JPS60260593A - モノクローナル抗体の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はマウス腹水液試料のモノクローナル抗体含量を
精製する方法に間する。より詳しくは、本発明は、結合
したポリエチレンイミン（ＰＣＩ）官能基を有するシリ
カゲルの個々の静的多孔性の組上における液体クロマト
グラフィー、及び約ｐ■６．０〜約８．３の水性緩衝液
によるポリエチレンイミン結合カラムからのモノクロー
ナル抗体の勾配溶離を利用するマウスの腹水流体からモ
ノクローナル抗体形のＩｇＭを分離精製する方法に係る
。

（間問題を解決する為の手段） 結合したポリエチレンイミン官能基を有するシリカゲル
の個々の静的多孔性相即ち、本発明のクロマトグラフ充
填物には２つの形式がある。

好ましい形式は特願昭５９年第２４２５８５号［米国特
許出願第５５５　、３６８号（ポリエチレンイミン結合
クロマトグラフ充填剤という名称］に記載されておりそ
の内容は本明細書に参照して取り入れる。間違するその
出願の文章が以下に報告される。

第二の形式のものはジ−バネセフ（Ｇ、Ｖａｎｅｃｅｋ
）とエフ、イー、レグニア−（Ｆ、Ｅ、Ｒｅ３ｎｉｅｒ
）、ｉ±ｋ。

バ　ム、　Ａｎ　１．　ｉｏｃ　ｅ　、１２１，１５６
−１５９（１９８２）及びニー、ジエー、アルバート（
Ａ、Ｊ、　Ａｌｐｅｒｔ）とエフ、イー、レグニア−（
Ｆ、Ｅ、　Ｒｅｇｎｉｅｒ）＋　久盃二。

ロマ　−　、Ｃｈ　ｏ　ａｔｏ　、　１８５，３７５−
３９２（１９７８）に記載された吸着された架橋ＰＣＩ
Ｃシーカゲルの静的な相である。この形式は商品名２”
シンクルパック（ＳｙｎＣｈｒｐａｋ）”の名称でイン
ジアナ州リンデンのシンクロームインコーホレーテッド
（ＳｙｎＣｈｒｏ＊Ｉｎｃ、）から市販されている。ア
ルバート及びレグニアーハ、ポリエチレンイミン（ＰＥ
Ｉ）がシリカゲル表面に吸着され架橋されて安定な重合
層を形成することを示している。ＰＥＩの構造は十分な
第１級及び第２級アミノ基を与えるので、シリカゲル表
面の隣接している　ＰＥＩ分子が多官能オキシランによ
り架橋され重合層となりうる。親水性のクロスリンカ−
例えばジグリシジルエチレングリコールの使用堰通じて
親水性の被覆が戸られ得る。

（ラムスデンの発明の詳細な記載） 本発明の非架橋共有結合ＰＥＩシリカゲル生成物は次の
段階によって都合よく生成さ゛れる。

Ａ　平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
カゲルを、不活性有機溶媒スラリー中で、約４００〜約
１８００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロ
ビルトリメトキシシランの低級アルカノール性溶液と約
２〜約５０時閏環境温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ　生じる固体フラクションを反応混合物から回収し、 Ｃ上記固体フラクションを乾燥し且つシランをシリカゲ
ルに完全に結合するのに十分な温度及び時間で加熱する
。

本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結合された
」という用語は、ＰＥ１部分がシリカゲルに化学的相互
作用によって共有的に結合されていて、プロピル−シリ
ル（Ｐｒ−５ｉ）の結合を生じていることを意味し、「
非架橋」という用語は隣接する共有結合したＰＥ１１８
分上のイミノ及びアミノ基が架橋していない又は架橋剤
と反応し、重合層を形成していないことを意味する。

束縛されるものではないが、反応は次のように２段階で
完了すると考えられる。

段階ｌ　シラン上のシリカヒドロキシル及びメトキシ基
が反応して５ｉ−０−５ｉ結合及び遊離メタノールを形
成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のままでいる。

段ＰＩ１２　残留メトキシ基との反応の完結がａ）及び
１ １−ＯＨ 無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則及び球状
（好ましい）の微粒形で市販されておりまた幾つかの商
品等級で得られ、メツシュ寸法が３−３−３２５（ＡＳ
Ｔの範囲である。数学的なメツシュ寸法の表示に頼るよ
りも、本発明の為のより正確な指標はシリカゲルの微粒
の平均粒径及び平均孔寸法がそれぞれ約３〜７０ミクロ
ン及び約５０〜約１０００、好ましくは約２５０〜５０
０オングストローム単位のものである。ＨＰＬＣクロマ
トグラフカラム充填に使用する最終製品のためには、約
３〜約１０ミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、
低圧クロマトグラブイ−カラム充填用には約４０〜約７
０ミクロンが好ましい。

シリカゲルスラリーを調製するのに適した不活性有機溶
媒のなかで脂肪族炭化水素例えば、ヘキサン、ヘプタン
など、芳香族炭化水素例えば、ベンゼン、トルエン、キ
シレンなど、低級アルカノール類例えば、エタノール、
イソプロパツール、ブタノールなと、塩素化メタン、例
えば塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等（注意
そのようなりロロ溶媒は高温で反応するかもしれない）
、及びテトラヒドロフラン、グライム（グリコールジメ
チルエーテル）、ジグライム（ジエチレングリコールジ
メチルエーテル）などの他の不活性溶媒が適している。

一般に溶媒１に対しシリカゲル又はＣＰＧのグラム　１
：５の比が適当なスラリーを与える。細かい不溶のシリ
カゲル微粒の不溶性の為に真の溶液でなくスラリーが得
られる。

（Ｎ−トリメトキシシリルプロビリ１．）−ポリエチレ
ンイミンとしても知られているポリエチレンイミノボロ
ビルトリメトキシシランはポリエチレンイミンとアミノ
プロピルトリメトキシシランとの反応生成物で次の式に
よって記載される。

−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎｌ２　（Ｉ） ここで本発明の目的にはｎは約４〜３７の整数又は平均
分子量で表現すると約４００〜１８００である。

シラン（１）は反応中でシリカゲルと共にシランを可溶
化させる為の十分なアルカノールを使用して低級ｃ、　
−Ｃｅアルカノール溶液の形で使用きれる。５ｏｚ（ν
／豐）のイソプロパツール溶液が好ましい。一般に約２
５〜１００　ｇのシラン又はこれに代わって約５０〜２
００１の５０χ（ν／ν）シランのアルカノール溶液が
各１００８のシリカゲルと反応するのに使用される。反
応は環境温度で実施できるが反応溶媒系の還流までの高
温を反応速度を強めるために使用することが出来る。反
応は実質的な完了（段階１）迄に容易に２〜５０時間内
に進行する。反応体の混合中に攪はんをするのが有利で
あるが、その後の反応は更に攪はんすることなしに続き
得る。

無水の条件は臨界的でなく、小量の水即ち約０．１〜１
．０　ｍｌ　／スラリー溶媒５０１の存在が反応に悪影
響を与えないことが見いだされている。

生じる固体フラクションは反応混合物から慣用の物理的
手段例えばろ過、遠心分離などによって回収される。一
般にろ過手段は粒径５ミクロンを保持するのに十分なも
が適するのに対し、遠心は３ミクロンの粒子寸法に適し
ている。

回収された固体フラクションは次に、乾燥、モしてシラ
ンをシリカゲルに完全に共有結合させるに十分な温度及
び時間で熱硬化される。一般に約４０〜１２０℃に於け
る　１４時間が十分であることが分かった。このように
して得られた共有結合し、非架橋の最終生成物は好まし
くは約０．５〜約−３，８％の窒素を含有している。（
以上でラムスデン発明の説明終） 本発明の目的にクロマトグラフ充填物（”ＰＥｌ−シリ
カゲル”と都合上場合によ）ては述べられる）は利用さ
れここで出発シリカゲルは約３〜約４０ミクロンの平均
粒径を有するものに限゛られている。

平均孔寸法は約５０〜約１０００オングストローム単位
であるけれども２５０オングストロームより大きい平均
孔寸法が好ましい。

従って、本発明は本質的に均一なモノクローナル抗体形
の１８Ｍを上記モノクローナル抗体を含有しているマウ
ス腹水試料から液体クロマトグラフ手段を用いて得る方
法を提供するが、ここでクロマトグラフ充填剤は平均粒
径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜約１０
００オングストローム単位を有し、上記レグニア−等に
従って吸着され゛た架橋形で、又は上記ラムスデンに従
って共有結合非架橋形でポリエチレンイミン官能基が結
合している微粒シリカゲルからなるものである。後者に
間してはＰＥｌ−シリカゲルクロマトグラフ充填剤は上
記の微粒状シリカゲンルと約４００〜１８００の平均分
子量を有するポリエチレンイミノプロビルトリメトキシ
シランとの反応生成物である。

本発明に於いてそのようなりロマトグラフ充填物が、液
体クロマトグラフィー、特に結合形１ｇＭモノクローナ
ル抗体′及びそれを含有しているマウス腹水中の他の蛋
白質のための高性能液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ
）に於いて特に適していることがわかり、これによって
適当な水性緩衝液を使用する勾配溶離により結合した蛋
白の優先的な分離を可能にしている。このようにして問
題の、本質的に均質なモノクローナル抗体を含め腹水液
中にもともと存在する幾つかの蛋白成分が得られる。

「本質的に均質な」というのは、本明１ｉｌＩｌｌでは
定量的に回収されたＩｇＭ抗体溶離フラクション中に存
在する蛋白質の〉９ｏｚが　ＩｇＭモノクローナル抗体
であることを意味する。純度％はこの技術で来既知の手
順、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ニー、ケー、ラエムリ（Ｕ、に、　Ｌａ
ｅｍ＋ｎ１ｉ）　、ネイチＪｒｐ　−（Ｎａｔｓｕｒｅ
）、２２７゜６８０（１９７０）参照）によって確認出
来る。

本発明は１ｇＭ形のモノクローナル抗体を含有するマウ
スゐ腹水液で使用するのに港している。そのようなモノ
クローナル抗体を含んでいるマウスの腹水液を調製する
方法はこの技術分野で一般的なものであり、例えば”モ
ノクロ−′ナルアンテイボディーズ、バイブリドマス（
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ−ｂｏｄ＋ｅｓ、　Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａｓ）：アニューデイメンジョンインバ
イオロジカルアナリスイズ（Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓ
ｉｏｎｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ
）”アールエッチ、ケネッット（Ｒ，Ｈ，にｅｎｎｅｔ
）等、プレナムプレス発行ニューヨーク（１９８０＞と
”メソッズインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”ジー、ガルフレッド（Ｇ
、Ｇａ１ｆｒｅｄ）シー、ミルスタイン（（Ｊｌｉ　１
ｓｔｅｉｎ）編集ジエージェー、ランゴン（Ｊ、Ｊ、Ｌ
ａｎｇｏｎｅ）とエイチ、パンブナキス（Ｈ，Ｖａｎ　
Ｖｕｎａｋｉｓ）、７３巻、３１−４６頁、アカデミツ
クプレス１９８１年発行を参照。

高度に精製された形のモノクローナル抗体の単離は明ら
かに望ましい。例えば、生体内の治療目的の為には、で
きるだけ精製され濃縮されているモノクローナル抗体が
悪い副作用を最小とし、意図される治療目的を最大限に
するために要求される。同様に試験管内診断目的の為に
そのような精製さ゛れ濃縮されたモノクローナル抗体は
個々の診断試験の感度及び特異性を最大限とするために
望ましい。

マウスの腹水液は、本発明の為に使用される前に、干渉
する微粒状物質を除く為に予備処理され、ＰＣＩ−シリ
カゲル支持体へモノクローナル抗体が結合することをを
達成する為に必要な適当なイオン強度及びｐＨに平衡化
される。個々の微粒物質は慣用の透明化手段、例えばろ
過、又は微粒物質をペレット化するに十分な力に於ける
遠心によって除き得る。微粒のないマウス腹水液の平衡
化はこの技術水準に於いて一般的な任意の手段により達
成できる。例えば、適当な形式及び寸法の分子ふるい、
例えば商品名セファデックスの名で市販されているもの
、の上で適当な緩衝液によってクロマトグラフィー的に
脱塩することにより、適当な緩衝液に対しての透析によ
り、及びその他によって達成され、個々のＩｇＭモノク
ローナル抗体のｐｌよりも大きいｐＨ（このｐｌはモノ
クローナル抗体がその環境に於いて正味のイオン荷電を
有さないもの〉、及び後のマウス腹水液のクロマトグラ
フ処理に於ける勾配溶離に使用される低イオン強度緩衝
液のイオン強度と同等か又はそれ゛よりも小さいイオン
強度に平衡化される。

液体クロマトグラフ、好ましくはＨＰＬＣに使用するの
に好ましいクロマトグラフカラムは前記の多孔性のＰＣ
Ｉ−シリカゲル固体支持体で充填される。

スチール又は方ラスクロマトグラフカラムは長さが約５
〜１００ｃＩ１１及び内径が約１−１００　ｍｍの寸法
を有するものを含む。適当なりロマトグラフパラメータ
ー、例えばカラム充填技術、カラム寸法、カラム温度、
圧力などを選択することは通常の技術を有する者により
容易に決定される。

充填されたカラムは適当な緩衝液をカラムに通すことに
よってクロマトグラフ中に於いて平衡化される。この緩
衝液平衡化段階の後、カラムはマウス腹水液の蛋白成分
のクロマトグラフ分離を行なう為に使用されるが、上に
記したようにマウス腹水液は予め微粒物がないものとさ
れており、適当なイオン強度及びｐＨに平衡化されてい
るものである。そのような予め処理されたマウス腹水液
の試料は、次に緩衝液平衡化カラムにかけられ、その成
分蛋白質をＰＥｌ−シリカゲル充填物に結合させる。

結合した蛋白は次に慣用の勾配溶離技術により選択的に
溶離されるがここで時間、流速、及び増加するイオン強
度又は減少するｐＨの勾配物を生ずる勾配形なとの相互
に依存するクロマトグラフパラメーターを考慮に入れる
。ｐＨ約６．０〜約８．３の陰イオン性緩衝液例えば燐
酸カリウム、トリスアセテート、酢酸アンモニウムなど
をそのような勾配を生じ結合する蛋白をポリエチレンイ
ミン官能基から溶離するのに使用できる。例えば勾配は
約３０分〜約４時間約０．１　ｍｌ／分〜約２１７分の
流速で形成するのが有利である。

分割された蛋白質はこの技術に於いて一般的な任意の手
段、例えば２８０　ｎｍに於ける紫外線吸収をモニター
することにより同定出来る。分離された蛋白を含有して
いる溶離フラクションをフラクションコレクターを使用
して集め得る。均質のモノクローナル抗体を含有する溶
離フラクションを例えば個々の抗体にってい展間された
ラジオイミュノアッセにより、他の抗原抗体反′応によ
り、又はポリアクリルアミド電気泳動なと良く確立され
ている手段によって同定することが出来る。

本発明の方法はモノクローナル抗体を含有するマウス腹
水液の全容量と独立にあることが分かりクロマトグラフ
充填に使用されるＰＣＩ−シリカゲルの量を除いて限定
する要因はない。即ちこの方法ば固体クロマトグラフ支
持体の容量を越えないかぎり実施可能である。

本発明に従ってモノクローナル抗体形１３Ｍを含有する
微粒物のないマウスの腹水液の試料がクロマドグラフ的
に分離され、本質的に均質の形で上記抗体を与える。よ
り詳しく前に記されたように好ましい方法は上記のモノ
クローナル抗体を含んでいる微粒のないマウスの腹水液
の試料を以下により精製する。

ａ、上記微粒物のないマウス腹水液の試料を後のクロマ
トグラフィー分離及び回収段階での勾配溶離に使用する
低イオン強度緩衝液のイオン強度と同等又はより小さい
イオン強度に、又モノクローナル抗体のｐｌよりも大き
いｐＨに平衡化させ、ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロ
ン及び平均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム
単位を有する微粒シリカゲルと約４００〜約１８００の
平均分子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリメ
トキシシランの反応生成物からなるクロマトグラフィー
充填物を使用する液体クロマトグラフィ一手段によって
、上記モノクローナル抗体形１３Ｍを上記試料から分離
回収する。

以下の実施例の助けにより本発明はより容易に理解され
るがこれらは単に説明のために与えられており本発明を
制限するものではない。

実施例１ 平均粒径５．２５ミクロン及び平均孔寸法３３０オング
ストロームを有し、ザセツブＡ　Ｒａタイオンズグルー
プ、ヘスベリア、カリフォルニアから商品名”ビンダッ
ク（Ｖｙｄａｃ　Ａ）”カタログＮｏ、　１０１７９Ｂ
５の商品名で球状のシリカとして市販されているシリカ
ゲル２０　ｇの１００　ｍｌ　）ルエン及び２１の水中
のスラリーを調製し、そして１０分間室温で攪はんする
。これに攪はんしなから３９：４　ｇの平均分子量５０
０を有するポリオキシエチレンイミノプロピルトリメト
キシシランの５０％（ｗ／ｗ）イソプロパツール溶液　
を加え、混合物をさらに５分間攪はんする。混合物を次
に室温で一夜放置する。混合物を次に１．０ミクロンフ
ィルターのろうとを使用してろ過する。ろ液を５０１の
トルエンで２回そして５０１のメタノールで２回洗い次
にろうと上で空気乾燥し最後に８０〜８５℃で約３時間
３０オーブン乾燥し共有結合した非架橋ＰＣＩシリカゲ
ル製品約２．８５χＮを生成する。

実施例２ 特異的抗血清によって決定される、　１３Ｍクラスの免
疫グロブリンに属するモノクローナル抗体を含有してい
るマウス腹水液２１試料を１５，６００　ｘ重力で５分
間遠心した。上澄み液を次に１Ｏｎ＋Ｍ燐酸カリウム緩
衝液ｐＨ６，７３へ、１夜（１７時間）２回のチェンジ
の１−リットル１０５Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ６，３７に対し
て透析することにより平衡化した。ステンレス鋼のクロ
マトグラフカラム２５　ｃｍ　ｘ　Ｏ，４６−−に実施
例１から得られたＰＥｌ−シリカゲル３．８８を充填し
ρ）ｌ　６．７３の０．０１モル燐酸カリウム緩衝液で
、この緩衝液をカラムに流速１−１１分で２０分ポンプ
で送ることによって平衡化した。マウス腹水液の０．２
５　ｍｌの平衡化された試料をポリエチレンイミン結合
シリカゲルカラムにかけ、０．０１モル燐酸カリウムｐ
Ｈ６，７３から０．２５モル燐酸カリウムｐＨ６，８へ
の流速１＋ｓｌ／分における６０分間の線形勾配を使用
して勾配溶離することにより蛋白分離を達成した。蛋白
溶離は２８０　ｎｓにおけるＵｖ吸収を使用して検出し
たがフルスケールの吸収は０．６４吸光度単位にセット
した。２８０　ｒｖ吸収ピークの一連のものを約３分〜
約２５分の保持時間の範囲で検出した。

約４４分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プ
ロフィールを有する同じモノクローナル抗体の均一試料
とのコクロマトグラフィックによって抗リポポリサッカ
ライドモノクローナル抗体として同定された。

約４４分に於いて溶離する蛋白ピークは二つの基準によ
って９０％純度より大であると評価された。

先ず第一は集められた蛋白ピークは下、Ｂ、レグニア−
、サイエンス、Ｊ、２４５（１９８３）に従ッテポリエ
チレンイミン結合シリカゲルカラム上のクロマトグラフ
後対称のピークを与えた。第二に、本質的にニー、ケー
、ラエムリ（Ｕ、にルａｅ＋＊５ｌｉＬネイチャー、２
２７　、６８０（１９７０）　、に記載されるように実
施されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動はＩｇＭモノクローナル抗体の重い鎖及び軽
い鎖に相当する二つの主要なりマシー（ｃｏｏｓ＋ａｓ
ｓｉｅ）ブルーバンドと、全体の染色された蛋白の１０
％に満たないものを表わす第三のかすかなグマシー（ｃ
ｏｏｎ＋ａｓｓｉｅ）ブルーバンドを与えた。

出願人　ジェイ　ティー　ベーカー　ケミカルカンパニ
ー 代理人　弁理士　佐々井弥太部　（他１名）・　−−人 、！、’、ｊ １　、：’、−＋ｊ　’、１．．．・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ１本質的に均質のモノクローナル抗体形１ｇＭを上記
   のモクローナル抗体を含有するマウスの腹水液試料から
   得る方法に於いて、上記モノクローナル抗体を上記試料
   から液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回収
   することからなるが、その場合にクロマトグラフ充填物
   が、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法的５
   ０−４９１０００オングストロ一ム単位を有し、そして
   共有結合非架橋形又は吸着された架橋形でポリエチレン
   イミン官能基が結合されている微粒シリカゲルから本質
   的になる方法。 ２、本質的に均質のモノクローナル抗体形　１８Ｍを上
   記のモクローナル抗体を含有するマウスの腹水液試料か
   ら得る方法に於いて、上記モノクローナル抗体を上記試
   料から液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回
   収することからなるが、その場合にクロマトグラフ充填
   物が、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約
   ５０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シ
   リカゲルと、約４００〜約１８００の平均分子量を有す
   るポリエチレンイミノプロビルトリメトキシシランとの
   反応生成物から本質的になるものである特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、本質的に均質のモノクローナル抗体形１３Ｍを上記
   のモクローナル抗体を含有するマウスの腹水液試料から
   得る方法に於いて、上記モノクローナル抗体を上記試料
   から液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回収
   することからなるが、その場合にクロマトグラフ充填物
   が、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５
   ０〜約１０００オングストローム単位を有し、吸着され
   た架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合している微
   粒シリカゲルから本質的になるものである特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ４、本質的ζこ精製したモノクローナル抗体形１３Ｍを
   上記モクローナル抗体を含有する微粒物のないマウスの
   腹水液の試料から得る方法に於いてａ、上記微粒物のな
   いマウス腹水液の試料を後のクロマトグラフィー分離及
   び回収段階での勾配溶離に使用する低イオン強度緩衝液
   のイオン強度と同等又はより小さいイオン強度に、又モ
   ノクローナル抗体のｐｌよりも大きいｐＨに平衡化させ
   、ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約
   ５０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シ
   リカゲルと約４００〜約１８００の平均分子量を有する
   ポリエチレンイミノプロビルトリメトキシシランの反応
   生成物からなるクロマトグラフィー充填物を使用する液
   体クロマトグラフィ一手段によって、上記モノクローナ
   ル抗体形１３Ｍを上記試料から分離回収することからな
   る方法。 ５、本質的に精製したモノクローナル抗体形１３Ｍを上
   記モクローナル抗体を含有する微粒物のないマウスの腹
   水液の試料から得る方法に於いて、ａ、上記微粒物のな
   いマウス腹水液の試料を後のクロマトグラフィー分離及
   び回収段階での勾配溶離に使用する低イオン強度緩衝液
   のイオン強度と同等又はより小さいイオン強度に、又モ
   ノクローナル抗体のｐｌよりも大きいｐＨに平衡化させ
   、ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約
   ５０〜約１０００オングストローム単位を有し、吸着さ
   れた架橋形でポリエチレンイミン官能基カー結合してい
   る微粒シリカゲルから本質的になるクロマトグラフィー
   充填物を使用する液体クロマトグラフィ一手段によって
   、上記モノクローナル抗体形ＩｇＭを上記試料から分離
   回収することからなる方法。