JPS60146154A - オステオカルシン関連誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオステオカルシン関連誘導体、当該誘導体を酵
素標識抗原として使用することを特徴とするオステオカ
ルシンの測定方法および測定試薬に関する。

オステオカルシンは分子中にγ−カルボキシグルタミン
酸残基を含む骨代謝関連の蛋白質である。

当該残基の生合成、すなわちグルタミン酸のｒ位炭素の
カルボキシル化反応にはビタミンにの存在が不可欠であ
ることがわかっている。

またオステオカルシンの抽出方法並びに物理的。

化学的性質についてはすでに知られており、参考として
掲げる下記文献における記述は上記方法並びに性質につ
いての説明として本発明において引用される。

１　）　Ｈａｕｓｃｈｋａ、　Ｐ、　Ｖ、、　Ｌｉａｎ
、　Ｊ、　Ｂ、　＆　Ｇａｕｏｐ、　Ｐ、　Ｍ、　：Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
７２．３９２５　（１９７５）２）　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｐ
、　Ａ、、　０ｔｓｕｋａ、　Ａ、　Ｓ、、　Ｐｏ５ｅ
ｒ、　Ｊ、　Ｗ、、　Ｋｒ１ｓ−ｔａｐｏｎｉｏ、　Ｊ
、　＆　Ｒａｍａｎ、　Ｎ、　：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７３．１４４７　（１９７６）３）　０１ｓ
ｅｎ、　Ｒ，Ｅ、　＆　５ｕｔｔｉｅ、　Ｊ、　Ｗ、　
：　Ｖｉｔａｍ、　Ｈｏｒｍ、、　３５゜５９　（１９
７７） ４）　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　Ｓ、　Ｋ、、　Ｐｒ１ｃ
ｅ、　Ｐ、　Ａ、　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、
。

２５４、４３７　（１９７９） ５　）　Ｌｉａｎ、　Ｊ、　Ｂ、　＆　Ｆｒｉｅｄｍａ
ｎ、　Ｐ、　Ａ、　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
。

２５３、６６２３　（１９７８） ６）　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｐ、　Ａ、、　０ｔｓｕｋａ、　
Ａ、　Ｓ、　＆Ｐｏ５ｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、　：　ＣＣａ
−１ｃｉｕ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎ
ｄ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ｅｄ、　ｂｙ
　Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、　Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、）、　
ｐ、　３３８．　Ｅｌｓｅ−ｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ　Ｉｎｃ、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１
９７８）７）　Ｈａｕｓｃｈｋａ、　Ｐ、　Ｖ、　＆　
Ｇａ１ｌｏｐ、　Ｐ、　Ｍ、　：　ＣａｌｃｉｕｍＢｉ
ｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃａｌｃｉｕｍ
　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　（ｅｄ、　ｂｙＷａｓｓｅｒｍａ
ｎ、　Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　ｐ、　３３８．　Ｅｌ
ｓｏｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｉｎｃ、、
　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９７８）８）　Ｏｔａｗａ
ｒａ、　Ｙ、、　Ｈｏ５ｏｙａ、　Ｎ、、　Ｍｏｒｉｕ
ｃｈｉ、　Ｓ、、　Ｋａｓａｉ。

Ｈ，＆　Ｏｋｕｙａｍａ、　Ｎ、　：　Ｊ、　Ｎｕｔｒ
、　Ｓｃｉ、　Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ、。

２６、２０９　（１９８０） ９）　Ｌｉａｎ、　Ｊ、　Ｂ、、　Ｈａｕｓｃｈｋａ、
　Ｐ、　Ｖ、　＆　Ｇａ１ｌｏｐ、　Ｐ、　Ｍ、　：Ｆ
ｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　３７．２６１５　（１９７８）
１０）　Ｐｏ５ｅｒ、　Ｊ、児、　Ｅｓｃｈ、　Ｆ、　
Ｓ、、　Ｌｉｎｇ、　Ｎ、　Ｏ，＆　Ｐｒ１ｃｅ。

Ｐ、　Ａ、　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２
５５．８６８５　（１９８０）さて血中のオステオカル
シンの増減は骨中のカルシウム量あるいは骨の石灰化と
関連があり、臨床的にはベージェット病、骨転移、原発
性副甲状腺機能冗進症、オステオベニアの診断において
有用な指標となることがわかっている。従って、血中に
おけるオステオカルシンの存在量を測定することは臨床
的に有意義なことである。この目的のため測定方法とし
て現在ラジオイムノアッセイ法が確立され、一般に提示
されている。下記文献にはオステオカルシンの測定の臨
床的な意義並びに上記ラジオイムノアッセイ法について
記述してあり、参考として掲げる。

１１）　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｐ、　Ａ、　＆　Ｂａｕｋｏｌ
、　Ｓ、　Ａ、　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５５、１１６６０（１９８０） １２）Ｐｒｉｃｅ、　Ｐ、　Ａ、、　Ｐａｒｔｈｅｍｏ
ｒｅ、　Ｊ、　Ｇ、、　Ｄｅｆｔｏｓ、　Ｌ、　Ｊ、　
：　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　６６、８７８−８８３
　（１９８０）ところで、ここに示されているラジオイ
ムノアッセイ法においては、放射性同位元素で標識した
オステオカルシンが不安定であり、またそれによって高
い測定感度がもたらされるとは必ずしも言えず、オステ
オカルシンの測定方法はいまだ満足できる状況に至って
いない。

かかる状況にかんがみ本発明者は特別の手技を要するこ
となく、単純簡便な操作によって実施することができ、
しかも検量性、特異性および感度の高い測定が可能とな
るオステオカルシンの測定方法を提供すべ（検討をおこ
なった。その結果。

オステオカルシンに架橋剤をもって酵素を標識せしめた
酵素標識抗原を使用して酵素免疫測定法をおこなうこと
により所期の目的が達成されることを知り本発明を完成
するに至った。

すなわち本発明の目的は単純簡便な操作によって検量性
、特異性および感度の高い測定が可能となるオステオカ
ルシンの測定方法並びにそのためにあらかじめ準備され
た測定試薬の提供であり。

本発明は当該目的の達成のために、オステオカルシンに
架橋剤をもって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用
する技術手段を開示するものである。

以下に本発明の構成をさらに詳細に説明する。

本発明酵素標識抗原は物質としては下記式によって示さ
れるオステオカルシン関連誘導体である。ここで式中Ｘ
はＸ−ＮＨ，がオステオカルシンである残基を意味して
おり、またＹはＹ−８Ｈがβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで
ある残基を意味する。

さらに具体的に説明すれば次のごとくである。

まず、オステオカルシンは９例えば下記−次槽造式によ
って示されるごとく９分子中にγ−カルボキシグルタミ
ン酸残基（Ｇｌａと略記）を含む骨蛋白質であり、動物
種によって多少の変化がある。

しかし２本発明においてオステオカルシンは動物種に関
係な（、要は分子中にＧｌａを２〜３個含有する骨蛋白
質であって１分子量が５，０００〜６，０００であるも
のについて、これを総称する概念として使用される。

またＹ−８Ｈにおいて記載される一８Ｈはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ分子中に存在するチオール基を意味してい
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼはβ−Ｄ−ガラクトサイ
ドの加水分解酵素であり９例えば基質として４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトサイドを使用した
場合には、４−メチルウンベリフェロンおよびβ−Ｄ−
ガラクトースを遊離する。

前記オステオカルシン関連誘導体はオステオカルシンの
抗原活性およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を併有し
ているので、オステオカルシンの酵素免疫測定法におけ
る酵素標識抗原として使用することができる。

本発明オステオカルシン関連誘導体の調製は。

架橋剤として例えばサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを使
用する場合に次のようにおこなえばよい。

まず、オステオカルシンにサクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ＳＭＣＣと略記する）を反応させ。

オステオカルシンのＮ末端にＮ−マレイミドメチルシク
ロヘキサンカルボニル基を導入する。ここでゲル濾過し
て反応生成物と未反応ＳＭＣＣとを分離する。次に反応
生成物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させ、当該ガ
ラクトシダーゼ中のＳＨ基を介してマレイミド基に附加
せしめる。限外濾過により濃縮後再びゲル濾過し、　２
２５ｎｍ吸光値並びにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を
測定して所定のフラクションを集めればよい。上記調製
によって得られる本発明オステオカルシン関連誘導体は
オステオカルシン関連誘導体の前記式において１（−Ｃ
Ｈ，−σ）−である誘導体である。この場合において本
発明オステオカルシン関連誘導体をオステオカルシン−
ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼと略記する。

架橋剤としてＳＭＣＣの代わりにサクシニミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートまたはｍ−マレイ
ミドベンゾイル’Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ルを使用する点を除いて上記調製と同様に調製すれば、
やはり本発明オステオカルシン関連誘導体を得ることが
できる。これらの場合において得られるオステオカルシ
ン関連誘導体は前記式においてＺがそれぞれ である誘導体である。

次に本発明測定方法について説明する。

本発明測定方法は酵素免疫測定法であって、競合法（固
相）を利用するものである。従って本発明測定方法の一
例として、抗原系としてのオステオカルシン（被検試料
中のオステオカルシン）およびオステオカルシン関連誘
導体（酵素標識抗原ン並びに抗体系としてのオステオカ
ルシン抗体（第一抗体）および固相化抗家兎ＩｇＧ抗体
ぐ固相化第二抗体）を構成要素とする測定方法がある。

特にこの方法について詳細に述べれば次のごとくである
。

まずオステオカルシン抗体（第一抗体）としては。

オステオカルシンで免疫した家兎の抗血清を使用すれば
よい。第二抗体としては９例えば家兎ＩｇＧで免疫した
ヤギの抗血清をアフィニティークロマトグラフィーでＩ
ｇＧ分割したものを使用する。家兎ＩｇＧで免疫したヤ
ギの抗血清としては例えばＣａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、より
市販品として入手することのできる凍結乾燥品を使用す
ることができる。アフィニティークロマトグラフィーの
ためのカラムとしては例えばＢｒＣＮで活性化したセフ
ァローズ４Ｂに家兎ｒ−グロブリンをカップリングさせ
た樹脂を充填したものを使用すればよい。アフィニティ
ークロマトグラフィーは９例えば前記凍結乾燥品を０．
１　Ｍ　Ｍａｉｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ７，８）に溶解してカラムに通し２次に５０
ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎθ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ２，３）で
溶出すればよい。

固相化のための固相としては当分野で通常使用されるも
のを使用すればよく９例えばセファロース６ＭＢ、シリ
コンピースなどを使用することができる。例えばシリコ
ンピースをよく洗滌した後。

前記第二抗体を加えて撹拌することにより吸着させる。

本発明はオステオカルシン関連誘導体を使用することを
特徴とする測定方法並びに測定試薬であるから、アフィ
ニティークロマトグラフィーのための樹脂および方法あ
るいは固相化のための固相および方法については９本発
明の目的を損わない限りにおいて自由に選択することが
できる。従ってここにおける記述並びに後記実施例は単
に好ましい態様例を示すにすぎず９本発明を限定するも
のではない。

さて、当該測定方法は具体的には次のように実施される
。

まず、オステオカルシン抗体（第一抗体）、被検試料お
よび本発明オステオカルシン関連誘導体（酵素標識抗原
）を混合し９例えば４°Ｃで一夜放置。

固相化第二抗体を加え、３７°Ｃで２時間インキュベー
トする。固相を分離し、固相に結合した酵素の活性を測
定する。なお酵素活性は次のように測定すればよい。

固相に基質溶液（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ
−４ラクトサイド）を加え、３７°Ｃで一定時間反応さ
せた後１反応を停止する。次に生成した４−メチルウン
ベリフェロン量を蛍光分析（励起波長３６０　ｎｍ、蛍
光波長４５０　ｎｍ）によって測定する。

次に本発明測定試薬は酵素標識抗原としてのオステオカ
ルシン関連誘導体を必須の構成成分として含有する試薬
である。従って、前記例示の酵素免疫測定方法に対応す
る試薬の具体的態様を示せば次のごとくである。すなわ
ち９本発明測定試薬はオステオカルシン関連誘導体それ
自体あるいは同誘導体とオステオカルシン抗体（第一抗
体）および／または固相化第二抗体とを組合せたセット
である。

ここで固相化第二抗体がその製造原料１例えば抗家兎Ｉ
ｇＧヤギ血清あるいはそのＩｇＧ分割および／または固
相のままで提供されることは自由である。

この場合には測定にあたり製造原料から固相化第二抗体
を用時調製して使用する。また測定操作の便益のために
適当なる希釈用の緩衝液、基質（例えば４−メチルウン
ベリフェリルーβ−Ｄ−ガラクトサイド）その他をセ・
ント中に添付することも自由であり、これらは本発明を
限定するものではない。

以下に記載する実験例をもって本発明の詳細な説明する
。

実験例１ 被検試料ウシオステオカルシンについて後記実施例３に
記載の測定方法によりＢ／Ｂ、　（％）をめ。

タテ軸にＢ／Ｂｏ（％）を、またヨコ軸にオステオカル
シン濃度をとる検量線を各測定方法ごとに作成した。

結果を図１に示す。図１は実施例３に記載の測定方法に
よりめた検量線を示し、抗オステオカルシン家兎血清は
２　Ｘ　１０’倍希釈、オステオカルシンー８ＭＣＣ−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼは５００倍希釈、基質は１．
５Ｘ１０　’Ｍである。

図１より本発明測定試薬並びに本発明測定方法がそれぞ
れ検量性の高いものであることが判明する。また測定感
度は０．１　ｎｇ／ｍＬであり、高い測定感度を示すも
のであることが判明する。

実験例２ 被検試料としてウシオステオカルシン、ヒトオステオカ
ルシン、ラットオステオカルシン、をとりあげ、実施例
３に記載の測定方法によって各被検試料についてのＢ／
Ｂｏ（％）をめ、実験例１におけると同様な検量線を作
成した。

結果を図２に示す。図中、θ印線はウシオステオカルシ
ンについて、Ｏ印線はヒトオステオカルシンについて９
口印線はラットオステオカルシンについての結果を示す
。図２より抗ウシオステオカルシン家兎血清はラットオ
ステオカルシンとは交差反応性を呈さないが、ウシオス
テオカルシンはもとより、ヒトオステオカルシンとも交
差反応性を呈することが判明する。またウシオステオカ
ルシンより調製した実施例２記載の測定試薬および同測
定試薬を使用する実施例３記載の測定方法はウシオステ
オカルシンおよびヒトオステオカルシンに対してよい検
量性を示すものであることが判明する。

実験例３ 被検試料としてヒト血清を後記実施例２に記載の希釈用
緩衝液で１０倍、２０倍、４０倍、８０倍に希釈したも
のをとりあげ、実施例３に記載の測定方法により各試料
についてのＢ／Ｂｏ（％）をめた。

結果を図３に示す。図３よりヒトオステオカルシンに対
する抗ウシオステオカルシン家兎血清の交差反応性は血
清中の他の夾雑蛋白質等の影響を受けることが少な（、
血清試料を２０倍乃至４０倍に希釈しても１本発明測定
試薬並びに本発明測定方法によって血清中ヒトオステオ
カルシンを測定することができることが判明する。

以下に記載する実施例をもって本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例１ まずウシオステオカルシンの抽出精製を以下のごとくお
こなった。ウシ大腿骨を細砕し、水洗後アセトンで脱脂
したものを凍結乾燥して得られた粉末を２０９６ギ酸で
脱灰することにより、オステオによるゲル濾過ならびに
ＤＥＡＥ−トヨバール６５０Ｓによるイオン交換クロマ
トグラフィーを行なって。

オステオカルシンを精製した。精製したものについては
、アミノ酸分析を行ない。そのアミノ酸組成より、オス
テオカルシンと同定した。

次に本発明オステオカルシン関連誘導体を以下のとト＜
作製した。ウシオステオカルシン３００μｇを１　ｍｌ
の５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，０）に溶解
した。

これに、１００μｔのＳＭＣＧ　（サクシニミジル４＝
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート）−ジオキサン溶液（３ｍｇムＬ）を加え。

室温で１時間反応させた。この反応液を５ｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５のカラムに通し、未反応のＳＭＣＣを除去し
て。

オステオカルシン−ＳＭＣＣ反応生成物を得た。カラム
の溶出は、　５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，
０）で行なった。

このカラムクロマトグラフィーを図４に示す。

図中、（工）はオステオカルシン−ＳＭＣＣ反応生成物
。

（２）は未反応５Ｍ０Ｃの各ピークを示す。得られたオ
ステオカルシン−ＳＭＣＣ反応生成物の一部（全量の約
１／２５）をとり、これに０．５■のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（Ｅ、Ｃｏ１１）を加えることにより、カップ
リングさせた。カップリング反応は、室温で１時間、つ
いで４℃で一晩放置させることで行なった。反応終了後
、　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５のカラムにかけ、　１
５０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭ　ＭｇＣ１，を含む５０
ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，０）で溶出し、目的
とするオステオカルシン−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼを採取して。

本発明オステオカルシン関連誘導体とした。なおこのカ
ラムクロマトグラフィーを図５に示す。得られた。オス
テオカルシン；β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液は、０．
２％ＢＳＡ、　０．１％　ＮａＮ３を加えて。

４°Ｃにて保存した。

実施例２ 実施例１において得られたオステオカルシン−２８Ｍ０
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼと下記■〜■の試薬とを
組合せてオステオカルシン測定用試薬セットとした。

■　固相化第二抗体（抗家兎ＩｇＧヤギ血清のＩｇＧ分
劇物をシリコンピースに固相化した固相化ＩｇＧ）の製
造原料 ■　抗オステオカルシン家兎血清 ■　希釈用緩衝液 なお、固相化第二抗体の製造原料から上記■の固相化第
二抗体を以下ａ、およびす、の二段の操作を経て用時調
製した。

ａ、第二抗体の精製 ＢｒＣＮで活性化したセファロース４Ｂ：５．に対して
１１００ｒＩＬの家兎γ−グロブリンをカップリングさ
せた樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィー
を行なった。

ヤギの抗家兎ＩｇＧ血清の凍結乾燥品（ＩｇＧとして約
２４１ｎｇを含む）を、４ｉＬの０．１Ｍ　ＮａＣ１を
含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ緩衝液（ｐＨ７，８）
に溶解し、先の樹脂を充填したカラムに通した。同緩衝
液でカラムを洗い、未吸着のものを除去した後。

０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む５０ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ
−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ２，５）を用いて、家兎ｒ−グロ
ブリンと特異的に結合した抗体を溶出させた。

溶出液には、直ちにＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓを加えてｐＨ７，
９とした。得られた特異的抗体を第二抗体とした。

ｂ、シリコンピースへの第二抗体の吸着シリコンピース
をあらかじめ蒸留水で、つづいて１５０ｍＭのＮａ１ｌ
を含む５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し
て使用した。

第２抗体５ｍ１７を同緩衝液５０　ｍｌに溶解させ、こ
れにシリコンピース５００個を加えて、室温で２時間撹
拌後、４℃にて数日放置した後測定に使用した。

また上記■の血清は以下のようにして得た。

ウシオステオカルシン６４０μｇおよびウシ血清アルブ
ミンｒｏｏＢ、ｇをＬ２ｍＬの５０ｍＭ　リン酸ｂｕｆ
ｆｅｒ　（ｐＨ７，４）に溶解させた後、１−ｅｔｈｙ
ｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ
ｌ）　−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏ　−ｃｈ
ｌｏｒｉｄｅ　（ＥＤＣ）、　１５　ｍｇを加えて、室
温にて一晩反応させた。

コノ反応液を１５０ｍＭのＮａＣ１を含む、１０ｍＭリ
ン酸ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，４）に対して透析した後
。

等量のＦｒｅｕｎｄＡ　ｃ６ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖ
ａｎｔを加えて、エマルジョンを作成した。

オステオカルシン約２００μｇ相当量を体重約３ｈｇの
家兎（♂）の背部皮肉数ケ所に注射した。

追加免疫は、３週間後および、さらにその５週間後に同
量を背部皮肉に注射することで行なった。追加免疫後、
３週間口に採血して。

ウシオステカルシンに対する抗血清を得た。

なお、ウシオステオカルシンに対する抗血清はヒトオス
テオカルシンとも免疫学的交差性を示すことが明らかに
されている。

上記■の希釈用緩衝液は５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
緩衝液（ｐＨ７，４）に１５０　ｍＭ　Ｎａ１ｌ、　０
，２９６ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）、　１ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ、、　２５０ＫＩＵ／ｍＬ７プロチニンおよび０
．０５％Ｔｗｅｅｎ　８０を含有せしめて調製した。

実施例３ 被検試料について実施例２記載の試薬セットをもって測
定する。まず、抗オステオカルシン家兎血清を希釈用緩
衝液によって２Ｘ１０’倍希釈し、この１００μ乙に被
検試料１００μｌを加え、４°Ｃで６時間インキュベー
トした。これにオステオカルシン−ＳＭＣＣ−４−Ｄ−
ガラクトシダーゼを希釈用緩衝液によって５００倍希釈
した液１００μＬを加え，４℃で一夜放置した。実施例
２で用時調製した固相化第二抗体を加え，３７８Ｃで２
時間振とうし，シリコンピースをとりだし，希釈用緩衝
液で洗滌し，シリコンピースを集めシリコンピースに結
合しているβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性（Ｂ）
を測定した。

別に被検試料を除いて，すなわぢ抗オステオカルシン家
兎血清．オステオカルシン−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラク
トシダーゼを希釈用緩衝液で希釈し。

以下上記と同じ操作によりシリコンピースに結合してい
るβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性（Ｂｅ）を測定
した。

最後に次式によりＢ／Ｂｏ　（％）をめた。

Ｂ／Ｂｏ（９６）＝　−　ｘ　１００ Ｂ。

なお、酵素活性は次のように測定した。

固相に１００μ乙の基質溶液（４　−　ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−ｐ　−　ｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄｅを１．５　Ｘ　１０　Ｍになるように。

１ｍＭＭｇＣｌ，を含む，５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
．７．０）に溶解したもの）を加え，１時間３７℃で反
応させた後，２．５ｍｌの０．１　Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ
−ＮａＯＨ　（　ｐＨ　１０．３）を加えて反応を止め
た。

生成した４　−　ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｎｉｆｅｒｏｎ
ｅ量を蛍光分析した。蛍光は，励起波長３６０　ｎｍ，
蛍光波長４５０ｎｍで測定した。

【図面の簡単な説明】

図１は実験例１に記載の図１に相応し，タテ軸ニＢ／Ｂ
ｏ　（９６）、ヨコ軸にウシオステオカルシン濃度をと
った検量線を示す。 図２は実験例２に記載の図２に相応し，タテ軸にＢ／Ｂ
０（９６）、ヨコ軸にウシオステオカルシン、ヒトオス
テオカルシン、ラットオステオカルシンの各濃度をとっ
た各検量線を示す。 図３は実験例３に記載の図３に相応し，タテ軸に）３７
Ｈａ　（９６）、ヨコ軸にヒト血清の希釈倍率をとった
検量線を示す。 図４９図５は実施例１において記載される図４゜図５に
相応し、それぞれカラムクロマトグラフィーを示す。 特許出願人 工−ザイ株式会社 図１ Ｂ／ＢＯ （％） オステオカルシン　（ｎｇ／　ｍｌ） 図４ （２） ０　２０　４０ 分　画！ｌ　Ｎｏ、（１，６７ｎ＋１．／を曲０）図　
面 図５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 によって示されるオステオカルシン関連誘導体。 〔ただし式中ＸはＸ−ＮＨ２がオステオカルシンである
   残基を意味し、ＹはＹ−８Ｈがβ−Ｄ−ガラクトシダー
   ゼである残基を意味する。またＺはする〕 （２）式 によって示される架橋剤にＸ−ＮＨ，を反応させてを生
   成せしめ、当該生成物にＹ−８Ｈを反応させることを特
   徴とする式 によって示されるオステオカルシン誘導体の製法。 〔ただしｘ、　ｙ、ｚは特許請求の範囲第１項における
   ただし書き記載と同一の残基を意味する〕（３）オステ
   オカルシンを酵素免疫測定法によって測定するにあたり
   、当該測定における酵素標識抗原として特許請求の範囲
   第１項記載のオステオカルシン関連誘導体を使用するこ
   とを特徴とするオステオカルシンの測定方法 （４）オステオカルシンを酵素免疫測定法によって測定
   する試薬であって、当該測定における酵素標識抗原とし
   て特許請求の範囲第１項記載のオステオカルシン関連誘
   導体が含まれることを特徴とするオステオカルシンの測
   定試薬