JPS59132889A - Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼの製造法Info
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- JPS59132889A JPS59132889A JP58006338A JP633883A JPS59132889A JP S59132889 A JPS59132889 A JP S59132889A JP 58006338 A JP58006338 A JP 58006338A JP 633883 A JP633883 A JP 633883A JP S59132889 A JPS59132889 A JP S59132889A
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- streptomyces
- alanine
- alanine dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はストレプトミセス属に属するし一アラニンデヒ
ドロゲナーゼ（Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎ−ａｓｅ （ＥＣ’１．４．１．１） 、以下Ａ
ＮＤＨという）生産能を有する菌株をＤＬ−アラニンを
含む培地に培養し、得られた培養物からＡβＤＨを採取
することを特徴とするＡＪＤＨの製造法に関する。
ドロゲナーゼ（Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎ−ａｓｅ （ＥＣ’１．４．１．１） 、以下Ａ
ＮＤＨという）生産能を有する菌株をＤＬ−アラニンを
含む培地に培養し、得られた培養物からＡβＤＨを採取
することを特徴とするＡＪＤＨの製造法に関する。
ＡβＤＨは、Ｌ−アラニン＋ＮＡＤ” ＋ ’Ｈ２０！
ピルビン酸十ＮＨ３＋＋ ＮＡＤＨ＋ Ｈ＋の反応を触
媒しＬ−アラニンの定量あるいはＬ−アラニンを含有す
るペプチドを基質とし種々のペプチダーゼを作用させ、
それより遊離するし一アラニンをＡβＤＨで測定するこ
とによるペプチダーゼの活性測定法に利用される酵素と
して重要である。さらに、近年にはピルビン酸、アンモ
ニウム塩、ＮＡＤＨの存在下本酵素を作用せしめＬ−ア
ラニンを合成するなどの酵素反応器に使用する酵素とし
て注目されている。
ピルビン酸十ＮＨ３＋＋ ＮＡＤＨ＋ Ｈ＋の反応を触
媒しＬ−アラニンの定量あるいはＬ−アラニンを含有す
るペプチドを基質とし種々のペプチダーゼを作用させ、
それより遊離するし一アラニンをＡβＤＨで測定するこ
とによるペプチダーゼの活性測定法に利用される酵素と
して重要である。さらに、近年にはピルビン酸、アンモ
ニウム塩、ＮＡＤＨの存在下本酵素を作用せしめＬ−ア
ラニンを合成するなどの酵素反応器に使用する酵素とし
て注目されている。
従来ＡβＤＨの生産菌としてはバチルス・セレウス〔ジ
ャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ。
ャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） ７６巻、５７８頁、 １９５
８年〕、バチルス・ズブチリス〔バイオキミカ エ バ
イオフィジカアクタ （Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ａｃｔａ） ９６巻、２４８頁、 １９６５年
） 、バチルス・スファエリカス〔ヨーロピアン ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅＩｌｌ、 ） １００巻、２９頁、 １
９７９年〕、サーマス・サーモフィラス〔バイオキミカ
エバイオフィジカ アクタ（ＢｉｏｃｈｉＩＩｌ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
８年〕、バチルス・ズブチリス〔バイオキミカ エ バ
イオフィジカアクタ （Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ａｃｔａ） ９６巻、２４８頁、 １９６５年
） 、バチルス・スファエリカス〔ヨーロピアン ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅＩｌｌ、 ） １００巻、２９頁、 １
９７９年〕、サーマス・サーモフィラス〔バイオキミカ
エバイオフィジカ アクタ（ＢｉｏｃｈｉＩＩｌ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ。
＾ｃｔａ） ６１５巻、３４頁、 １９８０年〕、ハロ
バクテリウム・サリナリイウム〔同誌５７０巻、１頁、
１９７９年〕、ストレプトミセス・クラブリゲルス〔
アーカイフ゛ス オフ゛ マイクロバイオロジー（Ａｒ
ｃｈ、 Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌ、 ） １２５巻、１３
７頁、 １９８０年〕が知られている。上記菌株よりＡ
ｊ！ Ｄ Ｈを取得するには通常の炭素源、窒素源、
無機塩に誘導物質としてＤ−アラニンまたはＬ−アラニ
ンを添加した培地に培養する 。
バクテリウム・サリナリイウム〔同誌５７０巻、１頁、
１９７９年〕、ストレプトミセス・クラブリゲルス〔
アーカイフ゛ス オフ゛ マイクロバイオロジー（Ａｒ
ｃｈ、 Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌ、 ） １２５巻、１３
７頁、 １９８０年〕が知られている。上記菌株よりＡ
ｊ！ Ｄ Ｈを取得するには通常の炭素源、窒素源、
無機塩に誘導物質としてＤ−アラニンまたはＬ−アラニ
ンを添加した培地に培養する 。
方法が行われているが、ＡβＤＨの生産性、価格などの
点から十分満足できるものではなかった。
点から十分満足できるものではなかった。
本発明者らはＡβＤＨを生産する菌株を検索しその製造
法について検討を重ねたところ、ストレプトミセス属に
属する菌株を、誘導物質としてＤＬ−アラニンを含む培
地に培養するとＡβＤＨが著量蓄積されることを見いだ
した。ＤＬ−アラニンはし一アラニンまたはＤ−アラニ
ンに比較して極めて安価であり、その産業的価値は大き
なものがある。
法について検討を重ねたところ、ストレプトミセス属に
属する菌株を、誘導物質としてＤＬ−アラニンを含む培
地に培養するとＡβＤＨが著量蓄積されることを見いだ
した。ＤＬ−アラニンはし一アラニンまたはＤ−アラニ
ンに比較して極めて安価であり、その産業的価値は大き
なものがある。
さらに、本発明者らは得られた培養物からｊｌＤＨを精
製するに当たってエチレンジアミン四酢酸（以下ＩＩ！
ＤＴＡという）な８の金属キレート剤を使用することに
より混在するペプチダーゼが容易に除去されることを知
り、その結果Ａｊ！ＤＨを高収率で得ることに成功した
。ペプチダーゼは、ＡＪＤＨをペプチダーゼ活性測定用
酵素の一つとして使用する場合には混在してはならない
ものとされている。
製するに当たってエチレンジアミン四酢酸（以下ＩＩ！
ＤＴＡという）な８の金属キレート剤を使用することに
より混在するペプチダーゼが容易に除去されることを知
り、その結果Ａｊ！ＤＨを高収率で得ることに成功した
。ペプチダーゼは、ＡＪＤＨをペプチダーゼ活性測定用
酵素の一つとして使用する場合には混在してはならない
ものとされている。
本発明で使用されるストレプトミセス属に属する菌株と
はストレプトミセス・グリセオルテラス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｔｅｕｓ ） 、スト
レプトミセス・ヒゲロスコピカス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ） 、。
はストレプトミセス・グリセオルテラス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｔｅｕｓ ） 、スト
レプトミセス・ヒゲロスコピカス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ） 、。
ストレプトミセス・アルボロンゲス（Ｓ、 ａｌｂｏｌ
ｏ−ｎｇｕｓ） 、ストレプトミセス・リモサス（Ｓ、
ｒｉｍｏ−ＳＵＳ ） 、ストレプトミセス・ファエ
オクロモゲネス（Ｓ、 ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ ） 、ストレプトミセス・リディカス（Ｓ、 Ｉ
ｙｄｉｃｕｓ） 、ストレプトミセス・カエスピトサス
（Ｓ、 ｃａｅｓｐｉ ｔｏｓｕｓ） ％ストレプトミ
セス・コエリコロル（Ｓ、 ｃｏｅＬｉｃｏｌｏｒ ）
、ストレプトミセス・ロゼウス（Ｓ、 ｒｏｓｅｕｓ
） 、ストレプトミセス・アルプス（Ｓ、 ａｌｂｕ
ｓ） 、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（３，
０１ｉｖｏｃｈｒｏ−ｍｏｇｅｎｅｓ ）−、ストレプ
トミセス・ルベル（Ｓ、 ｒｕ−ｂｅｒ ） 、ストレ
プトミセス・グリセウス（Ｓ、 ｇｒ−ｉｓｅｕｓ ）
またはストレプトミセス・メラノスポレア（Ｓ、 ｍｅ
ｌａｎｏｓｐｏｒｅａ ）などである。これらのうち特
に好ましいのはストレプトミセス・グリセオルテラス（
Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｌｕｔｅｕｓ ） ＩＡＭ ００６
０、ストレプトミセス・ヒゲロスコピカス（Ｓ、 ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉ−ｃｕｓ ） ＩＦＯ３９３４、スト
レプトミセス・リモサス（Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓ） Ｉ
ＦＯ３２２６またはストレプトミセス・ファエオクロモ
ゲネス（Ｓ、 ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ）
ＩＦＯ３１４９である。
ｏ−ｎｇｕｓ） 、ストレプトミセス・リモサス（Ｓ、
ｒｉｍｏ−ＳＵＳ ） 、ストレプトミセス・ファエ
オクロモゲネス（Ｓ、 ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ ） 、ストレプトミセス・リディカス（Ｓ、 Ｉ
ｙｄｉｃｕｓ） 、ストレプトミセス・カエスピトサス
（Ｓ、 ｃａｅｓｐｉ ｔｏｓｕｓ） ％ストレプトミ
セス・コエリコロル（Ｓ、 ｃｏｅＬｉｃｏｌｏｒ ）
、ストレプトミセス・ロゼウス（Ｓ、 ｒｏｓｅｕｓ
） 、ストレプトミセス・アルプス（Ｓ、 ａｌｂｕ
ｓ） 、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（３，
０１ｉｖｏｃｈｒｏ−ｍｏｇｅｎｅｓ ）−、ストレプ
トミセス・ルベル（Ｓ、 ｒｕ−ｂｅｒ ） 、ストレ
プトミセス・グリセウス（Ｓ、 ｇｒ−ｉｓｅｕｓ ）
またはストレプトミセス・メラノスポレア（Ｓ、 ｍｅ
ｌａｎｏｓｐｏｒｅａ ）などである。これらのうち特
に好ましいのはストレプトミセス・グリセオルテラス（
Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｌｕｔｅｕｓ ） ＩＡＭ ００６
０、ストレプトミセス・ヒゲロスコピカス（Ｓ、 ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉ−ｃｕｓ ） ＩＦＯ３９３４、スト
レプトミセス・リモサス（Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓ） Ｉ
ＦＯ３２２６またはストレプトミセス・ファエオクロモ
ゲネス（Ｓ、 ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ）
ＩＦＯ３１４９である。
上記菌株をＤＬ−アラニンを含む培地に培養し、従来知
られているバチルス・スファエリカス菌との／ＩＤＨＩ
Ｄ性の比較を行った。（第１表）第１表 第１表から、本発明法の有用性がわかる。
られているバチルス・スファエリカス菌との／ＩＤＨＩ
Ｄ性の比較を行った。（第１表）第１表 第１表から、本発明法の有用性がわかる。
本発明法において使用される培地としては種々の炭素源
、窒素源、無機塩ならびにＤＬ−アラニンを含む培地で
あれば合成培地、天然培地いずれでも用いることができ
る。培養形態は固体培養、液体培養のいずれでもよいが
、本酵素は菌体内酵素であるから集菌に便利な液体培養
が好ましい。
、窒素源、無機塩ならびにＤＬ−アラニンを含む培地で
あれば合成培地、天然培地いずれでも用いることができ
る。培養形態は固体培養、液体培養のいずれでもよいが
、本酵素は菌体内酵素であるから集菌に便利な液体培養
が好ましい。
ＤＬ−アラニンの培地への添加量は０．１〜１０％であ
り、より好ましくは０．５〜２％である。ストレプトミ
セス・ファエオクロモゲネスＩＰ０３１４９株を麦芽エ
キス、酵母エキスおよび無機塩からなる栄養培地に培養
したときのｏＬ−アラニン添加の効果を第２表に示す。
り、より好ましくは０．５〜２％である。ストレプトミ
セス・ファエオクロモゲネスＩＰ０３１４９株を麦芽エ
キス、酵母エキスおよび無機塩からなる栄養培地に培養
したときのｏＬ−アラニン添加の効果を第２表に示す。
第２表
本発明において用いられる菌株の培養条件について述べ
ると、培養温度は菌が生育し／ＩＤＨが生産される範囲
内であればいずれの温度でもよいが、好ましくは２５〜
３５℃である。ｐｕは通常６〜８の範囲で行われる。培
養時間は酵素力価が最高に達する時間を選べばよく、通
常２４〜４８時間である。
ると、培養温度は菌が生育し／ＩＤＨが生産される範囲
内であればいずれの温度でもよいが、好ましくは２５〜
３５℃である。ｐｕは通常６〜８の範囲で行われる。培
養時間は酵素力価が最高に達する時間を選べばよく、通
常２４〜４８時間である。
以上のようにして得られた培養物からＡ１１ＤＨを採取
するには、本酵素が菌体内に存在するためまず菌体の破
砕を行う。すなわち、培養物をそのまま、好ましくはろ
過または遠心分離により菌体のみを集め超音波、アルミ
ナ磨砕などの機械的方法によって菌体を破砕する。その
後、ろ過もしくは遠心分離によって固形物を除き粗酵素
液を得、さらに本酵素液を塩析、有機溶媒沈澱、吸着ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過などの公知の精製方法を適宜組合せることにより
精製ＡＪＤＨ標品が得られる。
するには、本酵素が菌体内に存在するためまず菌体の破
砕を行う。すなわち、培養物をそのまま、好ましくはろ
過または遠心分離により菌体のみを集め超音波、アルミ
ナ磨砕などの機械的方法によって菌体を破砕する。その
後、ろ過もしくは遠心分離によって固形物を除き粗酵素
液を得、さらに本酵素液を塩析、有機溶媒沈澱、吸着ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過などの公知の精製方法を適宜組合せることにより
精製ＡＪＤＨ標品が得られる。
ここで、前記したように本発明者らは精製の一手段とし
て金属キレート剤を用いると混在するペプチダーゼが容
易に除去されることを知った。金属キレート剤としては
ＥＤＴＡ 、α、α゛−ジピリジル、０−フェナンスロ
リンなどが例示され、使用に当たっては精製段階の任意
の点において酵素溶液に添加するだけでよい。添加濃度
は０．１〜１０１であり、より好ましくは０．５〜２ｍ
Ｍである。
て金属キレート剤を用いると混在するペプチダーゼが容
易に除去されることを知った。金属キレート剤としては
ＥＤＴＡ 、α、α゛−ジピリジル、０−フェナンスロ
リンなどが例示され、使用に当たっては精製段階の任意
の点において酵素溶液に添加するだけでよい。添加濃度
は０．１〜１０１であり、より好ましくは０．５〜２ｍ
Ｍである。
ストレプトミセス・ファエオクロモゲネスｌＰＯ３１４
９株の培養菌体を、１ｍＭ ＲＤＴＡを含む２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液に懸濁しセルミル（エドムント・ヴユ
ラー社製）にて破砕することにより粗酵素抽出液を得た
。この液に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように
加えてＡｌ１Ｄｆ（を沈澱させ、沈澱を上記と同じ緩衝
液に溶解したのちセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社製）でゲルろ過、次いでＤＢＡＥ−セルロース（ブ
ラウン社りカラムクロマトグラフィーを行い、各段階の
、Ｍ！ＤＨ活性およびペプチダーゼ活性を測定した。Ｅ
ＤＴＡを加えないで、他は上記と同様に操作した場合と
の比較を第３表に示す。なおペプチダーゼ活性の測定は
公知のロイシンアミノペプチダーゼ測定用試薬であるＬ
ＡＰＣ−テストワコー（和光純薬社製）を使用した。
９株の培養菌体を、１ｍＭ ＲＤＴＡを含む２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液に懸濁しセルミル（エドムント・ヴユ
ラー社製）にて破砕することにより粗酵素抽出液を得た
。この液に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように
加えてＡｌ１Ｄｆ（を沈澱させ、沈澱を上記と同じ緩衝
液に溶解したのちセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社製）でゲルろ過、次いでＤＢＡＥ−セルロース（ブ
ラウン社りカラムクロマトグラフィーを行い、各段階の
、Ｍ！ＤＨ活性およびペプチダーゼ活性を測定した。Ｅ
ＤＴＡを加えないで、他は上記と同様に操作した場合と
の比較を第３表に示す。なおペプチダーゼ活性の測定は
公知のロイシンアミノペプチダーゼ測定用試薬であるＬ
ＡＰＣ−テストワコー（和光純薬社製）を使用した。
第３表
第３表に示す通り ＥＤＴＡを添加することにより容易
にペプチダーゼが除去されることがわかる。
にペプチダーゼが除去されることがわかる。
無添加の場合はさらに複雑な精製工程が必要となる。
上記方法により極めて低廉な培地原料を使用して著量の
Ａｊ！ＤＨを蓄積せしめることができ、かつ簡単な操作
によりペプチダーゼを含まないＡβＤＨが収率よく得ら
れた。
Ａｊ！ＤＨを蓄積せしめることができ、かつ簡単な操作
によりペプチダーゼを含まないＡβＤＨが収率よく得ら
れた。
次ぎに以上のようにして得られたＡβＤＨの活性測定法
および理化学的性質について述べる。
および理化学的性質について述べる。
ＡβＤＨの酵素活性はＬ−アラニンとニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋という）を基質と
して酵素を反応させ、生成するＮＡＤ！（を３４０ｎｍ
における吸光度の増加から測定することにより算出され
る。すなわち、０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０） ０．８７ｍｅ、２１ｍＭ ＮＡＤ” ０
．０５ｍｅ、０．５ Ｍ Ｌ−アラニン０．０６−およ
び酵素溶液０．０２−を混合し２５℃で反応させ、反応
開始後１分間の３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定
する。対照としてＬ−アラニン溶液の代わりに水を用い
て上記と同様に操作し、得られた吸光度をブランク値と
して上記測定値から差引き、その値から生成ＮＡＤＨの
量を求める。酵素活性の表示は１分間に１μモルのＮＡ
ＤＨを生成する酵素量を１単位とした。
デニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋という）を基質と
して酵素を反応させ、生成するＮＡＤ！（を３４０ｎｍ
における吸光度の増加から測定することにより算出され
る。すなわち、０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０） ０．８７ｍｅ、２１ｍＭ ＮＡＤ” ０
．０５ｍｅ、０．５ Ｍ Ｌ−アラニン０．０６−およ
び酵素溶液０．０２−を混合し２５℃で反応させ、反応
開始後１分間の３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定
する。対照としてＬ−アラニン溶液の代わりに水を用い
て上記と同様に操作し、得られた吸光度をブランク値と
して上記測定値から差引き、その値から生成ＮＡＤＨの
量を求める。酵素活性の表示は１分間に１μモルのＮＡ
ＤＨを生成する酵素量を１単位とした。
ストレプトミセス・ファエオクロモゲネス ｌＰＯ３１
４９株より得られたＡβＤ Ｈの理化学的性質は次のと
おりである。
４９株より得られたＡβＤ Ｈの理化学的性質は次のと
おりである。
Ｔｌ） 作用
本酵素は次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−アラニン十ＮＡＤ＋＋ Ｈ２０
４ピルビン酸十ＮＨ３” ＋ ＮＡＤＨ＋ Ｈ”（２）
基質特異性 本酵素は第４表に示すように、Ｌ−アラニン以外のし一
アミノ酸にはほとんどもしくは全く作用しない。Ｄ−ア
ラニンを始めとするＤ−アミノ酸には作用しない。補酵
素としてＮＡＤＰ＋を用いた場合はＮＡＤ＋に比較し約
０．６％の活性を示すのみである。
基質特異性 本酵素は第４表に示すように、Ｌ−アラニン以外のし一
アミノ酸にはほとんどもしくは全く作用しない。Ｄ−ア
ラニンを始めとするＤ−アミノ酸には作用しない。補酵
素としてＮＡＤＰ＋を用いた場合はＮＡＤ＋に比較し約
０．６％の活性を示すのみである。
第４表
（３）至適ｐＨ
ｐＨ７〜１１の各ｐ＋＋において２５℃、１分間反応し
たところ、ｐｉ（１０付近が至適であった。
たところ、ｐｉ（１０付近が至適であった。
（第１図）
（４１ｐＨ安定性
ｐＨ４〜１１の各ｐＨにおいて２５°Ｃ１３時間処理し
たのちの残存活性を測定したところ、ｐ）ｌ ７〜９の
、 範囲で安定であった。（第２図）（５）至適温度 ２０〜６０℃の各温度においてｐｉ（１０，０，１分間
反応したところ、６０℃付近における活性が最大であっ
た。（第３図） （６） 熱安定性 ０〜６５℃の各温度においてｐＨ７，０，２０分間処理
したのちの残存活性を測定したところ、４５℃以下で安
定であ、った。（第４図） （７） 阻害剤および活性化剤 第５表に示す各種薬剤を加え活性を測定したところ、本
酵素はＣｕ”、Ｐｂ２＋の金属イオンおよびＰＣＭＢ
（パラクロロマーキュリ安息香酸）のごときＳＨ阻害剤
によって活性が阻害された。またＥｏｒｉなどの金属キ
レート剤およびジチオスライトールなどのＳ■保護試薬
によって活性化を受ける。
たのちの残存活性を測定したところ、ｐ）ｌ ７〜９の
、 範囲で安定であった。（第２図）（５）至適温度 ２０〜６０℃の各温度においてｐｉ（１０，０，１分間
反応したところ、６０℃付近における活性が最大であっ
た。（第３図） （６） 熱安定性 ０〜６５℃の各温度においてｐＨ７，０，２０分間処理
したのちの残存活性を測定したところ、４５℃以下で安
定であ、った。（第４図） （７） 阻害剤および活性化剤 第５表に示す各種薬剤を加え活性を測定したところ、本
酵素はＣｕ”、Ｐｂ２＋の金属イオンおよびＰＣＭＢ
（パラクロロマーキュリ安息香酸）のごときＳＨ阻害剤
によって活性が阻害された。またＥｏｒｉなどの金属キ
レート剤およびジチオスライトールなどのＳ■保護試薬
によって活性化を受ける。
（以下余白）
第５表
（８）基質親和性
本酵素のし一アラニン、ＮＡＤ＋に対するミバエリス定
数（Ｋｍ値）はｐＨ１０，０，２５℃の条件において、
それぞれ？、ＩＸ １０−３ Ｍ、 ３．６Ｘ １０−
５ Ｍであった。
数（Ｋｍ値）はｐＨ１０，０，２５℃の条件において、
それぞれ？、ＩＸ １０−３ Ｍ、 ３．６Ｘ １０−
５ Ｍであった。
（９）分子量
セファデックスＧ−２００によるゲルろ適法では、分子
量約２４０，０００、また５Ｏ５−ディスクゲル電気泳
動法による結果からは分子量約３９．０００の単一のサ
ブユニットから構成されていることがわかった。
量約２４０，０００、また５Ｏ５−ディスクゲル電気泳
動法による結果からは分子量約３９．０００の単一のサ
ブユニットから構成されていることがわかった。
実施例１
麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．２％、ＤＬ−アラ
ニン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭＣＩ ０．０５％
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２００，００１％（ｐＨ７，２）から成る組成の培地１
００ｍ１！を入れた５００ｍ容の坂ロフラスコにストレ
プトミセス・リモサス ＩＦｏ ３２２６株を一白金耳
接種し、３０℃で４８時間振盪培養し種培養液とした。
ニン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭＣＩ ０．０５％
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２００，００１％（ｐＨ７，２）から成る組成の培地１
００ｍ１！を入れた５００ｍ容の坂ロフラスコにストレ
プトミセス・リモサス ＩＦｏ ３２２６株を一白金耳
接種し、３０℃で４８時間振盪培養し種培養液とした。
次ぎに、上記と同じ組成の培地２０００−を入れた３０
０〇−容のジャーファーメンタ−に種培養液４０−を接
種し、３０℃、４８時間通気攪拌培養した。培養液を遠
心分離して菌体を集め１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、セルミ
ルにて１０分間菌体破砕を行った。この菌体抽出液を遠
心分離して固形物を除去し得られた上清液に硫酸アンモ
ニウムを５０％飽和になるように加えＡβＤＨを沈澱さ
せた。沈澱を遠心分離により集め、上記同緩衝液に溶解
したのちセファデックスＧ−２５を使用したゲルろ過に
より脱塩した。得られた酵素液を同緩衝液（ｐＨ７，５
）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着させ
、０．４）Ｉ ＫＣＩを含む同緩衝液（ｐＨ７，５）で
溶出した。酵素活性を含む溶出画分を集め限外ろ過によ
り濃縮したのち、同緩衝液（ｐＨ７，０）を外液として
透析した。透析液を同緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
たブルーセファロースカラムに吸着させ、０．３ Ｍ
ＭＣＩを含む同緩衝液（ｐＨ７，０）でＡＡＤＨを溶出
した。活性画分を集め、限外ろ過により濃縮、脱塩した
のち凍結乾燥し、比活性５．Ｏｕ／ｍｇのＡｊ２ＤＨ粉
末が２６０ｍｇ得られた。
０〇−容のジャーファーメンタ−に種培養液４０−を接
種し、３０℃、４８時間通気攪拌培養した。培養液を遠
心分離して菌体を集め１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、セルミ
ルにて１０分間菌体破砕を行った。この菌体抽出液を遠
心分離して固形物を除去し得られた上清液に硫酸アンモ
ニウムを５０％飽和になるように加えＡβＤＨを沈澱さ
せた。沈澱を遠心分離により集め、上記同緩衝液に溶解
したのちセファデックスＧ−２５を使用したゲルろ過に
より脱塩した。得られた酵素液を同緩衝液（ｐＨ７，５
）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着させ
、０．４）Ｉ ＫＣＩを含む同緩衝液（ｐＨ７，５）で
溶出した。酵素活性を含む溶出画分を集め限外ろ過によ
り濃縮したのち、同緩衝液（ｐＨ７，０）を外液として
透析した。透析液を同緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
たブルーセファロースカラムに吸着させ、０．３ Ｍ
ＭＣＩを含む同緩衝液（ｐＨ７，０）でＡＡＤＨを溶出
した。活性画分を集め、限外ろ過により濃縮、脱塩した
のち凍結乾燥し、比活性５．Ｏｕ／ｍｇのＡｊ２ＤＨ粉
末が２６０ｍｇ得られた。
実施例２
ストレプトミセス・ファエオクロモゲネスｌＰＯ３１４
９株を使用して、実施例１と同様に操作し、比活性６．
５ ｕ／ ｍｇのＡ＃ＤＨ粉末１５５ｍｇを得た。
９株を使用して、実施例１と同様に操作し、比活性６．
５ ｕ／ ｍｇのＡ＃ＤＨ粉末１５５ｍｇを得た。
第１図は本発明法によりストレプトミセス・ファエオク
ロモゲネス ＩＰｏ ３１４９株から得られたＡＡＤＨ
の至適ｐＨを表す図であり、第２図は同じ＜ ｐＨ安
定性、第３図は至適温度、第４図は熱安定性を表す図で
ある。 特許出願−人 天野製薬株式会社 第 １ 図 ｐＨ 第 ２ メ ３ ５ ７ ９ １
１ｐｌ＋ 第 ３ 図 ２０ ３０ ４１５０ ６０−４】 度
（０Ｃ） 第 ４ 図 温 度 （０ｃ）
ロモゲネス ＩＰｏ ３１４９株から得られたＡＡＤＨ
の至適ｐＨを表す図であり、第２図は同じ＜ ｐＨ安
定性、第３図は至適温度、第４図は熱安定性を表す図で
ある。 特許出願−人 天野製薬株式会社 第 １ 図 ｐＨ 第 ２ メ ３ ５ ７ ９ １
１ｐｌ＋ 第 ３ 図 ２０ ３０ ４１５０ ６０−４】 度
（０Ｃ） 第 ４ 図 温 度 （０ｃ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１ストレプトミセス属に属するし一アラニンデヒド
ロゲナーゼ生産菌をＤＬ−アラニンを含む培地に培養し
培養物からし一アラニンデヒドロゲナーゼを採取するこ
とを特徴とするし一アラニンデヒドロゲナーゼの製造法
。 （２） ストレプトミセス属に属するＬ−アラニンデ
ヒドロゲナーゼ生産菌がストレプトミセス・グリセオル
テラス、ストレプトミセス・ヒゲロスコピカス、ストレ
プトミセス・アルボロンゲス、ストレプトミセス・リモ
サス、ストレプトミセス・ファエオクロモゲネス、スト
レプトミセス・リディカス、ストレプトミセス・カエス
ピトサス、ストレプトミセス・コエリコロル、ストレプ
トミセス・ロゼウス、ストレプトミセス・アルプス、ス
トレプトミセス・オリポクロモゲネス、ストレプトミセ
ス・ルベル、ストレプトミセス・グリセウスまたはスト
レプトミセス・メラノスポレアである特許請求の範囲第
１項記載のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法。 ＋３） ＤＬ−アラニンの培地への添加量が０．１〜
１０％である特許請求の範囲第１項記載のし一アラニン
デヒドロゲナーゼの製造法。 （４） 培養物からし一アラニンデヒドロゲナーゼを
採取するに際し金属キレート剤を使用して混在するペプ
チダーゼを除去する操作を含むことを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載のし一アラニンデヒドロゲナーゼの
製造法。 （５） 金ＪｆＥキレート剤がエチレンジアミン四酢
酸、α、α９−ジピリジルまたは０−フェナンスロリン
である特許請求の範囲第４項記載のＬ−アラニンデヒド
ロゲナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58006338A JPS59132889A (ja) | 1983-01-17 | 1983-01-17 | Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58006338A JPS59132889A (ja) | 1983-01-17 | 1983-01-17 | Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59132889A true JPS59132889A (ja) | 1984-07-31 |
Family
ID=11635576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58006338A Pending JPS59132889A (ja) | 1983-01-17 | 1983-01-17 | Ｌ−アラニンデヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59132889A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116748A (en) * | 1988-09-27 | 1992-05-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the production of l-alanine dehydrogenase from 78-3 ferm bp-2517 |
-
1983
- 1983-01-17 JP JP58006338A patent/JPS59132889A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ACHIVES OF MICROBIOLOGY=1980 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116748A (en) * | 1988-09-27 | 1992-05-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the production of l-alanine dehydrogenase from 78-3 ferm bp-2517 |
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