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JPS61141888A - グルコアミラ−ゼ遺伝子 - Google Patents

グルコアミラ−ゼ遺伝子

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Publication number
JPS61141888A
JPS61141888A JP59264964A JP26496484A JPS61141888A JP S61141888 A JPS61141888 A JP S61141888A JP 59264964 A JP59264964 A JP 59264964A JP 26496484 A JP26496484 A JP 26496484A JP S61141888 A JPS61141888 A JP S61141888A
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JP
Japan
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glucoamylase
amino acid
acid sequence
rhizopus
gene
Prior art date
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Granted
Application number
JP59264964A
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English (en)
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JPH0630586B2 (ja
Inventor
Toshihiko Ashikari
俊彦 芦刈
Norinao Nakamura
規尚 中村
Yoshikazu Tanaka
良和 田中
Yuji Shibano
裕次 柴野
Hajime Yoshizumi
肇 吉栖
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Suntory Ltd
Original Assignee
Suntory Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Ltd filed Critical Suntory Ltd
Priority to JP59264964A priority Critical patent/JPH0630586B2/ja
Priority to CA000497521A priority patent/CA1267372A/en
Priority to AT85115910T priority patent/ATE86663T1/de
Priority to DE8585115910T priority patent/DE3587168T2/de
Priority to BR8506273A priority patent/BR8506273A/pt
Priority to US06/808,742 priority patent/US4863864A/en
Priority to EP85115910A priority patent/EP0186066B1/en
Priority to MX000956A priority patent/MX165920B/es
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Publication of JPH0630586B2 publication Critical patent/JPH0630586B2/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
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    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

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  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リゾプス属由来のグルコアミ２−ゼ遺伝子及
びその遺伝子が組込まれた新規な組換堅りターならびに
そのイクター（よシ形質転換された微生物に関する。
（従来技術） グルコアミラーゼ遺伝子のクローニングについては、ア
スペルギルス・ニガー由来のもの（Ｔｈｅ　ＤＭ：）　
Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ、　３　ｎｏ、５　　ｐｐ１０
９７−１１０２、（１９８４））およびアスペルギルス
・アワモリ由来のもの（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎａｔｉｃ、
ｓ　ａｎｄ　＆１ｅｃｕＬａｒＢｉｏｌｏｇｙ人ｂｓｔ
ｒａｃｔｇ　ｐ　１４２　（１９８４）　３がすでに報
告されている。
グルコアミ２−ゼ（Ｅ工３．２．１．３）は、α−１，
４−ダルコシト°鎖を非還元末端から加水分解し、また
α−１，６−グルコシド°鎖も分解する酵素で、アスペ
ルギルス属、リゾプス属、ムコール属糸状ｍなどの分泌
する酵素であり、グル；−スの製造、グリコーゲンやデ
ンプンの定量に用いられる。ｔ＃に糖質原料からアルコ
ールの製造（おける糖化剤として用いられている。近年
、リゾプス属起源の〆ルコアミラーゼは、他の菌由来の
ものに比べて生デンプンにも強く作用することから注目
されておシ、無蒸煮法あるいは低温蒸煮法によるアルコ
ール製造に最適なものであるＣ％Ｉ［昭５５−１７８５
２３号および４？願昭４９−１３５８１３号参照）。
しかしながら、リゾプス属では、麹式培養によらないと
高活性を得ることができないから液体培養で生産される
アスペルギルス属由来の酵素に比べて、酵素の生産コス
トひいてはアルコール製造のコストが上昇するという問
題がある。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、安価なかつアルコール製造に適したグルコア
ミラーゼの生産を可能ならしめること、および穀類等の
糖質原料から無蒸煮法又は低温蒸煮法によるアルコール
製造のため、酵母での遺伝子発現が可能なグルコアミ２
−ゼ遺伝子、特にリゾプス属の糸状菌由来のグルコアミ
２−ゼ遺伝子を提供すること、さらに上記遺伝子の組込
まれたイクターならびＫそのイクターにより形質転換さ
れた酵母等の微生物、特に液体培養可能な微生物上提供
することを目的とする。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、リゾプス属に属する糸状菌からグルコア
ミラーゼ遺伝子を初めて単離および構造決定し１次いで
この遺伝子から大腸菌や薄母中で発現可能なベクターを
作成し、大ＶｋＩや酵母の形質転換体を得、これが実際
にグルコアミラーゼを生産すること、さらにこの形質転
換体が生でんぷん又は低温蒸煮でんぷんから、直接アル
コールを生産しうろことを確認し次０本発明はこれらに
基づきなされたものである。
本発明の遺伝子を得るための糸状菌は、リゾプス属に属
するものでグルコアミラーゼを生産するものであれば、
いずれの種でもよく、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕａ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス−７オルモサエンシ
ス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｆｏｒｍｏｇａｅｎｓｉｇ）、
　　リゾプス・ヤバニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｇ　ｊ　ａ
ｖａｎｉｃｕｓ）　、リゾプス・サイランデンシス（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｈａｉｌａｎｄａｎｓｉｓ）などが
あげられる、特（リゾプス・オリザエに属する８１Ｍ０
０３４（微工研菌寄第７９６０号（Ｆ’Ｆ’ＲＭＰ−７
９６０））は、生澱粉分解に適したグルコアミラーゼ遺
伝子生することが本発明者らによって確認されている。
なおＳＡＭ　００３４の細菌学的性質は次のとおシであ
る。
培養所見　（バレイショ・ブト０り糖寒天培地、２８℃
、培養） 培養１８目でコロニーは直ｆｆ１５−５．５ｓｃｘ１コ
ロニーは白色、コロニーの裏面も白色、培１１２日目で
コロニーはゾレート（［径９　ｃｙｉ　）の全面にひろ
がる。コロニーは成熟とともに灰色になる。
匍匍枝は無色又は黄かっ色、成板はかつ色、胞子のり柄
は一般に成板から生じるが、匍旬枝から直接生じること
もある。Ｉ＠子のう柄は早生ｉたは群生、胞子のり枝が
二叉に分岐することもある。
長さ２２０−１２００μｍ１胞子のりは球形ないし亜球
形、暗かつ色、直径６０−１５０μｍ、柱軸は球形ない
し亜球形、胞子のう胞子は球形、亜球形又は多角形、表
面に筋がある。５−１５Ｘ３−７μｍ、厚膜胞子は亜球
形又は円筒形、６−１３Ｘ４−９μｍ、接合胞子は観察
できなかつ次。
３７℃で生育可能。
以上、胞子のり胞子が柱軸を持つ暗かつ色の胞子のり中
に形成され、更に胞子のり柄がかり色であり、″１九仮
根を持つことから、本発明の菌株（ＳＡＭ−００３４）
はＲｈ１ｚｏｐｕｓ属に属する真菌であると考えられる
。そこで工ｎｕｉ、　Ｔ、、　Ｙ、Ｔａｋｅｄａ　＆　
Ｈ。
エエｚｕｋａ、　１９６５　、　　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
ａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｇｅｎｕｓＲｈｉｚｏｐ
ｕｓ、　、Ｔｏｕｒｍｌ　ｏｆ　Ｃｅｎｅｒａｌ　ａｎ
ｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＭｉＣｒＯｔ）ｉｏｌｏｇＹ＊　Ｖ
ｏｌ、　ＩＬ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、　１２１　ｐｐ
。
Ｚｙｃｈ５Ｌ、　Ｈ，、Ｒ，Ｓｉａｐｍａｎｎ　ａｘａ
　Ｇ、　Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ。
１９６９、　Ｍｕｃｏｒａｌｅｓｓ　Ｅｉｎｓ　Ｂｅａ
ｃｈｒａｉｂｕｎｇ　ＩｌｌｅｒＧａｔｔｕｎｇａｎ　
ｕｎｄ　Ａｒｔｅｎ　ｄｉｅｓｅｒ　ＰｉｌｚＨｒｕｐ
ｐｅ。
３３５　ｐｐ、Ｔｅｒｌａｇ　ｖＯｎ　　Ｊ、　　Ｃｒ
ａｍｅｒ、　　Ｌｅｈｒｅ。
Ｄｏｍｃｈ、　Ｋ、　Ｌ＠　ｗ、Ｇａｍａ　ａｎｄ　Ｔ
、−Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ。
１９８０、　Ｃｏ！Ｉ！ｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　５ｏｉ
ｌ　Ｆｕｎｇｉ、　ｖｏｌ、　Ｉ。
８５９　ｐｐ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓｓ　１
−ｏｎｄｏｎ、　Ｋ準拠して既知のＲｈ１ｚｏｐｕｓ属
の種虜と医学的性質を比較すると、本阿株は、３７℃で
生育可能であり、胞子のり胞子の表Ｘに筋がら９、胞子
のう柄が長さ２２０−ｔｚｏｏμｍ、胞子のうが直ｆｆ
１６０−１５０／Ｊｍ。
胞子のり胞子が５−１５Ｘ３−７μｍであることからｔ
本！！株をＲｈ１ｚｏｐｕｓｓ　ｏｒｙｚａａと同定し
た。
グルコアミラーゼ遺伝子 本発明のグルコアミラーゼ遺伝子はｇｔ図００内に示す
塩基配列を有する。グルコアミラーゼ遺伝子の単離は、
リゾプス属のローＲＭ人より調製し九ｃ−ＤＮＡとして
得るか、またはリゾプス属の染色体ＤＮ人から例えばク
リエールらの方法（Ｃｒγｅｒ　ｅｔａｌ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄ：ｌ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ
、　ＩＬｐ３９−４４（１９７５））によって得ること
ができる。
後者の方法は、通常イントロンの配列を含有しておシ、
そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場合は発現できな
い、これら非真核生物中で発現できる遺伝子を得るには
、　ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの一部と染色体からの遺伝
子のイントロンを含まない配列部分のＤ′ＮＡをハイブ
リッドさせる方法によっても得ることができる０両者を
ハイブリッドさせる際に、一方又は両方のＤＮＡ部分に
適当な制限酵素切断部位が存在しない場合は、インビト
ロミュータジエネシスの手法を用いることによシ適当な
制限酵素部位を作成しノ１イブリッドさせることが可能
である。
かくして得られる本発明のグルコアミラーゼ遺伝子は、
ｇ１図００内のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみな
らず、これと同等の騨累活性を有するアミノｉｌＫ対応
する塩基配列も包含する。
リゾプス属由来のグルコアミラーゼ構造遺伝子は、第１
図のＮ末端から２６−６０４番目のアミノ酸配列をコー
ト０するＤＮＡであり、または、同図に付した塩基配列
番号１９０−１９６２に相当する。アミノ酸配列のＮ末
端から１−２５番に相当する部分は、シグナルはプチト
０に対する領域と考えられ、宿主の細胞外への分泌に関
与するものも考えられる。
上述のグルコアミラーゼ遺伝子を単離する好適な方法の
例を以下述べる。グルコアミ２−ゼの生産菌であるリゾ
プス属に属する糸状菌から全ＤＮＡを単離する。
単離の方法は、クリエールの方法（先述）ｔ″改変た方
法による。ｔず、リゾプスを胞子形成させ、その抱子を
集める。これを破砕し、その後クリエールの方法に従っ
て処理し、最後にゲルー過を行なう、　−１）イテコｌ
７）ＤＮＡ　−ｉ制限＃Ｘ　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　ｔ’用
いて消化し、公知のベクターｐＢＲ３２２のＨｌｎｄｌ
［サイトにクローニングし、リゾプスの遺伝子乏イブラ
リ−を大径筈に作成する。ライブラリーとして取得する
にはアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性の形
質転換体を得れば良い。
次いで実施例で述べる様なグルコアミラーゼＤＮＡ検出
用のプローブ（ＤＮＡオリビマー）ヲ作成し、コロニー
ハイプリダゼーションを行ない、このプローブとハイプ
リダイスするコロニーヲ増殖させ、プラスきドＤＮＡ　
＠抽出する。
本発明の遺伝子は、適当なプラスミドベクターに組込ん
で、酵母、枯草菌などの微生物中で発現させることによ
フ、リゾプス属グルコアミラーゼやアルコールの製造に
使用される６本発明はこのようなプラスミドベクター及
びこのベクターを含む酵母、枯草百などの微生物にも関
する。
なお、微生物内でグルコアミラーゼ遺伝子現せしむるた
めに、遺伝子組み変えにより、プロモーター領域および
／ｌたはテール領域（３′末非翻訳部分）として形質転
換微生物に適したものを使用することが好ましい（特開
昭５８−１４６２８１号参照）１例えば酵母内で発現さ
せるために、特願昭５７−１８４２９１号および特願昭
５７−１８４２９３号に記載された、グリセルアルデヒ
ｒ−３−７オス７エイトデハイドロダナーゼ遺伝子（Ｇ
ＡＰ−ＤＨ）　　のプロモーター領域（ＰＧＡＰ）　＊
　テール領域（ＴＧＡＰ）、抑制性酸ラオス７アターゼ
遺伝子（ＰＨＯり）のプロモーター領域（Ｐｐｈ口５）
　および３−７オスフオグリセロキナーゼ（ＰＧＭ）　
　のプロモーター領域（ＰＦ３工）を後記実施例に示す
如く利用できるが、これらｔ本発明の遺伝子とともに組
込まれたプラスミドベクターおよび該ベクターで形質ｆ
、夷された微生物は、本発明の好ましい態様である。
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
（ａ）ｌ）ＤＮＡの調製とクローニンググル；アミ２−
ゼ生産菌リゾプス・オリザエから全ＤＨＡを単離し７ｊ
、ＤＮＡの単離は、酵母で用いられているクリエールら
の方法（Ｃｒｙｅｒ　ｅｔａｌ。
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏ
ｌ　１２，３９−４４゜（１９７５））ｔ”改変して行
なり九、薄く切ったじゃが芋をオートクレーブで滅蔚後
、その上にリゾスス・オリザエの菌体を増殖させ胞子を
形成させ九。
それらの胞子を集め、０．１５　Ｍ　　Ｎａ１Ｊ−０，
０５匹ＤＴＡ溶液に１！！濁し、ガラス球を用いた細１
＠ＴＩＬ外装置ダイノミルを用いて１５秒間処理により
菌体を破砕した。その後の操作は、クリエールらの方法
に従り九が、最後にパイオクト社のバイオダ、ｚＡｓｍ
ゲルを用いてゲルＦａを行ない全ＤＮＡを単離した。
このＤＮＡ　′を制限酵素用、ｎｄｌｌ　　を用いて消
化し、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　Ｉ　？（トにクロー二
／グし、リゾプスの遺伝子ライブラリーを大径！ＷＡ８
０２　　株に作製した。大腸阿の形質転換は常法を用い
た。
２イブラリ−としてアンピリジン耐性形質転換体を取得
した。
ｌ）　形質転換体の選択及びグル；アミラーゼ遺伝子の
特性決定 形質転換体の遺沢は、ニトロセルロース７紙を用い九通
常コロニーハイブリダイゼーションと呼ばれる方法で行
なった。はじめにグルコアミラーゼＤＮＡ検出用のプロ
ーブを作製する為、精製したりゾプスのグルコアミラー
ゼを各種プロテアーゼで分解し、生成した一プデドを分
離精製した。
それらのイプチドについてアミノ酸分析と一次構造の決
定を常法に従って行なった。その結果、部分構造として
Ａｓｐ−Ｌｐｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｈｉａ−Ａ
ｌａ−８ｅｔからなるアミノ酸配列を得た。同時にこの
グルコアミラーゼＯＮ末端のアミノ酸配列は、Ａｌａ−
８ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであ夕、さらにＣ末端はＡｌａ
−Ａｌａである事も見い出した０次いで目的のプローブ
作成のため、前述のアミノ酸配列の一部に対応するＴｂ
ｒ−Ｔｒｐ−８ａｒ−Ｈｌｓ−Ａｌａの部分にりいて、
そのアミノ酸に対応ス；ｂ　３　）ンカｃ、、、５’　
−ＡＣＮＴＧＧＴＣＮＣＡＱＧＣ−３’の１４ｇ１の塩
基からなる３２種の合成りＮＡオリゴ−ｒ　−ｆ　）リ
エステル固相法によシ合成した。ここでＮは任意の塩基
、ＱはピリミジンのＴらるいはＣを示す、これらのＤＮ
Ａオリゴマーｔ（ｒ−ｐ）人ＴＰトＴ４−ポリヌクレオ
デジルキナーゼを用いて傾緻し、グル；アミラーゼ遺伝
子の検出用プローブとして用い九、コロニーハイブリダ
イゼーションの方法によってこれらのプローブとハイブ
リダイズする大腸ばの形質転換体コロニーを増殖させ、
この増殖物からプラスミドＤＮＡ　ｔ″抽出た。
抽出＊１各種制限＃素で処理し九のちアガロース電気泳
動を行な＾ＤＮＡ７ツグメントの解析を行なり九、その
結果、前記プローブとハイブリダイズｆｂコロニーにお
いて、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は４．３Ｋｂ
からな夕、Ｂ！ＬｍＨＸ、　Ｋｐｒｄ。
Ｍｌｕｌおよび５ａｃＸで一ケ所切断され、さらにＤｒ
ａ工で２ケ所、Ｂｇｌｌ［で３ケ所切断されるが、Ａｃ
ｃＩ、Ｂａ１４　Ｃ１ａＩ、　ＥｃｏＲＸ、　Ｈｐａ４
　Ｐａｄ、　Ｐｖｕｌｌ、５ｃａＩおよびＸｈｏｌでは
切断されないことが判明し九、この断片金持クプラスミ
ドｆｉ−ｐＲＧＡ３９と命名した。
（ｂ）ｌ）ＲＮＡ　ｏ＃ＡｇとｃＤＮＡのクローニング
リゾプス・オリザエの気中菌糸から全ＲＮＡ　　ｌ単離
した。仁れにはグアニジウムチオシアネートの使用（含
む公知の手ａｔ用い九、オリゴ−ｄＴセルロースクロマ
トダｙフイ會用い全ＭＡからポリアデニル化ＲＮＡ　ｔ
″ｍ　−ＲＮＡ　　分画として分取し九、このｍ　−Ｒ
ＮＡ　を用い岡山−バーブ法（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｂ、
　＆　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、、　Ｍｏ１．　Ｃｑｌｌ、　Ｂ
ｌｏｌ。
２．１６１（１９８２））によ夕ｃＤＮＡの遺伝子ライ
ブラリーを犬場函ＷＡ８０２　　中に作製した。
１）形質転換体の選択及びダルコアミツーゼｃＤＮ人の
特性決定 目的＃累のｃ−ＤＮＡを有する形質転換体の選択は、前
述のコロニーハイブリダイゼーションの方法で行なった
。／ルコアミラーゼｃＤＮＡ検出用のプローブとして前
記１−１）で得たダルコアζラーゼ遺伝子Ｏ２，Ｏｋｂ
　Ｄｒａ工断片を用い九、この断片を（α−”Ｐ）ａｃ
ＴＰ％ＤＮＡポリメクーゼ、工及びＤＮＡ７−ゼエヲ使
用するニックトランスレーション法によりて傾臓し、グ
ルコアミラーゼＤＮＡ検出用のプローブとして用い次、
このプロー〆とハイブリダイズする形質４ｆ換体コロニ
ーを増殖させ、ゾ２スミドＤＮ人を抽出し九、各種制限
酵素で処理したのち、アガロース電気泳動を行ないのＭ
Ａ　７クグメントの解析上行なった。プローブとノ・イ
ブリダイズするコロニーのプラスミｙＫ挿入されたＭＡ
断片は、Ｌ７ｋｌ）の大きさであり九。このプラスミド
ｔｐのＡ２３９と命名した。
（ｃ）　　ＤＮＡ配列解析 プ；ｙ　スｉ　）”　ｐＲＧＡ３９及びｐｃＧＡ　２３
９１−ら各ね制限＃Ｘを用いて分解し、アガロースゲル
でＤＮＡ断片を単離し、組換え７ア一ジＭｌ　３を用い
たジデオキシ法により塩基配列を決定した。ｐＲＧＡ３
９の解析の結果この遺伝子には、数十ｂｐからなるイン
トロンが４ケ所存在する事が確認された（第２図にイン
）ａンの存在部位を示す）、を九、ｐｃＧＡ２３９は完
全長のグルコアミ２−ゼに対応するｃＤＮＡではなく、
アミノ酸にして約５０９１欠けたものであり九、ｐＲＧ
Ａ−３９およびｐＣＧＡ２３９の遺伝子地図の比較を第
４図く示した。
（ｄ）　　発現用グルコアミ２−ゼＤＮＡの構築クロー
ン化されたｃＤＮＡは、完全長ではない。
そこで９００人２３９とｐＲＧ人３９ｔ″組み換えると
とくよシ、グルコアミラーゼのプロモーター（リゾプス
由来）金持り完全長のｃＤＮＡを作製した。その除、組
み換えに利用できる適当な制限簿素サイトがこれらのプ
ラスξト９中に存在しないため新しく、インビトローミ
ュータジエネシスの方法でＳａｌ工のサイトをｐｃＧＡ
２３９及びｐＲＧＡ　３９の同じところに新しく作シ、
組み換えを行なった（Ｎ５図参照）。
インヒトローミュータジエネシスの方法は、モリナガら
の方法（Ｍｏｒｉｎａｇａ、　Ｙ、、　ｅｔａｌ、Ｂ１
０／ＴＩＣＥＬＮＯＬＯＧＭ　２　、６３６−６３９　
（１９８４）　）に従り九。
こうして得られ九ゾ２スミドｐＣＧＡ３９は、Ｓａｌ工
のサイト１作製し′ｆ？：、ためにＮ末から５３誉目の
アミノ酸二゛トンが本来のリジンからアスパラギン酸に
変わっている。そこで再ひインビトローミエータジエネ
シスの方法を用いて、本来の塩基配列に戻った完全長の
グルコアミ２−ゼＤＮＡ　を含むプ２スミドｐＣＧム４
４９を得九、プラスミドｐＣＧＡ４４９は、工業技術院
微生物工業技術研究所にＳＡＭＯＯ３９の表示名でプタ
イスト条約の下に寄託され、受託番号Ｆ’ＥＲＭＢＰ−
６７３が付与されている。
カ刀人４４９中の完全長グルコアミラーゼＤＮＡは、ｇ
２図における矢印庇部分と第３図における矢印布部分が
結合し九ものである。
（ｅ）　　界母における発現ベクターの構築前記（６Ｊ
で得たｐｃＧＡ４４９に酵母で効率良く発現させるため
特願昭５９−１５７０３７号に開示され次数性ホス７７
ターゼのプロモーター（Ｐｐｈｏ　５　）を有するｐＹ
Ｇ工Ｆ’Ｌｍ　２１２から、ＥｃｏＲＩ−３ａｌｌ：　
　で切夛出される約８．３ｋｂの断片を用いた。このＥ
ｑｏＲニーＳａｌエサイトにｐＣＧＡ４４９　を組み込
む為ＫｐＣＧＡ４４９のＰｖｕＨサイト’１Ｘｈｏニリ
ンカーを用いてＸｈｏエサイトに変更し、プラスミドｐ
ｃＧＡ４５０　　ｔ″作製た（第６人図）、このプラス
ミドｔ　ＸｈｏＸおよびＩｃｏＲＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動で、λ２　ｋｂの断片金分離し、Ｔ　４
−　ＤＮＡリガーゼを用いて前述の８．３　ｋｂ　Ｉｃ
ｏＲＩ−８ａｌｌ断片にライゲーションし、この結果得
られたＰｐｈｏ　５　をプロモーターとして含むプラス
ミドｙ７（ｐＹＧＡ　２１４９と命名した。このプラス
ミｒを大腸！ＩＷＡ８０２　体中で増直させて分離した
（第６Ａ図参照）、ｐＹＧＩＦＩｍ２１２０発現プロモ
ーターＰｐｈｏ５とグリセロアルデヒｙ−ａ−リン酸脱
水素＃素のプロモーター（ＰＧＡＰ　”特願昭５７−１
８４２９１号参照）に変えたプラスミドｐＹＧＩＦＬ！
１２２２　を作製しく第６Ｂ図）上と全く同じ方法でｐ
ＹＧＡ２２４９　を作製しく図示せず）、プクスミト９
を分離しｔ。
サラＫ　ｐＣＧＡ４４９　Ｏ代Ｄ　Ｋ　ｐＣＧＡ４６９
　をＭ４　イテＭ様ｄ操作によりｐＹＧ工ＦＬｍ２１２
からｐＹＧＡ２１６９　（第６Ａ図右下）　／　ｐＹＧ
ＩＦＬｍ２２２　ｄ４ｐＹＧＡ２２６ｃＸ図示せず）を
作製し、プラスミ）＃全分離した。その際、ｐＹＧ工Ｆ
Ｌｍ２２２は、　ｐＹＧ工Ｆ’Ｌｍ２１２（８３Ｍ２７
４　ＦＥＲＭＰ−７７２７）と特願昭５７−１８４２９
１　Ｋ開示され九プクスミドｐＹｇａＰ　８７（ＳＢＭ
１５１　ＦＥＲＭ　ＢＰ−３８２）を用いてｆ１製し九
（第６Ｂ図参照）、すなわち。
、ＹＧ工ＦＬＩ！１２１２中唯−のＢａｍＨエサイトｆ
　ＢａｍＨ］：　テ開裂後、　ＤＮＡポリメ２−ゼＩに
よタフイルインし、ＨＬｎｄＩｉリンカ−を用いてＨ１
ｎｄｕサイトに変更したプ９スｉドｐＹＧ工ＦＬｍ２１
２Ｈｋ作製し九、ま次ｐＭｇａＰ８７のグリセロアルデ
ヒド−３−リン酸脱水素＃累の構造遺伝子開始コドンＡ
ＴＧの直前にインビトロミエータジエネシスによ夕Σｃ
ｏＲ工　　のサイ）１−作ムプラスミ）”　ｐＹｇａｐ
８７Ｅ七作製した。
ｐＹＧ工ＦＬｍ２１２Ｈｔ　ＥｃｏＲＩで切断しさらＫ
Ｈｌｎｄｌｌで部分的（切断後７ガロースメルを気泳動
で８．Ｏｋｂの断片を分離しｔ、ｉたｐＹｇａｐ８７Ｅ
　ｆ　ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｉｌで切Ｔｒｒ仕アガロ
ースメル電気泳動で１．１ｋｂの断片を分離し、ｐ’ｌ
’Ｇ工ＦＬｍ２１２Ｈの８．Ｏｋｂの断片と２イゲーシ
ヨン後大腸白金形質転換してプラスミド、ｐＹＧ工ＹＬ
ｍ２２２　を得た。
（イ）酵母Ｋｋけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現前述
のプラスミ）＃ｐＹＧＡ２１４９を用い酵母。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ８ｖｉｓｉａｓ　
ＸＳ−３Ｘ５−３Ｏ−２Ａ（’；１ｓｚｕ２　、　ｈｉ
ｓ　３　、　ｔｒｐｌ　、　ｕｒａ３　：ｌ　ｂよびＸ
Ｓ−Ｘ５−３Ｏ−２８（α、　１ｅｕ２．　ｈｉｌ１３
　ｇ　ｔｒｐｌ　Ｉ　ｕｒａ３　）を形算転換し、トリ
プト７ア／の栄養要求性で形質転換体を選択した。形質
転換は、Ｌｉ（１４！２を用いたイトウらの方法（Ｉｔ
ｏ、Ｈ，、ｅｔａｘ、Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、、　１
５３ｔ　（１９８３））で行なった。得られた形質転換
株を５−のＹＥＰＤ培地（１チ酵母エキス、２悌ポリイ
ブトン、２ｅ６メルコース）に−白金耳植菌後４８時間
後にサンプリングを行なった。エツベンドル７チューブ
にて１ｏｏｏｏ　ｒｐｍ　ｓ分間の遠心分離によシ上清
とイレットに分け、その上清を用いてグルコアミラーゼ
の活性を測定した。ゲルコアぽラーゼ活性の測定は可溶
でんぷん溶液（１０チ町溶でんぷん一２０７５Ｍ酢酸緩
衝液ｐＨ５，０）　８００μｌＫ前述の上清２００μｌ
を加え３７℃で反応後の遊離グルコースの量で求めり、
クルコースの量はグルコスタット（藤沢薬品）を用いて
定量した。活性は、２時間反応で測定しタトコロＸＳ−
３０−２Ａ　中ノ、ｐＹＧＡ２１４９　テｒｉ、０．０
０４ｍ／３１７、ＸＳ−３０−２Ｂ中のｐＹＧＡ２１４
９では、０．００８ｕ〜と々シ酵母の性によシ２倍の差
があった（第７図参照）、１ユニツトは、１分間に１ｐ
ｎｔｅｌ−のグルコースを遊離する活性とした。
ｐＹＧＡ２１４９を含まない酵母では、上清に活性は認
められなかった。
さらにプロモータとしてＰＧＡＰ−を利用している場合
その活性は０．４０ｔ／ｌＬ／となり、５０〜１００倍
のグルコアミラーゼ活性が出現した。°またプロモータ
ーとして酸性ホスファターゼＰｈｏ５を利用した場合グ
ルコアミラーゼ活性は、培地中のリン酸濃度に影響され
出現した。たとえば、通常のＹＰＤ培地で３０℃４８時
間培養後におけるこの菌のグルコアミラーゼ活性はＯで
あるが、硫酸！グネシウムとアンそニア水を用いてＹＰ
Ｄ中のリン酸を除いた培地（Ｒｕｂｉｎ　、Ｇ６Ｍ、　
Ｋｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４１．１９７−２
０２ｔ（１９７４））ではＰＧＡＦの場合と同程度のグ
ルコアミラーゼ活性が出現する。培養後の上清くついて
、ＳＤＳ　＄リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった
場合、／ルコアミラーゼ蛋白は、全菌体外蛋白質の５０
１以上である。
さらにそれらの活性がリゾプス由来のグルコアミラーゼ
によるものである事を免疫学的手法によシ確認した。精
製したグルコアミラーゼを用い。
ウサギによる抗体を作製した。この抗体を用い通常ウェ
スタンプロッティングと呼ばれる方法で検出した。これ
罠は、前述の活性を測定した４８時間培養後の上清１．
５ｄを濃縮して用いた。その３分の１量を１０チポリア
クリルアミド電気泳動し、泳動後、ゲル中のたんばく質
を電気泳動的にニトロセルロー３１紙上べ移動させ、固
定した。こうして得られたニトロセルロー３１紙を酵素
免疫実験法の手法を用いパーオキシダーゼの反応で検出
した。その結果リゾプスのグルコアミラーゼと分子量的
にほぼ同じ位置にグルコアミラーゼの抗体と反応するバ
ンドが存在し、たしかに、リゾプス由来のグルコアミラ
ーゼが酵母によシ発現している事を確認した。その結果
を第８図に示した。
（！りでんぷんを炭素源とした場合の増殖酵母ＸＳ　−
３０−２８株についてｐＹＧＡ　２１４９の有無につい
て炭素源を変えた場合の増殖について検討した。ＸＳ−
３０−２８をＹＥＰＤ培地で、ＸＳ−３０−２８（ｐＹ
ＧＡ２１４９）を１チカザミノ酸及びウラシルを含む最
少培地（０，６７％　Ｄｌｆｃｏ、　Ｙｅａｓｔ　ｎｉ
ｔｒｏｇｅ、ｎｅｂＬｓａ、　２チグルコース）で２４
時間３０℃で振とり培養し前場とした。　５００ｄの坂
ロフラスコＫ　ＹＥＰＤ培地または、ＹＥＰＳ培地（１
チ醪母エキス、２チボリベプトン、２％町溶性澱粉）を
１００ｍ作製し、オートクレーブ滅菌後３０℃にて前場
溶液を１ｙ加え、その後の増殖を６６０ｒＬｙｘの吸光
度によって比較した。その結果、プラスミ）’　ｐＹＧ
Ａ　２１４９を保持りないＸ５−３Ｏ−２Ｂ株は、ＹＫ
ＰＳ培地では、はとんど増殖しないが、ｐＹＧ人２１４
９を保持する株は、　ＹＥＰＳ培地でもＹＥＰＤ培地と
同程度の増殖速度で１帽しうる。この事実は、明らかに
ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９）　　がグルコア
ミラーゼを生産し、澱粉を分解して利用している結果で
ちる（第９図参照）。
（Ａ）　　形質転換酵母によるアルコールの生産１）可
溶性澱粉を用いたアルコール発酵培地はＹＰＳ　（１チ
酵母エキス、２チボリイプトン、１％、２チまたは５チ
町溶性澱粉＞　２００ｄを５００１Ｌｌマイヤー中で１
２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したものを用いた
。
酵母は次のものを使用した： ■　ＸＳ−３０−２Ｂ　　（グルコアミラーゼ遺伝子を
持たぬコントロール） Ｑｚ　　ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９で形質転
換〕この酵母はリゾプスのプロモーターを持つ。
■　ＸＳ−３０−２Ｂ　（ｐＹＧＡ２１６９で形質転換
〕この酵母はＰｈｏ　５プロモーターを持つ。
■ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２２６９テ形質転換〕こ
の酵母はＰＧＡＰプロモーターを持つ。
酵母の前々培を得るため、１チカザミノ酸、ウラシル、
アデニンを含む最少培地５ｄに１白金耳植菌し、２８℃
で２０時間振とり培養した６次いでこの前々培をＹＰＤ
培地に２壬植薗し、２８℃で２４時間靜１培養して々培
とした。但し、■の酵母については、Ｐｈｏｓを誘導す
るために低すン酸ＹＰＤ培地で培養した。この々培をＹ
ＰＳ培地に５壬檀菌し、２８℃で静置培養してエタノー
ルの生産を調べた。なお■の酵母については低すン酸Ｙ
ＰＳ培地で行った。各酵母圧ついて１，２および５％の
澱粉でのエタノールの生産並びに酵母の増殖を測定した
。その結果を次表１および２に示す。
表　　　　２ ４８時間目について　　　　　　、。
２−でんぷん利用 墓）低温蒸煮法（Ｉ、ＴＯ）Ｋよるアルコール発扉粉砕
とうもろこし１４０．！ｉ＋を仕込水４０２−中に加え
、嘔らにα−アミラーゼ製剤（ターマミル）０．５１を
増粘防止剤として、メタ重亜硫酸カリ１６０　ｐｐｒｍ
　を殺菌剤として添加し、８０℃〜８２℃に５分間保持
した後急冷した。
酵母の前々培および々培は１）と同じ菌を用いて同様に
行ない、この々培を７１！ｌとして上記低温蒸煮でんぷ
んに加え、２８℃で培養した。培養は、他の成分を添加
しないもの、カザミノ酸、クラシル、アデニンを補った
もの、および更に０．４１グルコースを加えたものの３
水準について行い、ｃｏ２減少量による発酵の進行状態
およびアルコール生成量を調べた。コｙ　）　ａ−ルは
、リゾシスグルコアミラーゼを通常量で用いた非形質転
換酵母の場合も調べた。結果を表３、表４および第１０
図に示す、これらの結果から判るとおシ、本発明の酵母
によれば、リゾプスグルコアミラーゼ製剤を添加するこ
となく、無蒸煮又は低温蒸煮でんぷんから直接アルコー
ルを製造することが可能でらる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のグルコアミラーゼのイントロンを含ま
ない構造遺伝子の塩基配列をジグナルイプチド領域とと
もに示す図でラフ、 第２図はリゾプス・オリザエの染色体ＤＮＡよシクロー
ニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
示す図でめシ、 第３図はリゾプス・オリザエの溝−ＲＮＡよシ得たｃＤ
ＮＡをクローニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＣ末
端側の塩基配列を示す図でｓｂ、第４図は、リゾプス・
オリザエの染色体ＤＮＡよ）クローニングしたグルコア
ミラーゼ遺伝子と、リゾプス・オリザエのｒｙｒ　−Ｒ
ＮＡよシｖ４製したグルコアミラーゼ遺伝子との比較図
でう夛、第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４図の
二つの遺伝子を組合せて、プラスミド９ベクター中にて
、イントロンのない完全長のｃＤＮＡを構成し、さらに
酵母中で効塞良く発現させるために、プロモーター及び
テールを組込む方法を示す一連の流れ図であって、第５
図はｐＣＧＡ４６９　Ｋ到るまでの図、第６Ａ図はｐＹ
（ｒＡ２１４９およびｐＹＧＡ　２１６９に到るまでの
図、そして第６８図ＦｉｐＹＧＩＦＬｙａ　２２２に到
るまでの図でろシ、 第７図は、形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産
を示すグラフでアシ、 第８図は、形質転換酵母の生産したグルーアミラーゼの
電気泳動図であシ、 第９図は、でんぷんを炭素源とした場合の形質転換酵母
の増殖曲線グラフであシ、 第１０図は、形質転換酵母によるアルコールの生産を示
すグラフで６る。 特許出願人　サン　トリ　一株　代金　社（外５名） 第２図（ｂ） 区＝の浄ごｒ、′４：′：″：二： 第３図（ａ） ；：なし） ｒゴＡ０℃ｐ譲貫−αＺＣ臥παｉπ頷Ｃ晶ＣＴ−品τ
Ａ手続補正角（方式） 昭和６０年　４月７８ ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ５、補正命令の日付　　　昭和６０年　３月２６日　（
発送日）６、補正の対象 手　　続　　補　　正　　書 昭和６０年　６月７７日 ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書の記載を次のとおり補正する。 頁　　　　行　　　　補正前　　　　　　補正後１８　
　　３　　　ＥＩ　　３．２．１．３．　　　　　ＥＣ
３，２，１，３゜２ｉ　　　１９　　１１ｚｕｋａ　　
　　　　　ｌ１ｚｕｋａ２３　　２　　よって得ること
　　　よって分離し選択すること ２３　　５　　非真核生物　　　　　の宿主２５　　８
．９　　　ハイブリット１させ　　組み換え２８　１９
　　この増殖物から　　　削除３１２〜３　　ジデオキ
シ法　　　　ダイデオキシ法３斗　５．１１　　　ｐＹ
ｇａＰ　８７　　　　　　ｐＹｇａｐ　８７３５　　１
６　　１０％　　　　　　　１．０％３６　　１１　　
　Ｐｈｏ５　　　　　　　　遺伝子のプロモーターＰｐ
ｈｏ　５ ３８　　　５　　　Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ　　　Ｄｉ
ｆｃｏ　　Ｙｅ＆５ｔ３８　７．１５　　　ＹＥＰＤ　
　　　　　　　ＹＰＤ３９　１２．２０　　　Ｐｈｏ　
５　　　　　　　Ｐｐｈｏ　５４１　表１′）’　　ｐ
ＹＧＡ−２１６９ｐＹＧＡ２１６９５の行 ４１　表”）＆　ｐＹＧＡ−２２６９ｐＹＧＡ２２６９
８の行 （２）明細書第２４頁第４行〜６行の「シグナルイプチ
ド・・・・・と考えられる。」を次のとおり補正する。 「シグナルはプチドに対する領域であり、宿主の細胞外
への分泌に関与するものである。即ち、実際にこのシグ
ナルイプチト′をコードする領域を用いて、酵母により
以下述べるよ５にグルコアミラーゼを生産させた場合、
グルコアミラーゼの９０％以上は培地中に分泌された。 さらに分泌されたグルコアミラーゼを通常の方法で精製
後、Ｎ末端のアミノ酸配列を調べたところ、２６番目の
アミノ酸から始まっており、酵母においてもシグナルは
プチビとして機能していることが示唆されている０ 従って、次式のアミノ酸配列： ＭＥＴ　　ＧＬＮ　　ＬＥＵ　　ＰＨＥ　　ＡＳＮ　　
ＬＥＵ　　ＰＲＯＬＥＵＬＹＳ　　ＶＡＬ　　ＳＥＲＰ
ＨＥ　　ＰＨＥ　　ＬＥＵ　　ＶＡＬ　　ＬＥＵＳＥＲ
ＴＹＲＰＨＥ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵ　　ＶＡＬ　
　ＳＥＲＬＡ をコードするシグナル配列および各種蛋白質性物質をコ
ードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ発現発現イータ−り、
適当な宿主を形質転換して、インターフェロン、リンフ
才力イン、インターロイキン２のような蛋白質性物質を
細胞外に分泌させることが可能である。」 （３）第１０図を別紙のとおり補正する。 以　　　　上

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）リゾプス属に属する糸状菌由来のグルコアミラー
    ゼ構造遺伝子。
  2. （２）リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス・オリザ
    エ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）である特許請求
    の範囲第１項記載のグルコアミラーゼ構造遺伝子。
  3. （３）下記のアミノ酸配列（ I ）又はそれと実質的に
    同等の酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする特許
    請求の範囲第１項または第２項記載のグルコアミラーゼ
    構造遺伝子。 【アミノ酸配列があります】
  4. （４）下記の塩基配列（II）で表わされる特許請求の範
    囲第１項ないし第３項のいずれか一項に記載のグルコア
    ミラーゼ構造遺伝子。 【アミノ酸配列があります】
  5. （５）リゾプス属に属する糸状菌由来のシグナルペプチ
    ドを上流に持つグルコアミラーゼ遺伝子。
  6. （６）リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス・オリザ
    エ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）である特許請求
    の範囲第５項記載のグルコアミラーゼ遺伝子。
  7. （７）下記のアミノ酸配列（III）をコードする特許請
    求の範囲第５項または第６項記載のグルコアミラーゼ遺
    伝子。 【アミノ酸配列があります】
  8. （８）下記の塩基配列（IV）で表わされる特許請求の範
    囲第５項ないし第７項のいずれか一項に記載のグルコア
    ミラーゼ遺伝子。 【アミノ酸配列があります】
  9. （９）リゾプス属に属する糸状菌由来のグルコアミラー
    ゼの構造遺伝子を含有するベクター。
  10. （１０）リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス・オリ
    ザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）である特許請
    求の範囲第９項記載のベクター。
  11. （１１）下記のアミノ酸配列（ I ）又はそれと実質的
    に同等の酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩
    基配列であるＤＮＡを含有する特許請求の範囲第９項ま
    たは第１０項記載のベクター。 【アミノ酸配列があります】
  12. （１２）下記の塩基配列（II）であるＤＮＡを含有する
    特許請求の範囲第９項ないし第１１項のいずれか一項に
    記載のベクター。 【アミノ酸配列があります】
  13. （１３）ベクターが、プラスミドｐＣＧＡ４４９、プラ
    スミドｐＣＧＡ４６９、プラスミドｐＹＧＡ２２４９ま
    たはｐＹＧＡ２１４９である特許請求の範囲第９項ない
    し第１２項のいずれか一項に記載のベクター。
  14. （１４）リゾプス属に属する糸状菌由来のグルコアミラ
    ーゼの構造遺伝子を含有するベクターで形質転換された
    微生物。
  15. （１５）リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス・オリ
    ザエで（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）ある特許請
    求の範囲第１４項記載の形質転換された微生物。
  16. （１６）下記のアミノ酸配列（ I ）又はそれと実質的
    に同等の酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩
    基配列であるＤＮＡを含有するベクターで形質転換され
    たものである特許請求の範囲第１４項または第１５項記
    載の形質転換された微生物。 【アミノ酸配列があります】
  17. （１７）下記の塩基配列（II）であるＤＮＡを含有する
    ベクターにより形質転換されたものである特許請求の範
    囲第１４項ないし第１６項のいずれか一項に記載の形質
    転換された微生物。 【アミノ酸配列があります】
  18. （１８）宿主微生物が、大腸菌、酵母または枯草菌であ
    る特許請求の範囲第１４項ないし第１７項のいずれか一
    項に記載の形質転換された微生物。
  19. （１９）プラスミドｐＣＧＡ４４９、プラスミドｐＣＧ
    Ａ４６９、プラスミドｐＹＧＡ２２４９またはｐＹＧＡ
    ２１４９によって形質転換されたものである特許請求の
    範囲第１４項ないし第１８項のいずれか一項に記載の微
    生物。
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