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドとテトラゾリウム塩とを含有する反応用溶液を
混合させる工程、（Ｃ）（ｂ１項で得られた混合液を固
定化胆汁酸脱水素酵素および固定化ジアホラーゼを同一
または個別に充填したカラムに導く工程、および（ｄｌ
＋０１項のカラム内でテトラゾリウム塩がジアホラ
ーゼの存在下で還元されて生成し、該カラムからの溶出
液中に含まれるホルマザンの可視部の吸光を測定する工
程、を包含し、そのことにキー上記目的が達成される。
本発明方法は１例えば、第１図に示される定量装置にキ
ー具体化される。この装置は、溶離液１を収容する溶離
液槽１１と、グラジェント用電磁弁１２および定流量ポ
ンプ１３を介してこの槽１１に連結される試料注入器２
と、試料注入器２に連結される分離カラム３とを有する
。溶離液１は１分析する胆汁酸の種類や数にキー複数種
が用いられる。
ー具体化される。この装置は、溶離液１を収容する溶離
液槽１１と、グラジェント用電磁弁１２および定流量ポ
ンプ１３を介してこの槽１１に連結される試料注入器２
と、試料注入器２に連結される分離カラム３とを有する
。溶離液１は１分析する胆汁酸の種類や数にキー複数種
が用いられる。
例えば、第１図に示すように、３種類の溶離液ｌａ、ｌ
ｂおよびｌｃをそれぞれ収容する溶離液槽１１ａ、ｌｌ
ｂおよびＩＩＣが設置される。この装置は。
ｂおよびｌｃをそれぞれ収容する溶離液槽１１ａ、ｌｌ
ｂおよびＩＩＣが設置される。この装置は。
さらに１分離カラム３に連結する固定化胆汁酸脱水素酵
素カラム５と、この固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５に
定流量ポンプ４２を介して連結される反応用溶液収容槽
４１を有する。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５はさら
に固定化ジアホラーゼカラム６に連結され、固定化ジア
ホラーゼカラム６は。
素カラム５と、この固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５に
定流量ポンプ４２を介して連結される反応用溶液収容槽
４１を有する。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５はさら
に固定化ジアホラーゼカラム６に連結され、固定化ジア
ホラーゼカラム６は。
可視吸光を検出する吸光度計７に連結されている。
吸光度計７にキー定量された定量値は記録計７１にキー
表示される。この装置によれば、まず、溶離液１がグラ
ジェント用電磁弁１２を介して定流量ポンプ１３によっ
て試料注入器２に供給される。試料注入器２にあらかじ
め供給されている胆汁酸混合物を含有する試料がこの溶
離液中に溶解して試料溶液が調製される。溶離液として
は、ｐＨ６〜１０の緩衝液が用いられる。この緩衝液に
は、必要に応じて５アセトニトリル、メタノール、エタ
ノールなどの有機溶媒が１０〜５０重量％の範囲で含有
される。有機溶媒の含有量が過剰であると胆汁酸の分離
が悪くなる。
表示される。この装置によれば、まず、溶離液１がグラ
ジェント用電磁弁１２を介して定流量ポンプ１３によっ
て試料注入器２に供給される。試料注入器２にあらかじ
め供給されている胆汁酸混合物を含有する試料がこの溶
離液中に溶解して試料溶液が調製される。溶離液として
は、ｐＨ６〜１０の緩衝液が用いられる。この緩衝液に
は、必要に応じて５アセトニトリル、メタノール、エタ
ノールなどの有機溶媒が１０〜５０重量％の範囲で含有
される。有機溶媒の含有量が過剰であると胆汁酸の分離
が悪くなる。
胆汁酸混合物を含有する試料は、あらかじめ熱エタノー
ル抽出、修飾シリカゲルやポリマーゲルによみ吸着処理
などを行い５分離カラムのゲルを汚染する蛋白質などを
除去しておく。試料注入器２で調製された試料溶液は２
分離カラム３に注入される。他方、溶離液１は定流量ポ
ンプ１３にキー常時分離カラム３に供給されている０分
離カラム３には多孔性シリカゲルなど液体クロマトグラ
フィーの分離カラムに通常用いられる微粒子が充填され
ている。この分離カラムにキー胆汁酸は各成分に分離さ
れ溶出される。溶出液は固定化胆汁酸脱水素酵素カラム
５へ導かれる。このカラム５へは、さらに、 ＮＡＤ
” とテトラゾリウム塩とを含む反応用溶液４が定流量
ポンプ４２にキー反応用溶液収容槽４１から導入される
。テトラゾリウム塩としてはニトロブルーテトラゾリウ
ム（３・３゛ −（３・３°−ジメトキシ−４・４゛
−ジフェニレン）ヒス（２−（ｐ−ニトロフェニル）−
５−フェニル−テトラゾリウムクロライド〕）が好適に
用いられる。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５には胆汁
酸脱水素酵素が固定されている。胆汁酸脱水素酵素とし
ては、シュードモナス テストステローニ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｓ＋ｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎｉ）やシュード
モナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
）由来の３α−Ｈ２Ｏなどが用いられる。特に有機溶媒
に対する安定性の高いシュードモナス テストステロー
ニ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎ
ｉ）由来の３α−Ｈ２Ｏが好適である。固定化胆汁酸脱
水素酵素カラムおよび後述の固定化ジアホラーゼカラム
に用いられる担体としてはセルロース、多孔性ガラスピ
ーズなどが好適に用いられうる。
ル抽出、修飾シリカゲルやポリマーゲルによみ吸着処理
などを行い５分離カラムのゲルを汚染する蛋白質などを
除去しておく。試料注入器２で調製された試料溶液は２
分離カラム３に注入される。他方、溶離液１は定流量ポ
ンプ１３にキー常時分離カラム３に供給されている０分
離カラム３には多孔性シリカゲルなど液体クロマトグラ
フィーの分離カラムに通常用いられる微粒子が充填され
ている。この分離カラムにキー胆汁酸は各成分に分離さ
れ溶出される。溶出液は固定化胆汁酸脱水素酵素カラム
５へ導かれる。このカラム５へは、さらに、 ＮＡＤ
” とテトラゾリウム塩とを含む反応用溶液４が定流量
ポンプ４２にキー反応用溶液収容槽４１から導入される
。テトラゾリウム塩としてはニトロブルーテトラゾリウ
ム（３・３゛ −（３・３°−ジメトキシ−４・４゛
−ジフェニレン）ヒス（２−（ｐ−ニトロフェニル）−
５−フェニル−テトラゾリウムクロライド〕）が好適に
用いられる。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５には胆汁
酸脱水素酵素が固定されている。胆汁酸脱水素酵素とし
ては、シュードモナス テストステローニ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｓ＋ｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎｉ）やシュード
モナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
）由来の３α−Ｈ２Ｏなどが用いられる。特に有機溶媒
に対する安定性の高いシュードモナス テストステロー
ニ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎ
ｉ）由来の３α−Ｈ２Ｏが好適である。固定化胆汁酸脱
水素酵素カラムおよび後述の固定化ジアホラーゼカラム
に用いられる担体としてはセルロース、多孔性ガラスピ
ーズなどが好適に用いられうる。
分離用カラム３で各成分に分離された胆汁酸は。
このカラム５内で胆汁酸脱水素酵素の存在下でＮＡＤ”
と反応して胆汁酸の水酸基がカルボニル基に変化し、ケ
ト型の胆汁酸を生じる。胆汁酸としてコール酸を用いる
と次のようにケトコールを生じる。
と反応して胆汁酸の水酸基がカルボニル基に変化し、ケ
ト型の胆汁酸を生じる。胆汁酸としてコール酸を用いる
と次のようにケトコールを生じる。
補酵素であるＮＡＤ”は還元されてＮＡＤＨを生じる。
生成ＮＡＤＨのモル数は胆汁酸のモル数に相当する。
固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５からの溶出液は次に、
酸化還元酵素であるジアホラーゼが固定化された固定化
ジアホラーゼカラム６に導入される。
酸化還元酵素であるジアホラーゼが固定化された固定化
ジアホラーゼカラム６に導入される。
ジアホラーゼとしては２例えば、バシルス ステアロテ
モフイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｓｏｐｈｉｌｉｓ）やクロストリジウム クルイベリ
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のも
のが用いられる。有機溶媒に対する安定性、温度変化に
よる安定性、経時安定性の点で特に、バシルス ステア
ロテモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）由来のジアホラーゼが好ましい
。このカラム６内ではテトラゾリウム塩と固定化胆汁酸
脱水素酵素カラム５で生じたＮＡＤＨとがジアホラーゼ
の存在下で反応し１次のようにホルマザンを生じる。Ｎ
ＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ“となる。
モフイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｓｏｐｈｉｌｉｓ）やクロストリジウム クルイベリ
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のも
のが用いられる。有機溶媒に対する安定性、温度変化に
よる安定性、経時安定性の点で特に、バシルス ステア
ロテモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）由来のジアホラーゼが好ましい
。このカラム６内ではテトラゾリウム塩と固定化胆汁酸
脱水素酵素カラム５で生じたＮＡＤＨとがジアホラーゼ
の存在下で反応し１次のようにホルマザンを生じる。Ｎ
ＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ“となる。
テトラゾリウム塩はＮＡＤＨに対して大過剰に用いられ
るため生成するホルマザンのモル数はＮＡＤＨのモル敗
、言いかえれば胆汁酸のモル数に相当する。
るため生成するホルマザンのモル数はＮＡＤＨのモル敗
、言いかえれば胆汁酸のモル数に相当する。
第１図のように固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５および
ジアホラーゼ固定化カラム６を連結する代わりに、それ
ぞれの酵素を１つのカラム内に固定化してもよい、この
ような胆汁酸脱水素酵素とジアホラーゼとが固定化され
た固定化酵素カラムは、それぞれの酵素を固定化したゲ
ルを混合してカラムに充填する方法；それぞれの酵素を
適量ずつ混合し、これをゲルに固定化してカラムに充填
する方法、などにキー調製されうる。このような固定化
酵素カラムを用いると２個のカラムを使用する場合に比
べてシャープな検出ピークが得られる。しかし、胆汁酸
脱水素酵素およびジアホラーゼの一方が極端に有機溶媒
に不安定な場合には。
ジアホラーゼ固定化カラム６を連結する代わりに、それ
ぞれの酵素を１つのカラム内に固定化してもよい、この
ような胆汁酸脱水素酵素とジアホラーゼとが固定化され
た固定化酵素カラムは、それぞれの酵素を固定化したゲ
ルを混合してカラムに充填する方法；それぞれの酵素を
適量ずつ混合し、これをゲルに固定化してカラムに充填
する方法、などにキー調製されうる。このような固定化
酵素カラムを用いると２個のカラムを使用する場合に比
べてシャープな検出ピークが得られる。しかし、胆汁酸
脱水素酵素およびジアホラーゼの一方が極端に有機溶媒
に不安定な場合には。
失活しやすい方の酵素にあわせてカラムの寿命が短くな
る。このような場合は、第１図のように別々のカラムを
用いて失活しやすい方のカラムを適宜交換するほうが分
析が安価になされうる。
る。このような場合は、第１図のように別々のカラムを
用いて失活しやすい方のカラムを適宜交換するほうが分
析が安価になされうる。
ジアホラーゼ固定化カラム６から溶出する溶離液は吸光
度計７へ導入される。この溶離液に含有されるホルマザ
ンは可視部に吸収を有する。例えば、テトラゾリウム塩
としてニトロブルーテトラゾリウムを用いたときには、
５８０ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示す、これ
は吸光度計７にキー検出され記録計７１に記録される。
度計７へ導入される。この溶離液に含有されるホルマザ
ンは可視部に吸収を有する。例えば、テトラゾリウム塩
としてニトロブルーテトラゾリウムを用いたときには、
５８０ｎｍ付近に吸収スペクトルの極大を示す、これ
は吸光度計７にキー検出され記録計７１に記録される。
この値にもとづいて各胆汁酸成分が定量される。吸光度
計７を出たホルマザンを含む溶液は廃液槽８へ入る。
計７を出たホルマザンを含む溶液は廃液槽８へ入る。
（作用）
本発明方法では、固定化胆汁酸脱水素酵素カラムを通過
した溶出液に含有されるＮＡＤＨの螢光を測定する代わ
りに、ホルマザンを生成させて該ホルマザンの可視吸光
を測定する。そのため、高価な螢光光度計を使用する必
要がなく、安価に胆汁酸の分析がなされうる。ＮＡＤＨ
を直接測定することがないため、測定時のチャートのベ
ースラインが時間経過とともに上昇することもなく、高
感度で胆汁酸の分析が可能である。
した溶出液に含有されるＮＡＤＨの螢光を測定する代わ
りに、ホルマザンを生成させて該ホルマザンの可視吸光
を測定する。そのため、高価な螢光光度計を使用する必
要がなく、安価に胆汁酸の分析がなされうる。ＮＡＤＨ
を直接測定することがないため、測定時のチャートのベ
ースラインが時間経過とともに上昇することもなく、高
感度で胆汁酸の分析が可能である。
（実施例）
以下に本発明を実施例につき説明する。
（Ａ）分離カラムの調製：粒子径が１０〜２０μｍのア
クリル系樹脂の微粒子が充填された内径６ｍｍ。
クリル系樹脂の微粒子が充填された内径６ｍｍ。
長さ２５ＣＩＩｌのカラム−２６０８ＩＬＥ（積水化学
工業株式会社製）を用いた。
工業株式会社製）を用いた。
（Ｂ）固定化３α−Ｈ５Ｄカラムの調製：粒径約８０μ
ｍのセルロース粒子を担体として用いた。このセルロー
ス粒子５ ｍｌｔにイオン交換水５ ｒｏｌｌおよび２
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液１０ｎ／！を加えて攪拌した。
ｍのセルロース粒子を担体として用いた。このセルロー
ス粒子５ ｍｌｔにイオン交換水５ ｒｏｌｌおよび２
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液１０ｎ／！を加えて攪拌した。
これにあらかじめシアン化ブロマイド２ｇを溶解したア
セトニトリル１ ｔａｌを加え、激し、く攪拌して９０
秒間反応させた。このようにして活性化させたセルロー
ス粒子を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５） 、 イオ
ン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次すみやかに洗浄した。こ
れに、シュードモナス・テストステロ一二（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎｉ）属細菌由来の
３α−Ｈ２Ｏ４４ｍｇを溶解させた０、５Ｍの塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５） ５
１１１を加え、室温で２時間攪拌して反応させて３α−
Ｈ２Ｏを担体上に固定した。セルロース粒子表面に存在
する活性点をブロックするために０．０５％の２−メル
カプトエタノールを含む０．ＩＭＩ−リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を加えて４℃で２時間反応させた。この
ようにして得られた固定化３α−Ｈ２Ｏを０．５Ｍの塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
、イオン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次繰り返し洗浄し
た。内径４日、長さ３０ｍのカラムを準備し、これに上
記の固定化３α−Ｈ２Ｏを充填した。
セトニトリル１ ｔａｌを加え、激し、く攪拌して９０
秒間反応させた。このようにして活性化させたセルロー
ス粒子を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５） 、 イオ
ン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次すみやかに洗浄した。こ
れに、シュードモナス・テストステロ一二（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎｉ）属細菌由来の
３α−Ｈ２Ｏ４４ｍｇを溶解させた０、５Ｍの塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５） ５
１１１を加え、室温で２時間攪拌して反応させて３α−
Ｈ２Ｏを担体上に固定した。セルロース粒子表面に存在
する活性点をブロックするために０．０５％の２−メル
カプトエタノールを含む０．ＩＭＩ−リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を加えて４℃で２時間反応させた。この
ようにして得られた固定化３α−Ｈ２Ｏを０．５Ｍの塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
、イオン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次繰り返し洗浄し
た。内径４日、長さ３０ｍのカラムを準備し、これに上
記の固定化３α−Ｈ２Ｏを充填した。
（Ｃ）固定化ジアホラーゼカラムの調製＝３α−Ｈ５Ｄ
Ｏ代わりにバシルス ステアロテモフィルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由
来のジアホラーゼを用いたこと以外は（Ｂ）項と同様に
操作を行い、固定化ジアホラーゼカラムを得た。
Ｏ代わりにバシルス ステアロテモフィルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由
来のジアホラーゼを用いたこと以外は（Ｂ）項と同様に
操作を行い、固定化ジアホラーゼカラムを得た。
（Ｄ）胆汁酸の定量：分離カラム３．固定化胆汁酸脱水
素酵素カラム５およびジアホラーゼ固定化カラム６を第
１図に示すように接続し、室温３０℃にて胆汁酸の分析
を行った。溶離液１ａは、０．５％リン酸アンモニウム
水溶液（ｐＨ９，１）とアセトニトリルとの混液（混合
容積比８７：１３）；溶離液１ｂは、１．２％リン酸ア
ンモニウム水溶液（ｐＨ９，７）とアセトニトリルとの
混液（混合容積比８５：１５）；溶離液１ｃは０．５％
リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９，１）とアセトニト
リルとの混液（混合容積比７６ ： ２４）である。反
応用溶液４としてはβ−ＮＡＤ”を５ｍＭの濃度で、ニ
トロブルーテトラゾリウムを０．０５％の濃度で、 Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａを１ｍＭの濃度で、そして２−メルカプ
トエタノールを０．０５％の濃度で含有する０、５％リ
ン酸アンモニウム溶液（ｐＨ９，５）を用いた。試料と
して、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキ
シコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸の５
種類について、それぞれ遊離型、グリシン包含型および
タウリン包含型の３種類、計１５種類の胆汁酸を準備し
た。これらの胆汁酸をそれぞれ各１０μｍｏｌ／Ａずつ
含有する試料溶液を調製した。
素酵素カラム５およびジアホラーゼ固定化カラム６を第
１図に示すように接続し、室温３０℃にて胆汁酸の分析
を行った。溶離液１ａは、０．５％リン酸アンモニウム
水溶液（ｐＨ９，１）とアセトニトリルとの混液（混合
容積比８７：１３）；溶離液１ｂは、１．２％リン酸ア
ンモニウム水溶液（ｐＨ９，７）とアセトニトリルとの
混液（混合容積比８５：１５）；溶離液１ｃは０．５％
リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９，１）とアセトニト
リルとの混液（混合容積比７６ ： ２４）である。反
応用溶液４としてはβ−ＮＡＤ”を５ｍＭの濃度で、ニ
トロブルーテトラゾリウムを０．０５％の濃度で、 Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａを１ｍＭの濃度で、そして２−メルカプ
トエタノールを０．０５％の濃度で含有する０、５％リ
ン酸アンモニウム溶液（ｐＨ９，５）を用いた。試料と
して、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキ
シコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸の５
種類について、それぞれ遊離型、グリシン包含型および
タウリン包含型の３種類、計１５種類の胆汁酸を準備し
た。これらの胆汁酸をそれぞれ各１０μｍｏｌ／Ａずつ
含有する試料溶液を調製した。
定流量ポンプ１３ （ＴＲＩ ＲＯＴＡＲＩＩ ； Ｊ
ＡＳＣＯ社製）にキー溶離液１ａをｌｌｌ１β／分の流
速で流しながら、上記試料溶液５μｌを試料注入器２キ
ー注入した。分離カラム３からの溶出液に反応用溶液４
を定流量ポンプ４２ （ＬＣ−３Ａ、島津製作所社製）
で０．６ａｌｌ１分の流速で注入して混合し、固定化３
α−Ｈ５Ｄカラム５および固定化ジアホラーゼカラム６
に順次導き、酵素反応を行わせた。試料溶液注入４分後
にグラジェント用電磁弁１２を切り換えて溶離液として
１ｂが供給されるようにした。さらに。
ＡＳＣＯ社製）にキー溶離液１ａをｌｌｌ１β／分の流
速で流しながら、上記試料溶液５μｌを試料注入器２キ
ー注入した。分離カラム３からの溶出液に反応用溶液４
を定流量ポンプ４２ （ＬＣ−３Ａ、島津製作所社製）
で０．６ａｌｌ１分の流速で注入して混合し、固定化３
α−Ｈ５Ｄカラム５および固定化ジアホラーゼカラム６
に順次導き、酵素反応を行わせた。試料溶液注入４分後
にグラジェント用電磁弁１２を切り換えて溶離液として
１ｂが供給されるようにした。さらに。
３１分後にグラジェント用電磁弁１２を切り換えて溶離
液ＩＣが供給されるようにした。これを、吸光度計７
（５ＰＤ−６ＡＶ 、島津製作所社製）を用いてＯＤを
測定し記録計７１で記録した。
液ＩＣが供給されるようにした。これを、吸光度計７
（５ＰＤ−６ＡＶ 、島津製作所社製）を用いてＯＤを
測定し記録計７１で記録した。
得られたチャートを第２図に示す。第２図において、ピ
ークａはコール酸、ピークｂはグリココール酸、ピーク
Ｃはタウロコール酸、ピークｄはウルソデオキシコール
酸、ピークｅはグリコウルソデオキシコール酸、ピーク
ｆはタウロウルソデオキシコール酸、ピークｇはケノデ
オキシコール酸、ピークｈはデオキシコール酸、ピーク
ｉはグリコケノデオキシコール酸、ピークｊはグリコデ
オキシコール酸、ピークにはタウロケノデオキシコール
酸、ピーク！はタウロデオキシコール酸。
ークａはコール酸、ピークｂはグリココール酸、ピーク
Ｃはタウロコール酸、ピークｄはウルソデオキシコール
酸、ピークｅはグリコウルソデオキシコール酸、ピーク
ｆはタウロウルソデオキシコール酸、ピークｇはケノデ
オキシコール酸、ピークｈはデオキシコール酸、ピーク
ｉはグリコケノデオキシコール酸、ピークｊはグリコデ
オキシコール酸、ピークにはタウロケノデオキシコール
酸、ピーク！はタウロデオキシコール酸。
ピークｍはリトコール酸、ピークｎはグリコリトコール
酸、そしてピークＯはタウロリトコール酸に相当する。
酸、そしてピークＯはタウロリトコール酸に相当する。
、を較五
（Ａ）分離カラムの調製：実施例１ （Ａ）項と同様で
ある。
ある。
（Ｂ）固定化３α−Ｈ５Ｄカラムの調製：実施例１ （
Ｂ）項と同様である。
Ｂ）項と同様である。
（Ｃ）胆汁酸の分析−反応用溶液中にテトラゾリウム塩
を含有せず、かつ固定化ジアホラーゼカラムを連結しな
かったこと以外は実施例１ （Ｄ）項と同様に行った。
を含有せず、かつ固定化ジアホラーゼカラムを連結しな
かったこと以外は実施例１ （Ｄ）項と同様に行った。
固定化３α−Ｈ３Ｄカラムから溶出する溶離液中に含有
されるＮＡＤＨの螢光を測定した。螢光光度計の励起波
長は３４０ｎｍ、螢光波長は４６０ｎａ＋、測定レンジ
は１６である。得られたチャートは第２図とほぼ同様で
あるが、ベースラインの漸高が認められた。
されるＮＡＤＨの螢光を測定した。螢光光度計の励起波
長は３４０ｎｍ、螢光波長は４６０ｎａ＋、測定レンジ
は１６である。得られたチャートは第２図とほぼ同様で
あるが、ベースラインの漸高が認められた。
（発明の効果）
本発明方法によれば、このように、液体クロマトグラフ
ィー法を利用し遊離型、アミノ酸抱合型など各種の胆汁
酸を含有する試料溶液から各胆汁酸を分離して、これを
精度良く、かつ安価に分析することが可能である。この
ような方法にキー血清や尿中の胆汁酸の分析を行い、そ
の分画パターンから各種疾病の早期診断に役立てること
も可能である。
ィー法を利用し遊離型、アミノ酸抱合型など各種の胆汁
酸を含有する試料溶液から各胆汁酸を分離して、これを
精度良く、かつ安価に分析することが可能である。この
ような方法にキー血清や尿中の胆汁酸の分析を行い、そ
の分画パターンから各種疾病の早期診断に役立てること
も可能である。
第１図は本発明方法による胆汁酸の定量方法の一実施例
を示すフローダイヤグラム、そして第２図は実施例１に
おいて記録された記録計７１のチャートである。 ｌ・・・溶離液、２・・・試料注入器、３・・・分離カ
ラム。 ４・・・反応用溶液、５・・・固定化胆汁酸脱水素酵素
カラム、６・・・固定化ジアホラーゼカラム、７・・・
吸光度計。 以上
を示すフローダイヤグラム、そして第２図は実施例１に
おいて記録された記録計７１のチャートである。 ｌ・・・溶離液、２・・・試料注入器、３・・・分離カ
ラム。 ４・・・反応用溶液、５・・・固定化胆汁酸脱水素酵素
カラム、６・・・固定化ジアホラーゼカラム、７・・・
吸光度計。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）胆汁酸混合物を含有する試料溶液を液体クロ
マトグラフィーにキー各胆汁酸成分に分離する工程、 （ｂ）該分離された各胆汁酸成分を含有する溶出液にニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドとテトラゾリウム
塩とを含有する反応用溶液を混合させる工程、 （ｃ）（ｂ）項で得られた混合液を固定化胆汁酸脱水素
酵素および固定化ジアホラーゼを同一または個別に充填
したカラムに導く工程、および（ｄ）（ｃ）項のカラム
内でテトラゾリウム塩がジアホラーゼの存在下で還元さ
れて生成し、該カラムからの溶出液中に含まれるホルマ
ザンの可視部の吸光を測定する工程、 を包含する胆汁酸の分析方法。 ２、前記胆汁酸脱水素酵素が３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼである特許請求の範囲第１項に記載
の分析方法。 ３、前記テトラゾリウム塩がニトロブルーテトラゾリウ
ムである特許請求の範囲第１項に記載の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60102866A JPS61260897A (ja) | 1985-05-15 | 1985-05-15 | 胆汁酸の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60102866A JPS61260897A (ja) | 1985-05-15 | 1985-05-15 | 胆汁酸の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61260897A true JPS61260897A (ja) | 1986-11-19 |
Family
ID=14338828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60102866A Pending JPS61260897A (ja) | 1985-05-15 | 1985-05-15 | 胆汁酸の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61260897A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811692A1 (en) * | 1995-12-21 | 1997-12-10 | Marukin Shoyu Co., Ltd. | Method of determining bile acid conjugated with sulfuric acid and kit therefor |
| CN111521705A (zh) * | 2020-05-05 | 2020-08-11 | 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 | 一种血清中胆汁酸的富集方法 |
-
1985
- 1985-05-15 JP JP60102866A patent/JPS61260897A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811692A1 (en) * | 1995-12-21 | 1997-12-10 | Marukin Shoyu Co., Ltd. | Method of determining bile acid conjugated with sulfuric acid and kit therefor |
| EP0811692A4 (en) * | 1995-12-21 | 1999-12-15 | Marukin Shoyu Kk | METHOD FOR DETERMINING GALLIC ACID CONJUGATED WITH SULFURIC ACID AND TEST SET THEREFOR |
| CN111521705A (zh) * | 2020-05-05 | 2020-08-11 | 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 | 一种血清中胆汁酸的富集方法 |
| CN111521705B (zh) * | 2020-05-05 | 2021-04-20 | 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 | 一种血清中胆汁酸的富集方法 |
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