JPS60155129A - 固定化抗原または抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原または抗体をフ□イブロインに固定化する
新規な製造方法ｉ関する。

抗原と抗体が結合し、複合体を形成する特異的逓反応は
一般に抗原抗体反応と坪ばれている□。

近年、微嬌の生物試料の分析にこの特異的な反応を利用
したラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイム
ノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）等のいわゆる免疫測定法が広
く行われるようになってきている。これらの方法におい
ては操作釦、　錆＆シＭｔｆｌｔ獣鯖ΔＩ伽愉Δ＆シ妻
鯖Δ小猜原または抗体とを分離する必要があり、この分
−を容易に行うために抗原または抗体を適当な担体に固
定化することが種々試みられている。

上記の固定化方法は、一般に化学結合法、吸着法、包括
法の三つに大別することができ、そのなかで吸着法によ
るものが実用化されているとはいえ、各方法とも後述す
る種々の欠点を各々有している。

即ち、化学結合法は例えばグルタルアルデヒド法、臭化
シアン法、カルボジイミド法等により不溶性の担体の官
能基と抗原または抗体の官□ 能基とを共有結合させるものであるが、一般に、−、′ この化学結合法は反応時に抗原または抗体の変性が起こ
り易く、固定化された抗原または抗体の複合体形成能が
低下してしまうことが多い。

また結合反応が数段階を饗するものや高価な試薬を用い
なければならないことが多く１ｇ！にその未反応の試薬
類の除去にも多大の注意を払わなければならない等の欠
点がある。

吸着法は不溶性担体に抗原または抗体を物理的あるいは
イオン的な吸着力によって結合させるものであるが、化
学結合法と異なり、その結合力は比較的弱いために抗原
または抗体が遊離し易く、ｐＨ１共存イオンの種類ある
いは強度等の至適範囲が狭いので、その使用に際しては
著しく制約を受ける。

また、抗原または抗体は変性し易いために、吸着法によ
る固定化では長期の保存安定性を期待することは難しい
。

包括法としてポリアクリルアミドゲルあるいはアセチル
セルロース中への抗原または・抗体の包括固定化が報告
されている〔例えばクリニカル　−　ケ　ミ　ス　ｉ・
　リ　４　（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｏ＋１ｓｔｒｙ
）　第　１８巻、１３４１頁（１９７３年）文献参照〕
。しかしながらポリアクリルアミドゲルを用いる固定化
では重合反応時の抗原または抗体の失活およびモノマー
のＭ性が問題となり、また該固定化物はゲル状物である
ため機械的強度が十分でなく、非特毘的吸着物を除去す
るための充分な洗浄を施すことができない。

またアセチルセルロース等の水不溶性で非水溶媒を用い
る必要のあるポリマーでは、一般に水溶性である抗原ま
たは抗体の分散性が悪く、そのため均一な固定化抗原ま
たは抗体が得られにくい。

次に、抗原または抗体を担体中に従来通りの方法で包括
させると、抗原または抗体分子早：が大きいため、担体
の内部に固定化された抗原または抗体は反応に関与し難
い。反対に担体内部の抗原または抗体が反応できるよう
なポーラスな材質で包括した場合には、その使用に際し
ては複合体を形成しなかった抗原または抗体を洗浄除去
することが困難で、測定の感度が著しく低下［７てしま
う欠点がある。

本発明者等はこれら従来技術の欠点を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、後述する如く抗原または抗体の機能を
損うことなく強固に固定化され往つまた保存安定性に優
れた固定化抗原または抗体を製造する方法を見い出し本
発明を完成した。

斯かる本発明の製造方法は、予め抗原または抗体を塗１
１ｊ　した基板に、フィブロイン水溶液を塗７］ｊシ、
乾燥もしくは塩析により皮膜化させ、次いで該皮膜を基
板より引き剥がすことを特徴とする固定化抗原または抗
体の製造方法である。

該フィブロイン水溶液は通常生糸、絹紡糸、生糸屑、キ
キ、ビス、〈ずまゆ、ブーレット等のＭ４及び絹原料を
、常法によりセリシンを精練除去した後、例えば銅−ア
ンモニア水溶液、水酸化銅−エチレンジアミン水溶液、
ロダン酸塩水溶液、９化リチウム水溶液、塩化カルシウ
ム水溶液、硝酸カルシウム水溶液、あるいは硝酸マグネ
シウム水溶液等に溶解し、水に対して透析層１具するこ
とにより調製される。

フィブロイン水溶液のフィブロインａ度は乾燥によって
皮膜化させる場合には、通常２〜２５重４１％、好まし
くは３〜２０重量％、特に好ましくは５〜１５％φ％で
あり、また塩析によって皮膜化させる場合には、通常１
５〜３０重量％である。

固定化抗原または抗体は、通常水溶液中で使用されるこ
とが多く担体の耐水性がをされる。

従って本発明のフィブロ・インフィルムにおけるフィブ
ロインの結晶化度は少なぐとも約２０％、特に約３０％
以−１−が好ましく、無定型ないしは結晶化度が約２０
％に満たない場合には、フィブロインフィルムは水に可
溶性になったり水膨潤性が非常に大きくなる等好ましく
ない。

斯かる結晶化度をイ１するフィブロインフィルムは、１
ｊ４析によって皮膜化させる場合には、例えば常法に従
って飽和硫安水溶液で塩析することｍ：よって得られる
。

一力、乾燥によって皮膜化させる場合には、結晶化が充
分進むようにフィブロイン水溶液に予め結晶化促進剤と
して、エチルアルコール、エチレングリコール、グリセ
リン等のアルコール類、あるいは硫酸ナトリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸アンモニウム等の凝固性塩を認加し
ておくことか好ましい。

各々の添加量はアルコール類ではフィブロインに対して
通常２〜５０４４％、好ましくは１５〜３５屯星％、凝
固性塩ではフィブロインに対して通常２〜２０重都−％
、好ましくは５〜１０重量％である。

乾燥は、抗原または抗体が熱変性や失活を引き起こさな
い温度、通常４５℃以下、好ましくは３０℃以下で１０
〜２０時間行うや 所かる方法により、いずれの場合においてもフィブロイ
ンの結晶化度は約２０％以上となるが、通常概ね５０％
を超えることはない。

なお本発明で規定するフィブロインの結晶化度は以下の
方法により得られた数値である。

本発明のフィブロインフィルム（被検フィルム）と、対
照として４℃で相対湿度が５５％の条件下でフィブロイ
ンのみの水溶液から皮膜化したほぼ無定形のフィブロイ
ンフィルム（対照フィルム）に、それぞれＣｕ−にα線
を照射し赤道方向の回折強度・を記録して得られるＸ線
広角回折チャート（ｗｔＪ１図）において、２θ、＝１
５゜と３０′″の強′度を直線で結び、この直線と被検
フィルムの回折強度曲線（ａ）とで囲まれた部分の面積
をＡ、またＬ記直線と対照フィルムの回折強度曲線（ｂ
）とで囲まれた部分の面積をＢとすると、結晶化度ｍは
次式で表わされる。

結晶化度（％）＝Ａ−ＢＸ１００ 本発明に用い得る抗原または抗体は特に限定される□も
のではなく、抗体としてはＩｇＧ　、　ＩｇＭ　、　Ｉ
ｇＡあるいはＩｇＥのいずれのクラスでも良い。

またマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、あるいは
人等いずれの動物から採取した抗体でも使用可能である
；（、特西細胞融合法によって採取したモノクローナル
抗体の使用が感度、精度の点で好ましい。

なお、通常使用する杭体はいずれも常法により例えば硫
安塩析またはＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー等で精製したものを用いる。

抗原としてはフィンロインに固定化され得る程度の分子
量を有するものならばいずれも使用可能で、低分子量の
ハプテンも他の高分子に結合させたものならば用いるこ
とができる。゛　□、　具体例としてはヒト絨毛□性ゴ
ナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトゲン等の・
ホルモンまたはその抗体、□α−フェトプロティン（Ａ
ＦＰ）、ハプトグロビン、Ｈ′ｌ１１ｓ抗原等の血清蛋
白またはその抗体、大腸菌毒素、コレラトキシン等のト
キシンまたはその抗体、風疹ウィルス、インフルエンザ
ウィルス等のウィルスまたはその抗体、ある、いはエス
トラジオール、プロゲステロン、テストステロン、ラエ
ニトイン、プロ力インアミド、カナマイシン、゛ペニシ
リンン・・バルビッール酸等のハプテンまたはその抗体
等が挙げられる。　′　□ 抗原または抗体□は例えば水、生理食塩液あるいは緩衝
液等に溶解した状態で基板上に塗布さレルカ、ソノ濃度
は通常５０１１ｇ　’／ｄ　〜５０ｍｇ／　ｄ、好まし
くは１００　ｇ／ｄ　ＮＮ１０ｆ／ａＱテある。

１　塗布される抗原または抗体量は基板の単位面積当た
り、通常０．２〜゛２０ｇ　／　ａｌ、好ましくは０．
５　、ｉ　１１１５ｇ　／、ａｌ、特に好ましくはｉ−
ｔ、ｏｇ／ｃ／である５、；・　′ 塗布・は、例えば流延あるいは噴霧によって行うことが
好ましい。　：　、 塗布する４基板は特に限定されないが、例えば四方を仕
切ったテフロン板２アクリル板あるいはガラス板等が挙
げられる。

またこ・１れら基板の表面をサンドベニパー等で粗面加
工することにより実質的にフィ・プロイン。

フィ・ルムの有効・面積・・を増加させることもできる
。・　□　、、。

抗原または抗体を基板に塗布した後、必要に・より；乾
燥するが、乾燥はフィブロイン水溶液をその一ヒΔ）ら
塗布できる程度であれば良く、従つモ完全な乾燥状態、
あるいは未だ湿間している状態であっても良い。

フィブロイン水溶液の塗布は、例えば流延・によっ゛で
行うこ□とが好まし・、い、　′□　、、、′　・乾燥
温度は抗原または抗体が熱変性、失活を引き起こさない
温度、通常４５℃以下、好ましくは３０℃以下で行う。

本発明方法によって得られる抗原または抗体固定化フィ
ブロインフィルムを用いてＲＩＡ、ＥＩＡ等を行う場合
には、該フィブロインフィルムをそのまま、あるいは必
要に応じて適当な基材や容器への接着等によって固定し
たものを使用することができる。

斯かる本発明方法によれば、極めて容易に所望の抗原ま
たは抗体をフィブロインフィルム（表面）１−にはなは
だ効率良くその機能を損うことなく　、ＦＬつまた強固
に固定化することができる（各実施例参照）。

従って本発明方法によって得られる固定化量１式（また
は抗体は吸着法の場合とは異なりＰＨやイオン強度等の
変化によって、抗原または抗体が担体から遊離すること
はほとんどなく（試験例２参照）非特異的吸着物を除去
するための洗炸も充分に行うことができ、更にフィブロ
イン自身が非＃賞的吸着の生じ難い素材であることも相
俟って、測定精度を高くすることができる（試験例４　
、６　、１１参照）。

更に保存安定性に関しても吸着法による固定化抗原また
は抗体に比して極めて優れた特性を有している（試験例
７参照）。

次に本発明を以下の実施例および試験例により更に詳細
に説明する。

実施例１ （１）フィブロイン水溶液の調製： 生糸１００ｇを１．０＠量％のマルセル石けん水溶液５
文中に浸漬し、８０℃で３時間精練した。水洗後、更に
０．５重量％のマルセル石けん水溶液５文に浸漬して８
０℃で３時間精練し、セリシン等を実質的に除去したフ
ィブロイン原料７２ｇを得た。

水１００ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーグー
中に塩化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５℃に昇温後
、前記のフィブロイン原料７０ｇを投入、攪拌下に１時
間溶解した０次いで１８０ｇの温水（７５℃）を加えて
希釈混合した。フィブロインの溶解液を冷却した後、ホ
ローファイバー型の透析器を用いて、流水に対して透析
脱塩し、５．７重量％のフィブロイン水溶液１２００ｍ
９を得た。塩化カルシウムの残留量は０．０８重♀％で
あった。

（２）モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムの製造： モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物マウス）を
生、埋金塩液に溶解し、２５ｆｔｇ／−の抗体溶液を調
製した０次にこの溶液を四方を仕切ったテフロン板Ｆに
抗体量が５ｇ／ａ／となるように流延し、　１５℃で３
時間乾燥した。前記フィブロイン水溶液にグリセリンを
フィブロインに対して３０重品％になるように加えた溶
液をその上から流延し、２０℃で１０時間乾燥すること
によって皮膜化させ、厚さ６０−の表記モノクローナル
抗ヒ）ＡＦＰ抗体固定化フィブロインフィルムを得た。

前記の方法（但し、理学電機輛製ガイガー会フレックス
２０２７型を使用し、Ｃｕ−Ｋａ線、　４０ＫＶ、　２
ｈ＾で測定、）によって算出したフィブロインの結晶化
度は３５％であった。

表記フィブロインフィルムを用いて以下の各試験を行っ
た。

試験例１　見掛単位面積当たりの抗体固定化量表記フィ
ブロインフィルムをＩ　Ｘｏ、５　ｃｒａの大きさに裁
断し、生理食塩液で洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体（免疫
動物ウサギ）の西洋ワサビのペルオキシダーゼ標識物溶
液（５０ｇ　／　ｄ　）　（酵素標識は、ジャーナル・
オブ・ヒストケミストリｍ９エンド・サイトケミストリ
ー（ＪＢｒｎａｌｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｔ
　ａｎｄ　Ｇｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２２巻、
１０８４頁（１９７４年）に記載の方法に準じて過ヨウ
素酪酸化法により行った。〕４−中に浸漬し、４℃で２
４時間反応させた。次いで遊離の抗マウスＩｇＧ抗体−
ベルオキシダーゼ標識物を除去するために生理食塩液で
該フィルムを充分洗浄し、これに１６．７腸Ｎｏ−フェ
ニレンジアミン、２．４５腸踵過酸化水素を含むクエン
酸−リン酸２ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　４−を
加えて室温で５分間反応させた後、　３．４　Ｎ硫酸２
−を加えて反応を停止させた。この反応液について４９
２　ｎｍにおける吸光度（以下Ａｂｓ４９２と略す、）
′を測定し、予め作成した検−８Ｉ：線から該フィルム
の表面に固定化された表記抗体固定化量をめたところ０
．２８パ／ａｌであった。

試験例２　固定化の強度 ３種のリン酸緩衝液（ｐＨ５，３、６，８、８，１）各
５−中にＩＸｏ、５ｃ鳳の大きさの該フ゛イブロインフ
ィルムをそれぞれ浸漬し、２５℃で２４時間振とうした
０次に前記試験例１と同様にして見掛単位面積当たりの
抗体の固定化量を測定したところいずれの場合にも前記
試験例１の値に比し固定化量の減少は認められなかった
。従って抗体は該フィブロインフィルムに強固に固定化
されていることが確認された。

実施例２ 実施例１と同じモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体１生理
食塩液に溶解し、　３７５　ｇ／−の抗□体溶液を調製
した０次にこの溶液を四方を仕切ったアクリル板（１８
０＃のサンドペーパーで粗面加工したもの）」二に抗体
量がｌｅｇ／ｃａｒとなるように流延し、２２℃で６声
間乾燥した０次いで実施例１（１）と同様にして得たフ
ィブロイン水溶液を・濃縮して１３．５１量％のフィブ
ロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロインに対
して３０重量％になるように加えた溶液をそのしから流
延し、室温で一夜乾燥することによって皮膜化させ、厚
さ１１〇−□ の表記モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムを得た。

実施例１（２）と同様にして測定したフィブロインの結
晶化、度は３７％であった。

表記フィブロインフィルムを用いて以下の各試験を行っ
た。

試験例３　見掛単位面積当たりの抗体固定化量試験例１
と同様にして、ＩＩＡ定した結果、該フィルム自体に固
定化された表記抗体固定化酸は０．３２闘／ａ１．であ
った。

、試験例４　定量感度の測定 １　１　１　７１　１ 表記フィブロインフィルムを７×１２１■の大キさに裁
断し、厚さ２００−のポリエステルシート、１０２　ｍ
ｍ、、□１０ｃｍ）　ｆ）’４ｍ偏、７４　ｋ　ｊ−ｆ
）上端をシアノアクリレート氷接着剤で一着した。

次に内径ｌｅｓｍの試験管に０．５重量％牛血清アルブ
ミンを含む生理食塩液′を０．５　＠Ｑずつ分注し、１
−記フィルムを各々が完全に浸漬するように入れ、室温
で１時間放置した０次いで該０７５傘量％牛血清アルブ
ミンを含む生理食塩液を吸引除去した後、各々に各既知
嬢度の標準ＡＦｐ　、　ｔｏ％人鹿清およびモノクロー
ナル抗ヒ）ＡＦＰ抗体（免疫動物マウス、但し、−窒化
したモノクローナル抗体とは認ａｓ位の異なるも）、）
のペルオキシダーゼ標識物（１，２ｇ／ｄ）の入った０
−１＊量％牛血清７“ルブミンを含む生理食塩液をｏＩ
ｓ、＋１ずつ入れ、２２℃で２時間静置した０次いでイ
オン交換水で、それぞれ３回洗浄した後、別に準備した
内径１５ｍ−の°試験管中に入れ、各試験管にそれぞれ
１８．１ｓＮｏ−フェニレンジアミン、２．４５脂に過
酸化水素を含むクエン酸□−リン酸２ナトリウム員衡溶
液（ｐＨ５，５）　ｌ　ａＱずつを加え入れ、室温で暗
所・に１時間静置した。ＩＮ［酸１ｄによ讐て酵素□反
応を停止させ、この□反応液についてＡｂｓ４９２を測
定し標準曲線を得た。

結果を第２図に示したが固相への非特異的吸着は少なく
、ＡＦＰｌｎｇ／ａＱの測定が可能であることが解る。

また該フィルム自体が着色し、肉眼でその着色度を比較
したところ２〜４ｎｇ／−の判定も可能であった。

実施例３ モノクローナル抗ｈＣＧ抗体（免疫動物マウス）を生理
食塩液に溶解し、２５０ｇ／ａＱの抗体溶液微調製した
０次にこの溶液を、四方を仕νＪったアクリル板上に抗
体量が７．５　ｇ／ａｔとなるように流延し、１０℃で
５時間乾燥した０次いで実施例１（１）と同様にして得
たフィブロイン水溶液を濃縮して＋　２　、７　気量％
のフィブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロ
インに対して２５重量％になるように加えた溶滴をその
上から流延し、１５°Ｃで１０時間乾燥することによっ
て皮膜化させ、厚さ１００−の表記モノクは−ナル抗ｈ
ＣＧ抗体固定化フィブロインフィルムを得た。実施例１
（２）と同様にして測定した表記フィブロインフィルム
の結晶化度は３８％であった。

表記フィブロインフィルムを用いて以−ドの各試験を行
った。

試験例５　見掛中位面積当たりの抗体固定化量試験例１
と同様にして測定した結果、該フィルム表面に固定化さ
れた表記抗体固定北門は０．３１℃ｇ／ａ／であった。

試験例６　定量感度の測定 表記フィブロインフィルムをｌ　Ｘｏ、５　ｃｔｓの大
きさに裁断し、標準ｈＣＧをＯ〜１００ｈｌＵ／−の範
囲の種々の濃度で含有する０、１重量％牛血清アルブミ
ンを含む生理食塩液０．５ｉ中に各々浸漬し、２５℃で
１時間反応した。続いて未結合のｈＣＧを生理食塩液で
充分に洗浄除去後、抗ｈＣＧ抗体のペルオキシダーゼ標
識物（２０℃ｇ／１ｏ（１）を含有する。、ｉ　ｉｔ％
牛而清面ルブミンの生理食塩液０．５−中に浸漬し、２
５°Ｃで１時間反応した。次いで、未結合の該標識物を
生理食塩液で洗浄除去し、各々のフィルムを試験例１と
同様に酵素反応を行って、この反応液についてＡｂｓ４
９２を測定し標準面線を得た。

結果を第３図に示したが内相への非特異的吸着は少なく
、ｈ　ＣＧ　２ｍ１Ｕ　／ｍｌの測定が可能であること
が解る。

次に生理食塩液の代りに評康な男子人尿を用いて−ｈ記
ｈＣＧを溶解し、同様にして測定した結果、吸光度がや
や低下したものの第３図と同様の結果が得られた。

試験例７　保存安定性試験 表記フィブロインフィルムと、対照として吸着法により
製造された固定化抗体のポリ塩化ビニルフィルム（比較
例１参閤）との保存安定性を比較した。

各々のフィルムを４℃と４５℃（相対、湿度が共に６５
％）の各雰囲気中に放置し、試験例１と同様にして見掛
単位面積当たりの抗体固定化部および試験例２と同様に
して標＠ｈＣＧの１００ｍ杉の結果を第１表に示した。

第１表力）ら明らかな如く表記フィブロインフィルム４
よ４５℃で６ケ月経過後も初期の抗体活性を保持してし
また。

一方、対照のポリ塩化ビニルフィルムは４５℃で３ケ月
で活性が半減し、４℃でさえ６ケ月で初期活性の約２／
３に低下した。従って本発明方法で製造される表記フィ
ブロインフィルム４士り１照のポリ塩化ビニルフィルム
に比して遥力）４こ優れた保存安定性を有していること
が−る。

比較例１ ポリ塩化ビニルフィルム（厚さ　１２０　ｈ　）をＩＸ
ｏ、５ｃ膳に裁断し、実施例３と同じモノクローナル抗
ｈＣＧ抗体の生理食塩液（１（Ｉｔｇ／ａＱ）ＺｓＱ中
に浸漬し、４℃で２４時間放置して、抗体を吸着させた
桟、未吸着の抗体を生理食塩液で洗浄除去して、、吸着
法により製造さ゛れた固定化抗体であるポリ塩化ビニル
フ４）レムを得た。

実施例４ ヒ　ｌＧ　Ｌ　［イブ　プロ　ンフ　ルムの抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体（免疫動物ヤギ）を生理食塩液に溶解し、１ｍｇ
／−の抗体溶液を調製した。吹にこの溶液を、四方を仕
切ったガラス板上に抗体量が５μｇ／ｄとなるように塗
布し、２０℃で１時間乾燥した２次いで実施例２と同様
にして調製したフィブロイン溶液をそのヒから流延し、
２５°Ｃで１０蒔間乾燥することによって成膜化させ、
厚さ１．１０−の表記抗ヒトＩｇＧ抗体固窒化フイブロ
インフイノし・ムを得蜂実施例１（２）と同様にして測
定した表記フィブロインフィルムの結晶化度Ｌ±３７％
であった。

表記フィブロインフィルムを用０て以不゛の試験を行っ
た。　、、 試験例８　見掛単位面積当たりの抗原固定化量抗ヤ、ギ
ＩｇＧ抗体（免疫動物ウサ、ギ）の西洋ワサビのペルオ
キシダーゼ竺識物、溶液（５０１／　ｄ）を用いる襲は
試験例１と同様にして！定した結果、竺フィルム！面に
固定化量た表記抗喀本固定化量は０−２３ｇ／ｃｊであ
った。

実施例５ ３抗ヒトアルブミン抗体（免疫動物ヤギ）を生理食塩液
に溶解し、ＩＢ／−の抗体溶液を調製した０次にこの溶
液を、四、方を仕切ったガラス板１実に抗体量が５ｇ／
４となるよ、う、←塗布し、２０℃で１時間乾燥した。

次いで、実施例、２と同様にして調製しへフィブロイン
溶液をそのｌ−、から流延し、２５℃で１．０時間乾燥
することに、、Ｊ″って皮膜化させ、厚さ１２０−の表
記抗ヒトアルブミン抗体固定化フ、イブロインフィルム
を轡た。実施例１（２）と、同様←し工測定した表記、
フィブロイン、フィルムの結晶化度は４１％であった。

一興フイブロインフィルムを用いて以下の試験１を行っ
た。

試験例９、見掛：単位面積当たりの抗体固定化量試験例
８と同様にして一定した結果、該フィル４ｈ表（２）に
固定化、された表記抗体−窒化最は０．２１ｇ　／　ｄ
であった。

実施例６ ．７“　ヒフイブ、ロインフ　レムの　′：。

ｈＣＧを、四方を仕切ったガラス板上に１０１０／４７
ト’ｉ：Ａ３．つ４：、ｆｆｉ鴫シ、４５℃テ、１０　
時＋１４１　乾、＄　１．！た０次、ｇｘ、、７実、施
Ｑ、、、１　（、１）と同様にし−１て得たフィブロ、
イン溶、液を濃、、縮、、シ、て１Ｇ、２改蟻％７のフ
ィブロイン水＃液、とじ更にグリセリンをフ、イブロイ
ンに対して２５重’、：＊　＝　、ｇ、、生る。ように
加、え！−溶液をそ、９（、から流延し、　１５℃で１
５時間乾燥することによって成膜化させ、厚さ１２０−
の表記ｈＣＧ固定化フィブロインフィルムを得た。実施
例１、（２，）と、同様にして測定した表記フィブロイ
ンフィルムの結晶化度は３５％Ｆやつ、た−　璽　゛ 表記クィブロインフィ２レムを用いて以下の各試験を行
っｆＦ−ｆ 試験例１０　見掛、、＠　、位面積当たりの抗原固定化
量−表記フイブロインフイルムｆ　、Ｉ　Ｘ　Ｏ，５、
ｔ、ｔｍの大きさに裁断し、生、埋金塩液、で洗滌後１
．抗ｈｃＧ。

抗体（免疫動物、マウス）のベルオキシダーギ、標織物
（１０＋ｚｇ／ａＱ）を含む０．１重量％牛血清アルブ
ミン生理食塩液０．５　ｄ中に浸漬し４℃で２４時間反
応させた。以下試験例１と同様にして測定な行った結果
、表記抗原固定化量は約０．１１１Ｊ／ａ／であった。

試験例１１　定夢感度の測定 表記フィブロインフィルムラｌ　Ｘｏ、５　ｃｔａの大
きさに裁断し、モノクローナル抗ｈＣＧ抗体（免疫動物
マウス）をＯ〜１０ｕｇ／−の範囲の種々の濃度で含有
すると川にまた、同じ抗体にビオチンを結合したビオチ
ニル化モノクローナル抗ｈＣＧ抗体を０．５　ｐ／顧含
む０．１屯に％の生血清アルブミン生理食塩液０．５　
ｄ中に、各々浸漬し、２５℃で１時間反応した。次に未
結合の抗ｈＣＧ抗体及びビオチニル化抗ｈＣＧ抗体を生
理食塩液で洗浄除去した後、アビジンペルオキシダーゼ
（５μｇ／ｄ）を含む０．１重量％牛血清アルブミン生
理食塩液０．５＠ｊＱ中に浸漬して２５℃で１時…（反
応し生理食塩液で洗浄後、各々のフィルムを試験例１と
同様に酵素反応を行ってこの反応液についてＡｂｓ４８
２を測定し標準曲線を得た。

結果を第４図に示したが固相への非特異的吸着は少なく
、モノクローナル抗ｈＣＧ抗体０．０２〜ｔｏｇ／−の
範囲の測定が可能であることが解る。

実施例７ ヒト契体形成ホルモンを、四方を什ν）っだアクリル板
［−に５　ｐｇ／ａｔとなるようにように流延し。

１０℃で１０時間乾燥したう次いで実施例１（１）と同
様にして得たフィブロイン水溶液をＩＩｓ縮して１３屯
早％のフィブロイン水溶液とし、更にグリ七１しをフィ
ブロインに対して３０屯早−％になるよつに加えた溶液
をそのしから流延し、　１５℃で１０時間乾燥すること
によって皮膜化させ、厚さ１１０−の表記ヒト情体形成
ホルモン固定化フィブロインフィルムを得た。　実施例
１（２）と同様にして測定した表記フィブロインフィル
ムの結晶止爪は３７％であった。

表記フィブロインフィルムを用いて以下の試験を行った
。

試験例１２　見掛単位面積ちたりの抗原固定化量抗ヒ）
Ｍ体形成ホルモン抗体（免疫動物マウス）のペルオキシ
ダーゼ標識物を用いて試験例１と同様にして測定した結
果、該フィルム表面に固定化された表記抗原固定化量は
ｏ、２ｅｇｇ／　ａ／であった・ 実施例８ ヒトＡＦＰ固１．イフィブロインフィルムのし ヒ１−ＡＦＰを、四方を仕切ったアクリル板五に５ｇｇ
／ａ／となるように流延し、１０℃で１０時間乾燥した
０次いで実施例１（１）と同様にして得たフィブロイン
水溶液を濃縮して１３重量％のフィブロイン水溶液とし
、更にグリセリンをフィブロインに対して３０＠量％に
なるように加えた溶液をその上から１１ｔ延し、１５℃
で１０時間乾燥することによって皮膜化させ、厚さ１２
０−の表記と）ＡＦＰ固定化フィブロインフィルムを得
た。実施例１（２）と同様にして測定した表記フィブロ
インフィルムの結晶化度は４２％であった。

表記フィブロインフィルムを用いて以Ｆの試験を行った
。

試験例１３　見掛単位面積当たりの抗原固定化早抗ヒ）
ＡＦＰ抗体（免疫動物マウス）のペルオキシダーゼ標識
物を用いて試験例１と同様にして測定した結果、該フィ
ルム表面に固定化された表記抗原固定化量は０．２１ｇ
／ａ／であったつ

【図面の簡単な説明】

第１図は、フィブロインの結晶化度測定のためのＸ線広
角回折チャートの一例を示すものであり、（ａ）はフィ
ブロインフィルムの、また（ｂ）は対照の無定形フィブ
ロインフィルムの回折強度曲線である。 第２図はＡＦＰの標準画１１（試験例４）を、第３図は
ｈＣＧの標準曲線（試験例６）を、第４図は抗ｈＣＧ抗
体の標準曲線（試験例１１）をそれぞれ表わす。 第１図 回折角度（２θン 第　λ　図 ＡＦＰ（ｎｇ／ｍＲ） 第３図 第９図 抗ｈＣＧ抗体（絹／　ａＱ　）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 予め抗原または抗４を塗布した基板に、フィブロイン水
   溶液を塗布して皮膜化させ、次いで該皮膜を基板より引
   き剥がすことを特徴とする固定化抗原または抗体の製造
   方法。