JPS61111695A - Ｂ型肝炎ビールス又はｂ型肝炎ビールス成分からのｄｎａフラグメント、ポリペプチド及びオリゴペプチド、組み換えｄｎａ分子、ｄｎａベクター、エシエリヒア・コリｋ１２変異体、ポリペプチドの製法、ｂ型肝炎ビールス疾患に対する接種物質、モノクロナール抗体ｍａ１８／７、マウス雑種細胞ｇｏ１ａ１８／７‐１並びにモノクロナール抗体ｍａ１８／７の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産呆上の利用分野 本発明は、Ｂ型肝炎ビールス又はＢ型肝炎ビールス成分
からのＤＮＡフラグメント、ポリペプチド及びオリゴペ
プテド、組み供えＤＮＡ分子、ＤＮＡベクター、エシエ
リヒア●コリＫ１２ｆ異体、ポリペプチドの製法、Ｂ型
肝炎ビールス疾患に対する接種物質、モノクロナール抗
体ＭＡ１８／７、マウス雑檀細胞Ｇｏ　　ＩＡ　　１８
／７−１並びにモノクロナール抗体ＭＡｉｌ３／７の製
法に関丁る。

従来の技術 ヨーロッパ特許出願第００２０２５１号明細曹ＫＩｌ’
ｌ、Ｂ型肝炎ビールスのＤＮＡのデノム又はこのデノム
のフラグメントをトランスファーベクターにより好適な
宿主微生物中に移入する方法が記載されてあり、移入さ
れた微生物はＢ型肝炎ビールスのデノム又はその７ラグ
メントにより暗号付けされるポリペプテドを生産する能
力を有する。例えは、この方法により抗ｙＡ特性を有す
る２２６アミノ酸からのタンパク質（Ｓ一タンパク質）
が得られ、これはＢ型肝炎ビールス疾，りに対する接種
物負の製造に世用することができる。

ところで、Ｂ型肝炎ビールスがその外被中に１０８又は
１１９アミノ酸の高免疫原住ポリペプチド配列を含有し
、これが肝炎ビールスの特定のデノムフラグメントによ
り、即ちプレ（Ｐｒａｅ　）　−８（１）−ヌクレオチ
ド配列により暗号付けされることが判明し予想外であっ
た。

プレー５（１）−ヌクレオチド配列に相当するアミノ酸
配列（プレー５（１）−アミノ酸配列）−このプレー５
（１）−アミノ酸配列の等価の変異体を含めて−９なく
とも１個を官有するポリペプチドはＢ７肝炎ビールス感
染に対するＷ：種物質の製造に好適である。例えは、そ
のようなペプチドは遺伝子工学市方法で装造することが
できる。

ヨーロッパ特許出願ｆｉｉｐＪ００２０２５１号明細す
から公知のＳ−タンパク質に対し、本発明によるプレー
５（１）−タンパク質に著しい抗原性損失全件なわずに
細菌中で製造されるか又は例えはＢ型肝炎ビールスもし
くはその外被タンパク質から得られる。

健康状態、姓及び年齢に相応して、公知のＳ−タンパク
質で接種した患者の一部では測定可能な抗体が形成せす
、他の患者では抗体は再び急速に消失する。経験上、接
種して、抗体を有していない患者は保ｄされてはいない
。他方、Ｂ型肝炎の回復期患者の臨床的観察によれは、
Ｓ−タンパク質に対する抗体がＢ型肝炎ビールス粒子の
消失後しばらくしてから初めて血清中に出現しかつ多く
の回復期患者が全治にもかかわらす全く抗体を形成しな
いことが明らかである。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題は、殊に作用物質が比較的低い分
子量を有するポリペプチドである、Ｂ型肝炎ビールス疾
患に対する改良された接種物質を開示することであり、
その際にこの作用物質が十分なかつ純粋な形で製造でき
ることである。更に、本発明の課題は、免疫原注を有す
る小型ペプチド配列（７°レー５（１）−アミノ酸配列
）を暗号付けてるヌクレオチド配列を含有する、ビール
ス性ＤＮＡ自体よりもはるかに小さなりＮＡ配列（プレ
ー５（１）−ヌクレオチド配列）を獲得することである
。このペプチド配列は、これを生宿主微生物中に移入す
ると抗体の形成を誘発し、この抗体はこの宿主ＱＢ型肝
炎ビールスによる感染から保護することができる。

問題点全解決するだめの手段 本発明の目的は峙許詞求の範囲に記載されている。

明細蕾中記載のアミノ酸の略語は国際的に常用の像笛的
略語である（例えば、ヨーロッパ特許出願第００２０２
５１号明細誓、第４頁参照）。

例えは、本発明の篤異的で予測し得なかった利点は次の
通りである： １、　本発明によるプレー５（１）−ポリペプチドはＢ
型肝炎接種物質として、主にＢ型肝炎ビールスに対する
及び僅かにＢ型肝炎表面抗原粒子に対する抗体を形成す
る。一般に、Ｂ型肝灸ビールス含肩試料中にはほぼ千倍
過剰の非感染性肝炎衣面抗原が存在する。従来のＢ型肝
炎接棟物質は、非感染性Ｂ型肝炎表面抗原粒子の存在で
は一緒に消費される抗体全生成する。それに対して、保
護作用をする抗−プレ−８（１）抗体はＳ−タンパク質
含有接種物質に基づいて形成される抗体に比べて、同量
のＢｆｉ肝炎ビールスを感染性物質から遊離するのに、
はるかに少量で存在していてよい。

２、　プレー５（１）−アミノ酸自じ列の性質に、それ
がＢ型肝炎ビールス抗原金形成し、この抗原に対してＢ
型肝炎ビールス感？１治療する除に初めに抗体が形成さ
れることを示す。これは改良された免疫原注１−［わす
。

６、　プレー５（１）−アミノ酸配列全奉するペプチド
に対する抗体は、ＢｆＭ肝炎肝炎ビール子粒子択的検出
に好適でありかつ生物体数からＢ型肝炎ビールス粒子を
除去するための免疫吸着剤としても好適で）・る。更に
、プＬ／−８（１）−アミノ酸配列を有するペプチドに
対する抗体１診断及びＢ型肝炎感染の経過の判定に使用
することができる。それというのもＢｉ肝肝炎ビースフ
粒子を先的に反応しかつ２Ｑ　ｎｍのＢｑ肝炎表面抗原
粒子と僅かしか反応しないからである。シレー５（１）
−含有抗原は、この抗原に対して体数及び細胞の免役反
応を試験するのに好適な試薬である。例えは、この免役
反応はＢ型肝炎の治療にきわめてｌ侠であり得る。場合
によりプレー８（１）タンパク質に対する抗体は生物学
的物質からＢ型肝炎ビールスを除去するのにも好適であ
る。更に、場合によりプレー５（１）含有製剤は既に存
在するＢ型肝炎ビールス感染の治療にも使用することが
できる。

プレー５（１）−アミノ酸配列のサブユニット全含有す
るか又は専らそのようなサブユニットより成るペプチド
及び例えば特許請求の範囲第８項によりＸがＱＨである
か又は記載の他のものを表わすプレー８　（１）−タン
パク’Ｊｔ（７’レー５（１）−アミノ酸配列を含有す
るタンパク質）から分解により生成するペプチドも同様
にＢ型肝炎に対して免疫原性であり、それ数本発明に含
まれる。専らプレー５（１）−アミノ酸配列のサブユニ
ットであるペプチドは、例えば次のようなオリゴペプチ
ドである： Ｈ−ＰｈｅＰｒｏｉｓｐＨ：ＬｓＧｌｎＬｅｕＡａｐＰ
ｒｏＡｌａ−ＱＨ；　　Ｈ−ＡｓｎＡｓｎＰｒｏＡａｐ
ＴｒｐＡｓｐＰｈｅＡｓｎＰｒｏ−ＱＨ；　Ｈ−Ｔｈｒ
ＡｓｎＡｒｇＧｌｎＳｅｒＧ’ｌｙＡｒｇＰｒｏＴｈｒ
−ＯＨ；　１１−ＡｌａＡｓｎＡｒｇＧ１ｎＳｅｒＧ４
７ＡｒｇＰｒＯＴｈｒ−ＯＨ：　　Ｈ−ＰｒｏＰｒｏＰ
ｒｏＡｌａＳｅｒＴｈｒＡｓｎＡｒｇＧ’ｌｎＳｅｒｌ
ｌｙＡｒｇＧｌｎＰｒｏＴｈｒＰｒｏ−ＯＨ又はＨ−Ｐ
ｒ。

ＰｒｏＰｒｏＡｌａＳｅｒＡｌａＡａｎＡｒｇＧｌｎＳ
ｅｒＧｌｙＡｒｇＧｌｎＰｒｏＴｈｒＰｒｏ−ＯＨ。

該当するプレー５（１）−アミノ酸配列のサブユニット
は少なくともアミノ酸６個より成っていなげればならな
い。前記のアミノ酸配列を含有するより大きなペプチド
も同様にＢ型肝炎に対して免疫原性である。

ＢＷ肝炎ビールｘ（ＨＢＶ）１ｍ３９０００Ｊ”＃トン
の見掛は分子量ｔ−有する光面タンパク質（Ｐ３９）及
び４２０００ダルトンの糖タンパク質（ＧＰ４２）を含
有する。ＧＰ４２及びＰ６９は同一のタンパク質配列を
有するか、付加的に（）Ｐ４２はＮ−グリコシド結合の
炭水化物餉＠を含有する。Ｐ　３９／Ｇ　Ｐ　４２は公
知のビールス性衣面タンパク質ＧＰ３３でコターミナル
で））る。（ｃｏ−ｔｅｒｍｉ−ｎａｌ　）　（シュテ
イツペ及ヒ’ｆ　ルＩＪ　ｙ　ヒ（ＳＴｌ１ｇ　＆　Ｇ
ｍＲＩＪＣＨ）共著、６ヴアイｏｏジー（ＶｉｒＯｌ、
　）　”、１２３巻、４６６〜４４２頁（１９８２年）
及び１Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　”　、４６巻、６２６〜６２８貞（１９
８３年）〕。コターミナルとは、ＧＰ６６の全アミノ酸
配列がＰ３９／ＧＰ４２のカルボキシ末端部に含まれて
いること金表わす。付加的に、Ｐ３９／Ｇ　Ｐ　４２は
アミノ末端部で、本発明によりプレー５（１）−配列（
７″レー５（１）−アミノ酸１１列）として表わされる
１０８又は１１９アミノ酸配列を含有する。相応するプ
レー５（１）−ボリペゾチドの構造は種々のＢ型肝炎ビ
ールス単離体の公知ＤＮＡ配列から生じる。Ｂ型肝炎ビ
ールス亜型、の間ではまさにプレー５（１）−配列中で
多軟のアミノ能交換が存在する。プレー５（１）−配列
全大型狭面タンパク質Ｐ３９／ＧＰ４２のアミノ末端１
析片として規定する遺伝ば９基本構造はＢ型肝灸ビール
スの丁べての公知単離体で同一である。種々の表面蛋白
質は丁べて、第１の開始コドンで開始しかつ終止コドン
で停止する塩基トリプレット（コドン）の連転１・的配
列により暗号付けされる。開始コドンは、タンパク質の
生合成の開始に必要でおり、同時にアミノ酸のメチオニ
ンをタンパク質のアミノ末端として暗号付はするトリブ
レンドＡＴＧより成る。

タンパク質の生合成は終止コドンＴＡＡ　、　ＴＧＡ　
。

ＴＡＧで停止する。一般に、タンパク質の生合成は暗号
付はする配列の第ｉ　ＡＴＧコドンにより開始する。こ
れはＢ型肝炎ビールスのＰ３９／ＧＰ４２にも該当し、
それ故６８９又は４００１的のアミノ酸のタンパク質が
生じる。

Ｂ型肝炎ビールスの特殊性として後から２つの開始コド
ンも感染細胞のタンパク質生合成の任意の開始点として
使われる。第１開始コドンの後にトリプレット１０８又
は１１９個（亜型による）が位置するＡＴＧ　）リグレ
ットはＧＰ３３／３６のアミノ末端として機能する。第
２と第１の開始コドンとの間の配列はプレーＳ（１）一
白Ｌ列として定義される。文にトリプレット５５個の後
で第６開始コドンが存在し、これはＢｆｒ肝灸ビールス
表面主要タンパク質Ｐ２４／ＧＰ２７（遺伝子Ｓとして
も弄わされる）のアミノ禾端を規定丁る。第２と第６の
一始コドンの間の５５コドンの配列はプレーＳ（２）一
配列と定義される。環状Ｂ型肝炎ＤＮＡ中のプレーＳ（
１）一及びプレーＳ（２）−ヌクレオチド配列の状態及
びプレーＳ（１）−ヌクレオチド配列の切断部位は第１
図に図示した。ＫｃＯＲ　ｌ切断部位を通常のように開
始点として、即ちＯで堀わ丁。

プレーＳ（１）一配列は１０８又は１１９アミノ酸のア
ミノ酸配列並びにこれらのアミノ酸配列の暗号付けに関
与する相応するＢ型肝炎ビールスＤＮＡのヌクレオチド
配列ヲ表わ丁。グレー８（１）−ヌクレオチド配列は１
０８又は１１９コドンの述続であり、ごれはＨＢｅＡｇ
ヲ暗号付けする開放解読わくの終止コドンの前最高４０
０又は３８９コドンで開始し、かつ同一の開放解読わく
の終止コドンの前２８１コドンで終胎丁る。このダレー
Ｓ（１）−ヌクレオチド配列は対応するプレーＳ（１）
−アミノ醒配列を暗号付けする。プレーＳ（２）−ヌク
レオチド配列は５５コドンより成りかつプレーＳ（１）
−ヌクレオチド配列に面接接続している。プレーＳ（２
〕−ヌクレオチド配列はＨＢａＡｇの開放解読わくの終
止コドンの前に２８１コドンが存在丁る開始コドン（コ
ドンＡＴＧはメチオニン全暗号付けする）で開始しかつ
同じ解読わくの文に５５コドンの後で終結する。例えは
、対応するプレ−８（２）−アミノ酸配列は次のもので
ある： ＭｅｔＧｌｎＴｒｐＡｓｎＳｅｒＴｈｒＡｌａＰｈｅＨ
ｉｓＧ１．ｎＡｌａＬｅｕＧｌｎＡｓｐＰｒｏＡｒｇＶ
ａＩＡｒｇＧｌｙＬｅｕＴｙｒＰｈｅＰｒｏＡ１ａＧｌ
ｙＧｌｙ８ｅｒＳｅｒ８ｅｒＧ１ｙＴｈｒＶａｌＡｓｎ
ＰｒｏＡ１ａＰｒｏＡａｎ工１ｅＡｌａｓｅｒＨｉｓ工
１ｅＳｅｒｖｅｒ工１ｅＳｅｒＡｌａＡｒｇＴｈｒＧｌ
ｙＡａｐＰｒｏＶａｌＴｈｒＡｓｎ　．ＨＢｓＡｇ　ｆ
ｃ暗号付けする開放解読わく（％計請求の範囲第１項参
照）とはＢ型肝炎ビールスＤＮＡの一部であり、これは
例えば”ヴイラール・ヘパチｆ，Ｘ．　（　Ｖｉｒａｌ
　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　）　１９　８ｉ”〔国焉シンポ
ジウム、フランクリン・インヌチチュート●プレｙ．　
（　Ｆｒａｎｋｌｉｎ工ｎ８ｔｉｔｕｔ８Ｐｒｅｓｓ　
）、フィラデルフィア１９８２：１８２頁に皐げられて
おりかつ２つの領域″領域プレＳ（　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｐ
ｒｅ　Ｓ　）　”と″′遺伝子Ｂ　（　Ｇｅｎ　Ｂ　）
　”とよＦ）＃：る。この領域グレＳは本発明によるプ
レーＳ（１）一配列とそれに接続しているグレーＳ（２
）一配列より成り、遺伝子Ｓ（タンパク質Ｐ２４／ＰＧ
２７の遺伝子）はプレー８　（２）　−自己夕１１に＠
接接絖している〔６ヴイラール・ヘパチチス、ラボラッ
トリー・エンド・クリニカル・サイエ７　ス（　Ｖｉｒ
ａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙａ
ｎａ　（：：ｌｉｎｉｃａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　）″
、７１貞、Ｆ．及びＪ．　）Ｊゝインハルト●エディタ
ーズ●マーセル●デンカ−（　Ｆ，　ｕｎｄ　Ｊ，　Ｄ
ｅｉｎｈａｒａｔ　ＥｄｉｔｏｒｓＭａｒｃｅｌ　Ｄｅ
ｋｋｅｒ　）、ニューヨーク、バーゼル在（１９８３年
）参照〕。それ故、プレーＳ（１）ーアミノ酸配列に、
ＨＢｓＡｇ　＠暗号付け丁る＃読わくの第１開始コドン
で開始しかつ終止コドンの２８１コドン前で停止するＢ
型肝炎ビールスＤＮＡの１０８又は１１９コドンの連続
である。

本発明の範囲においてＢ型肝炎表面抗原（　ＨＢｓＡｇ
　）とは次のことを表わす：　ＨＢｅＡｇは、主にタン
パク質Ｐ２４もしくはＧＰ２７より成る’ｌ　Ｑ　ｎｍ
のＢ型肝炎表面粒子の抗原である。

これらの蛋白＊Ｐ２４もしくはＧＰ２７は例えはビータ
ーンン及びその他（　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）
共著、′プロシーゾングズ・オブ・ヂ・ナショナル・ア
カデミイ・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ，Ａ
ｃａｄ，Ｓｃｉ　　）　　″、　７　４巻、　１５３０
〜ろ４頁（１　９７７年）、米国に記載されている。例
えは、タンパク質Ｐ２４は既に引用した１ウ゛イ２−ル
・ヘパチチス・ラボラトリ・エンド・クリニカル・サイ
エンス”の７１貞第４図によりヌクレオチド１６１〜８
４１により■己載される。

このＨＢｓＡｇ　ｔ−暗号付けしている開放解読わくに
第１図によりヌクレオチド２８５９で開始丁る。

プレーＳ（１）−アミノ酸配列もしくはこれを含有丁る
ペプテドは、特異ｆｌＦｉにモノクロナール抗体ＭＡ１
８／７と反応しかつこれと結合丁ることにより特徴付け
られる。

主に、プレー８（１）−アミノ酸配列より成る本発明に
よるポリペプチドはこのプレー５（１）−配列と共に天
然アミノ酸更に１２個まで全含有していてよく、その際
にこの付加的なアミノ酸１〜１２個は殊にプレー５（１
）−アミノ酸配列のカルボキシ末端に存在する。特に、
Ｘが特許趙求の範囲第８項に挙げられているものヲ尭わ
丁アミノ酸もしくはアミノ酸配列が該当する。

例えば、本発明によるプレー５（１）−アミノ酸配列を
含有するより大きなポリペプチドはそのカルボキシ末端
に更に天然アミノ酸１２〜１０００個及びそのアミノ末
端に更に１〜１０００個、殊に１〜５００個、特に１〜
２５０個を包含していてよい。特に、そのような大型ポ
リペプチドはカルボキシ末端にプレー５（２）−アミノ
酸配列全部を包含するか又はこのプレー８　（２）　−
アミノ酸配列と、プレー５（２）部分に連結している遺
伝子Ｓから由来するペプナド部分と七包含してよい。

プレー５（１）−ポリペプチドを合成するためのＤＮＡ
フラグメントは、例えば次の制限酵素によるＢ型肝炎ビ
ールスＤＮＡの切断により生成する： プレー５（１）−配列の前の切断としてＢｓｔ　Ｆｌｉ
■及び次にエキソヌクレアーゼ、例えはＢａ１３１（す
べての亜ｆｆ１）、ＡｌｕＩ（亜ｍａａ）又はＢｇｌ　
ｉｔ　（亜ｍａｙ）もしくはそのアイソシゾマ−（工ｓ
ｏｅｃｈｉｚｏｍｅｒ　）で処理。鉤に１プＬ／−８（
１）−配列はこの切断後に初めにアミノ酸のメチオニン
が存在する部位で開始し、つまり例えばＢ型肝炎ＤＮＡ
中で酵素Ｂｓｔ　ｍ　１１−）−Ｂａ１５１による切断
部位後の最初のメチオニンコドン（ＡＴＧ　）により標
識付けられている。プレー８（１）−配列内の付加的な
ＡＴＧ　）　ＩＪプレットは亜型毎に保持されているの
ではなくかつ開始コドンとしての機能七有しておらず、
単にプレー５（１）−配列のメチオニンを暗号付はする
だけである。例えば、第２の切断はプレー８（１）−配
列後の切断としてＦｌ：ｃｏＲＩで行ない、従って例え
はプレー５（１）−配列の末端はこの恥ｏＲ）切断の前
の最初のアミノ酸アラニンのコドンが存在する部位であ
る。プレー５（１）−配列の後及び遺伝子Ｓの前の切断
として亜型に応じて更に多数の他の酵素が、例えばｘｈ
ｏ　１　（亜型ａｙ）、ＢａｍＨｌ（亜型ａａｖ、　）
のようなものが好適である。

アミノ酸配列プレー８　（１）　−Ｘを有するポリペプ
チドでは又は特に次のものを我わ丁：１、　　Ｅｉｃｏ
ＲＩ切断部位までのプレー８　（２）　−配列の残基と
してＭｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ又はＭｅｔ−Ｈｌｓ−Ｔｒ
ｐ ２、　　Ｍｅｔ−Ｇｌｎ＋Ｔｒｐ−Ｙ又は１４ｅｔ−Ｈ
ｌｓ−Ｔｒｐ−Ｙ　。

その際にＹは本発明にとって本質的な部分ではなく、終
止コドンがＤＮＡ配列中で出現するまでベクターにより
偶然に暗号付けされる天然アミノ酸１〜５０個、殊に１
〜６０個、特に１〜１２個である。例えばＹはＬｅｕＰ
ｒＯＡｒｇＡ１ｆＬＰｈ１３Ａｒｇ−□ｍ ６、例えばプレー５（１）−配列がプラスミドｐＧＬ　
１０１　（もしくはｐＢＲ３２２）のｐｖｕ　１１　Ｗ
Ｊ位に挿入される際に、又は更に例えば次のものを表わ
す： Ｃ７ＥＩＬｅｕＡｌａＡｒｇＰｈｅＧｌｙＡ１３ｐＡｓ
ｐＧ１ｙＧ１ｕＡｓｎＬｅｕ−ＯＨ。

（１２”　　　）　ＡｌａＳｅｒＡｒｇＶａ１８ｅｒＶ
ａ１ＭｅｔＴｈｒＶａｌＬｙｓＴｈｒＳｅｒＡｓｐＴｈ
ｒＣｙｓ８ｅｒＳｅｒＡｒｇＡｒｇＡｒｇＳｅｒＬ６ｕ
ＩａｅｕＶ＆１Ｃ７８Ｌ７Ｂ　ＡｒｇＭｅ　ｔＰｒｏＧ
１７Ａｘａ　ＡｒｇＬｙａ　ＰｒｏＶａＩＡｒｇＡｌａ
ＡｒｇＧｌｎＡｒｇＶａｌＬｅｕＡ１ａＧｌｙＶａ’１
ＧｌｙＡｌａＧｌｎＰｒ。

−ＯＨ１ ４、Ｉｉ：ｃｏＲＩＯ代りＫ　ＨＢＶ　−ＤＮＡ　ｉ、
）ｉＢｓＡｇ　（７）開放解読わくの終止コドン近く、
認識配列が位置する酵素で切断することもできる。得ら
れたポリペプチドは配列又としてプレー５（２）−配列
の大きい方の部分又は全プレー５（２）及び遺伝千日の
アミン末端部を包含する。例としては亜ｍ　ａａＷａに
関してにＢａｍＨｌによる断片が挙げられ、亜型ａｙ　
Ｖｃ関してはｘｈＯＩが挙げられ、その際に衣現される
タンパク質はプレー８　（１）　−配列以外にプレー日
（２）配列のより大きなアミン末端部も包含する。例え
はＸｂａ　ｌによる切断は、全プレー８（２）−配列と
遺伝子Ｓのアミン末端領域全包含するタンパク質を誘導
するであろう。

更に、全く一般的には、例えは主にプレー５（１）−ア
ミノ酸配列より成るポリペプチドより高い分子歓のタン
パク質も、それが任意の部位にプレー５（１）−配列又
はこの配列のフラグメントが組込まれて包含する場合に
は免疫涼的にＢ型肝炎に対して作用する。

例えは、プレー８（１）−配列又はそのフラグメントヲ
有するこのような高分子タンパク質の製造は次の方法に
より行なうことができる：プレー８（１）−ヌクレオチ
ド配列は任意の他の遺伝子とフェイズ（Ｐｈａｓｅ　）
中のＤＮＡ連結により連結することができるので、タン
パク質合成が連続的にプレー５（１）−配列から他の遺
伝子に移行する。例えば、第２の遺伝子は公知の細菌ｇ
：酵素、例えはβ−ガラクトシダーゼ又は接種物質とし
て重要であるタンパク質、例えばジフテリア−又は破傷
風毒素を暗号付けすることができる。その融合生成物は
その大きさ故に一般に免疫ｊ性でありかつ部分的に細菌
性の由来故に細歯細胞中で場合により安定である。プレ
ー５（１）−配列を細菌性構造遺伝子内に挿入すること
もできる。β−ガラクトシダーゼフラグメント金暗号＋
ｉけする配列中に制限切断部位を含有するｐｔＴＲ型又
はｐＵＣ型のベクタープラスミド金使用することができ
る〔ｒン（Ｇｅｎｅ）″、１９巻、２５９頁（１９８２
））。

これらのプラスミド又は類似のプラスミド中にＨＢＶ　
−ＤＮＡの各７ラグメント、鉤にプレー５（１）−配列
の主要部ヲ府するそのようなものも移入するごとができ
る。ＨＢＶ　−ＤＮＡ　７ラグメントに好適な処理、例
えばＢａｄ　３１による短縮又は酵素ターミナルヌクレ
オチドトランスフェラーゼによる数個の塩基の伸長によ
り組み換えＤＮＡ　においてわくの正しい構造が達成さ
れる場合に、そのようなりＮＡを有するクローンはグレ
ー８（１）配列部分ｔ−有する融合タンパク質全表現す
ることができる。この除、ＨＢＶ−ＤＮＡフラグメント
がなおプレー５（１）−配列の開始コドンを含有してい
る必要はない。挿入したＨＢＶ　−ＤＮＡフラグメント
は非常に大きな領域、例えはプレー５（２）領域及び遺
伝子Ｓの部分又はプレー８（１）領域の小型の断片も包
含する。殊に、この目的のために例えば僅か２７ヌクレ
オチドを弔する非常に小型の断片は化学的なヌクレオチ
ド合成により製造することができる。より大きな安定性
及びより容易な単離のために七のような小型の遺伝子フ
ラグメントをより大型の遺伝子と融合する。

次の表１、表２、表６及び表４には、主袂な狙り部領域
を含めて種々の亜型（例えば亜型ａｙｗ。

ａ（ｉＷ２　、ａｄｒ　）の種々のＢｇ肝炎ビー＃スＤ
ＮＡ単端体のプレーＢ（１）−ヌクレオチド配列並びに
このプレー日（１）−ヌクレオチド配列に相応するプレ
ー５（１）−アミノ酸配列が例示されている。六１及び
光２はＢ型肝炎ＤＮ入の亜型５ＬａＷ　２の２つの異な
る単離体、表６は亜型ａｉｒ及び表４は亜型ａｙｖ　Ｋ
関する。この際に、ＫｃｏＲＩ制限切断部位ｆ　ＤＮＡ
配列のゼロ点とした。表１のプレー８（１）−アミノ酸
配列は式１（ｘ＝ｏｕ）のペプチドに相当する。表２の
プレーＳ　（１）　−アミノ酸配列は…式のペプチドに
相当し、鉄６のシレー５（１）−アミノ酸配列は用穴の
ペプチドに相当しかつ表４のプレー８（１）−アミノば
配列は１１式のペプチドに相当する（ＸはそれぞれＯＨ
）。

それ故、本発明はＢ型肝炎ビールスのＤＮＡから切断す
ることができる核酸７ラグメントにも関し、これは分子
量３９０００ダルトンのタンパク質のアミノ酸の最初の
１１９ないしは１０８個を暗号付けする遺伝子の一部を
含有する。例えば、このタンパク質は例Ｉにより得られ
る。

それ故、この点で本発明はヌクレオチド約３２４〜３５
７を有する核酸フラグメントに関し、特にこのフラグメ
ントは、免疫原性ペプチド配列を暗号付げし、そのペプ
チド配列は生体内で、Ｂ型肝炎ビールスに対して活性で
ある抗体の生成を誘導し、その際このペプチド配列は基
本的に前記の表１〜４に記載した構造を有するか又は等
価の免疫原性を有する任意のペプチド配列である。

本発明は、遺伝的接合の際に、プレー５（１）−遺伝子
の解読わくが保持されていることな条件として、微生物
又は真核細胞中で前記のヌクレオチド配列を表現するた
めのベクターにも関する。

本発明により使用されるヌクレオチド配列はその比にお
いて、その表現の際にＢ型肝炎ビールスの亜型に応じて
（亜型ａ（ＬＷ２　、　ａｄｒ　、　ａｙｗ及び他の変
異体）変動する決定群の発生をもたらす変動可能性を有
する。

表１〜４によるペプチド配列では前記の配列の最初のア
ミノ酸ｔｊ　Ｎ−末端でメチオニンでありかつ反対のＣ
−末端でアラニンである。

それ故特に、本発明は例えば特許請求の範囲第６項に記
載されているようなペプチド配列又は等価の免疫原性を
備えている類縁ペプチド配列を暗号付けする表１〜４に
示されているヌクレオチド配列にも関する。

前記の用語１等価のペプチド配列”とは、一定の部分が
表１〜４に記載のペプチド配列の相応する部分と精確に
は一致していないペプチド配列であり、その際に変異は
タンパク質の一般的な免疫原性に作用しない局所的な突
然変異又は該当する′ｓ１類のタンパク質！表現するこ
とのできる種々の抗原型をもたらす構造の一時変異に帰
因し得る。

特に、本発明はプレー５（１）−アミノ酸配列のサブユ
ニットである次のペプチド配列にも関する： ペプチドＡ　：　ＰｈｅＰｒｏａｓｐＨｌａ（）ｌｎＬ
ａｕＡｓｐＰｒｏＡｌａペゾチドＢ：人ａｎＡａｎＰｒ
ｏＡａｐＴｒｐＡａｐＰｈｅＡｓｎＰｒ。

ペプチドＯａ　　：　ＴｈｒＡａｎＡｒｇＧ１ｎＳｅｒ
Ｇ１ｙＡｒｇＰｒｏＴｈｒペプチドＣｂ：ム１ａＡａｎ
ＡｒｇＧＸｎｌｉｅｒＧ４ｙＡｒｇＰｒＯＴｈｒ前記の
ペプチドにおいて左側の最初のアミノ酸がアミノ末端で
あり（例えばペプチドＡではＰｈｅ）かつ右側の最後の
アミノ酸がカルボキシ末端であり（例えばペプチドＡで
にＡｌａ　）　、このことは本明細書に挙げられている
他のペプチドもしくはペプチドフラグメントにも該当す
る。

プｖ’−５ｃ１）−アミノ酸配列からの小型ペプチドフ
ラグメントの製造は常用の合成ペプチドの製法により行
なうことができる。例えば、ペプチドａＣもしくはＣｄ
は特許請求の範囲第１６項記載の方法によりカルボキシ
末端アミノ酸から出発して製造することができる。

本発明は、本発明にょるボ１ノペゾチド（例えば特許請
求の範囲第８項による）並びにそのようなポリペプチド
の前記のサブユニット（例えば特許請求の範囲第７項記
載のオリゴペプチドもしくは特許請求の範囲第８項記載
のポリペプチドの７２グメント）ｙａ／特にポリペプチ
ド型又はタンパク置型のより大型のキャリア分子に連結
することにより生成する生成物、更にそのようなペプチ
ドを結合生成物の形で、特に製薬的に認容な賦形剤と一
緒に含有する製剤、羞びに特にＢ型肝炎に対する接種物
質にも関する。製薬的賦形剤は、特に経口的、腸管外、
直腸に又は特に鼻の粘膜に噴錫することにより行なうこ
とのできる選択した投与法に通常のように適合させる。

例えば、特許請求の範囲第７項又は第８項によるポリペ
プチド並びにこれらのポリペプチドの７ラグメントは常
用のペプチド合成法により製造することもできる。

更に、本発明は例えば特許請求の範囲第８項によるポ１
）ペプチドのフラグメントな製造するために暗号付げす
るＤＮＡ配列に関する。

ペプチドＩに関しては、特に式：　ＴＴＴ　ＱＣ（３Ｇ
ＡＴＯＡＴ　ＯＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＯＣＯＴのポリヌク
レオチド配列が該当する； ペプチド■に関しては、特に式：　ＡＡＯＡＡＴ○１ｍ
！Ａ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＧＡＯＴＴＯＡＡＯＱＣ！Ｏの
ポリヌクレオチド配列が該当する； ペプチドｌｃ及びＩｄＫ関しては式：　ＱＣ！Ｔ００Ｔ
　ＣＯＴ　Ｇｏｏ　ＴＣＩＣＧ　（又はＡ　）　Ｃｏ　
ＡＡ’ｒ　ＯＧＧ　０ＡＣ）ＴＯＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　
ＯＡＧ　ＯＯＴ　ＡＯＴ　０００のポリヌクレオチド配
列又はトリプレット少なくとも６個の断片が該当する； もしくはこれらの場合のそれぞれにおいて、その都度の
前記の６つのポリヌクレオチドに対して相補性のポリヌ
クレオチド又は各トリプレットが同じアミノ酸を暗号付
げすることのできる類似の任意のトリプレットに代えら
れていてよい任意のポリヌクレオチドが該当する。

更に、本発明の核酸は、第１図による相応するＤＮＡ配
列の相互に相補性の２本鎖の１本だけを含有していても
よい。

もちろん本発明は等価の１本鎖又は２本鎖のプレー５（
１）−ヌクレオチド配列、とりわけ暗号付げする鎖、相
応する２本鎖ＤＮＡ又は相応するメッセンジャーＲＮＡ
、特にヌクレオチドの相応する相補性鎖により再現され
るものにも関する。

前記のヌクレオチドと一定のトリプレット又は短いトリ
プレット配列により異なっているプレー５（１）−ヌク
レオチー鎖も本発明に含まれるが、但しこれらのヌクレ
オチド配列は例えば特許請求の範囲第８項のプレー５（
１）−ポリペプチドの免疫原性を保持するポリペプチド
を暗号付げする能力を有している。一般に、場合により
１本鎖の相応する核酸を生成するために２本鎖のＤＮＡ
を変性した後で、′その長さの少なくとも約９０％に相
応する相補性ＤＮＡ鎖とノーイブリダイゼーションする
能力を保持するプレー５（１）−ヌクレオチド鎖が該当
する。

本発明によるプレーｓ　（１）　−ＤＮＡは細菌及び真
核細胞（例えば酵母細胞）中で、特にビールス性Ｂ型肝
炎のビールスに対して活性である抗体の製造を生宿主微
生物中で誘導する状態のタンパク質又はペプチドの製造
に関してその表現を可能にするベクター中に組み込まれ
る。本発明によるヌクレオチド配列の翻訳から得られる
タンパク質又はペプチドは接種物質として又は診断の助
剤として使用することができる。

本発明の他の特徴は、本発明によるプレーＳ（ｉ　）　
−ＤＮＡフラグメント並びにプレー８（１）−ペプチド
の製造、同定及び取得に関する説明から明らかとなる。

特に、本発明＆工、前記のプレー５（１）−ヌクレオチ
ド配列の発現を可能にする、特に雑種タンパク質の形の
ベクターにも関し、雑種タンパク質において本発明によ
るポリペプチド又はそのフラグメントの免疫学的性質を
有するタンパク質フラグメントがキャリア分子に結合し
ており、その際にそれ全体に免疫原性又は免疫反応性が
付与されており、その性質によりこのタンパク質が予め
注入された宿主微生物中でビールス性感染に対して保護
作用をする抗体の製造を誘導する能力を有する。

特に、本発明はベクタープラスミド１）ＤＲ５４０〔製
造元ファーマシアＰＬバイオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉａａｌｇ　）　〕に関
する。

このベクターは基本的な構造的特徴としてｔａｃ−プロ
そ一ターを含有し〔＠デン（Ｇｅｎｅ　）”、２０巻、
２３１頁（１９８２）］、このプロモーターはタンパク
質合成を開始するための高度に有効なシグナル配列であ
る。ｔａｃ−プロモーターの後部にＩ）ＤＲ５４０ｔｔ
　Ｂａｍ　Ｈ工切断部位を含有する。本発明の目的のた
めにその切断部分の１本鎖末端を１本鎖に特異的なヌク
レアーゼで除去した。そのような一時変具プラスミドｔ
ＤＮＡフラグメント、例えばプレー５（１）−フラグメ
ントと混合し、かつ酵素ＤＮＡ　ＩＪガーゼを添加する
と、組み換えＤＮＡが生成し、これは挿入したＤＮＡフ
ラグメントからの開始コドンがｔａｃ−プロモーターの
近くに存在する場合に常にタンパク質の製造をもたらす
ことができる。

方法ａ）： ヌクレオチド配列ＧＡＡＴＴＯ’に切断する制限ヌクレ
アーゼとしてはｌ１ｉｃｏ　Ｒ工が該当する。

この酵素による処理は水性媒体中温度６４〜４０°Ｃ１
殊に３６〜３８℃、−値７．０〜８．０、殊に７．４〜
７．６、時間１５分間〜１６時間、殊に１〜２時間行な
う。必要なβ値調節は例えば１　０　０　ｍＭ　　ト　
　リ　　ス　−　　ＨＣＪ、　　　　５　　０　　ｍＭ
　　ＮａＣＪｌ、　　　　１　　０　　ｍＭＭｇｃｊ２
のような緩衝剤により行なう。

例えば、酵素反応の終結は２５０鮨ナトリウム−ＩＤＴ
Ａを添加して最終濃度２５ｍＭにするＯ例えば、この酵
素の失活化は５〜３０分間、殊に１０〜１５分間６０〜
８０°Ｃ１殊に６４〜６６℃に加熱することに工り行な
う。

例えば、ヌクレオチド配列ＡＧＯＴを分離する制限ヌク
レアーゼとしてはＡ’ｌｕ工又はそのアイソシブマー、
例えばＯｘａ工が該当する。

Ａｌｕ　工による処理は水性媒体中で温度３５〜４０℃
、殊に３６〜３８°Ｃ％−値７．０〜８６口、殊に７．
５〜７．７、時間１５分間〜１６時間、殊に１〜２時間
行なう。

必要なβ値の調節は、例えば６ｍＭ　トＩＪスーａＣＺ
、５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣＪ、６ｍＭ　ＭｇＣｕ２．１０
鮨ジチオスレイトールのような緩衝剤により行なう。

例えば、酵素反応の終結はＮａ−ＫＤＴＡ　２５０　ｍ
Ｍを添加して最終濃度１ＱｍＭにすることに工り行なう
。

例えば、この酵素の失活化は５〜３０分間、殊に５〜１
０分間６０〜８０℃、殊に６４〜６６℃に加熱すること
により行なう。

例えばヌクレオチド配列ＡＧＡＴ　ＯＴを分離する制限
エンドヌクレアーゼとしてはＢＧＩＩＩが該当する。

この酵素による処理は水性媒体中で温度３４〜４０℃、
殊に３６〜６８℃、−値９．０〜１０．０、殊に９．４
〜９．６で、１５分間〜１６時間、殊に１〜２時間行な
う。

例えば、必要なβ値の調節ｔ２２０　ｍＭグリシ：／−
ＮａＯＨ５１０ｍＭＭｇＣｊ２．７ｍＭデβ−メルカプ
トエタノールのような緩衝剤により行なう。

例えば、酵素反応の終結は２５０　ｍＭ　Ｎａ−ＩＤＴ
Ａを添加して最終濃度２０ｍＭにして行なう。

例えば、この酵素の失活化は５〜３０分間、殊に５〜１
０分間６０〜８０℃、殊に６４〜６６℃に加熱すること
により行なう。

ヌクレオチド配列ＧＧＴＮＡＣＣ（Ｎは任意のヌクレオ
チドＡ％　Ｇ、Ｔ又はＣであってよい）を分離する制限
ヌクレアーゼとしては、例えばＢｓｔＩ！ｉＩＩ又はそ
のアイソシゾマーＡβｐＡ工、ＢｓｔＰ工、ｌｃａ工が
該当する。

Ｂｓｔ　Ｉｌｉ　１１による処理は、水性媒体中温度５
５〜６５℃、殊に５８〜６０°Ｃ１−値７．０〜８．０
、殊に７．５〜７．７で、１５分間〜１６時間、殊に１
〜２時間行なう。

例えば、必要なＰＩ（僅の調節は１００ｍＭトリス−Ｅ
（ＣＪ、５　Ｑ　ｍＭ　ＫＣＪ、５　ｍＭ　Ｍｌ？；Ｃ
Ｊ２のような緩衝剤により行なう。

制限酵素Ｉｎｃｏ　Ｒ工及びそのアイソシブマーはプレ
ー５（２）−配列の開始点の後方で、即ち分子量！＋３
０００もしくは３６０００ダルトンの公知の表面タンパ
ク質を暗号付けするＢ型肝炎ＤＮＡのヌクレオチドの開
始点の後方で切断する・前記の他の３種の制限酵素（Ｂ
ｓｔＦｆｌ［％Ａｌｕ工、ＢＧｌｌ［及びそれらのアイ
ソシブマー）はプレー５（１）−配列の開始点前で切断
する。

一方がＦｉｃｏ　Ｒ工及び他方がＢｓｔ　Ｅ［［、Ａｌ
ｕ工又はＢＧ’ｌ　Ｉｔの両方の酵素型によるＢ型肝炎
ＤＮＡの処理は同時に又は順次に行なうことができ、そ
の際に順序は任意である。例えば、初めにＢｅｔＥｌｌ
又はそのアイソシブマーもしくはＡｌｕ工又はＢＧＩ　
ＩＩで処理し、次いで酵素ＥｃｏＲ工で処理するか又は
逆であってもよい。

前記の制限酵素で切断する際に、露出している５′−遥
一鎖末端（５′−粘着末端）ン有するＤＮＡフラグメン
トが生成する（例えば特にＥｃ。

Ｒ工及びＢｓｔ　ＩＩＩ並びに相応するアイソシゾマー
を使用する際に該当する）場合は、この露出している末
端を単一鎖特異性ヌクレアーゼにより除く、即ち平滑末
端（’ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｓ　）に変換することが推奨
される。例えば、この変換のための皿−鎖末端ヌクレア
ーゼとしてはムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ
−Ｂｅａｎ−Ｎｕｃｌｅａｓｅ　）、ヌクレアーゼｐＨ
ヌクレアーゼＳ工、ノイロスポラ・クラッテ（Ｎｅｕｒ
ｏｓｐｏｒｅ　ｃｒａｓｓａ　）からのヌクレアーゼが
該当する。

（ｆｌＪ　、ｔば、ムングービーン・ヌクレアーゼによ
る処理は水性媒体中温度２０〜４５°Ｃ１殊に６６〜３
８°Ｏ，ｐＨ４〜５、殊に４．４〜４．５で５〜３０分
間、殊に５〜１５分間行なう。

例えば、必要なβ値の調節は６０　ｍＭ酢酸ナトリウム
−酢酸、Ｌ　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　Ｈ＆Ｃ１、２ｍＭ　ＺｎＣ
ｊ　。

１０チグリセリンのような緩衝剤により行なう。

例えば、酵素反応の終結は２５０　ｍＭ　Ｎａ４ＤＴＡ
を添加して最終濃度ｉＱｍＭにすることにより行なう、 例えば、これらの酵素の除去は、Ｔ、マニアチスどＭａ
ｎｉａｔｉｓ　）、ｍ、？、フリッチュ（Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ　）及びＪ、サンプルツク（Ｅ３ａｍ’ｂｒｏｏｋ　
）共著、′モレキュラー・クローニング、ア・ラボラト
リ−・マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ　（’ｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　）　”
、４５８頁〔コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリーズ（Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ’
ｂｏｒａｔｏｒ工θ８）、コールド争スプリング・ハー
バ−・ニューヨーク、米国在（１９８２年）〕に記載さ
れているようにフェノール及びクロロホルムで振出する
ことにより行なう。

露出している単一鎖末端の除去はＢａｌ　３１のような
２本鎖特異性エキソヌクレアーゼで処理することによっ
ても行なうことができ、その際に露出している単一鎖ば
かりでなく、全フラグメントをプレー５（１）−配列の
開始コドンが存在する末端で更に短か＜シ、それにより
プレー５（１）−配列の開始コドンと、可能な限り６〜
１２個の塩基対であるシャイン・デルガルノ配列（Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ−８ｅｑｕｅｎｚ　）との間
の有利な間隔が達成される。

この酵素による処理は水性媒体中、温度２０〜４０°Ｃ
１殊に２５〜６５°０１−値７．０〜８．０、殊に７．
５〜８．１で１〜６０分間、殊に１０〜２０分間で行な
う。

例えば、必要なｐ）（値の調節は２０　ｍＭ　）リス−
ＨＣｔ、１２　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｚ、ｊ　２ｍＭ　Ｏ＆Ｃ
Ｊ２．６Ｑ　ｍＭＮａＣｆ、１ｍＭ　］！！ＤＴＡのよ
うな緩衝剤により行なう。

例えば、酵素反応の終結は最終濃度３５ｍＭへの２５０
　ｍＭ　Ｎａ−ＦｉＤＴＡの添加により行なう。

この酵素の失活化は、例えば６０〜７５℃、殊に６０〜
７０℃に５〜３０分間、殊に５〜１０分間加熱すること
により行なう。

更に、場合により得られたＤＮＡフラグメント中で単−
鎖切れ目（Ｆｉｎｚｅｌｓｔｒａｎｇｌ’ｕｃｋｅｎ　
）を閉じる必要がある・。このために、付加的にかつ有
利にエキソヌクレアーゼで処理した後で相応するポリメ
ラーゼで処理する。例えば、そのようなポリメラーゼと
しては、フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）による大腸菌からの
ＤＮＡ−ポリメラーゼの大型フラグメント又は逆転写酵
素が該当する。

ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ−フラグメントによる処理は水
性媒体中、温度６〜２５℃、殊に１０〜１４℃、−値７
．０〜８．０、殊に７．３〜７．５で温度に応じて１０
分間〜１６時間、殊に４〜１６時間行なう。

例えば必要なβ値の調節は６．６　ｍｕ　）　ＩＪスー
ＨＣＪ、６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ
、１鮨ジチオスレイトールのような緩衝剤により行なう
。

例えば、好適なフラグメントはＨＢＶ−ＤＮＡをＢｓｔ
　Ｅｌ型の制限ヌクレアーゼで処理し、引続いてエキソ
ヌクレアーゼで処理しかつＥｃｏＲ工で切断することに
より得られる。Ｂｓｔ　Ｆｉｌｌにより誘導されたフラ
グメント末端を更にプレー５（１）−配列の方向に移行
させるために、Ｂａ１６１消化に対する選択的方法とし
てプレー５（１）−配列を有する約４０口の塩基対のＤ
ＮＡフラグメント又はそのような約４００塩基対のフラ
グメントとプラスミドのＤＮＡ　（例えばプラスミドｐ
ＧＬ　１０１　）とからの組み換えＤＮＡを再度制限酵
素Ａｌｕ工で処理することが推奨され、これによりプレ
ー８（１）−配列を有し、プレー５（１）−配列の開始
コドンとシャイン・デルガルノ配列との間の塩基対３〜
１２個の最適な間隔を有するＤＮＡフラグメントが得ら
れる。場合により、組み臭えプラスミドＤＮＡは形質転
換により宿主細胞（大腸菌）上で引続いて選択及びクロ
ーン化を伴って増殖し、その後そのＤＮＡから陽性クロ
ーンの溶菌後にプレー５（１）−配列を有するＤＮＡフ
ラグメントを酵Ｍ　Ａｌｕ　工で処理することにより再
び切断する。

例えば、プレー５（１）−配列を有するＤＮＡフラグメ
ントの単離は常法で行なうことができる：３゜５〜８．
０％、殊に４〜６％のポリアクリルアミドデル中又は０
．９〜２．０％、殊に１．２〜１．５チのアガロースゲ
ル中で、１モレキユラー・クローニング、アーラボラト
リー・マニュアル１．１５０〜１７８頁に記載されてい
るような緩衝剤及び条件を適用するゲル電気泳動。フラ
グメントを有利にエチジウムブ四ミーで着色しかつ長波
長σｖｍで照射することにより可視化しかつ公知の大き
さのフラグメントシリーズと比較することにより約３７
０〜３９０Ｌｙ″Ｊ塩基を有する所望のフラグメントを
同定しかつこのフラグメントな含有するゲル面を切断す
る。ＤＮＡを透析チューブ中の電気的溶離によりアガロ
ースから溶出しかつジエチルアミノエチル−セルロース
とのイオン交換により精製する。正確な方法は“ラボラ
トリ−Φマニュアル″（前記引用文献中）に記載されて
いる。ポリアクリルアミドデルからは所望のＤＮＡフラ
グメントな記載されているように緩衝剤中に拡散するこ
とにより溶離する。

プレー５（１）−配列により暗号付けされるポリペプチ
ドを取得するに当り、前記のようにして得られたプレー
５（１）−配列を有する相応するＤＮＡフラグメントを
ベクターのＤＮＡ　（例えばプラスミド又はビールスＤ
ＮＡ　）と絹み換える。このためのプラスミドとしては
例えば次のものが該当する：選択可能なマーカー遺伝子
、例えばアンｔシリン耐性の遺伝子と強力なプロモータ
ーを含有するプラスミド、特にプラスミドｐＧＬ　１０
１及びｐＤＲ５４０゜シラスミドｐＧＬ１０１は菌株Ｅ
・コリＪＭ　１０　ｉ　ｐＧＬ　ｉ　Ｏ１の形で薔託番
号ＤＳＭ　３０８１でドイツ微生物保存機関（：　Ｄｅ
ｕｔａｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉａ−ｍｅｎ　、グリーゼバツハシュトラーセ
（Ｇｒｉｅｓｅ−ｂａｃｈｓｔｒａβｅ）８、Ｄ−３４
００Ｐツチンゲン（Ｇｉ６ｔｔｉｎｇｅｎ　）　）に寄
託されている。プラスミド１）ＧＬｌ　０１　（”　、
ＬＶｉｒｏｌ、”、３７巻、６８３〜６９７頁（１９Ｂ
１年〕〕はシグナル配列としてｌａｃ　ｕｖ　５プロモ
ーターＺ含有しく　”Ｇｅｎｅ’、２０巻、２３１頁（
１９８２年）〕、これは犬腸菌の正常状態では調節タン
パク質、つまり１ａＣ−リプレッサーによりブロックさ
れている。

例えば、この１ａｃ−ＩＪプレツサーはイソプロピ”　
　ルチオがラクトン＜（工ＰＧＴ　）により所謂誘導物
質（工ｎｄｕｋｔｏｒ　）に対して作用しないように処
理されている。工（）ＰＴの添加により１ａＣ−プロモ
ーターは遊離しかつ高度にＲＮＡ−ボηメラ〜ゼに結合
し、これがプロモーターに従うＤＮＡ配列をｍＲＮＡ　
Ｋ転写する。ＤＮＡ配列により暗号付けされているタン
パク質はｍＲＮＡで表現され、即ちポリペプチド鎖に翻
訳する。プラスミドｐＧＩ、　１０１は１ａｃ−プロモ
ーターの直後に制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　Ｔｉの
切断部位を含み、この部位にプレー５（１）−配列が挿
入される。

Ｐｖｕ　ＩＩによる処理は水性媒体中、塩度６４〜４０
℃、殊に３６〜３８゛Ｃ及びｐＨ７，０〜８．４、殊に
７．５〜７．９で１５分間〜１６時間、殊に１〜２時間
行なう。反応緩衝剤としては、例えば６ｍＭ　）リス−
ＨＣｊ、６０　ｍＭ　Ｈａｃｋ、　６　ｍＭ　ＭｇＣｆ
２．７ｍＭβ−メルカプトエタノールを使う。

反応の停止は最終濃度１３ｍＭまでの２５０ｍＭＥＤＴ
Ａの添加により行なう。失活化げ６５〜８００ｃ、殊に
６５〜７０°Ｃに１０分間加熱することにより行なう。

シラスミＦ　ｐＤＲ５４０（ファーマシアＰＬバイオケ
ミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ　）　］はシグナル配列として：Ｌａａ　ｕ
ｖ　５プロモーターの代りに、ｔａｏ−プロモーターを
含有し、これは原則的に全く同様に作用するが、次のＤ
ＮＡ断片の約１０倍強力な転写を惹起する〔１プロシー
ジンゲス・オプ・デ・ナショナル・アカデミイ壷オプー
サイエンシズ（Ｐｒｏａ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
）’。

８０巻、２１頁、米国（１９８３年）〕。このプラスミ
ドはｔａｃ−プロモーターの直後にＢａｍ　Ｅ（工切断
部位を含み、この部位にプレー５（１）−配列が同様に
挿入された。

Ｂａｍ　Ｈ工による処理は水性媒体中、偏度３４〜４０
℃、殊に６６〜６８℃及びｐＨ７，０〜９．０、殊に７
．９〜８．１で１５分間〜１６時間、殊に１〜２時間行
なう。例えば、反応緩衝剤としては１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｊ、　１　００　ｍｕ　ＮａＣｊ、５　ｍＭＭｇＣＪ
ｚ　％　　１　ｍＭβ−メルカプトエタノールを使う。

Ｂａｍ　Ｅ（工は単一鎖末端を生成するので、これを前
記のようにムング・ビーン・ヌクレアーゼ又は類似する
作用を有する酢素で除去しなげればならない。

切断したプラスミドｐＧＬ　１０１又はｐＤＲ５４０と
デレーＳ　（ｉ　）　ＤＮＡ−フラグメントとの連結は
ＤＮＡ−リガーゼ、特にＴ　４−ＤＮＡリガーゼにエリ
アデノシン三リンＭ　（ＡＴＰ　）　０．５〜２　ｍＭ
。

殊に水性媒体中０．８〜１．２　ｍＭの存在において温
度０〜２０℃、殊に４〜５°Ｃ及びｐＨ７，０〜８．２
、殊に７．５〜７．７で行なう。反応緩衝剤としては、
例えば６６ｍＭトリス−ＨＣＪ−１５ｍＭＭｇ（Ｊ２．
５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　１　ｍＭ　ＡＴＰを使う。

このようにして得られた反応混合物中のプラスミ’ｒ’
　−ＤＮＡは例えばハナハン（Ｈａｎａｈａｎ　）の方
法〔１ジヤーナル自オプｅモレキユラー〇バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏｌ　）″、１６６巻、５５７〜５８
０頁（１９８３年〕〕により細菌の宿主細胞中に移入さ
せかつプラスミド−ＤＮＡを有する細胞を選択する。宿
主細胞としては、ａ菌、殊に制限能又は組み換え能を有
していない大腸菌菌株、例えばＥ、コリ菌株、ＴＭ　１
　口１が該当する。

この際、大腸菌とＬＢ培地（１％バクトドリプトン、１
％酵母エキス、ＨａＣＪ、　０．５％’Ｙ２０分間１２
０°Ｃでオートクレーブにかげる）中で６００ｎｍの光
学密度（０Ｄｅｏｏ　）　Ｏ−１〜Ｏ−１５まで培養し
、その後λｆｇＣＪ２を最終濃度２０ｍＭまで添加し、
更にＯＤ、。。０．５５〜０．６５まで培養する。その
後、培地を急速に０℃に冷却し、細胞を遠心分離にかげ
かつその細胞をノーナノ・ンにより記載されている形質
転換緩衝剤中に再懸濁させ、冷時て６〜４チジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理し、直ちに瞬間凍結させ
る。

更に６〜４％ＤＭＳＯの添加後、移入すべきＤＮＡ約１
〜４　ｔｔ９　／　ｍｌを供与し、再度冷時に恒温保持
しかつ瞬間凍結させる。このプロセスによりＤＮＡの細
胞中への受容が行なわれろ。最後に、細胞を溶かしかつ
１０倍容量のＬＢ培地中で０．５〜２時間６７°Ｃで培
養する。この混合物から、その０．１〜［］、２．７を
大きさ８ｃｔ’ａのベトリ皿中の半固体培地上に塗って
単一クローンを製造する。

この培地は、１．５％寒天が熱時に溶解されたＬＢ−培
地より成る（　ＬＢ−寒天）。機能性プラスミドＤＮＡ
を実際に受容したそのような細菌細胞だけを増殖させる
ために、ＤＢ培地に抗生物質アンピシリンを、有利に最
終濃度２０〜２００、殊に５０〜１５０μｇ／ｄで添加
する（　ＬＢＡ　−寒天）。組み換えプラスミドはアン
ピシリン抵抗性を規定する遺伝子を含有する。−晩３７
°Ｃで培養後、数十個乃至数百側の細菌のコロニーが寒
天層上に認められる。

受容されたプラスミドの少ない部分だけが所望のプレー
Ｅ＋　（１）　−ＤＮＡ−配列を有する組み換えプラス
ミドＤＮＡを含有する。それを確認するために、ＬＢＡ
−培地で湿潤した直径８０１２Ｂのニトロセルロース膜
をクローンを有する寒天平板上に置きかつこのように出
発平板のレプリカを製造する。ニトロセルロース膜を新
しい寒天平板上に置き、培養すると、鏡像のような配置
で出発平板のクローンが再び成長する。この膜　　・上
で公知方法によりクローンの細菌細胞を溶菌化しかつＤ
ＮＡ　Ｙその場でアルカリにより１本鎖に分離する。こ
の１本鎖は非可逆的に膜に結合する。この膜を公知の１
本領ＨＢＶ−ＤＮＡと恒温保持し、その際にこのＨＢＶ
−ＤＮＡは予め３２ｐ標識したヌクレオチド三リン酸で
所謂ニック翻訳（Ｎ１ｃｋ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　
）することによす放射性にした。プレー８　（１）　−
ＤＮＡを組み込んだクローンをこの試験では３２ｐ標識
したＨＢｖ−ＤｕＡｙその相応する塩基対と結合する。

膜の相応する位置がＸ線フィルムの黒色化により認めら
れた。

出発平板上の相応するクローンを同定することができか
つ増殖させることができる。このその場の（ｉｎ　８ｉ
ｔｕ　）ハイブリダイゼーション全体についてはＴ、−
ｒニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　、Ｋ、Ｆ。

フリッチ−Ｌ　（Ｆｒ１ｔａｃｈ　）、Ｊ、サンプルツ
ク（ＳａｍｂｒＯＯｋ　）共著、”モＶ’キ：ｓ−ラ＊
ｌローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）
　”、３１２〜３２８頁〔コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリニズ（００１（Ｌ　５ｐｒｉ、ｎｇ　
Ｈａｒ’ｂｏｒ　Ｌａ’ｂｏｒ−ａｔＯｒｉＱθ）〕に
詳説されている。

その場の−・イブリダイゼーションは挿入されたデレー
５（１）−配列の極性を認識することはできない。ｍＲ
ＮＡ　Ｆ’ｔ　５’から６′の方向でのみ合成され得る
のであつ、それ故組み換えプラスミドの半分だけ、正し
い極性な有するものだけがプレー５（１）−タンパク質
の合成に案内される。それ故、デレー５（１）−配列を
有する一連のクローン”ｊ　ＬＢＡ培地中でそれぞれ培
養しかつそこから公知方法によりプラスミド−ＤＮＡ（
Ｔ、マニアチス及びその他共著、′モレキュラー・クロ
ーニング、９２頁：前記引用文献）を単離しかつｐＧＬ
　１０１の場合には制限酵素Ｋａｏ　Ｒ工及びＳａｕ　
９６エによる切断で特徴付けられる。プレー５（１）−
配列はその開始点から約１００塩基離れてｓａｕ　９６
　工部位を含有し、ベクターｐＧＬ　１０１は挿入部位
の前約１００塩基にコｃｏ　Ｒ工部位を有する。従って
、正しい極性では２００塩基対フラグメントが生じる。

誤った極性ではプレー５（１）−フラグメントの最後の
３００塩基がｌａｃ　ｕｖ　５プロモーターと接合し、
それ故４００塩基対フラグメントが存在する。

プラスミドＰＤＲ５４０の場合、正しい極性のプレー５
（１）挿入は阻ｎｄ　Ｉ及びＢａｌ工による切断で確定
した。正しい極性は２６０塩基対フラグメントをもたら
し、誤った極性は３６０塩基対フラグメントに案内する
。７ラグメントの大きさは既に記載したように５％ポリ
アクリルアミドゲル中でデル電気泳動により確定した。

プレー５（１）配列を含有する組み換えプラスミドＤＮ
Ａを正しい極性で含有するクローンは原則的に、ＤＮＡ
の認識されない変化が起らない限り特許請求の範囲第８
項の１式プレー５（１）−タンパク質乞合成する。！式
中ＸはＭｅｔ　Ｇ４ｎＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ
Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇである。

２種のクローンｐＫＧ　１及びｐＫＧ　２ではプレー５
（１）−タンパク質の合成は明瞭に立証された。プラス
ミドｐＫＧ　’Ｉ、はプラスミドＩＰＧＬ　１０１とプ
レー５（１）−配列とより成り、ｐＫＧ２はベクターｐ
ＤＲ５４０から誘導される。両方のプラスミドは大腸菌
、ＴＭ　１０１中に存在しかつ寄託番号ＤＳＭ　３０７
９の菌株大腸菌ＪＭ　１０１ｐＫＧ　１として及び寄託
番号３０８０の菌株大腸菌ＩＮ　１０１　ｐＫＧ　２と
してドイツ微生物保存機関（ＤＳＭ　；グリースバッハ
シュトラーセ８、Ｄ−３４００）ｆツチｙ）ｆン在）に
寄託されている。

プレー５（１）−タンパク質の製造に当り、菌株の１種
を工ＰＧＴ　３．５〜２ｍＭ　、殊に１ｍＭ　Ｙ含むＤ
Ｂ培地中、３５〜３９℃、殊に６７℃で培養しかつ定常
的なフェイズの達成直後に遠心分離する。その後、詰込
まれた細胞ｔｍ茜の細胞壁を分解する酵素リゾチームで
及び例えばノニデット（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　）　Ｐ　４０
のような非イオン界面活性剤により処理する。この処理
は水性媒体中温度０〜４℃でリゾチーム１〜１０ｍ１？
／ｄ。

殊ニ４〜７５ｍ１ｉ＋／ｍ’ａ’用いてＰ）（７，２〜
７．６で５〜１５分間、殊に８〜１２分間行なう。例え
は、緩衝剤としてｉ　Ｑ　ｍＭ　）リス−Ｈ（Ｊ及び１
ｍＭ　’ＫＤＴＡを使う。その後、混合物を１２０００
〜ｉ　ｓｏｏ。

ｒ、ｐ、ｍ、で１０〜２０分間４℃で遠心分離する。

上澄みは可溶性大腸菌タンパク質と共にプレー５（１）
−タンパク質を含有する。

プレー５（１）−タンパク質馨免疫親和性りｏマドグラ
フィ（工ｍｍｕｎａｆｆｉｎｉｔｉｉｔｓ　ｃｈｒｏｍ
ａｔ。

ｇｒａｐｈｉｅ　）により富化しかつ、ｖ′ｉ！７製す
る。そのために、モノクロナール抗体ＭＡ　１８／７’
ｖ固体のキ′ヤリアに共有結合させる。例えば、キャリ
アとしては多孔性のビーズ状ガラス又はビーズ状アガロ
ースゲルが好適である。共有結合には市販されている両
方の材料の誘導体、例えば孔径１４０ｎｍのアミノプロ
ピルシラン塗布したビーズ状ガラス〔フル力（Ｆｌｕｋ
ａ　）社〕又はブロムシアン活性化セファロース４Ｂ〔
ファーマシアＰＬバイオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ−ＰＬ−Ｂｉｏｃ−ｈｅｍｉｃａｌｓ　）　］を使う
。塗布したビーズ状ガラスのアミノ基ｔグルタルジアル
デヒド水溶液で、つまり１〜２０％、殊に４〜８％のそ
の水溶液を用いて、０−６０℃、殊に２０〜２５℃及び
ｐＨ７〜１０、殊に８〜９で１０〜６０分間、殊に２０
〜４０分間活性化する。活性化したキャリア材料を低分
子アルカリ性緩衝剤で洗いかつ過剰量のＭＡ　”／７　
’ｅ加える。殊に、ＭＡ１８／７は腹水から１７チ硫酸
ナト“リウムで沈殿させることにより取得する。

沈殿した免疫グロブ１７７０．０１Ｍ炭酸ナトリウム中
にｐＨ９で再び溶かしかつ活性化したキャリア材料と２
〜２０時間、殊に４時間、０〜２０’Ｏ，殊に４〜８°
０で振盪する。その際に共有結合が惹起される。グルタ
ルジアルデヒド活性化キャリアの場合は、シック塩基考
造の生成結合を硼水素化ナトリウムで還元することによ
り安定化する。これは０．０５〜０．２％硼水素化ナト
リウムと１〜４時間０℃及びｐＨ９（±１）で攪拌する
ことにより行なう。その後、キャリアに固定した抗体Ｍ
Ａ　１８／７　Ｙ　ＰＢＳ緩衝剤、次に３Ｍチオシアン
酸ナトリウム（ＮａＥＩＣ！Ｎ　）溶液及び再び’Ｅ’
ＢＢ緩衝剤で洗う。

プレー８（１）−粗製エキス？このように製造した免疫
吸着剤−と反応させる。このために、免疫吸着剤をクロ
マトグラフィカラム中に詰込み、その後粗製エキスンこ
のカラムを通してゆっくりと流すか又は稀釈した粗製エ
キス（ＰＢＳ中で１：５〜１：２０に稀釈）に免疫吸着
剤を加えかつ振ｍ￥る。プレー５（１）−タンパク質の
結合はＯ〜４０’Ｃ，殊に１８〜２５℃で０．５〜２４
時間、殊に１〜４時間で行なう。大腸菌タンパク質Ｚ可
能な限り除去するために、引続いてＰＢＳ　、　　１．
５　Ｍ　ＮａＣｊ　溶液、殊に１Ｍ　ＮａＣＪ　。

再度ＰＢＳで十分に洗浄する。プレー５（１）−タンパ
ク質の分離は３　Ｍ　Ｎａ５ＯＮか又１ｚｐ）１１．８
〜２．２の酸性緩衝剤、例えば０．２Ｍクエン酸溶液で
行なう。このために、その免疫吸着剤Ｚクロマトグラフ
ィカラム中に装入しかつ解離緩衝剤ｔポンプで送りかつ
溶出液が分別により生じる。

フラクション中分離したタンパク質は光学密度２８０　
ｎｍで検出する。特異的なプレー５（１）の検出はそれ
ぞれのフラクション５μノＺ多孔性（孔１．２μｍ）ナ
イロン膜正に滴加する。滴の乾燥後に、膜を初めに非特
異的な結合を飽和するために胎生小生血清中に置き、そ
の後ＭＡ１８／７ン／Ｊ％牛血清に添加しかつ振盪下に
恒温保持し、ＰＢＳで洗い、最後に酵素の西洋ワサビの
根のベルオキシダーゼン共有結合して含有するマウス免
役グロブリンに対する抗体を調える。

このペルオキシダーゼ標識された抗マウスエｇｉｔ市販
されている。これは２０％胎生小牛血清中１：１００〜
１　：２０００、殊に１：２００で膜に加える。膜が試
料からのプレー５（１）−タンパク質を吸着している部
分ではＭＡ　１８／７及び後からペルオキシダーゼも結
合する。結合したペルオキシダーゼを公知の呈色試駆に
より検出する。褐色のスポットの濃度が存在するプレー
５（１）−タンパク質の量の手足量的尺度である。

この試駆で強く反応するフラクションを一緒にしかつ透
析チューブ中で又は限外濾過膜〔例えばサルトリウス（
５ａｒｔｏｒｉｕｓ　）社のコロイド膜〕中でＰＢＳに
対して透析しかつ数日以内に使用しない場合にはそれま
で凍結させる。

方法ｂ） Ｂｆｉ肝炎肝炎ビール子粒子Ｂ型肝炎嵌面抗原を使用す
る。この出発物質は予め公知方法で精製する。この方法
は水性媒体中温度Ｏ〜１００℃、殊に２０〜５０００で
行なう。殊に、ブロムシアンによる処理は水性媒体中温
度Ｏ〜５０°０．７より小さい−で行なう。酸性のβ値
は無機酸（例えば塩酸、硫酸、リン酸）か又は有機酸で
調節することができる。例えば、有機酸としてはＰＫ！
直５〜４．９のものが該当する（例えばイ酵、酢酸）。

ブロムシアンは過剰量で、例えば２倍乃至最高５倍の過
剰量（重量に関して）で便用する。プロへシアンで処理
する際に、主にプＶ−日（１）−アミノ酸配列より成る
ペプチド並びに場合によりそのようなペプチドの７ラグ
メントも得られる。

殊に界面活性剤による処理は２０〜１００℃、殊に６５
〜４０°Ｃで５〜６０分間、殊に５〜１０分間水性媒体
中で行なう。例えば、界面活性剤としては、脂肪族硫酸
モノエステルの可溶性塩、例えばウラリル硫酸ナトリウ
ムが該当する。例えば、水性媒体中の界面活性剤の濃度
は０．１〜２０％、殊に０．５〜３％である。この界面
活性剤処理での他の添加物としては次のものが該当する
ニジスルフィＰ架橋員を分解する試薬、即ち遊離８Ｈ基
含有化合物、例えば有機スルホヒドリル化合物、例えば
ゾチオト２イト（ＤｉｔｈｉＯｔｈｒｅｉ、ｔ）、ジチ
オエリスリット、２−メルカゾトーエタノール。前記の
界面活性剤処理により解離したビールスタンパク質が得
られる。

このようにして得られたタンパク賀混合物は殊に分子量
３９０００及び４２０００ダルトンのタンパク質２種（
タンパク質Ｐ３９及びタンパク質ＧＰ４２）を含有し、
これらは公知のようにゲル電流泳動により単離すること
ができる。

この界面活性剤により得られるペプチｒ混合物を引続い
てプロテアーゼで処理して更に小型のプレー５（１）−
配列を有するペプチドに分解することができる。

例えば、プロテアーゼとしてはスタフイロコツクス・ア
ランウスからのｖ８プロテア−ぜが該当する。殊に、こ
のプロテアーゼはポリペプチド鎖をグルタミン酸の部位
で分解する。この反応は温度２０〜５０°Ｃ１殊に６５
〜４０°Ｃ１ｐ８６．０〜８゜０１殊に７．２〜７．６
で１〜４日間行なわれる。反応混合物はラウリル硫酸ナ
トリウム２チ以下及びジチオトレイトール２チ以下、殊
にそれぞれ０．５〜１．２９６を含有すべきである。

分解されたプレー５（１）−配列を有するタンパク質は
混合物から例えばゲル電気泳動により分離する。このた
めに、重合体含有率１０〜１８チ、殊に１６〜１５チの
ポリアクリルアミドデルを使用する。このゲルは形成し
た試料の穴を有するフラットな層の形を有する。緩衝剤
系はレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）により記載されており〔
”ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）”、２２７巻、６８０
〜６８５貞（１９７０年）〕、電気泳動の実施及び分離
したタンパク質の単離に関する記載は一バイロロノー（
Ｖｉｒｏｌ　ｏｇｙ　）”、１２６巻、４６６〜４４２
頁（１９８２年）になされている。電気泳動の終値後、
タンパク質はその大きさに相応してフラットなデルの一
定の区域に存在する。プレー日（１）−タンパク質が存
在する区域は公知の比較タンパク質との比較により決定
し、その際にこれらのタンパク質及び試料混合物のタン
パク質は銀で呈色させることにより最も良好に可視化さ
れる。１８０００ダルトンのタンパク質フラグメントの
区域を切断し、粉砕しかつ緩衝溶液で溶離する。

引続いてプロテアーゼで処理することにより、主にプＶ
−日（１）−及びシレー５（２）−アミノ酸配列より成
るペプチドが得られる。

方法Ｃ） この方法は、場合により常法で保護されている相応する
アミノ酸から常用の方法で合成して行なう。また、一般
的な市販の保護アミノ酸の使用下に自動ペプチド合成機
、例えばベックマン・モデル９９０ペプチド・シンテテ
イジーラ−（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏａｅｌ　９９　Ｑ　
ＰｅｐｔｉａＳｙｎｔｈｅｔｉｓｉｅｒｅｒ）の使用が
可能である。

例えば、特許請求の範囲第７項又は第８項によるペプチ
ドの合成は、常法で相応する保護アミノ酸から行ない、
即ち初めに、α位アミン基が保護されている、合成すべ
きペプチドのカルがキシ末端アミノ酸をこのために常用
の合成用キャリアに共有結合させ、α−アミノ保護基を
脱離し、このようにして得られた遊離アミノ基に次にす
ぐ続く保護アミノ酸をそのカルボキシ基を介して結合さ
せ、次にこの第２のアミノ酸のα−アミノ保護基を脱離
し、このアミノ基に次のアミノ酸を結合させ、このよう
にして次第に合成すべきペプチｒの他のアミノ酸を正し
い順序で連結乙かつすべてのアミノ酸の連結後に最終ペ
プチドをキャリアから脱離し、場合により存在する他の
側位官能基の保護基を脱離する。

アミノ酸を連結するための反応は、温度範囲１０〜４０
℃、殊に２０〜６０°Ｃで、場合によりこのために常用
の不活性の溶剤又は懸濁剤（ｆ＋Ｊえばジクロルメタン
）中で行ない、その際場合により溶解度を改良するため
にジメチルホルムアミ１ｓ２０％までを加えることがで
きる。

合成キャリア材料としては、合成重合体、例えばビーズ
状の膨潤性ポリステノン樹脂（例えばポリスチレンとジ
ビニルベンゼン１％とからのクロルメチル化共重合体）
が該当する。例えば、α位アミン基の保護基としては次
のものが該当する：第三ブチルオキシカルビニル基、カ
ルボベンズチオ基ないしはカルボベンズチオ基（場合に
よりそれぞれｐ−ブロム−又はｐ−二トローベンジル基
を有する）、トリフルオルアセチル基、７テル基、０−
ニトロフェノキシ−アセチル基、トリチル基、ｐ−トル
エンスルホニル基、ベンシル基、ベンゼン核で直換され
ているベンジル基（ｐ−ブロム−又はｐ−二トロベンジ
ル基）、α−フェニル−エチル基。このためにはジエス
Ｐ、グリーンシュタイン（ＪＯＢ８θＦ、　Ｇｒ＠ｅｎ
ｓｔｅｉｎ）及びミルトン・ウイニノッ（Ｍｉｌｔｏｎ
　Ｗｉｎｉｔｚ）共著“ケミストリー・オデ・アミノ・
アシズ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ
１ｄｓ）”、２巻、例えば８８３頁及びそれ以下、ジョ
ン・ウィリー・エンｒ・サンズ・インコーホレイテッド
（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ、ｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ工ｎａ、
）、＝ニーヨーク在（１９６１年）並びに“デ・ペプチ
ッズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉ＋ｉｓ）”、２巻の兄、グロ
ス（Ｇｒｏｓｓ）及びＪ、マイエンホー７ア（Ｍｅｉｅ
ｎｈｏｆｅｒ）共著、“スペシャル・メソツズ・イン・
ペプチＰ・シンセサイズ（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏ
ａｓ　１ｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ８ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ａ
部（ｐａｒｔ人）”、表１．２０頁及び表■、２１項、
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）、ニューヨーク在（１９８０年）が参考になる。基本
的に、これらの保護基は該当するアミノ酸の他の官能性
の側位基（ＯＨ基、ＮＨ２基）の葆護にも適用される。

存在スるヒドロキシ基（セリン、トレオニン）は殊にベ
ンジル基など類縁基により保護する。

α位ではない他のアミノ基（例えばω位のアミン基、ア
ルギニノのグアニジノ基）はニトロ基で保護すると有利
である。

個々のアミノ酸は常法で相互に接合する。特に、対、称
アンヒドリドの方法（ジシクロへキシルカルボジイミド
の存在で）、カルボジイミド法、カルボキシ基に−ヒｒ
ロキシベングトリアゾール法。

例えば、他の方法としてはアジド法、混合アンヒドリド
法、Ｎ−カルボン酸アンヒドリド法、活性エステルの方
法、変性カルがジイミドの使用が該当する。

例えば記載のペプチド合成法はＥ［、Ｄ、ヤクデヶ（Ｊ
ａｋｕｂｋｅ　）、■、イエシュカイト（Ｊｅｓｃｈｋ
ｅｉｔ）共著、′アミノディン１ペプチデ、プロタイネ
（Ａｍｉｎｏｓａｕｒｅｎ　、　Ｐｅｐｔｌｓ　、　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｅ）”、フェアラーク・ヒエミー（Ｖｅｒ
ｌ、ａｇＯｈｅｍｉｅ）出版、ウブインハイム在）、（
１９８２年）に記載されている。

アルギニノの接合にはカルボシイミド法を使い、アスパ
ラギン並びにグルタミンの接合にはカルボジイミド−ヒ
ドロキシ−ベンゾトリアゾール法を使うと有利であるＣ
　Ｌグロス（Ｇｒｏｓｓ）及びＪ、−ｒイエンホー７ア
（Ｍｅｉｅｎｎｏｆｅｒ）共著、“デ・ペゾチズ（Ｔｈ
ｅ　Ｐｅｐｔｉａｓ）”、２巻参照〕。

一般に、他のアミノ酸に関しては対称又は混合アンヒド
リドの方法を使う。

例えば、既述のペプチドＯｃもしくはＯ（Ｌの合成は次
のように行なう：これらのオリゴペプチドの配列は第２
図に図示されている。合成に当り、Ｎａ−第三ブチルオ
キシカルボニル（Ｎａ−Ｂｏｃ　）保護されたＬ−アミ
ノ酸（ｙｘｕｋａ）を使用した。Ｌ−セリン及びＬ−ト
レオニンの側位官能基は付加的に０−ベンジル基、Ｌ−
アルギニノのそれはＮａ−ニトロ基で保護する。初めに
、Ｎａ−ＢＯＯ−Ｌ−プロリンを４−オキシメチルフェ
ニルアセテート化合物〔“ジャーナル・オデ・ゾ・アメ
リカ′ン・ケミカル・ンサイエテイ（Ｊ。

Ａｍ、　Ｏｈｅｍ、　Ｂｏａ、）”、９８巻、７３５７
〜７６６２貞（１９７６年）；“ジャーナル・オデ・オ
ルがニック・ケミストリー（Ｔ、Ｏｒｇ、　Ｇｈｅｍ、
）　”　。

４６巻、２８４５〜２８５２頁（１９７８年）〕を介し
てキャリア材料のバイオビーズ（Ｂｉ、０ｂｅａｄｓ）
ｓ　−ｘ　１　（Ｂｌｏ　−Ｒａａ　）に結合させる（
　ＢＯＯ−Ｐｒｏ　−ＰＡＭ−ポリスチレン）。Ｎ−末
端Ｂｏｏ保護基を酸により脱離した〔“ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）”、２０６巻、６１９〜６２０頁（１９６
５年）〕後で、まずＮａ　−ＢＯＣ保護されたアミノ酸
をカップリングする。このカップリング工程では６種類
の方法を適用した。Ｎａ−Ｂｏｏ　−Ｎａ−ニトロ−Ｌ
−アルギニノはシンクロヘキシルカルざジイミドの適用
下に（ＤＯＯ；“ジャーナル・オプ・ジ・アメリカン・
ケミカル・ソサイエテイ”、７７巻、１０６７〜１０６
８頁（１９５５年）；同８８巻、１０１３〜１０６０頁
（１９６６年）〕、Ｎα−Ｂｏｏ　−Ｌ−アスパラギン
及び−−グルタミンはジシクロへキシルカルざジイミド
／１−ヒドロ午りペンデトリアデールの適用下に（ＤＣ
Ｏ／　ＨＯＢＴ　；“ヒエーミッシエ・ベリヒテ（Ｏｈ
ｓｍ、Ｂａｒ、）”、１０３巻、７８８〜７９８頁（１
９７０年）；“ジャーナル・オデ・オルガ−ニック・ケ
ミストリー”、４５巻、５５５〜５６０頁（１９８０年
）〕並びに残りの保護されたアミノ酸は対称アンヒｒリ
ドを介して（ＥＩＡ　；“ジャーナル・オデ・ジ・アメ
リカン・ケミカル・ンサイエティ”、９７巻、６５８４
〜６５８５貞（１９７５年）；“アンデヴアンドゥテｅ
ヒエミー（Ａｎｇｅｗ、　Ｏｈｅｍｉｅ）”。

国際英甜版（工ｎｔ、Ｆｆｄ、Ｆｉｎｇ１．）、１０巻
、６６６頁（１９７１年）；“ホップ・セイラーズ・ツ
アイトシュリフト・フェア・フイズイオロギッシエ・ヒ
エミー（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈ１
ｓｉｏ１．。

Ｏｈｅｍ、）”、′５５３巻、１９７６〜１９７６頁（
１９７２年）〕結合させた。１０番目のアミノ６Ｌ−ア
スパライン酸の結合後にキャリア材料を分割し、一方の
半分にはＮａ−Ｂｏｏ　−Ｌ　−アラニンを結合させた
。合成は１６番目のアミノ酸まで別々に行ないかつ別々
に分離する。同時に側位官能保護基の脱離を行ないなが
ら行なうキャリア材料からの最終ペプチドの分離は弗化
水累及び１０％（ｖ／ｖ　）アニソールで実施した〔“
Ｂｕｌ−１，Ｏｈｅｍ、　Ｂｏａ、Ｊｐｇ、　”、４０
巻、２１６４〜２１６７員（１９６７年）；“ジャーナ
ル・オプ・オルガ−ニック・ケミス）　ＩＪ−”、６５
巷、３１５１〜６１５２頁（１９７０年）；“ジャーナ
ル・オデ・ジーアメリカンｅケミカル・ノサイエテイ”
、９７舎、３４８５〜６４９６頁（１９７５年）〕。

タンパク質Ｐ３９／ＧＰ４２のｆＶ−ｓ（１）一部分は
Ｅ１粒子の表面上に存在する。マウスをＭＷ粒子で免疫
処理するとプレー１３（１）−ポリペプチドに対する抗
体が形成する。このように免疫したマウスの膵臓細胞か
ら公知方法により〔“ジャーナルφオデ・イムノロジー
（Ｊ。

工ｍｍｕｎｏｌ　、　）”、２６巻、１５４８〜１５５
０貞（１９７９年）〕、プレー日（１）−ポリペプチド
に対する七ノクロナール抗体（ＭＡ１８／７）を生産す
るハイブリッドーム細胞列（Ｈ）ｒｂｒｉａｏｍｚｅｌ
ｌ　−Ｌｉｎ１ｅ）を生成する。細胞列及び相応する抗
体は試験管内では細胞培地として、生体内ではＢＡＬＢ
　／　ｃマウスの腹水癌として増殖させる。ＭＡ１８／
７抗体は亜型ａ（ＬＷ２又はａｙｗのＨＢＶ粒子と、Ｈ
ＢａＡｇフィラメントと及び２Ｑ　ｎｍ　ＨＢａＡｇ粒
子の抗原量に対し約偽〜”Ａｏの結合強さで反応する。

単離したＰ６９／ＧＰ４２も同様にＭＡ１８／７に結合
する。

Ｐ　３９／Ｇ　Ｐ　４２からシレーＳ−配列をグルタミ
ン酸特異性プロテアーゼで分群すると、１６４ないしは
１７５６のアミノ酸のアミノ末端ポリペプチドフラグメ
ントが生成し、これもＭＡｉ８／７と結合する。分解部
位はＨＢａＡｇ主要タンパク質のアミノ末端の１コドン
後に存在する。この処理により１（ＢＹ　、　フィラメ
ント及びＨＢａＡｇ２０ｎｍ粒子から、最も重要なビー
ルス特異性抗原決定群を含有するポリペプチドを生成す
ることができる。

それ故、本発明はモノクロナール抗体ＭＡ１８／７ない
しは雑揮細胞列ＧＯＩＡ１８／７−１にも関する。この
抗体ＭＡ１８／７は、プレー日（１）−アミノ酸配列を
含有するペプチドに対する高い特異性を有する。特に、
新規抗体ＭＡ１８／７は尚度棺製に及びプレー８（１）
−配列を有するペプチドの検出に好適である。

本発明により細胞融合により新規の免疫グロブリン生産
性雑種細胞列が得られる。

このために、免疫したマウス（例えば株ＢＡＬＢ　／　
Ｃ）から採取した直後の）岸繊細＃！を骨髄腫細胞、例
えば骨髄腫細胞Ｘ　６６−　Ａｇ　８−６５６と、パン
フレットの“ノ＼イブリドーマ・テクニックス”（Ｈｌ
、ｂｒｌｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”；コールド・
スプリング・ハーバ−・う♂う）　！ｊ　−（ａｏｌａ
ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｏｏｒａｔｏｒｙ）出
版（１９８０）、米国ニューヨーク・コールＰ＠スフリ
ンク壷ノーーバー在〕に記載されている方法により融合
させ、引続いてクローン化しく制限稀釈度の条件下に）
選択しかつ培養する。！６３−Ａｇ３−６５３骨髄腫細
胞はＰ　３−　Ｘ　６３−　Ａｇ　８骨・請腫亜クロー
ン（８ｕｂｋｌｏｎ）からの亜クローンである〔Ｊ。

キアニ（Ｋａａｒｎｅ７）及びその他共著“ジャーナル
・オ、デ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａ１ｏｆ工ｍｍｎ
ｏ１ｏｇｙ）″、１２６巻、Ｉ’ｈ４．１５４８頁（１
’９７９年）参照〕。

雑種細胞の成長が見られる培地をデレー５（１）−特異
性抗体の含量に関して次の工うに試験する。

雑種細胞の成長が細胞塊の形成により認められる容器の
培養土♂みから一部を、稀釈ＨＢＶ粒子で塗布した（　
ＨＢＶ粒子はｐ）４７．４のリン酸ナトリウム溶液で稀
釈）マイクロ力何カツノ中に装入する。ペルオキシダー
ゼで標識した公知の抗マウス免疫グロブリンの添加によ
り公知のように、相応する培養液から抗体がＨＢ’７抗
原に結合したかどうか（前記のバンフレツドノ）イブリ
ドーマ・テクニックス”参照）を測定する（呈色反応）
。激しい呈色反応を行なう試料を大凰培養谷器中に装入
しかつプレー５（１）−＆’Ｊペプチド（例えばペプチ
ドＰ３９もしくはＧ　Ｐ　４２）と反応するかどうかを
、これに対して“グアイロロジ一台バンド（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ　ＢａｎｃＬ）、１２３徹４３６〜４４２ｓ、（
１９８２年）に記載のペプチドＧＰ３３とは反応しない
ことを試験する。

これらの前提条件を満足する培養液を再度制限稀釈反の
条件下にクローン化する。このようにして得られたクロ
ーンはシレー５（１）−ペプチドに対するモノクロナー
ル抗体を生産する。

このようにして得られた抗体の１つをＭＡ１８／７と表
わしかつ常法で細胞培地として増殖させる。

例えば、この増殖はビン中ＲＰＭエアール（Ｅａｒｌｅ
）１９９／１０％胎生小牛血清中で行ない、その際にげ
ンの内壁は１ｃＲ２当たりマウス（株ＮＭＲ工）の腹膜
マクロファージ１０３で塗布されている。

この培養液を６７°Ｃ及び５　（ｉ　００２　／空気に
保持する。しかし増殖はシンビンマウス、例えばＢＡＬ
Ｂ　／　Ｑ中で腹水癌として行なうこともできる。

このためにマウスに予め１０日間プリスタン（２，６，
１０，１３−テトラメチル−ペンタデカン）０．５ｄを
腹腔内注入し、次に３Ｘ１０’個の相応する雑樵細胞を
注入する。

癌マウスの腹水からの新規モノクロナール抗体の単離は
公知方法で、殊に例えばに酸す）　ＩＪウム又は硫酸ア
ンモニウムによる分別沈殿及び場合により引続いて妹に
セルロースをベースとする。例えばジエチルアミンエチ
ルセルロースをベースとする好適なキャリアを介してク
ロマトグラフィ処理により行なう。雑種細胞上澄み（細
胞培養上澄み）からの単離は、公知方法で、殊にブドウ
球菌タンパク質ムがカップリングしているセファロース
（ビーズ状アがロースデル）に結合させかつ引続いて水
性緩衝液を用いて分離することにより行なう。

このように製造した抗体は直接プノー日（１）−ペプチ
ドの検出にもしくは生物学的に不活性なキャリアに共有
結合させた後で７０Ｖ−８（１）−ペプチドの高度精製
に使用することができる。

この除に、抗体の共有結合は殊にアがロースをベースと
する相応して活性化されたキャリア（この場合例えばア
ガロースはゾロムシアンで活性化されている）又は多孔
性ビーズ状ガラス、例えばアミノプロぎル基含有ビーズ
状がラス〔フルカ社（ｙｘｕｋａ）　、スイス在〕に対
して行なう。例えば、高度精製するに当りプレー５（１
）−ペプチドの溶液を弱塩基性−１例えば−７〜９てこ
のように製造した抗体親和性キャリア上に、中性−で溶
出液がタンパク質を含まなくなるまで洗浄する場合にボ
ンデで送りかつ引続いてシレー５（１）−アミノ酸配列
を有する結合ペプチドをカロトローグイオンの濃溶液、
例えば高モルの（飽和まで２モル、特に６モル）アルカ
リチオシアネート溶液、例えばチオシアン酸ナトリウム
溶液を用いてＰＨ７で又はＰ）１１．６〜２．５で酸性
緩衝溶液で溶離する。９１１えは、このようにして得ら
れたタンパク質含有フラクションから−７で透析するか
又はｒル謙過（例えばセファデックスＧ２５）により溶
離剤を除去し、その際にこれらの手段は生理的緩衝液の
使用下に実施する。

細胞列（）０１ム１８／７−１は次の保存機関にｒ１４
Ｌ８４１０１５０１で沓託されている：公衆衛生局、国
立動物細胞培地保存（ＰｕｂｌｉａＨｅａｌｔｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　１３ｅｒｖｉａｅ　、　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌＯｏｌｌｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃ
ｅ１ｌ　０ｕｌｔｕｒｅａ　；ボートン・ダウン、サリ
スペリー、フィルトシャイア（Ｆｏｒｔ　Ｄｏｙｎ　、
　８ａ１．１ｓｂｕｒｙ　、　Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ）１
９Ｆ４０．Ｔ（）、英国性〕。

この細胞列は、一定の特性に関連して免疫グロブリン工
ｇ（ｈ　／カッパに包含される。抗体はタンパク質のプ
レーＢ（１）−アミノ酸配列もしくは少なくとも６個の
アミノ酸を含有すべき、このプレー５（１）−アミノ酸
配列のフラグメントな含有するタンパク質と結合する。

雑種細胞ＧＯＩＡ１８／７−１は液体窒累中で凍結させ
て、付加的に１０チジメチルスルホキシドを含有する下
記の培地中で保存することができる。凍結速度は緩慢に
、約１〜ｂ分である。更に増殖するために凍結細胞を例
えば（凍結細胞３Ｘ１０６個のミニチューブ）迅速に浸
漬しかつ徐々に（１０分間で）例えば次の組成の培地１
０ゴと混合する： 培地１９９／アール（Ｅａｒ：Ｌｅ）　（：ｒ、ｖ、　
％＃ガンＭｏｒｇａｎ　）及びその他共着、“プロシー
ジングズ・ソサイエテイ自７オー・エクスペリメンタル
・バイオロジー・エンド・メデイシン（Ｐｒｏａ　、Ｂ
ｏａ　、　Ｅ：ｃｐ、Ｂｌ、Ｍａｄ、）”、７３巻、１
頁、１９５０　）　　　　　　　　　　　　２４．３５
．９ＲＰＭ工／１６４０　（Ｇ、Ｉ、モア（Ｍｏｏｒｅ
）及びその他共著、′ジャーナル・オデ・ジ・アメリヂ カン・メ（イカルＯアソシエーション（Ｊ。

ムＨ１，ＭｅＪ　　１ｓａｏａ、）　　″、１９９巻、
５１９頁、１９６７　；　Ｗ、！、アール（Ｆｉａｒｌ
ｅ）及びその他共著、“ジャーナル・オデ・デ赤ナシヨ
ナνキャンサー・インステイテユート（、Ｔ、　Ｍａｔ
。

０ａｎａｓｒ工ｎｓｔ、）”、４巻、１６５員、１９４
３）２６．００　ｌｌ ＮａＨＯＯ３１０，００ｊ’ グルタミン２００゛ｍＭ　　　　　　５Ｑｄ非必須アミ
ノ酸（常用の非必須アミノｉの混合物）　　　　　　　
　　　　　　５０ｄ抗生物質−抗糸状菌物質−溶液　５
０ゴＭＺＭ　（最少基本培地）中のショウ性ブドウ酸１
００ｍＭの・ナトリウム塩　　　　５０ｄ胎生小牛血清
　　　　　　　　　５００−再蒸留水、ａｏ２で−６，
９〜７．０にしかつ濾過により滅菌した　　　　　　　
　　全量５ノ例えば、次の培地も使用することができる
：８０％ＲＰＭ工１６４０ ２１培地１９９／アール からの混合培地８０／２０ 付加的に、 ＮａＨＣＯ２２０Ｊｉ’ ２００　ｍＭＬ−グルタミン　　　　１００づ１００×
非必須アミノ酸　　　　１００Ｍ１００×抗生物質−抗
糸状菌物質−溶液００ＩＲ１ ペニシリン１００００単位 ストレプトマイシン１００００μｇ ＩＰａＳ　（胎生小生血清＞　　　　　　ｉｚ再薫蒸留
水　　　　　　　　　　全量１０）ａｏ２で−６，７〜
７．０に調節及び 濾過滅菌 引続き、細胞を遠心分離しく重力加速度の５００倍）、
沈積した細胞を前記の培地３０ＷＬｌ中に再懸濁させ、
次いで底面積７５ｃＩＩＬ２の細胞培養ビン中に装入す
る。

プレー５（１）−配列を有するポリペブチｒ特に主にシ
レー５（１）−配列より成るか又はこのプレー５（１）
−配列のサシユニットより成るポリペプチドはＢ型肝炎
ビールス疾患に対する接種物質として好適である。その
ような接種物質は作用物質として本発明によるペプチド
（例えば特許請求の範囲第８項によるペプチド）少なく
とも１種を含有する。接種物質は本発明によるペプチド
（例えば特許請求の範囲第８項によるペプチド）２種又
は数棟を含有してもよい。殊に、作用物質として１式の
ペプチド少なくとも１種及び場合により付加的に５式の
ペプチドを含有する接種物質が該当する。殊に、ＸはＭ
ｅ　ｔＧｌｎＴｒｐＬｅｕＰｒｏＡｒｇム１ａＰｈｅＡ
ｒｇ　−ＯＨを表わす。これら両方のペプチドの混合物
は、すべてのビールス並製に対する抗体と共にプレー５
（１）−配列に対する多数の亜を特異性抗体をも誘導す
る。

Ｂ型肝炎疾患の治療に当り、本発明によるポリペプチド
又はオリゴペプチドを接種物質に常用のように例えば注
入により又はスプレーの形で適用する。

特に、本発明によるデＶ−８＜１）−ペプチドはＢ１ｆ
１肝炎ビールス粒子に対して免疫し、これに対し無害の
ＨＢｓムｇ　２０　ｎｍ粒子に対しては殆んど作用しな
い。

接種物質の製造に当り、本発明により得られたデレー５
（１）−ペゾチｆは免疫親和性クロマトグラフィ及び常
用の方法により精製しく濾過、特に分子濾過及びデル濾
過、分離、勾配遠心、吸着及び次いで溶離等）、場合に
より濃縮しくゾーン遠心、分子濾過、吸着及び次いで溶
離）、安定剤の添加により安定化しかつ好適な保存剤（
例えばベンジルアルコール、クロルブタノール、チオメ
ロサール、フェノール、クレゾール）により耐久性にす
る。

更に、接種物質の抗原性はアジュバントの添加により高
めることができ、ないしは貯蔵性を達成することができ
る。

アジュバントとしてはフロインドアジュバント翫油性及
び他の有機アジュバント、特に酸化アルミニウム、水酸
化アルミニウム及びリン酸アルミニウムのようなアルミ
ニウム混合物が該当する。

プレー日（１）−ペプチドは組合せ接極物質の成分とし
ても使用することができる。

ドイツ微生物保存機関（ＤＢＭ　；グリーゼバツハ７エ
トラーセ（Ｇｒｉｅｓｅｂａａｈａｔｒａβｅ）８、Ｄ
−３４０（１’ツテンデン（Ｇδｔｔｉｎｇｅｎ）在〕
にブタペスト条約により冨託されている微生物は次の通
りである（純培養）： １）畜託番号ＤＳＭ　６０８２のＥ、コリに４９０ｐＨ
ＢＶ　９９１ 微生物Ｅ、コリに４９０ｐｌｖ９９１はクローンＰＨＢ
Ｖ　９９１を生産する。それはプラスミドＰＨＢＶ　９
９１を含有する細菌エシェリヒア・コ！ＪＫ１２菌株４
９０である（純培養）。プラスミドは出発シラスミドｐ
ＢＲ３３２と、ＢａｍＨ工部位に挿入されているＢ型肝
炎ビールスＤＮＡ　（単離体Ｆ９９１）より成る。この
シラスミドはビ−ルス性遺伝子生産を発現しない。

２）寄託番号ＤＢＭ　５０８１のＥ、コリｆｆＭ１０１
ｐＧＬ　１０１ この微生物はプラスミドｐＧＬ　１０１を有するＥ、コ
リに１２の変異体である〔メツシング及びその他共著、
′ニュークリイック・アンズ・リサーチ（Ｎｕ＋、ｌｅ
ｉ、ｃ　Ａｃ１５　Ｒｅｓ、）”、９巻、６０９負、（
１９８１年））、このプラスミドは組み換えＤＮＡであ
り、オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）及びｐＢＲ３２２のβ−
ラクタマーゼから、ｔａＣ−プロモーターから及びＢｆ
ｉ肝炎ビールスＤＮＡのプレー５（１）−７５Ｐグメン
トから。アンピシリン耐性を発現する。

６）寄託番号ＤＳＭ　３０７９のＥ、コリＪＭ１０１Ｋ
Ｇ　１ この微生物はｆ−ｙスミドｐＫ３１を含むエシェリヒア
・コリに１２変異体〔メツシング及びその他共著、“ニ
ュークリインク・アンズ・リサーチ”、９巻、３０９頁
（１９８１年）〕でおる。このプシラスミは組み侠えＤ
ＮＡであり、オリジン及びｐＢＲ５３２のβ−ラクタマ
ーゼから、１ａｃｕｖ５−プロモーターから及びＢ型肝
炎ビールスＤＮＡ　ｆ）プレー５（１）−フラグメント
から。

これはアンぎシリン耐性及び１１９アミノ酸のプレー８
（１）−ポリペゾチｒを発現する。

４）舒託番号ＤＡＭ　３０８０のＥ、：ｒす、ＴＭｌ　
０１ｐＫＧ　’ｌ この微生物はプラスミドｐＫ０２を有するエシェリヒア
・コリに１２＆異体（メツシング及びその他共著、′ニ
ュークリイック・アシズ・リサーチ”、３巻、５０９貞
（１９８１年）〕である。このシラスミドは組み侠えＤ
ＮＡであり、オリジン及びＩ）ＢＲ３２２のβ−ラクタ
マーぜから、ｔａａ　−プロモーターから及びＢ型肝炎
ビールスＭムのプレー８　（１’）−７ラグメントから
。

これはアンぎシリン耐性及び１１９アミノ酸を有するプ
レー５（１）−ポリペプチドを発現する。

前記の１）〜４）に挙けた微生物の培養−及び貯蔵条件
は次の通りでわる： 培地ニ ルリア肉汁（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）　：　ｄｉ母母
印キスジフコ（ＤｉｆｃＯン１０Ｉ、バクトドリプトン
・ジフコ１０Ｉ／、ＮａＣｌ３１　、　Ｐ８ＮａＯＨに
より調節、蒸留Ｈ２０で１）に、滅菌溶液中のアンぎシ
リン〔ピノターｈ　（Ｂｔｎｏｔａｌ）　、バイヤー（
Ｂａ７＋ｓｒ）社〕１００ＩＩ９、滅菌前のｐ）（：　
７．５、滅菌１２０℃で２０分間、酸素に対する挙動：
好適性、培養温度：３７℃、培養時間ニー晩、貯蔵：４
°Ｃ１移種間隔：６ケ月 貯威条件：寒天上４℃で又は５０チグリセリンーＩｔＢ
−アンピシリン中−２０℃で。生存能力試験の条件：寒
天上に前記のルリア肉汁培地を塗る。

実施例 次に挙げた実施例中で一般的に記載した方法、例えば酵
素反応、沈降及び精製等に関しては、特に記載のない限
り、Ｔ、マニアテイス（Ｍａｎｉａ−ｔｉａ　）　、Ｅ
、？、　７リツチユ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ　）　、Ｊ、サム
デルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）共著、１モレキユラー
ルークローニング、ア・ラホラトリー・マニュアル（Ｍ
ｏ１．ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　）　’　、：２−ルｌ−
’−スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃ０１（
Ｌ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　）　、１９８２年に従って行なった。

Ｍ％ｍＭ、μＭは以下常に次の意味を有するｍＭ　　：
１ｔあたり該油物質１モルを含有する水溶液、 ｍＭ　　：　Ｉ　Ｌあたり該当物質１ミリモルを含有す
る水溶液、 μＭ　　：１ｔあたり該当物質１マイクロそルを含有す
る水溶液 例　　Ｉ １、　出発ＤＮＡ　ｐＨＢＶ　９９１の製造ＨＢＶ粒子
（ＥＢＶ　−Ｂ型肝炎ビールス〕の単離ＨＢＶ−ＤＮＡ
の獲得のための原料としては血液銀行でより分けられた
ＨＢｌＩＡｇ陽性保存血液を先ず集める。該試料に関し
て、ＨＢｅＡｇを免疫電気泳動を用いて〔デベロップメ
ンタル・バイオロジー　（Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ
、ン、スタンダード３０゜１９７５年、７８〜８７頁〕
、かつＨＢｅＡｇを市販のラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ　）を用いて検査する。ＨＢｓＡｇを２５μｍ１／ｌ
ｅｌより多量に、かつ１：１００を越えるＨＢＩＡｇ−
力価を有する試料は大きな確率でＨＢＶ−粒子を１０８
／ｄより多く有しており、出発材料として好適である。

ＨＢａＡｇ陽性の血液供給者の約５％の人がこのような
甑を有している。このような血液供給者又は知られてい
るＨＢＶ−保有者に的をしばって血漿泳動により血漿を
集めることももちろんできる。出発量としては血漿少な
（とも１０ｄ、Ｌかし有利に４０〜７０−を使用する。

該血漿を先ず１００００　ｒ、ｐ、ｍ、、４℃でアング
ルローター中で遠心分離する。−沈殿物及び脂肪層を捨
て、透明な血漿をピペットで吸い取る。寸法１４Ｘ９５
ｍの超遠心分離管中で、透明な血漿量１０１Ｌｌを３０
ｔｓ（重量／容量）蔗糖溶液２ｄと２０％蔗楯溶液０．
５ｍｌからなる不連続蔗糖傾斜溶液上に積層する。該蔗
糖溶液は１３０　ｍＭ　ＮａＣＬ、　　２０　ｍＭ　）
リスＨｃｔ　ｐ）１７．４中で配合されている。使用で
きる血漿量により遠心沈殿管６本までに前記の方法で満
たし、スウィング・チューグローター中で１０℃、３８
０００ｒ、ｐ、ｍ、で超遠心分離を行なう。得られた上
澄みを脂質と共に完全に吸い取る。

ＤＮＡ−標識 容管の沈殿物に次の新たに調製した溶液１００μＬを加
える：　２０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　ｚ　２５　ｍＭ　Ｎ
Ｈ４Ｃ４２５ｍＭ　）リス−ＨｃＬ　ｐｉ（７，６；　
０．５％ノニデット（Ｎｏｎ１ｄｅｔノーｐ　４０　ｓ
　Ｏ−２％β−メルカプトエタノール；２．５り／ａｕ
デオキシーアデノシン三燐酸；２．５１Ｒ９／ｄデオキ
シ−チミジン三燐酸；２．５＋ｎ９／ｄデオキシ−グア
ニシン三燐酸；１０マイクロキユーリー１２５沃素−デ
オキシーシチジンニ燐酸。該溶液をリベットで吸引した
り、吐き出したりして（少なくとも１０回）沈殿を十分
に懸濁゛させ、その後沈殿を合し、閉鎖したグラスチッ
ク容器中で６７℃で３時間恒温保持する。この際、ＨＢ
Ｖ−ＤＮＡ　ｆ？ＩＪメラーゼは放射性１２５−沃素−
デオキシ−シチジンをＨＢＶ−ＤＮＡ中に組み入れ、Ｈ
ＢＶ−ＤＮＡの一本鎖切れ目を満たす。

ＤＮＡ−遊離 ０．１〜最高１１１ＩＪの前記混合物を超遠心分離管１
４Ｘ９Ｓｘｚ中で、１３０ｍＭＮａＣｔ；　２０ｍＭト
リス−ＨＯ２；　０．１　％牛血清アルブミン中の６０
％溶液６ｍｌ、２０％溶液５−及び１０チ溶液１〜２祷
からなる不連続蔗糖傾斜溶液上に積層する。　４’Ｏｓ
　３８０００　ｒ、ｐ、ｍ、で８時間後、上濱液を再び
注意深く吸い取り、沈殿に次の新たに１４製した溶’Ｗ
ｊ、　１００　ｔｔｔを加える：　４０ｍＭトリス−Ｈ
ＣｔＰＩ′１７．５　；　０．３％ラウリル硫酸ナトリ
ウＡ　；　４０　ｍＭＥＤＴＡ　；　２ｍ９／−プロテ
イナーゼに０該沈殿をあらかじめ十分に再分散させ、次
いで３７℃で４時間恒温保持し、この際ＨＢＶ−ＤＮＡ
は遊離する。

フェノール抽出 ＨＢＶ−ＤＮＡをフェノール抽出により精製する。

全溶液（約１２０μｔ）を１．５ｄ−”／屋遠心分離容
器中にＷえ、次いで緩衝液で液化されているフェノール
同容量を添加する。両方の液体を振動又は回転により十
分に混合する。このためＫはフォアテックス（Ｖｏｒｔ
ｅｘ　）ミキサーが好適である。エッペンドルフ遠心分
離機（Ｅｐｐｅｎ−ｄｏｒｆ　ｚａｎｔｒｉｆｕｇｅ　
）中で約６０秒間遠心分離する、すなわち約２００　Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、まで十分に加速し、次いでブレーキをかけ
ることにより、該乳液を再び分離する。上方の水層を敗
り出し、新しい容器中で新たにフェノールで抽出スる。

その後、記載した方法で水飽和ジエチルエーテルで２回
抽出するが、この際水層は下である。

アルコール沈降 残った水性ＤＮＡ−溶液（約１００μｔ）に１００μｔ
あたり３Ｍ酢酸ナトリウム２５μｔを、かつ１■／ｄを
有する転移−ＲＮＡ−水溶液２０μｔを担体物質として
加え、その後エタノール３３０μｔを加える。該混合物
を−７０〜−８０℃に冷却し、１５分後に再びＶＷ容器
中で室温で５分間、最高回転数、例えば１２０００　ｒ
、ｐ、ｍ。

で遠心分離する。上澄液を完全に吸い取り、沈殿を真空
中で短時間乾燥し、１０ｍＭトリス−ＨＣ１ｐｋ４７．
４．１騙ＥＤＴＡ　５０μＬ中に溶解し、低温貯蔵する
。放射性崩壊のために１週間以内に更に処理する。

制限分析 ＨＢ’Ｖ−ＤＮＡをクローン化する前に、これをＥＩＢ
Ｖ−ＤＮＡ中にできるだけただ１ケ所切断部位を有づ゛
る制限＃素で切断しなげればならない。試験バッチにお
いては、ＨＢＶ−ＤＮＡ　２〜３　ｌｉｔにＢａｎ１（
Ｉ約１０単位を有するＨ２ｏ２μＬ中のバクテリオファ
ージλのＤＮＡ　（市販３０．５μ９を、かつ反応緩衝
液（２０ｍＭ）リス−Ｈｃｔ　ｐ）１８．０　；　２０
０ｍＭ　ＮａＣｔ；　１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　；　２
　ｍＭβ−メルカプトエタノール）５μｔｆ加え、最終
容量的１０μｔが得られる。ＢａｍＨＩ　ｆ含有しない
コントロールバッチを同様に処理する。３７℃で１時間
恒温保持した後、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１０％
グリセリン及び標識色素として電気泳動による移動に標
識色素として通常使用される０、１チオレンジ色素、例
えばオレンジＧ（メルク社、注文番号６８７８）を有す
る電気泳動緩衝剤１．０μｔを添加し、この混合物を電
気泳動担持穴中に入れる。これと平行して試料か既知の
大きさのＤＮＡ−７ラグメントの混合物、例えばＨｉｎ
ｌ　Ｉで切断されているλ−ＤＮＡ　′ｔ−担持する。

電気泳動は、アガロース２．２　ｌＩを電気泳動緩衝液
２００１Ｌｌと共に加熱することにより得られた１、１
％アガロースデルで行なわれる。緩衝液電気泳動は実験
室で常用の水平又は垂直−デル電気泳動装置中で、有利
に平坦デル中で実施し、この際製造者の指示に注意すべ
きである。

該当する装置中の移動距離は１５〜３０ｃＩｎであり、
ゲル厚は２〜６Ｂ、試料担持は陰極側であり、少なくと
も試料２０μｔを収容することができるのがよい。数時
間後、オレンジＧが帯域としてゲルの陽極方向の端部に
達するまで場の強さを約４〜６ボルト／ｃｌｒＬで実施
する。次いで該デルを取り出しエテジクムデロミド溶液
（５００μｍ７”ｔ）１を中に３０分間浸す。この際、
試料に添加した、同様にＢａｍＨＩで消化されたλ−Ｄ
ＮＡのＤＮＡ帯並びに比較軌跡中の公知ＤＮＡ　−７ラ
グメントの帯域が着色する。長波の買光で照射すること
によりＤＮＡ−７ラグメントは赤色の螢光帯として可視
である。ＨＢＶ−ＤＮＡの量は、場合によりＨＢＶ−Ｄ
ＮＡが可視となるためには十分ではない。この帯状模様
をオレンジフィルターを用いて暗所、１０〜２４０秒の
露光時間で写真をとることが有利である。ＨＢｖ−ＤＮ
Ａの表示のためにはデルを常法で乾燥させるが、この際
にデルを安定な濾過用厚紙又は親水性プラスチック箔〔
例えばデルボンド（ｏｅｌｂｏｎａ）：］上に載せる。

濾過用厚紙を使用する場合には、市販の真空接続部を有
するゲル乾燥装置を使用しなければならない。ゲルポン
１″箔を使用する場合には、濾紙を上に載せるととくよ
り液体を吸い取る。乾燥したゲルは薄層としてゲル担体
上に留まり、これを暗所でＸ−線フイルム又はＸ線増強
箔と、例えばコダックＸＡＲ−フィルム及びデュポン（
Ｄｕｐｏｎｔ　）ハイグラスーフエルステルカーフオー
リス（Ｈｉｐ：Ｌｕ５−ＶｅｒｓｔＫｒｋｅｒｆｏｌｉ
ｆ３　）と及びＸ線カセットと密に接触させる。

フィルムとデルの相対位置は針刺しにより印をつけ、接
着テープにより固定する。１２５沃素標識ＨＢＶ−ＤＮ
Ａはデルの該当位置でＸ線フィルムを黒くする。該フィ
ルムを数時間〜数日の後現像する。

制限切断がなされていない場合、ＨＢＶ−ＤＮＡは一部
環状で、一部線状であるので、ゲルもしくはレントデン
フイルムにおいて２本のバンドが見られる。１方のバン
ドはＤＮＡ−７ラグメントの大きさが塩基対約４０００
に相当し、環状形のものであり、もう１方のバンドは線
状形の塩基対約３０００〜３２００であり、わずかに遠
方に移動している。１ケ所で切断した後は環状ＤＮＡは
線状ＤＮＡに変換し、環状ＤＮＡのデルバンドはＢａｍ
ＨＩ中で消失する。制限酵素が複数ケ所で切断する場合
には、塩基対６０００より少ない新しいＤＮＡ−フラグ
メントが生じる。保存血液からのＨＢＶ−ＤＮＡ単離体
Ｆ９９１は明らかにＢａｍＨＩ−切断位をただ１つ有し
ているので、この単離体を以後の処理に選択した。後の
工程はこのような単離体にのみ好適である。残りの約４
５μｔのＨＢＶ−ＤＮＡ量は前記と同じ緩衝液中で１０
０率位ＢａｍＨＩで、最終容量１００μを中油化するが
、λ−ＤＮＡは添加せず、容量を相応して大きくする。

３７°Ｃで１時間後、ＢａｍＨＩをフェノール抽出及び
エーテル抽出により前記のように除去する。このＢ５１
ｍＨＩ切断ＨＢＶ−ＤＮＡを組み供え及びクローニング
に使用する。

ＤＮＡ−組み換え ベクターとしては市販のプラスミドｐＢｎ　３２２を使
用する。純粋なプラスミド−ＤＮＡ　６μＩを前項に記
載したように５０μを中のＢａｍＨＩ　１０単位を用い
て切断し、フェノール抽出及びエタノール沈降によりＮ
　ａ　シ、Ｈ２Ｏ５０μを中に取り込む。これに１００
　ｍＭ　）リス−Ｈｃｔ　ｐｆ−１８，０２００μを及
びバクテリア・アルカリ性ホスファターゼ［１５，７■
／−；硫酸アンモニウム溶層中４５単位／〜、製造者ウ
アーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　）　１２　μ
ｔを添加する。不純物であるデオキシリボヌクレアーゼ
を不活性化するために、該ホスファターゼをあらかじめ
６５′Ｃで２５分間加熱した。反応混合物を６５℃で６
０分間恒温保持し、次いでフェノール及びエーテルで前
と同様に抽出する。脱ホスホリル化プラスミド−ＤＮＡ
　３０μを及びＢａｍＨＩ切断ＨＢＶ−ＤＮＡ　５０μ
ｔを混合し、前記のように先ずエタノールで沈降させる
。乾燥させたＤＮＡを次の新たに調製した溶液５０μｔ
ｔ／Ｃ取り込む＝３０蜆トリスーＨＣ２ｐｋｌ　７−６
　ｙ　１５　ｍＭＭｇＣｔ２　＃　５０　ｍＭＫＣｌ　
；　２０鮨ジチオトライトール；２０μＩ／ｍｌ牛血清
アルブミン、純粋；１ｍＭアデノシン三燐酸、０．２単
位Ｔ　４−　ＤＮＡ−リガーゼ（市販）。該混合物を１
２．５°Ｃで２４時間恒温保持する。

Ｅ、コリ細胞の形質転換 必要なＬＢ−培地は１％バクトドリプトン（Ｂａｃｔｏ
−ｔｒｙｐｔｏｎ　：乳カゼインの膵液消化物）；０．
５％酵母エキス；蒸留水中の１％ＮａＣｔからなり、か
つ１２０℃で２０分間オートクレーブ処理され【いる。

Ｅ、コＩＪＫＩ　２株４９０（又はこの目的に常用の大
腸菌株ンのコロニーを１ｔの三角フラスコ中のＬＢ−培
地１００１中に接種し、１夜振盪下に３７°Ｃで培養す
るが、この際滅菌フラスコはゆるく置いたアルミニウム
キャップでおおわれている。この予備培地から６−を２
ｔの三角フラスコ中のＬＢ−培地４００創上に移す。こ
れを６７°Ｃで振盪し、この際２０分毎に光学密度（Ｏ
Ｄ）を５５０　ｎｍで測定する。０Ｄ５５０が０．６〜
０．７になったら、該フラスコを氷水中で振盪すること
により０℃に冷却する。次いで、該バクテリアを低温で
６００Ｏｒ、ｐ、ｍで１０分間遠心分離する。該細胞を
１５ｍＭ　ＮａＣ１氷冷溶液少量中に懸濁させ、次いで
氷冷１５　ｍＭ　ＮａＣ２で４００１にする。該細胞を
前記のように４℃で遠心分離し、氷冷６０ｍＭＣａＣ２
２溶液２００１中に取り込み、２０分間氷上に放置する
。次いで、再び遠心分離し、氷冷６０　ｍＭ　ＣａＣｔ
２溶液４０ｄ中に懸濁する。該細胞は使用時まで長くて
１日間氷上で保存することができる。該細胞２００μｔ
を滅ｆｔｉプラスチック試験管中で組み換えＤＮＡ　（
これはりガーゼ反応により得られる）１５〜３０μｔと
混合し、６０分間氷上に放置する。その後、該試験管を
４２℃に加熱した水浴中に正確に１２０秒間授し、次い
で再び氷上に５分間放置する。次いで、Ｌ、Ｂ−培地２
−を加え、該バッチを３７°Ｃで１時間恒温保持する。

これから１００μｔを培地１ＯＮを含有する直径８ｃＩ
ｆＬペトリシヤーレ上に塗布した。該半固体の培地は寒
天ｉ、ｓｙ、バクトドリグトン１ｏＬｅ母エキス１０！
９、ＮａＣ２５ｇｓ蒸留水１Ｌからなる。該成分を混合
し、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理し、５５’
Ｃに冷却する。これに水中の２５１ｎ９／ｍｌアンピシ
リン（ナトリウム塩）の滅菌溶液４祷を添加する。該溶
液１０−を滅菌ペトリシャーレ中に注ぎ出し、凝固させ
る。該プレートを４°Ｃで２週間保持する。塗布プレー
トを３７℃で１夜恒温器中に入れる。生じたコロニーか
ら実際に組み換えＤＮＡの形のプラスミＶ＋有している
コロニーを見い出さなければならない。

ＢａｍＨＩによりグラスミドＰＢＲ３２２中のテトラサ
イクリンに対する耐性遺伝子は破壊される。

外米ＤＮＡが入った時、このプラスミドはそのテトラサ
イクリン耐性金失なう。平行して、得られたコロニー全
規定された順序で、テトラサイクリン２０μｍ１　／ｄ
ｔ有するＬＢ−寒天上に接糧しく５５℃の培地１ｔに５
０％エタノール中のテトラサイクリン−ａｃｚ１０■の
溶液２１を加え、ペトリシャーレに注ぎ込む）、かつ同
時にも５１度同じ順序でＬＢ−アンピシリン−グレート
上に接種する。このためには各コロニーに対してそれぞ
れ滅菌したつまようじが好適である。３７”Ｃで１夜恒
温保持した後両方の培地上のコロニー成長を比較する。

アンピシリン含有培地上で増殖し、ナト２サイクリン富
有培地上で増殖しないコロニーは組み込まれたＨＢＶ　
−ＤＮＡを有する所望のプラスミドを有する大腸菌クロ
ーンの候補クローンである。

最終的な同定はこの候補クローンからプラスミドを単離
し、制限分析により行なわれる。このためには該クロー
ンを滅菌つまようじでそれぞれＬＢ−アンピシリン−寒
天を有する８σペトリシヤーレの面の含に塗布し、３７
°Ｃで１夜培養し、滅菌つまようじで集めて、Ｖ型遠心
分離容器中で緩衝液（２５％蔗糖、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃ１ＰＨ８，０）　２００μｔと十分に懸濁させる。こ
れにリゾチーム溶液（１０■７ｍ１）６６μｔを添加す
る。室温で５分後２５０　ｍＭ　ＥＤＴＡｐ）１８．０
　５．４μｔを添加する。５分後界面活性剤溶液６２０
μｔを添加する：界面活性剤としテ０．１％アルキルフ
ェニホリエチレングリコール〔ドライドｙ　（Ｔｒｉｔ
ｏｎ　）　ｘ　−１００”］　；　７７ｍＭＥＤＴＡ　
ｐ　５０　ｍＭ　）リス−ＨＣ１ｐ）１８．００水浴中
６５℃で１５分間の後、該溶液を４℃で、最大回転数、
例えば１２００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０分間で透明にす
る。上置液を新らしいＶ型容器に入れて、同容量のイソ
ゾロパノール（約５５０μｔ）と混合し、−２０℃で２
時間放置し、ＤＮＡ−沈降物を５分間最高回転数で遠心
分離する。上澄みを完全に取り出し、真空中で短時間乾
燥し、Ｈ２Ｏ７５μを中に再び溶解する。このいわゆる
ミニ溶解物（Ｍｉｎｉｌｙｓａｔ　）はプラスミド−Ｄ
ＮＡ　ｋ供給し、制限分析に好適である。

ミニ溶解物１０μｔを前記の条件でＢａｍＨＩで消化し
、前記のように１．１チアガロ−スプル中で電気泳動分
析を行なう。プラスミドのＤＮＡ　−７ラグメントをエ
チジウムゾロミドで着色し、可視とする。比較物質とし
てＨｉｎｄ　１９７断λ−ＤＮＡ　（市販）１μＩを一
緒に分析する。コロニーが完全９９１−　ＤＮＡ又はＢ
ａｎ阻位を有するＨＢＶ−ＤＮＡ　ｔ−組み入れた７′
″２スミドを有する時、ζｐＢＲ５２２の４０００塩基
対−７２グメントと共に３２００ＢＦ−７ラグメントが
相応するミニ溶解物中に生じる。すべてのＨＢＶ−ＤＮ
Ａ−単離体ではなく、多分はんのわずかなＨＢＶ−ＤＮ
Ａ−単離体だけがＢａｍＨＩ一部位を有しているという
ことは明らかである。厳密に同じ実験法を行なうため罠
は、比較的多くのＨＢＶ−単離体を調べなければならな
い。ｇｃｏＲＩと他のグラスミド、例えばＰＡＣＹＣ！
　１８４を用いて類似の実験を行なうこともできる。

選択された、グラスミドｐＨＢＶ　９９１を有する大腸
菌株をＬＢ−アンピシリン−寒天上に塗布し、生育力の
保持のために６ケ月ごとに新しい培地上に接種する。該
培地は乾燥から守られていなげればならない。ＬＢ−ア
ンピクリン液体培地に２０チグリセリンを混ぜる時、−
２０℃で１年間までの貯蔵が可能である。

１）ＨＢＶ　９９１　ＤＮＡ　ノｆｉ　ｊｌｌｌｉ前記
のように、ｐＨ５Ｖ９９１を有する大腸菌２００ｄの１
夜経過培地をＬＢ−アンピシリン培地１００ｄ中に入れ
る。この予備培地２０１を２ｔ−フラスコ中のＬＢ−ア
ンピシリン培地４００ｄＩＣ接種し、４００ｉｄを有す
る三角フラスコ６個までを平行して使用することができ
る。

フラスコ１個について、以後記載する。増殖は３７℃で
振盪下に行なう。０Ｄ６００　（６００ｎｍで測定した
光学密度〕を追跡するが、側面に突出部を有し、直接測
光機中に装入することのできる、平行して着色するクレ
ットフラスコ（Ｋｌθｔｔｌｃｏｌ’ｂｅｎ　）中で行
なうのが最も好適である。ｏＤ６００が０．４　（２〜
３時間後）になった時にフラスコ１個あたりクロラムフ
ェニコール２．５ｄ（エタノール中３４ダ／ｘｉ）を加
え、次いで３７°Ｇで１夜振盪する。次いで細胞を４９
０で１０分間６０００　ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離する。

上澄みを注ぎ出し、該細胞を水冷緩衝液（１６０ｍＭ　
ＮＡＣ１；　１０　ｍＭ　）リス−ＨＣ１ｓ　ｐＨ７−
ａ　ｚ　１ｍＭ　ｇＤＴＡ　）全１００罰中で懸濁し、
再び遠心分離する。上澄みを流し出し、該ペレットを溶
解緩衝液（５０ｍＭグルコース；　２５　ｍＭ　トリス
−Ｈｃｔ　％　Ｐ）（８，０；　１ｏ　ｍＭ　ＥＤＴＡ
　）で懸濁し、次いでリゾチーム溶液（溶解緩衝液１ｄ
中５０ｍ９）１ｄを加える。室温で５分径変性溶液（１
チラウリル硫酸ナトリウム；　２００　ｍＭ　ＮａＯＨ
）　２０１を添加し、僅かな揺動下に氷上で１０分間貯
蔵する。次いで、高濃度アセテート溶液（３Ｍ酢酸カリ
ウム、２Ｍ酢’／１１）１５ｄを添加し、強力に攪拌し
、更に１０分間氷上に保持する。次いで４℃で２００　
Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離する。

上置は＠透明な溶解物”であり、これにイソプロパノー
ル０．６容量を混合する。２０〜２５℃で１５分後、沈
降物を２０℃で１２００Ｏｒ　−ｐ　ｍ　ｍ　ｓで２０
分間遠心分離し、上澄みを捨て、該沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、真空中で短時間乾燥させ、１Ｑ　ｍＭ
　）　リス、１鮨ＥＤＴＡ　（ＴＥ　）　８−中に溶解
する。

このＤＮＡ溶液１−あたり固体塩化セシウム１１１を添
加して溶解し、該ＣａＣＬ溶液１−あたりエチジウムプ
ロミド溶液（１０１ｎ９／ｄ）　８０μｔを加える。該
密度は１．５５．！ｉ’／ｃｍ３であるべきであり、や
むをえない場合はＴＥ緩衝液又はＣａＣ１で後調製する
。該溶液を透明な密封可能な遠心分離管〔例えば、ベッ
クマン（Ｂｅａｋ−ｍａｎｎ　）のクイックシール（Ｑ
ｕｉｃｋａｅａｌ　）　１６Ｘ７６ｍ〕中に装入し、や
むをえない場合肢管をパラフィン油で縁まで一杯にする
。アングルロー　／　−（例えばベック−ｒ　ｙ　（Ｂ
ｅｃｋｍａｎｎ　）　Ｔ１７０．１）中、２０℃及び４
５０００　ｒ、ｐ、ｍ、で６６時間後、管を取り出し、
この際多くの場合普通の光で２つの赤い帯域が可視であ
る。下方の帯域を注射針でさして取り出すが、この際第
２の針で穴をあけることにより上から空気を導入する。

このようにして得られた溶液からエチジウムプロミドを
水飽和ｎ−デタノール同容量と共に５回振出することに
より抽出する；塩化セシウムをコロジオンケース〔サル
トリウス（５ａｒｔｏｒｉｕｓ　）　）中で’ｒＥ−緩
衝液１００１１Ｌ１３回に対して各２時間の透析により
除去する。次いでｐＨＢＶ　９９１　ＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させ、出発培地４００−あたりＴＥ緩衝液５０
μを中に溶かす。該溶液のＤＮＡ　１１度を適当に希釈
してＵＶ測光により測定する、この際１の０Ｄ２８０は
純粋なりＮＡ　５０μｇ／―に相幽する。

りａ　−ｙ　Ｋ　４９０　ＰＨＢＶ　９９１にオイては
、プレー８（１）−ヌクレオチド配列はコドン１１９個
からなる。

該クローンは寄託機関１ドイツ微生物保存機関（Ｄ８Ｍ
　）　、グリーゼバツハストラーセ（Ｇｒｌｅａａｂａ
ｃｈｇｔｒａｓｓｅ）　８．３４００ｒツテンデン（Ｇ
８ｔｔｉｎｇｅｎ　）　、西ドイツ国”において記号に
４９０　ｐＨ５Ｖ９９１で寄託されており、寄託番号Ｄ
ＳＭ　３０８２である。

ここに使用した株大腸菌に１２の４９０のかわりに、デ
ルクローン化に好適なすべての他の大腸菌に一変異体を
使用することもできる。

２、　　ｐＨＢｖ　９９１　カらのグレー８（１）−７
ラグメントの製造 ａ）　　Ｂｓｔ　Ｅ　ｌ　／　Ｂｓｔ３１　／　Ｅｃｏ
ＲＩ−フジグメント １０　ｍＭ　トリス−Ｅ（Ｃｔｐ）−１７，４及びＥＤ
ＴＡ　１　ｍＭ（緩衝混合液’Ｉ’Ｅ）２０［］μを中
のＢ型肝炎−ＤＮＡ　（りｏ　−ｙ　ｐＨＢＶ　９９１
　）　２６０　ＡｌをＥａｔｇｎｓｏｏ単位で、反応緩
衝液２００μｔＬｙ′）添加下に６０°Ｃで５時間消化
した。反応緩衝液は２　０　０　　ｍＭ　　）　　リ　
ス　−　ａｃｚ、　　ｐＨ７，４；１　００ｍＭＫＣｌ
　；　１０　ｍＭ　ＭｇＣ２２を含有する。該溶液をＴ
Ｅ緩衝液中のジエチルアミノエチル−セルロース約１−
′ｔ−有する小さいクロマトカラム上に添加した。該浴
液が吸い込まれた後、ＴＥ５ｍで洗浄した。その後ＴＥ
中の２　Ｍ　ＮａＣｔｏ、５　ｍｅ　５同順次加え、溶
離液を分離して補集する。それぞれエタノール１−を添
加することにより、ＤＮＡを前のように、しかし他の塩
添加なしに沈殿させ、再び全部で’Ｉ’Ｅ２７５μを中
に溶かす。

２４ＩｎＭＣａＣ１２；２４ｍＭＭｇＣｔ２；４００ｍ
ＭＮａＣｔ；　４０　ｍＭ　）リス−ＨＣ４％　ｐ）１
８．０．２ｍＭＥＤＴＡ　；　０．５　Ｗ／ｄ牛血清ア
ルブミンからなる緩衝液２７５μｔを添加し、該混合物
を３０°Ｃに加熱した。Ｂａｌ　３１を正確に０．６単
位添加した後、正確に−１６分間消化し、そして第２の
同じバッチにおいては１８分間消化する。Ｂａｌ３１は
時間と直線関係で末端部を短かくするので、二つの異な
る時間により、正しい長さの７ラグメントが得られる確
率ｔ′高くすべきである。

個々のＢａｌ３１チヤーゾは試料バッチ中ではじめにそ
の作用が試験されなけ°ればならない。末端部あたり塩
基約２８個が除去されるべきである。

反応はそれぞれ２５０　ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　７０μ
ｔの添加により中断され、次いで両方のバッチの混合物
を６０゛Ｃに１０分間加熱し、次いでコロジオンケース
中で２時間ＴＥ１００ｄに対して透析する。その後ＤＮ
ＡをＫｃ　ｏ　ＲＩで消化した。２００麿トリス−Ｈｃ
ｔ　ｐＨ７，５；　ＮａＣｔｌ　００　ｍＭ　；ＭｇＣ
ｌ２２０　ｍＭの緩衝液同容量及びＥｃｏＲＩ　１００
０単位を添加し、６７℃で２時間恒温保持する。

ＥｃｏＲＩ　を加熱（６０″Ｃ７１０分間）ＩＩＣより
不活性にした。ＤＮＡを二倍容量エタノールで沈降させ
、６．６　ｍＭ　トリス−ＨＣ２ｐＨ７，４，６，６ｍ
ＭＭｌ？：Ｃ１−ｚ　、１　ｍＭジチオドライド”−ル
、５ｍＭＮａＣｔ、　　１００μＭデオキシアデノシン
三燐酸、１００μＭデオキシチミジン三ｇ４酸２０μを
中に溶かし、フレナラ（Ｋ］、ｅｎｏｗ　）−ポリメラ
ーゼ０．２単位で１４℃で１６時間恒温保持する。

塩基対組６７０〜４００の大きさのＤＮＡ−フラグメン
トを５％ポリアクリルアミドｒゲルで電気泳動により分
離する。デル緩衝液及び室緩衝液は６０　ｍＭ　）リス
−硼酸塩、６０ｍＭ硼酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐ）
１８．３　（ＴＢＥ　）であった。デルは長さ２０ｃｍ
５幅１８ｃｒＩＬ及び厚さ１酩であった。試料担持穴は
幅８朋であり、かつそれぞれに１０μｔが装入された。

該試料に電気泳動を行なう前にＴＢＥ中の５０％グリセ
リン；　０．０５％ブロムフェノールブルーを加えた。

電気泳動を２４０ボルトで２〜４ｍ間後、ブロムフェノ
ールブルーがデルの陽極側に遅するまで行なう。その後
、所望のフラグメントは中央の音の区域内にあり、これ
はエチジウムプロミド溶液（０，５μ９／罰）での着色
によりＵＶ光中で可視になる。フラグメント帯域を切り
取り、小さくして、秤量し、次いで同容量の０．５Ｍ酢
散アンモニウム；ｉｍＭＥＤＴＡと混合し、３７℃で１
夜転倒回転させる。

その後２０℃で１０００　Ｏｒ−Ｌｍ−で１０分間強力
に遠心分離する。上泄みをエタノール２容量で沈降させ
、ＴＥ２０μを中に溶かす。

ｂ）　　Ｂａｔ　Ｅ　ＩＩ　／　ＥｃｏＲＩ　７ラグメ
ントＴ　Ｅ　４０　ｆｉｔ中ｆ）　ｐＨＢＶ　９９１　
ＤＮＡ　５０　ｐ９　Ｋ２００　ｍＭ　）リス−ＨＣＬ
ｐ）−１７，４；　１００　ｍＭ　ＫＣｌ；１０　ｍＭ
　ＭｇＣｌ２４０　ｆｉｌを、かつＢａｔ　Ｅ　Ｉｆ　
１２０単位を混合し、６０℃で２時間水浴中で恒温保持
し、次いで２５０　ｍＭ　ＮａＣ２，５０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２２０μＬ及びＥｃｏＲＩ　２００単位を添加し、更
に３７℃で２時間消化した。次いで該溶液を水浴中７０
℃で５分間加熱し、その後マイクロコロジオンケース中
で１時間ＴＥ１００−に対して透析した。該溶液（約１
５０　ｐＬ　）　Ｋ　６０　ｍＭｏＬ酢酸ナトリウム緩
Ｗｉ液Ｐｌ（４−４６；１００ｍＭＮａ（：Ｌ　；　２
　Ｔｎ）Ａ　ＺｎＣｔ２　ｇ　１０％グリセリン緩衝液
、同容量を、かつムング・ビーン／　（ＭｕｎｇＢ（＋
ｈｎｅｎ　）ヌクレアーゼ１００単位を加え、６７°Ｃ
で１０分間恒温保持した。その後、２５０ｍＭ　Ｎａ２
ＥＤＴＡ　３０μｔを添加した。該混合物を前記の１）
で記載したように（フェノール抽出、アルコール沈降を
参照）、フェノール／エーテルで抽出し、エタノールで
沈降させた。ＤＮＡをＴＥ　２０μを中に取り込み、塩
基対４００の長さのフラグメン）　ｔ−２ａ）と同様に
して電気泳動により単離し、ＴＥ２０μを中だエタノー
ル沈降物を溶解する。

ｃ）　　ＡＪＬｕ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ　７ラグメント
次の工程はプレー５（１）−配列を含有する（例えば２
　ｂ）又は２　ａ）により得られた）　ＤＮＡ−７ラグ
メントの増殖に使われるが、この際その他に制限酵累Ａ
ｔｕ　Ｉ　Ｋより、このようなフラグメントから不必要
な塩基対を脱離させる。ベクターとしてはツンメル（Ｔ
ｈｕｍｍｅｌ　）等により記載されているグラスミドＩ
）（）Ｌ、　１０１　ｔ−使用した（　Ｊ、　Ｖｉｒｏ
”１．第３７巻、１９８１年、第６８６〜６９７頁）。

該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０１中で１）に記載したよ
うに増殖させ、抽出し、精製する。ＴＲｌ５μを中の１
）（）Ｌ　１０１　ＤＮＡ　１０μ９に反応緩衝液（１
２ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐ）１７−４　ｓ　１２０　ｒ
ｒｌｈｌ　ＮａＣ２ｔ　１２　ｍＭＭｆ５Ｃ２２ｙ　１
５ｍＭ／−メルカプトエタノール；　０．０２％トライ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　ｘ　１００　）　１５　ｐｔ
を、及びＰｖｕ　ｌ　２０単位を混ぜ、３７”Ｃで２時
間恒温保持する。該混合物を６５℃で１０分間加熱し、
Ｐｖｕ　ｌを不活性化する。

前記の２ｂ）のＴＲｌ０μを中の７ラグメント１μｇに
ＥｃｏＲＩ　−Ｐｖｕ　ｌで切断したシラスミドｐＧＬ
　１０１のＤＮＡ　０．３　μｌｌを加え、かつ５　Ｑ
　ｍＭトリスＨＣ２ＳＰＨ７−４−、１０ｍＭＭｇＣＬ
２．１　ｍＭアデノシン三燐酸塩２０μを中でＴ　４−
　ＤＮＡ　！ｊガーゼ０．１単位で４　’Ｃで１８時間
連結する。ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ　）の方法により
バッチの士で大腸菌株ＪＭ１０１（アメルスハム　ブラ
ウンシュバイク（Ａｍｅｒｇｈａｍ　Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ　）　：ｌが形質転換し、アンピシリン含有グ
レート上で選択した。プレー８（１）−フラグメントを
有する形質転換体を、その場でコロニーのハイブリダイ
ゼーションによりニトロセルロース膜上で３ａｐ−標識
Ｂ型肝炎ビールス−ＤＮＡと同定し總陽性のクローンか
らミニ溶解物が製造され、その中に含有されるプラスミ
ド−ＤＮＡ　ｆ：Ａｔｕ　Ｉで消化した。この際、再び
主にグレー８（１）−配列ｔ−金含有る４５０塩基対フ
ラグメントが生じた。Ａｊｕ　ｌ消化物中で所望の４５
０塩基対フツグメントを有する選択されたクローンから
精製したプラスミド−ＤＮＡを調製規模で製造し、この
５ちの５０μ７７　ｔ−Ａｔｕ　（で消化し、クレー８
（１）配列を有する所望のＤＮＡ−７ラグメントをｒル
ミ気泳動により単離し、エタノール沈降後、’ｒｇ　２
　［１μＬ中に溶解した。

３、　　クレー５（１）−ポリペプチドの発現ａ）　　
Ｌａｃ　ｕｖ　５プロモーターによる転写コントロール
。

Ｂａｔ　Ｅ　ｆｌ　／　Ｂａｔ３１　／　ＥｃｏＲＩ　
７ラグメントもしくはＡｊｕ　ｌ　／　ＥＣＯ五フラグ
メントを２　ｃ）におけるようにｐＧＬ　１０１と連結
し、大腸菌ＪＭ１０１中でクローン化する。フラグメン
ト挿入の正しい極性はそれぞれのｆ−ｙスミドＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ及び８ａｕ　９６１での二重消化及びフラグ
メントの大きさの測定により求められる。正しい極性に
おいては塩基対１４００．６１６．２２２．７９．１８
．１７個を有する７ラグメ　　　゛ントの他に２００塩
基対フラグメントが生じ、誤まった極性においてはその
かわりに塩基対６８０個を有するフラグメントが生じる
。

ｂ）　　ｔａａ−プロモーターによる転与コントロール
。

グラスミドＤＮＡ　ｐＤＲ５４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
−ＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ　）　５０　ｔｔｌを
ＢａｍＨＩ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂａ
　）で消化し、突き出ている末端部を前記のようにムン
グ・ビーン（Ｍｕｎｇ−Ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼで短
かくする。フェノールで抽出し、ｘ　ｐ　７−　／ｌ／
で沈降したＤＮＡ　０．３　ＩｌｌをＡｔｕ■／Ｅｃｏ
ＲＩ　７　、ｉ’グメント１μｌと前記のように連結し
、該組み換えＤＮＡをクローン化する。正しい極性を有
するクローンを、該プラスミドをＨｉｎｉ　ｌ及びＢａ
Ｌ　ｌで消化することにより決定する。正しい極性にお
いては２５０塩基対７ラグメントが得られ、誤った極性
においてはそのかわりに３６０塩基対７ラグメントが得
られる。

ａ）　　グレー５（１）−ボリペゾチド生産クローンの
同定。

正しい極性を有するクローンをニドｕセルロース膜上に
塗布し、該膜をＬＢ−培地、１００μｓ／１アンピシリ
ン及び１ｍＭイングロビルチオガラクトシドからなる寒
天培地上に載置し、６７°Ｃで１夜培養する。該コロニ
ーをその場で湿ったｍＭ上に載せリゾチーム５■／Ｍ！
！及びクロロホルム蒸気で室温で１５分間２溶菌する。

仄いで、該膜をモノクロナール抗体ＭＡ　１８／７の１
：４希釈ハイブリドーム培地上筐み液と共に６７℃で１
時間振盪し、０．２％トウィーン２０で６回洗浄し、マ
ウス１８（）　Ｋ対する抗体、ペルオキシダーゼ標識、
（タコパツツ；　Ｄａｋｏ−ｐａｔｔａ　）　ｉ　：　
１０００と２０％牛血清中で３７’Ｃで１時間振盪し、
ＰＨ３中の肌５％界面活性剤ツウイーン２０で３回洗浄
し、０．０１％ジアミノベンチジン、０．０３％Ｈ２Ｏ
２で着色する。

Ｓａの：！ロニーはＢ　性のコントロールコロニーより
明らかに強く着色する。

グレー５（１）−ポリペグチｒの抽出及び濃縮 ａ）所望の生成物の濃縮のためには免疫吸着体を製造し
た。孔径１４０　ｎｍを有する多孔性アミノグロビルー
ガラス球（アミノグロビル基を含有するガラス球）　（
Ｆｌｕｋａ　）　３９を０．６ＭＮａＨＣＯ３中の６％
グルタルジアルデヒｒと共に室温で３０分間振盪し、十
分に水で洗浄し、次いで０．０１　Ｍ　ＮａＨＣＯ３ｐ
Ｈ９，１中のマウス腹水力らのモノクロナール抗体ＭＡ
　１８／７　（一定の特徴免疫グロブリンＧ１／Ｋａｐ
ｐａを有する）（１７チ硫歌ナトリウムで２回沈降させ
ることにより精製）５０１１９と室温で４時間振盪する
。球を０．１３　Ｍ　ＮａＣ２及び０．０２ＭＮａ−燐
酸塩出７．４　（ＰＢ８溶液）で洗浄し、次いで０．０
１　ＭＮａＨＣＯ３中の０．１％ｍ水素化ナトリウム５
−と共に氷上で２時間攪拌する。次いで、ガラス球を小
型カラム中で、先ずＰＨ８２０ｘｉで、次いで３　Ｍ　
　Ｎａ５ＣＮ　２１！Ｌｌｚ次いでも５１度ＰＢＳ　２
０　ｄで洗浄する。

ｂ）グレー５（１）発現する大腸菌クローン、例えば３
ａ）によるｐＫｏ　１又は３１））によるｐＫｏ２をア
ンピシリン１００μｍ１／ｌｄを有するＬＢ培地中で１
伎培養し、このうちの１０ｄを２ｔ−フラスコ中の１　
ｍｕ　ＩＰＴＧを有するＬＢ培地４００上に接種し、３
７℃で振盪する。６００　ｎｍにおける光学密度が２．
５に達したら、細胞を遠心分離し、該ペレットを１０　
ｍＭ　）リスａｃｔ　ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　
（緩衝液ＴＥ　）同容量中に懸濁し、５Ｉｖ／１ｊＬｌ
リゾチーム及びＴＥ中の１％ノ二デットｐ４ｏを加える
。氷上で１０分後、４℃で１２００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
１５分間遠心分離した。上置み液は透明な溶菌物である
。

Ｃ）透明な溶菌物６．５助を、１時間かけてポンプでミ
ニカラム（寸法５　Ｘ　５０　ｍｍ　）中の免役吸着体
（５Ｌ）により製造）１−中を通す。カラムを順次、そ
れぞれ０．２％ツウイーン２０を含有するＴＥ　２　ｔ
ｘｌｚ　Ｃ６５Ｍ　　ＮａＣＬ２１ＬＩ　％　Ｈ２Ｏ２
０虹で洗浄する。次いで、グレー５（１）−ボリペグチ
ドをＴＥ緩衝液中の３　Ｍ　　Ｎａ８ＯＮ　２　ｍで溶
かし、フラクション１００μＬを採取した。はじめの６
つのフラクションは約１０倍に濃縮したプレー８（１）
−ボリペグテドが純粋な形で得られる。溶離液を合し、
２時間ＰＢＳ溶液（０，１３Ｍ　　ＮａＣＬ　＋　０．
０２　Ｍ　Ｎａ−燐酸塩出７．４〕に対して透析し、凍
結する。

得られたポリペグチドは特許請求の範囲第８項に記載し
た式Ｉ（ここで、Ｘ　”　ＭｅｔＧｌｎＴｒｐＬｅｕＰ
ｒｏＡｒｇＡｌａＰｈｅＡｒｇ−ＯＨ）を有する。

技術的用語及び略語は次のものを表わす。

Ｔｒｉｍ　：　トリスヒドロキシメチルアミノエタンＩ ＥＤＴＡ　：エチレンジアミノ四酢酸、ＴＥ　：　１　
ｔあたりトリスＨＣｔｐ）１７．４１０ミリモル及びＥ
ＤＴＡ　１ミリモルを官有する水性緩衝混合液、 ＬＢ−培地：該培地は乳カゼインの１％膵液消化物（バ
クトドリプトン）、０．５％酵母エキス及び１％Ｎｅ、
Ｃ１（蒸留水中）からなり、オートクレーブ中で１２０
℃で２０分間加熱した、 ＰＢＳ　：　１　ｔあたりＮａＣＡ　１３０ミリモル及
び燐酸ナトリウムｐ）１７．４　２０ミリモルを含有す
る水性緩衝混合液。

ツウイーン２０：ポリオキシエチレン＜２０）−ンルビ
タンモノラウレート 開放解読わく：開始コドンで始まり、終止；トンで終結
するコドンの最長の可能な 連続配列。

コドン：ポリペプチド配列中のアミノ酸を暗号付けする
か、又は３つの終止コドン （ＴＡＡＳＴＧＡＸＴＡ（）　）の１つとしてタンパク
質生合成の中断を暗号付ゆする ヌクレオチド塩基の３単位 開始コドン（ＡＴＧ　）　：タンパク質生合成を開始す
るために必要であり、アミノ酸メ チオニンをタンパク質配列のアミン末 端で又はタンパク質配列内で暗号付け する。

ＥｃｏＲＩ　：制限エンドヌクレアーゼ（例えばＢＲＩ
−社）、 Ｂａｔｇｎ　：制限エンドヌクレアーゼ（例えばＢＲＬ
１社）、 ＢＧｔＩＩ　：制限エンドヌクレアーゼ（例えば凰社）
、 Ｂａｔ３１：２本鎖特異性エキソヌクレアーゼ（例えば
ＢＲＬ社ン、 クレナウーボリメラーゼ：クレナク（Ｋ：Ｌｅｎｏｗ）
によるＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム
社）、 ムング・ビーン・ヌクレアーゼ：１本鎖特異性エキソヌ
クレアーゼ（ＰＬ−ＢｉＯ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）） Ａｔｕ　Ｉ　：制限酵素（ＢＲＬ社）、Ｔ４−ＤＮＡ−
リガーゼ：　種々のＤＮＡ分子を結合する酵素〔バイ第
２デズ（Ｂｉｏｌａｂａ　）社〕 Ｓａｕ　９６１　：　　制限エンドヌクレアーゼ〔二ニ
ー・イングランド・バイオオラブズ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ’ｂａ　）社〕
ＢａｍＨＩ：制限エンドヌクレアーゼ（二ニー・イング
ランド・バイオラデズ社） Ｈｉｎｄ　Ｎ　：　制限エンげヌクレアーゼ（二ニー・
イングランド・バイオラデズ社） Ｂａｔ　Ｉ　：　ｉｌｌ限エンドヌクレアーゼ（二ニー
・イングランド・バイ第２デズ社） 表現プラスミドｐＧＬ　１０１　：その出発グラスミド
ｐＢＲ３２２に対して、これはＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ　ｌ
［−制限切断により塩基２０６６だけ短か（されている
。生じた切れ口 中に、ＥｃｏＲＩ部位及びＰｖｕ…部位の再生下にＤＮ
Ａ　７ラグメントが挿入され、該〕２グメントは誘発性
Ｌａｃ　ｕｖ　５−プロモーターを有する。大腸菌中に
天 然に存在するＬａｃ−プロモーターのこの変種は遺伝子
をＣＡＰ−遺伝子生成物の結合によらず表現することが
できる。

文献：　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　、第３７巻、１９８１年、
第６８３〜６９７頁。

例　　■ Ｂ型肝炎ビールス（ＨＢＶ　）又はＢ型肝炎ビールス表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）からグレー８（１）−アミノ酸配
列及びプレー５（２）−配列を有するポリペプチドの製
造 該例によるペプチドは第１図によるプレー５（１）−ア
ミノ酸配列及びグレー５（２）−アミノ酸配列からなり
、両方のアミノ酸メチオニン及びグルタミン酸がグレー
５（２）に接続しているグレーＳ−ポリペプチドである
。

出発物質として好適であるのは特にＨＢＶ−粒子又はＨ
Ｂ８Ａｇ−フィラメントであり、これらは常法で又はこ
の例の終わりに記載されている方法で精製された。精製
ＨＢｓＡｇ　２０　ｎｍ粒子も該粒子が十分量のタンパ
ク質Ｐ３９及びＧＰ　４２を含有している場合は好適で
ある。各試料のりンパク質宮量は改良２８０　ｎｍにお
ける匠−測光機により測定されるが、この際吸光係数４
．６はＨＢＶ−タンパク質又はＨＢａＡｇ−タンパク質
１ｍ９／１の溶液と想定された。１３０　ｍＭ　ＮａＣ
ｔ。

２０ｍＭ燐酸ナトリウム−７，５を含有する水溶液（緩
衝液ＰＢＳ　）　０．４　ｄ中の精製ＨＢＶ粒子４０μ
ｇ又は精製ＨＢ８Ａｇフィラメント４００μｇ又はＨＢ
ｓＡｇ’；！　Ｏｎｍ粒子４ｍ９に５００　ｍＭ　）リ
ス−ａｃｔ　ｐ）１７．４　；　０．５％ドデシル硫酸
ナトリウム；５％ジチオドライド（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｉｔ　）の水溶液０．１　ｍＪを、次いでＰＢＳ　５
０μを中のスタフイロコックス・アウレウス（５ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ　）　Ｖ　８からの
純粋プロテアーゼ０．１２５■を加える。該混合物を６
７℃で恒温保持した。

２４時間後及び４８時間後にそれぞれプロテアーゼ溶液
５０μｔを追加した。７２時間後、該溶液に６％ドデシ
ル硫酸ナトリウム、１０％ジチオドライド、１４０ｍＭ
　トリス−Ｈｃｔ　ｐｆ（６，８；２２％グリセリン、
；０．０３％ブロムフェノールブルーの水溶液０．６ｄ
’を加え、９５°Ｃで５分間加熱した。その後５０μｔ
のアリコートに関して、該溶液を１５％ポリアクリルア
ミドデルにより電気泳動を行なった。該分離デルは厚さ
１．５ｍ、幅１８ｃｒＩＬ及び長さ２４ｃｍであった。

これは陰極に試料穴１０個を有した。外側にある試料穴
には既知分子量を有するタンパク質マーカー混合物を入
れる。緩衝剤系はレムリ（Ｌａｅ−ｍｍｌｉ　）により
記載されている〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、第２
２７巻（１９７０年ン、第６８０〜６８５頁〕。電気泳
動を６〜６ボルト／ｃｒＩＬで１夜かけて行なった。次
いで、デルを取り出し、分離した１つのアリコート及び
タンパク質マーカーを有する２ｃＩＩｔ幅の長尺ストリ
ップを切断し、メリル（Ｍｅｒｉｌｌ　）等の方法によ
り銀で着色する〔サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）　第２
１１巻（１９８１年）第１４３７頁〕。既知分子量のタ
ンパク質マーカーと比較することにより、プロテアーゼ
消化物中のプレー８−７ラグメントの１８０００ダルト
ンの帯域が同定される。

着色していないデル部分中の相応する帯域を切り取り、
回転乳棒を有するセルホモブナイブ−〔ホラター・エル
グエイエム（Ｐｏｔｔｅｒ　−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ　）に
より〕で微細にし、水中の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウ
ム溶液３容量と共に２時間振盪した。強力な遠心分離（
１００００ｒ、ｐ−ｍ−）の後、グレーＳ−タンバク質
７ラグメントを有する上澄液を凍結乾燥した。

１８０００ダルトンのプレーＳ−ポリペプチドはグロテ
インＰ３９及びＧＰ　ａ　２からのみ由来するものであ
り、ＨＢＶ又はＨＢａＡｇの他のタンパク質に由来する
ものであってはならないので、出発材料が該タンパク質
を含有しているということが保証されていなげればなら
ない。このことは０．７５ｍｍの厚さのデル層を有し、
その他は前記と同じである分析用ポリアクリルアミドデ
ル電気泳動により確認することが最も有利である。電気
泳動穴あたり純粋なＨＢｓＡｇタンパク質２μｌを使用
して開始する時、銀着色において約３９０００及び４２
０００ダルトンの位置に明らかに認識される着色帯域を
認識することができる。

ＨＢＶ−粒子及びＨＢ５１Ａｇフィラメントの精製は次
のように行なわれた： １１１ＬｌあたりＢ型肝炎ビールス１０８以上を有する
人血清（約１５０ｄ）をＴＮＥ−緩衝液（０−１３Ｍ　
　ＮａＣｔｓ　　１０　ｍＭ　トリスヒドロキシアミン
メタンＨＣ７、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＢＤＴＡ　、水中
）と共にポンプで、球状の６％アガロースデル〔例えば
バイオデ／Ｉ／　（Ｂｉｏｇｅ’ｌ　）　Ａ　５　Ｍ″
ｌを有するクロマトグラフィーカラム（厚さ１０ｃ！ｎ
。

長さ１００ｃｉ）中を通過させた。捕集した５００個の
フラクション１５ｄをビールスコア抗原に関して酵素免
疫テスト（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第４２巻、１９８２年、
第７６１頁ンで試験したが、この際ビールス外被をテス
トの前に０．５％ノニデツ）Ｐ２Ｏ及び０．３％β−メ
ルカグトエタノール（それぞれ最終濃度）であらかじめ
分解した。

陽性フラクションを合し、そのうちの各６０−を収容能
力６８ｍ１の遠心分離管１０〜１２本中でＴＨＥ緩衝液
中の６０％蔗糖＃液（Ｎ量７１鈑）ｓｒｕｇ上に積層す
る。肢管をスウィング・チューブ・ローター〔例えばベ
ックマン（Ｂｓｃｋｍａｎｎ）社のＳＷ　２８　）中で
１０℃で２５００　Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で２４時間遠心分離する。上澄みを完全に除去し、各管
６本からの沈殿物をＴＨＥ緩衝液１１中に懸濁させる。

このビールス懸濁液をＴＨＥ緩衝液中の３０〜５５％の
蔗糖濃度傾斜液上に１３酎遠心分離管（例えばペックマ
ン社のローターＳＷ　４２　Ｔｉ用）中で積層し、１０
℃で３４００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０時間遠心分離した。

管底を突き刺して、フラクション４００μｔを集め、該
フラクションの２５μｔをコア抗原（前記の酵素免役テ
ス））及びＨＢａＡｇ（前記酵素免疫テストノに関して
定量的に試験した。最大コア抗原活性を有するフラクシ
ョンは主にＢ型肝炎ビールス粒子（ＨＢｖ−粒子〕を含
有し、はとんど他のタンパク質を含有しない。ＨＢｓＡ
ｇビークフラクションは主にＨＢａＡｇフィラメントか
らなる。

例　　ｌ グレー５（１）に対するモノクロナール抗体ａ）Ｂｆｉ
肝炎ビールス及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）の
精製： １−あたりＢ型肝炎ビールス１０８以上を有する人血清
（約１５０ｄ、ｌを’ｒＮＥ−緩衝液（０，１３Ｍ　　
ＮａＣ１，１０ｍＭ　）リスヒドロキシアミノエタンＨ
ｃｔ　、　ｐ）１７．ａ　、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　１水
中ンと共にポンプで、球状の６％アガロースデル〔例え
ばバイオデル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ａ　５　Ｍ　］を有す
るクロマドグ２フイーカラム（厚さ１Ｄα長さ１００ｃ
ｒＩＬ）中を通過させた。捕集した５００個のフラクシ
ョン１５ｍ１をビールスコア抗原に関して酵素免疫テス
ト（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第４２巻、１９８２年、第７６
１頁）で試験したが、この際ビールス外被をテストの前
に０．５％ノニデットｐ４０及び０．３％β−メルカプ
トエタノール（それぞれ最終濃度）であらかじめ分解し
た。

陽性７ラクシヨンを合し、そのうちの各３０１を収容能
力６８創の遠心分離管１０〜１２本中でＴＮＥ緩衝液中
の６０％Ｍ糖浴液（ＴＬ量ＺＴＬ量）８ａ上に積層する
。肢管をスウィング・チューブ・ローター〔例えばペッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社のｓｗ　２８　：ｌ中で
１０℃で２５００　Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で２４時間遠心分離する。上澄を完全に除去狐容管６本
からの沈殿物ｆｔＴＮＥ緩衝液１ｄ中に懸濁させる。こ
のビールス懸濁液をＴＮＥ緩衝液中３０〜５５％の蔗糖
濃度傾斜液上に１３ｄ遠心分離管（例えばベックマン社
のｏ　−ＩＩ　−８Ｗ　４２Ｔｉ用）中テａｔ層し、１
０℃で５４００　Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で２Ｄ時間遠心分離した。管底を突き刺して、フラクシ
ョン４００μｔを集め、該フラクションの２５μｔをコ
ア抗原（前記の酵素免疫テスト）及びＨＢａＡｇ（前記
酵素免疫テスト）に関して定量的に試験した。最大コア
抗原活性を有するフラクションは主にＢ型肝炎ビールス
粒子（ＨＢＶ−粒子）を含有し、はとんど他のタンパク
質を含有しない。ＨＢａＡｇビーク７．５クシヨンは主
にＨＢａＡｇフィラメントからなる。

ｂ）ａ胞りローンＧｏ　ＩＡ　１８／７−１主にＨＢＶ
粒子を含有するりにより得られたフラクション０．５ｍ
ｌを生理食塩水に対して透析し、完全フロイントのアジ
ュバント（Ｆｒｅｕｎａ’５ｃｈａｎ　Ａｄｊｕｖａｎ
ａ　）　０．５　ａｔと共に乳化し、種Ｂａｔｂ　／　
ｃのマウス中腹腔内注射した。４週間後、不完全７０イ
ンドのアジュバント（ミコバクテリウム不含）中のＨＢ
Ｖ−粒子０．５編を新たに注射した。４目抜マウスの牌
臓を取り出し、小さく破砕し、公知法により〔パンフレ
ット：ハイプリドーマ・テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）　、：ｌ−ルドースグリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏＩＡ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ＨａｒｂｏｒＬ５１ｂｏｒａｔｏｒｙ　）出版、１
９８０年、コールド・スプリング・ハーバ−１・ニュー
ヨーク、ＵＳＡ参照〕タイプＰ　３　Ｘ　６８−　Ａｇ
　８．６５３のマウス骨髄腫細胞〔ジャーナル・オブ・
イムノロジー　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ン第２３巻（
１９８０年）、第１５４８頁〕と融合する。雑種細胞を
公知法（前記パンフレット、ハイプリドーマ・テクニッ
クスノによりクローン化しく制限希釈法ン、選択し、培
養する。ＢＷ肝炎ビールスに対する抗体を生産する細胞
クローンを同定するために、細胞液体培地（すなわちク
ローンの上澄み）を次のように前処理したマイクロ力価
カップ中に入れる：　ＨＢＶ粒子２０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム−７，４で１：１００に希釈し、コノ希釈ＨＢＶ　ｆ
ｉ合物５０μｔをマイクロ力１曲カップ中に加える；室
温で４時間後にＨＢＶ混合物を除去する。引き続き、緩
衝液ＰＢＳ　（１６０ｍＭＮａＣＬ％　２０　ｍＭ燐酸
ナトリウム−７，５）中の１％牛血清アルデミン浴液１
００μｔをマイクロ力価カップ中に２時間加え、次いで
除去し、カッｆをＰＢＳ−緩衝液で３回洗浄した。抗体
の結合をペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン
の添加後、着色反応により可視とする（パンフレット、
）−イブリドーマ・テクニックス参照）。上澄み液が強
い呈色反応を示すクローンをより大きな培地容器に移し
、これがプレー５（１）−ポリペプチドと（例えばペプ
チ）’Ｐ３９もしくはＣ）Ｐ４２とン反応するが、ポリ
ペプチドＧＰ　３３〔バイロロギー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　）　、第１２３巻、１９８２年、第４３６〜４４２頁
〕とは反応しないかどうかに関して試験した。２種のク
ローンはこの前提条件を満たした。そのうちの１種はク
ローンＧｏ　ＩＡ　Ｉ８／７−１と呼ばれ、再クローン
化され、かつより大きな培地中又はマウス（ＢａＬ″ｂ
／ｃ　）中腹水腫として増殖する。該クローンＧｏ　Ｉ
　Ａ１８／７−１は抗体ＭＡ　１８−７を生産する。抗
体は細胞液体培地中に存在するか、又は１０００倍の濃
度で腹水中に存在する。（マウス中での増殖は次のよう
に行なわれる：　Ｒ，Ｈ。

ケネット（Ｋｅｎｎｅｔ　）、Ｊ、Ｊ、　ｆｆツクカー
ン（ＭｃＫｅａｒｎ　）　、Ｋ、Ｄ、ベヒトール（Ｂｅ
ｃｈｔｏｌ　）共著ζモノクロナール・アンチざディー
ズ、ハイデリドーマズ（Ｍｏｎｏｃ：Ｌｏｎａｌ　Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ　。

Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　）　ニア・二ニー・ディメンシ
ョンイン・バイオロジカル・アナライシス（ａ　ｎｅｗ
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａ
ｎａｌｙｓｅｓ　）　、プレナム・プレス・ニューヨー
ク　ラント・ロンドン（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｕｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　）１９８２年
、第４０３〜４０４頁。クローンＧｏ　Ｉ　Ａ　ＩＶ７
−１は一定の特性を有する免疫グロデリンエｇＧ１、カ
ッパ（ｋａｐｐａ　）を有し、これは特異的にＨＢＶ−
粒子、ＨＢ８Ａｇ　フィラメント及び２０　ｎｍ粒子中
のＰ　３９　／　ＧＰ　４２に、かつグレー５（１）ポ
リペプチドに結合する。抗体ＭＡ１８／７は界面活性剤
、還元剤及び熱により変性されたＰ３９／ＧＰ４２にも
結合する。Ｐ３９／　ＧＰ　４２をＶ８７’ロチアーゼ
で切断すると、抗体は特異的に質量ｉ　５ｏｏｏダルト
ンのグレー８（１）−ポリペプチドに結合する。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＥ１１　Ａｇを暗号付けする開放解読わくを
示し、第２［Ｆ］は固相によるオリゴペプチド合成法を
示す。 ニＬシｚｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、主にプレーＳ（１）−ヌクレオチド配列より成る、
   Ｂ型肝炎ビールス又はＢ型肝炎ビールス成分からのＤＮ
   Ａフラグメントにおいて、それは１０８又は１１９コド
   ンの配列であり、その配列がＢ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡ
   ｇを暗号付けする開放解読わくの第１開始コドンで開始
   しかつ解読わくの終止コドンより２８１コドン前で終結
   することを特徴とするＢ型肝炎ビールス又はＢ型肝炎ビ
   ールス成分からのＤＮＡフラグメント。 ２、１０８又は１１９コドンの配列であり、その配列が
   Ｂ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇを暗号付けする開放解読わ
   くの第１開始コドンで開始しかつ解読わくの終止コドン
   より２８１コドン前で終結するプレーＳ（１）−ヌクレ
   オチド配列より成る、Ｂ型肝炎ビールス又はＢ型肝炎ビ
   ールス成分からのＤＮＡフラグメントにより暗号付けさ
   れるプレーＳ（１）−アミノ酸配列よりもつぱら成るか
   又は主にそれより成るポリペプチド。 ３、もつぱら又は主にプレーＳ（１）−アミノ酸配列よ
   り成るポリペプチドにおいて、このプレーＳ（１）−ア
   ミノ酸配列が、酵素ＢｅｔＥIIによるＢ型肝炎ＤＮＡの
   切断部位後の最初のメチオニンコドンＡＴＧにより暗号
   付けされるメチオニンで開始し、かつこのプレーＳ（１
   ）−アミノ酸配列の終結が、酵素ＥｃｏＲ I によるＢ
   型肝炎ＤＮＡの切断部位前の最初のアラニンコドンＧＣ
   Ｃにより暗号付けされるアラニンであることを特徴とす
   るポリペプチド。 ４、前記のプレーＳ（１）−アミノ酸配列もしくは特許
   請求の範囲第１項によるプレーＳ（１）−ヌクレオチド
   配列により暗号付けされるプレーＳ（１）−アミノ酸配
   列、又は少なくとも６個のアミノ酸から成るこのプレー
   Ｓ（１）−アミノ酸配列の免疫原性部分配列を含有する
   が、但しヨーロッパ特許出願第００２０２５１号明細書
   の特許請求の範囲第２７項によるタンパク質は除く特許
   請求の範囲第２項又は第３項記載のポリペプチド又はオ
   リゴペプチド。 ５、アミノ酸配列プレーＳ（１）−Ｘを有していて、Ｘ
   がアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】、【アミノ
   酸配列があります】、【アミノ酸配列があります】、【
   アミノ酸配列があります】、 【アミノ酸配列があります】、 【アミノ酸配列があります】、 【アミノ酸配列があります】、 【アミノ酸配列があります】又はＸが等価である他のタ
   ンパク質を表わすが、但しヨーロッパ特許出願第００２
   ０２５１号明細書の特許請求の範囲第２７項記載のタン
   パク質は除く特許請求の範囲第２項から第４項までのい
   ずれか１項記載のポリペプチド。 ６、少なくともペプチドフラグメント【遺伝子配列があ
   ります】；【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】 又は前記のペプチドフラグメント からの少なくとも６個のアミノ酸を前記の順序で含有す
   るが、但しヨーロッパ特許出願第００２０２５１号明細
   書の特許請求の範囲第２７項記載のタンパク質は除く特
   許請求の範囲第２項から第５項までのいずれか１項記載
   のポリペプチド又はオリゴペプチド。 ７、式：【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】；【遺伝子配列があります】
   ；【遺伝子配列があります】；【遺伝子配列があります
   】又は【遺伝子配列があります】である特許請求の範囲
   第２項から第６項までのいずれか１項記載のオリゴペプ
   チド。 ８、式 I ： 【遺伝子配列があります】 又は式II： 【遺伝子配列があります】 又は式III： 【遺伝子配列があります】 又は式IV： 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＝ＯＨか又はペプチドフラグメント【遺伝子配
   列があります】、【遺伝子配列があります】、【遺伝子
   配列があります】、【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】 又はプレーＳ（２）−配列【遺伝子配列があります】を
   表わす〕の特許請求の範囲第２項 から第７項までのいずれか１極記載のポリペプチド又は
   これらのペプチドの等価の変異体。 ９、細菌、酵母又は動物性細胞中でプレーＳ（１）−配
   列を発現する能力を有する組み換えＤＮＡ分子。 １０、第１図に図示されている少なくともプレーＳ（１
   ）−ヌクレオチド配列か又は少なくとも６個のコドンか
   ら成るこのヌクレオチド配列のサブユニットを含有する
   ＤＮＡフラグメント。 １１、全プレーＳ（１）−アミノ酸配列又はこのプレー
   Ｓ（１）−アミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸か
   ら成る部分を発現するために組み換えＤＮＡ分子を含有
   するプラスミド型又はファージ型のＤＮＡベクター。 １２、プレーＳ（１）−ヌクレオチド配列を有するＢ型
   肝炎ＤＮＡのＡｌｕ I ／ＥｃｏＲ I −フラグメント又
   はＢｅｔＥII＋Ｂａｌ３１／ＥｃｏＲ I −フラグメン
   ト又はＢｇｌII／ＥｃｏＲ I −フラグメントを含有す
   る特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡベクター。 １３、ドイツ微生物保存機関ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３
   ０７９、ＤＳＭ３０８０及びＤＳＭ３０８１で寄託され
   ているような、プレーＳ（１）−ポリペプチドを発現す
   るエシェリヒア・コリＫ １２変異体。 １４、Ｂ型肝炎ビールスＤＮＡのプレーＳ（１）−ヌク
   レオチド配列により暗号付けされるポリペプチドもしく
   はプレーＳ（１）−アミノ酸配列又はそのうちの少なく
   とも６個のアミノ酸より成るサブユニットを含有するポ
   リペプチドを製造する方法において、公知方法で、Ｂ型
   肝炎ビールスＤＮＡを同時に又は順次に １）ヌクレオチド配列ＧＡＡＴＴＣを分離する制限エン
   ドヌクレアーゼで処理し、 ２）ヌクレオチド配列ＡＧＣＴ及び／又はヌクレオチド
   配列ＡＧＡＴＣＴ及び／又はヌクレオチド配列ＧＧＴＮ
   ＡＣＣを分離する制限エンドヌクレアーゼで処理し、か
   つこのようにして得られた主にプレーＳ（１）−配列よ
   り成るＤＮＡフラグメントを常用のベクターのＤＮＡと
   組み換え、この組み換えベクターＤＮＡを細菌の宿主微
   生物中に移入しかつ選択及びクローン化後にプレーＳ（
   １）−アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させか
   つ単離することを特徴とするポリペプチドの製法。 １５、Ｂ型肝炎ビールスＤＮＡのプレーＳ（１）−ヌク
   レオチド配列により暗号付けされるポリペプチドもしく
   はプレーＳ（１）−アミノ酸配列又はそのうちの少なく
   とも６個のアミノ酸より成るサブユニットを含有するポ
   リペプチドを製造する方法において、公知方法でＢ型肝
   炎表面抗原又はＢ型肝炎ビールス粒子をジスルフィド架
   橋員を分解する試薬の存在においてイオン系界面活性剤
   で単一タンパク質に分解しかつこれをブロムシアン又は
   グルタミン酸特異性プロテアーゼで処理し、次いで場合
   により更にグルタミン酸特異性プロテアーゼで処理し、
   プレーＳ（１）−配列又は場合によりプレーＳ（１）−
   配列を包含するタンパク質フラグメントを単離すること
   を特徴とするポリペプチドの製法。 １６、Ｂ型肝炎ビールスＤＮＡのプレーＳ（１）−ヌク
   レオチド配列により暗号付けされるポリペプチドもしく
   はプレーＳ（１）−アミノ酸配列又はそのうちの少なく
   とも６個のアミノ酸より成るサブユニットを含有する式
   ：【アミノ酸配列があります】；【アミノ酸配列があり
   ます】； 【アミノ酸配列があります】； 【アミノ酸配列があります】； 【アミノ酸配列があります】又は 【遺伝子配列があります】 もしくは式 I ： 【遺伝子配列があります】 又は式II： 【遺伝子配列があります】 又は式III： 【遺伝子配列があります】 又は式IV： 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＝ＯＨか又はペプチドフラグメント【遺伝子配
   列があります】、【遺伝子配列があります】、【遺伝子
   配列があります】、【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】又はプレーＳ（２）−配列【
   遺伝子配列があります】 を表わす〕のペプチド又はこ れらのペプチドの等価の変異体を製造する方法において
   、公知方法で、初めに、α位アミノ基が保護されている
   、合成すべきペプチドのカルボキシ末端アミノ酸をこの
   ために常用の合成用キャリアに共有結合させ、α−アミ
   ノ保護基を脱離し、このようにして得られた遊離アミノ
   基に次にすぐ続く保護アミノ酸をそのカルボキシ基を介
   して結合させ、次にこの第２のアミノ酸のα−アミノ保
   護基を脱離し、このアミノ基に次のアミノ酸を結合させ
   、このようにして次第に合成すべきペプチドの他のアミ
   ノ酸を正しい順序で連結しかつすべてのアミノ酸の連結
   後に最終ペプチドをキャリアから脱離し、場合により存
   在する他の側位官能基の保護基を脱離することを特徴と
   するポリペプチドの製法。 １７、作用物質として、１０８又は１１９コドンの配列
   であり、その配列がＢ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇを暗号
   付けする開放解読わくの第１開始コドンで開始しかつ解
   読わくの終止コドンより２８１コドン前で終結するプレ
   ーＳ（１）−ヌクレオチド配列より成る、Ｂ型肝炎ビー
   ルス又はＢ型肝炎ビールス成分からのＤＮＡフラグメン
   トにより暗号付けされ、酵素ＢｅｔＥIIによるＢ型肝炎
   ＤＮＡの切断部位後の最初のメチオニンコドンＡＴＧに
   より暗号付けされるメチオニンで開始し、かつこのプレ
   ーＳ（１）−アミノ酸配列の終結が、酵素ＥｃｏＲ I
   によるＢ型肝炎ＤＮＡの切断部位前の最初のアラニンコ
   ドンＧＣＣにより暗号付けされるアラニンであるプレー
   Ｓ（１）−アミノ酸配列又はこの配列の少なくとも６個
   のアミノ酸からのサブユニットを有するペプチド少なく
   とも１個を含有することを特徴とするＢ型肝炎ビールス
   疾患に対する接種物質。 １８、作用物質として、前記のプレーＳ（１）−アミノ
   酸配列又はこの配列の少なくとも６個のアミノ酸からの
   サブユニットを有するペプチド少なくとも１個並びに製
   薬的に認容な賦形剤、添加物及び／又は助剤及び／又は
   アジュバントを含有する特許請求の範囲第１７項記載の
   接種物質。 １９、集団特異性免疫の誘起に重要であるＢ型肝炎ビー
   ルスペプチド構造を中和するモノクロナール抗体ＭＡ１
   ８／７。 ２０、英国の公衆衛生局に寄託番号８４１０１５０１で
   寄託されているような抗体ＭＡ１８／７を合成するマウ
   ス・雑種細胞細胞ＧＯ １Ａ１８／７−１。 ２１、Ｂ型肝炎ビールスに対して免疫化されたマウスの
   脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、得られた雑種細胞クロ
   ーンのうち、プレーＳ（１）−アミノ酸配列を含有する
   Ｂ型肝炎ビールスペプチドとだけ反応するものを選択し
   、選択したクローンを増殖しかつこのようにして得られ
   た培養液から抗体を単離するモノクロナール抗体ＭＡ１
   ８／７の製法。