JPS58501544A - エンドトキシン誘発メディエ−タ−（ショック検定）によるリポプロティンリパ−ゼの抑圧 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドトキシン誘発メディエーター（ショック検定）によるリボプロティンリパ ーゼの抑圧 本発明はナシ、ナル　インステイチ、−ト　オプ　ヘルスによる付与の過程を通 じてなされたものである。

関連文献 本出願人は本発明の対象にか＼わる二つの論文の著者もしくは共著者であって、 これらは以下の論文である：（１）〔出願人のみ〕１リボプロテインリパーゼ活 性におけるエンドトキシン誘発扶病における研究　、Ｊ、ＥＸＰ。

ＭＥＤ１５１５４巻＠３１−６３巻成３１（１９８１，９，８板層である１９８ １年９月に刊行）、参考として記載；及び＜２）〔フィリップエイチ、ペカツ及 びエム、ダニエルレーンの共著者として〕、滲出細胞からのエンドトキシン誘発 メディエータ−による３Ｔ３−Ｌｌ細胞にかけるリボプロティンリパーゼ抑圧　 ＰＲＯＣ，ＮＡＴ　Ｌ　ＡＣＡＤ、　ＳＣＩ誌７９巻、９１２−１１６ページ（ １９ｇ２．２．２２以降である１９８２年２月に刊行）、参考として同様に記載 。

本発明は動物宿主における侵入刺激の効果及び作用の分析のための方法及び関連 物質に関し、特に宿主中に存在する同化酵素の活動に及はすこのような侵入刺激 の機構及び大きさに関する。

公知技術の記載 例えば細菌、ビールス、原生動物の感染及び腫瘍、内毒素蝉の種々の侵入刺激に 対する応答として種々の哺乳動物宿主には、いくつかの共通した物理的及び生化 学的障害が見られる。例えばこれらの応答は発熱、白血球症、食欲不振及び活力 低下、及び筋肉、白血球、肝臓の新陳代謝における異常である。最近、原形動物 寄生虫であるトリパノゾーマ　ブルセイに感染した兎におけるハイパートリグリ セリデミアがＭＯＬ、ＢＩＯＣＨＥＭ、ＰＡＲＡＳＩＴＯＬ誌、第１巻、３１− ３８ページ、１ｓ８０年刊Ｋ　＞　’ｖ＊　テン−。ニー、ロウザー及びニー、 セラ建によシ報告されている。報告されたハイパートリグリセリデミアは、末梢 組織における酵素リボプロティンリパーゼ（ＬＰＬ）の活性に著しい低下を伴う 。

ＬＰＬ、活性は他にも観察されておｐｌこの状態は人体がシ冒ツク状態にあゐ時 に存在することが注目される。

参照文献としてはクー、ビー、ｉンほかによる　肝臓病患者における血清及び肝 臓の脂質　、Ｊ、ＣＬＩＮ、ＩＮＵＥＳＴ、２４号、６２３ページ以下、１９４ ５年；　Ｘ）、：／　フイ。

ガリンほか　感染における血清脂質　、Ｎ、ＥＮＧＬ、Ｊ、Ｍｇ１）、２８１号 、１０８１−１０８＠ヘージ、ＩＪ６１１年１１月１ｓ日刊；ディー、７アルス チほか　兎の血清脂質に及ぼす三種の細菌感染の形番　、Ｊ、ＢＡＣＴＥＲＩＯ Ｌ　、　ｅｓ号、１６１５ページ以下、１９６８年；ニス、イー、グロスベルブ ｔ１か　ひなの胚におけるビールス感染による過類脂質血症：新しいシンドロー ム　、Ｎａｔｕｒ・誌、ロンドン、２０８号、９ｓ４ページ以下、１１１６！Ｉ 峰；ロパートエル。

ヒル￥島ほか、　細菌性エンドトキシンを静脈内注射した兎におけろ過類脂質血 症、脂肪過多肝臓及びプロモスルホフタレン停滞　、Ｊ、ＬＩＰＩＤ、ＲＥＳ、 ６号、５６３−５６８ページ、１９６４年、サカグテ　オサムほか　エンドトキ シン注射マウスにおける類脂質新陳代謝の変化、ＭＩＣＲＯＢＩＤＬ、ＩＭＭＵ ＮＯＬ、２３（２）号、７１−８５ページ、１９７９　年；アール、エフ、カム シュミット、１エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／Ｈ＠Ｊマウスにおける部分的に純化 された白血球性内因的メディエータ−の活性　、Ｊ、ＬＡＢ、ＣＬＩＮ、ＭＥＤ 、　９５号、６１６ページ以下、１９８０年；及びディエータ−、Ｊ、ＲＥＴ、 ＳＯＣ，２３（４）号、２８７−４ｉ１７ページ、１９７８年がある。

メグイエ−ター（ｍ＠ｄｉａｔｏｒｓ　）　の存在は少なくとも疑われていたに せよ、エネルギー貯蔵細胞の一般的な同化活動に及ぼすその影ｆｋ（もしあると すれば）は知られていなρ１っだ。本出願の出願人はこれらメゾイエ−戸がわる 種の同化酵素の活性に抑圧的な効果を及はすと考えた。それによる活性の減退が 、侵入に対する応答として宿主がシ田ツク状態に入った場合に観察された。従っ て、本発明においては、エンドトキシン感性及びエンドトキシン不Ｍ性マウスか らの、エンドトキシン刺激腹膜マクス滲出細胞によｐ生産されゐメゾイエ−Ｉ− と、同化酵素活性測定のための試薬に関する開発との関係；３Ｔ８−Ｌｌ　グリ ープイボサイト　モデル系と関連するこの系のよル深い研究；１メディエータ− に対する抗体を開発するための方法及び材料、同定のためＯスクリーニング方法 ；及びこれら　メディエータ−の活性を調整しうる薬剤の開発；などはすべてそ の発明範囲に含まれるものである。本出願人は、メディエーター現象のより深い 検討を可能にするため、また感染の余病及び随伴シ璽ツクの治療に有用な実際的 診断ツールを提供するため、方法学の必要、また関連する診断材料の必要がある と考えた。出願人は、本願における開示はこの必要性に対する指針となると信す る。

発明の景約 本発明の第一の局面によれば、哺乳動物における同化酵素の状態を検定するため に使用するメディエータ−の調製方法が開示される。この方法は、哺乳動物が例 えばビールス、細菌、原生動物、腫瘍、エンドトキセミアその他の侵入刺激を受 けている場合に特に有用である。その吃っとも単純な局面の場合、この方法は哺 乳動物から大食細胞標本を集め、この大食細胞の一部を、侵入事態と関連する刺 激物質と共に保温することを含む。例えば刺激物質は、エンドトキセミア、トリ パノゾーマの場合、また上述寄生原生動物であるトリパノゾーマ　プルセイその 他の場合、エンドトキシンであってもよい。

われわれの本出願及び以紡の出願において示した腹膜滲出細胞は、大食細胞の入 手源を例示しているが、このような細胞は腹属域以外からも入手することができ るのであって、本発明にはこのよう表変更も含まれると理解されるべきである。

大食細胞及び刺激物質は記載するように保温本しくは培養され、その後この大食 細胞は、同化＃鰍の活性を抑圧しうるメチイエ−ター物質の生産を誘発される。

メディエータ−生産の誘発は、好ましくは、例えば約２０時間に及ぶ保温時間内 に達成されるのがよい。生じた培地はメディエータ−物質を回収するように適切 に処理される。

例えば遠心分離し、メディエータ−物質含有表層物を引き出すか、或いはメディ エータ−をＶｔ１Ｉｉ！アンモニウムの４Ｏ−６ＯＮ溶液と共に沈澱する。

先に述べたように、メディエータ−物質は広い範囲の効果を有する。これには、 例えばリボプロティンリパーゼ（ＬＰＬ　）　、アセチル−エンジムＡカルボキ シラーゼ、脂肪酸シンテターゼなどの同化酵素について観察される抑制効果を含 む。また浄血細胞形成における抑制効果も含む。なぜなら後に特定の実施例で１ ５２ＦｆＵされる例えばジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチレン ビスアセドア建ド、ブチＡ／酸、ヒボキサンチン等によシメディエーター物質は 、赤色細胞の成長及び分化を抑制することがわかっているからである。

本発明の別の態様は、−轡又は数種の同化酵素の活性を抑制する此方を庵つゆえ に、種々の侵入刺激を検知する方法Ｋか＼わる。との方法においては、複数の大 食細胞標本が調製され、同化活性子に対してその効果の特徴がそれぞれ異なる多 数の既知の刺激物質と共に選択的に保温する。大食細胞標本の一つは感染刺激の 想定位置から得た材料と共に保温し、その彼すべての標本を上述方法に従って保 温してもよい。その後、既知刺激物質から白米するメディエータ−物質を含む衣 Ｍｋ物のそれぞれを試験することによって、存在する侵入刺激の同定のための比 較連続体を提供することができる。この試験方法は、例えはリボプロティンリパ ーゼ（ＬＰＬ）活性を係数として使用する場合には、８Ｔ３−Ｌｌ細胞系をオリ 用してよい。同様に、赤細細胞銹発子が使用される場合には、フレンドビールス −変換エリスμロイケミア細胞が保温され、その後観察される。参考文献として 、フレンド、シー０．シャー、ダブリ１．ホ２ンド　ジュー。ジー及びサトー； 　Ｇ、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣ１，６８号、３７Ｂ−３８２ベージ ；マークス、ビー、ニー１．リフキントウアール、ニー６．テラダ、エム０．ル ベン　アール。

７−１．ガジット、ワイ、及びフィバツバ、イー　ＩＣＮ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐ ｏｓｉａ　ｏｎ　Ｍｏｌ＊ｃｕｌａｊ　ａｎｄ　Ｃ＠ｌ−１ｕｌａＦ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、Ｘ巻、・ヘマトボイエティ、り細胞分化　、アイ−、ダブリ１．ゴルデ 、エム、ジェー。

クライン、ディー、メトカルフ及びシー、エフ、フォックス−集（Ａｃａｄ＠ｍ ｉａ　Ｐｒ＠ｓｓ社、二、−ヨーク）、２１に一３５ページ、１９７８年；があ る。轟然０ことでめるが、特定Ｏ活性を適切に観ｒしたい場合には、他の細胞系 も利用で裏、本発明はこれに記載される特定の細胞系にのみ限定されるものでは ない。

本発明は、哺乳動物中におけるメディエータ−物質活性を測定することによｐ　 Ｉｌ＋乳動乳中物中ける種々侵入刺激の存在を検知する方法にもか＼わる。すな わち、多数のメチイエ−ター物質を既知刺激物質から調製し、これを、夫々のメ ディエータ−物質の存在を検知しうる抗体を成長させるために使用することがで きる。これら抗体は公知方法によって９Ａ＃でき、公知方法には例えは溶融！ウ ス牌臓リンパ球及び骨髄腫と共によく知られたヒブリドｉ法が含まれ、或いは兎 、山羊その他の哺乳動物中につくることによって調製できる。公知のメディエー タ−及びその抗体は適当にラベルして例えは血清中のメディエータ−物質の存在 を試験するのに使用し、ｇ性の程度を判断し、その中のメディエータ−物質の活 −性を観察することによシ感染が増大しているか減少しているかを決定すること かで裏る。本発明のこの局面によシ、種々の公知免疫法を利用することができる 。例えは、公知メディエータ−物質或いはそれらと関連する抗体に対して検知可 能なラベルをすることによる単独或いは二重抗体法がある。

本発明の更に別の実施態様は、哺乳動物におけるシ。

ツク発生防止方法に関し、この方法は、哺乳動物におけるメディエータ−物質の シＩＩｖり促進活性の存在を検知し、その後哺乳動物におけるシｍｙりの進行を 防止するのに十分な量の、メディエータ−物質の抗体を投与する段階を含む。

また、検定系が開示され、これはメディエータ−物質の合成或いは活性を抑制し うる薬剤のスクリーニング（ぶるいわけ）のためにｒ＄伽される。前者の場合、 刺激大食細胞によるメディエータ−の生産に及はす試験薬剤の効果が決定される 。後者の場合、例えは３Ｔ３−ＬＬ細胞のような細胞試験系に特定のメディエー タ−を導入し、次に得られた細胞培養体に対して試験薬剤を導入し、その後、メ ディエータ−活性の変化について、薬剤単独の添加によるものか、或いは既知メ ディエータ−物質の添加量による効果に基づくものかを検査する。

多くの物質、化合物、試剤についてメディエータ−物質の生産及び活性に影響を 与えるか否か決定する丸めの試験が既に行われた。後に詳細に説明されるように 、ステ四イドデキサメタゾーンのみが抑制効果を有し、この効果はメディエータ −物質の製造にのみ限定されているように見えた。しかしながら、このｔｌかの 薬剤、試剤勢についてもデキサメタゾーンについて採用され記載されているよう に試験することもできる。

メディエータ−物質０Ｉｉｌｉ製及びその活性の１景ｊｉ：の決定は、診断上又 治療上の適用について種々のルートＯ開発を生みだし九。以上の説明及び板層の 説明から、直接的に或いは免疫診断上有用な抗体の開発を通じてメディエータ− 物質の同定により侵入刺激の検知がなされることは明らかである。更にこれら同 じ抗体が哺乳動物におけるシｌＩｖりの進展を避けるために、メディエータ−活 性のコントロールによる直接的な治療のために利用できるのである。一方メディ エーター物質は、メディエータ−物質の有香効果を中和できる薬剤、試剤その他 の物質の同定のための検定系におけるスクリーニング剤として使用し、それによ り感染の重管な続発症の治療が可能となる。

従って本発明の主たる目的は、哺乳動物における同化酵素に抑圧的々効果を及ば ず−Ｓ或いは数種のメディエータ−物質の誕製法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、例えば感染などの侵入刺激の存在が疑われる哺乳動物 における、一種或いは数種のメディエータ−物質の検知方法を提供することであ る。

本発明の更に別の目的は、哺乳動物におけるメディエータ−物質の有害な効果を 撃退するのに有効な薬剤、試剤叫をスクリーニングする方法及び関連する検定系 を提供することである。

本発明の更に別の目的は、メディエータ−物質活性の有害な影◆をに和するか避 けるため、その活性を制御する哺乳動物の治療方法を提供することである。

本発明のその他の目的及び利点については、例示的な図面と関連する以下の説明 から当業者には明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、エンドトキシンで処理したエンドトキシン感性マウスから得た血清 が、エンドトキシン感性マウスにおける脂肪性組織ＬＰＬ活性に及はす影響を示 す。

メディエータ−活性の観察及び結論は実施例■、パラグラフＥに示されている。

データは各群の６体のマウスの平均（±血清）として表わされている。

第１Ｂ図は、エンドトキシンで処理したエンドトキシン感性マウスから得た血清 が、エンドトキシン耐性マウスにおける脂肪性組織ＬＰＬ活性に及ばず影響を示 す。

データは各群の３体のマウスの平均（±血清）として表わされている。

第２図は、エンドトキシン耐性マウスにおける脂肪性組織に及はす滲出細胞培養 体から得た培地の効果を示す。

データは４体或いは５体の平均値（±血清）として表示されている。

第３図は、３Ｔ３−Ｌｌｈ胞のリボプロティンリパーゼ活性に及はす、エンドキ シン処理マウス腹膜滲出細胞から得た条件つき培地の効果を示す。データは４体 の平均値（±血清）として表示されている。

第４図は、３Ｔ３−ＬＬ細胞におけるアセチルコエンジムＡカルボキシラーゼ及 び脂肪酸シンテターゼの活性に及ぼす、エンドトキシン処理マウス腹膜滲出細胞 から得た条件つき培地の効果を示す。条件つき培地の３００声りが、３．５−の ＤＭＥ培地と１０％胎児牛血清を含有する６ａ１皿の８Ｔ３−Ｌｌ細胞（４，２ Ｘ１０　細胞７皿）の培養体に添加された。表示された保温時間の後、アセチル コエンジムＡカルボキシラーゼ（記号　・　で表示）及び脂肪酸シンテターゼ（ 信号　Ｏで表示）の酵素的活性が、細胞のディジトニン解放可能シトソリックフ ラクシ、ンに及ぼす影暫を検定した。

ｋ　ｓ　図ハ、アセチルコエンジムＡカルボキシラーゼの合成を抑圧するメディ エータの効果を示す。メディエータ−（条件つき培地の３００μｔ）に対して３ Ｔ３−Ｌｌ細胞を表示された時間さらした後、細胞に０．５ｍＣ１の３５８−メ チオニンで１時間パルスラベル処理を施した。

単層のディジトニン処理によシシトソリック７ラクシ璽ンを得た。シトソリック フラクシ嘗ン（すべての決定値について２×１０″ｃｐｍ）の部分標本を、実施 例１に記載されているように分離され特徴ずけられている抗アセチルコエンジム Ａカルボキシラーゼ及び免疫沈澱可能材料と共に保温した。パネルＡ：免疫吸収 可能プ四ティンの７．５Ｘ−アクリルアミド０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｄ　Ｓゲル分析 の放射能写真である。レーン１はメディエータ−にさらさない場合の比較例；レ ーン２．３及び４はメディエータ−に細胞をそれぞれ３．６、及び２′０時間さ らした例である。

パネルＢ；放射能写真のＩＩＩ！ｌＬ測定走査結果であって、メディエータ−に さらした後の、比較例に対する免疫吸収可能材料の残留％を示す。

第６図は脂肪酸シンテターゼの合成を抑圧するメディエータ−の効果を示す。実 験的な＊＊ａ第番図の説明と同じである。パネルＡ：免疫吸収可能脂肪歇シンセ ターゼの７．５Ｘ−アクリルアンド−８ＤＳゲル分析の放射能写真であって、レ ーンｌｄメディエータ−にさらさない場合の比較例；レーン２．３及び４はメデ ィエータ−に細胞をそれぞれ３．６及び２０時間さらした例である。

パネルＢ：放射能写真の濃度御」定走査結果であって、メディエータ−にさらし た後の、比較例に対する免疫吸収可能材料の残留％を示す。

第７囚は、プロティン中への５１５Ｓ−メチオニン結合に及ぼすメディエータ− の効果を示す。８Ｔ３−Ｉ、１細胞が、エンドトキシン処理マウス腹膜滲出細胞 から得た３００μＬの条件つき培地と共に所定時間保温され、また０゜５＊Ｃ１ の３５８−メチオニンで１時間プロティンパルス２ベリングをし九。溶解性プロ ティｙ−が細胞のディジニトロン処理によｐ得られ、単層残留分はＮＰ−４０で 抽出材料中への３５８−メチオニンの結合は、実施例■に記載されているように して実施された。メディエータ−に細第８図は、細胞のジストンリック７２クシ 璽ンにおけるプロティン合成に及ばずメディエータ−の効果を示す。

メディエータ−に細胞をさらした後、３５Ｓ−メチオニンを２ベルしたシトソリ ツクプロティンの７．５Ｎ−７クリルアきドー０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｄ　Ｓゲル分 析の放射能写真が示される。３７１−Ｌｌ細胞がパルスラベルされ、可法プロテ ィンが実施例Ｈに記載するようにデイジトニンによシ得られた。各時点における シトンリツクフラクシ冒ンの部分標本（２Ｘ　１０’　ｃｐｍ）がゲルに適用さ れ電気泳動処理を施された。レーン１及び２はメチイエ−ターにさらさない比較 例；レーン３及び４はメディエータ−に１時間さらしたもの；レーン５及び６は ３時間さらしたもの；レーン７及び８は６時間さらしたもの：レーン９及び１０ は、エンドトキシンにさらさないマウス腹膜滲出細胞から得られた条件つき培地 に対して２０時間さらしたもの；レン１１及び１２はメディエータ−に細胞を２ ０時間さらしたものである。

第９図は、細胞の膜フシクシ曹ンにおけるプロティン合成に及ぼすメディエータ −の効果を示す。メディエータ−に細胞をさらした後、Ｓ−メチオニンをラベル しり膜プロティンの７，５％−アクリルアミド−０，１ＸＳＤＳゲル分析の放射 能写真が示される。案験的構成は第８図と関連する説明と同じである。膜プロテ ィンは実施例■に記載されるようにＮＰ−４０抽出により得られる。レーン１及 び２はメディエータ−にさらされない比較例；レーン３及び４はメディエータ− に１時間さらした例；レーン５及び６は３時間さらした例；レーン７及び８は６ 時間さらした例：レーン９及び１０は、エンドトキシンにさらさないマウス腹膜 滲出細胞から得られた条件つき培地に細胞を２０時間さらしたも０；レーン１１ 及び１２はメディエータ−に２０時間さらした例である。

泥１０図は、　７レンド細胞における細胞成長及びヘム含量に及ばず、マウス大 食細胞培養体η為ら得られた条件つき培地の効果を示す。

フレンド細胞（クローンＤＳ−１９）を９６時間、Ｍｅ、２Ｓｏ（１，５容積％ ）の存在しない状態でもしくは存在下に培養した。エンドトキシン（５μｔ／ｄ ）で刺激される〃為或いは刺激されないマウスの腹膜大食細胞培養からの条件づ き培地＜ｇ長培地の８０μｔ／−）を培養初期に添加した。細胞数がチトグラフ モデル６８００で数えられ、凡戦細胞のパーセント抑制として表わされた。未処 理比較培地における細胞数はａ　ｘ　ｉｏ’細胞／−であった。ヘム含量は既に 開示されているような（サッサ、ニス、グラニック；ニス、チャン、シー及ヒカ ッパス、Ｘ−、着、１９７５年　分血球造血において　、ケ１．ナカノ、ジェー 、ダプリュ、フィッシャー及びエフ、タカク１１東京大字田版、束児、３８３− ３９６ページ）蛍光枳；３足法によシ決足された。データは二重決定値の平均値 である。ナトグラフ法によｐ数えられたトリパンブルー陽性細胞の数は全培養基 の８−１０ＸでｔＤまた。

＠１１囚は、Ｍ＊ｇＳＯ処理を施したフレンド細胞の細胞成長及び赤血球分化に 及はすエンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−の投与依存効果を示す。細胞 は９６時間、大食１Ｉｌ１１胞メディエータ−の増大する濃度と共に１．５％Ｍ ・、ＳＯの存在下に培養された。酵素及び中間物の測定は実施例■以下に記載さ れるようにして行われた。データは二重決定値の平均値である。

第１２図は、細胞成長及び赤血球分化に及はすエンドトキシン刺激大食細胞メデ ィエータ−の遅れた添加の影醤を示す。

フレンド細胞は培地を変えずに９６時間培養された。

Ｍｅ２　ｓｏはＯから最終濃度でわる１、５容積％までに添加されたが、エンド トキシンに刺激された大食細胞メディエータ−は横座標（成長培地−あたり５ｏ ｐｔの条件つき培地）に示す時に添加した。細胞数、ＡＬＡデハイドラターゼ及 びＰＢＧデアミナーゼの活性、ヘム及びプロトポルフイルン含量紘実施例ｍ以下 に記載されるように培養終期に測定された。データは二重測定値の平均値である 。

ＭｅｌＳＯのみで処理された比較培養基の値は次の通りである。

細胞数　ａ、　Ｏ（ＸＩＯ−’　／ＩＩ／）ＡＬＡデハイドラターゼ　３．００ （ｎモルＰＢＧ／ｌｏ’細胞、ｈ）ＰＢＧデアミナーゼ　１２０（ｐモル　ウロ ポルフィリノーゲン／１０６細胞、ｈ） プロトポルフィリン　０．５７（ｐモル／１０’細胞）ヘム　５ｇ０（ｐモル／ １ｏ６細胞） 第１３図は、ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒボキサンチン或いはヘミンで処理されたフ レンド細胞における細胞成長及びヘム含量に及ぼすエンドトキシン刺激大食細胞 メディエータ−の影畳を示す。細胞紘培地を羨えることなく９６時間培養された 。化学物質及びエンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−（成長培地−あたｊ ５８０μを添加）の導入時間は、化学物５ｉｉＬが０から最終濃度までの間にＨ 〜ｉＢＡの場合惰Ｍ１ブチル酸は１．３ｍＭ、ヒボキサンチンの場合ｂｍＭ１ヘ ミンの峯合０．１　ｍ　Ｍでおった。鉋」定は実施例■以下のようにして簗施さ れた。データは二重決定値の平均値である。

第１４図は、一定速良で成長するフレンド細胞の成長及び分化に及はすエンドト キシン刺激大食細胞メディエータ−の影会を示す。

詳細な説明 上述の如く、われわれは本願においてメディエータ−物質と呼ぶ試剤を発見した 。これは本願において刺激物質と呼ぶ物質による刺激に応動して哺乳動物細胞中 に生ずるものである。刺激物質は、侵入的な刺激、例えば細菌、ビールス、酸根 のａｍＸ原生物質、七〇恒ゼ、」えばエンドトキシンアなどのｂｘを伴うことを ％徴とする。われわれはメディエータ−物質が哺乳動物のある細胞の新陳代謝を 四化作用から異化作用に変える作用をもつことを観察した。特にメディエータ− 物質はリボプロテインリハーゼ（ＬＰＬ）、その他の酵素及び先に述べた！０導 剤等の同化１諏の活性を抑圧するよりに考えられる。これらメデメエーター■ｔ ｄ神１耐１には晒ダ動物ｆ卦Ｈス争疫系とエネルギー係累組織の閣の連絡系の一 部である。

従りて先述したよりな哺乳動物における種々の侵入刺激に応動じてこれらメゾイ エ−！−動物質、脂肪性組織、例えば筋肉、肝臓等が侵入に対して斗うためにエ ネルギーが必要な場合にエネルギー保蔵組織に対して影◆を及ばずために生みだ されると理論やけられる。更に評しくいうとこれらメディエータ−物質はエネル ギー保蔵組織に対して同化作用状態から異化作用状態に変える作用をなし、それ によりこれらエネルギーの供給が容易であるようにする。侵入が短期間である場 合には、哺乳動物は急速に回復しそのエネルギー保蔵を補充する。しかしながら 侵入が慢性的なものである場合、完全なエネルギーの枯渇、悪液質及び死亡が生 じうる。

上述観察をする一次作業の間に、メディエータ−を調製する方法が開発された。

その鮒明は先ず実施例ＩＯバッグ２７ＤＫ述べられており、これによれば腹膜滲 出細胞が適幽に培養され、その後公知刺激物質エンドトキシンの存在下に保温さ れた。保温後、大食細胞はメディエータ−物質を主するように誘導される。ある 面においてはこのような誘導は長い保温期間にわたりて生ずることもｔＤｎ、ま たこの期間は変化するものであるから、本発＋ｔｉ％定Ｏ期間に限定される一部 ではない。

その後、メディエータ−物質を細胞培養基から回収し、本明細書に開示されてい る二種或いは二種の方法で、将来使用するために保蔵する。回収は遠心分離及び 沈澱を含む種々の公知技術のいずれかＫよりて行われる。例えば実施例■のパラ グラフＤに記載される培養を遠心分離１／　％表面に浮かぶものをその彼とｐ出 した。或いはメディエータ−を硫酸アンモニウムの４０−　＄０％溶液で沈澱さ せるか或いはＤＥＡＥ七ルローズ或いは同様の交換樹脂で吸着させてもよい。メ ディエータ−物質回収のための特定の方法の返択は当業者によっては自明である 。

本発明はまた、メディエータ−物質の存在及び活性を１１＋１定することにより ｗ乳動物宿主における侵入刺激の存在を検知する方法に関する。既に述べたよう に、メゾ（エータ−物質は例えに溶融したマウスの牌白血球及び骨髄腫組胞を用 いるハイブリドーマ法を含む種々の公知方法によシ、兎、山羊、羊その他の喘乳 動物に抗体を生じさせるために使用できる。抗体は標準的な方法により隔離で色 、疑わしい哺乳動物宿主におけるメディエータ−物質の存在試験に利用できる。

更に、抗体は更に抗体を作るためさながら抗原のように他の極類に利用できる。

抗体は咄乳類、特に人間の血清におけるメディエータ−物質の存在を決定するた めに使用でき、それによｐ例えばバクテリア、ビールス或いは原虫類の感染など の侵入刺激の存在、或いはある種の重傷の存在を決定するために使用することが できる。以下の設明Ｏため、メディエータ−活性に対する抗体をＡｂ。

と呼び、別のＳ類におけるメディエータ−活性をＡｂ、と呼ぶ。

患者の血清中Ｋ１１ｌ素レベルまでメディエータ−物質の存在することが疑われ ている患者には、その存在は、そのような決定に適用可能な通常の免疫学的な手 法によシ確かめられる。多くの有用な手法が知られている。特に有用な手法の三 つは、検知可能なラベルをラベルしたメディエータ−１検知可能なラベルをラベ ルした抗体人ｂ□、検知可能なラベルを２ベルした抗体＾ｂ、を利用するもので ある。これらの方法は以下の式に要約でき、式中修印は粒子がラベルされている こと、また　Ｍｅｄ　はメディエータ−活性を示す。

Ａ−Ｍ＠ｄ　−Ａｂｌ　＝　Ｍｅｄ　ＡｂｌＢ　、Ｍａｄ　＝　Ａｂ　１　ｘ　 ＭｅｄＡｂｌ”Ｃ，Ｍ＠ｄ　÷Ａｂｌ　＝　Ａｂ”ｚ＝ＭｅｄＡｂＩＡｂ”これ らの方法及び適用は当業者にはよく知られておｐ１従りて本発明の範囲内で交換 可能に利用できるものである。　競争的　方法、即ち方法人は米国特許第３，６ ５４゜０９０号及び３，８５０，７５２号に記載されている。方法Ｃ１１サンド イツチ方法　は米国特許第ＲＥ３１，００６号及び第４．０１６，０４３号に記 載されている。このほかの方法も知られておυ、二重抗体法或いは　ＤＡＳＰ　 法などがある。

いずれの場合ともメディエータ−物質は抗体と共に複合体を作ｐこれら複合体の 一つの成員は検知可能ラベルでラベルされている。複合体が形成されていること 、及び所望する場合そ（ＤＪｌｔｉ、７ベルの検知に適用できる公知方法によｐ 決定できる。

上述の説明から人す、■特性は、これがＡｂｌと反応するものであることがわか るであろう。これは、一つの鴫乳動愉種における抗体Ａｂ□が他の釉において抗 体Ａｂ、を作るための抗原として使用できた、といりことによる。

例えばＡｂＸは、Ａｂ□を抗原として山羊中に作ることかできる。Ａｂ２は、従 って山羊に作られる兎耐性抗体であシうる。本明細査及び始末の範囲において、 Ａｂｌはメディエータ−活性抗体と呼はれ、またＡｂ２はメチイエ−ター活性抗 体に反応する抗体或いは　抗−抗体　と叶ばれる。

これらの研究に４つともよく使用されるラベルは放射性素子、酵素、紫外線にさ らされると蛍光を発する化学物質、その他である。

多数の蛍光性物質が知られており、ラベルとして使用できる。これらＫは例えば フルオレシャイン、ローダンン及びオー″）ミンが含まれる。好ましい検知物質 は、インチオシアネートを通じてフルオレシャインと結合し山羊中にｗＩ４製さ れる兎抗性抗体である。

メディエータ−組成物はまた放射性素子或いは酵素をラベルすることができる。

放射性ラベルは現在適用可能なカウンティング方法のいずれかによｐ検知できる 。好ｉ　Ｌ　イ同位’ｙｃＱｅ　ｕ　”Ｃ１１３１工、３Ｈ１”Ｉ及び”Ｓｒあ る。酵素ラベルは今日適用可能な比色法、スペクトル分析、蛍光スペクトル分析 、ガスクロマトグラフィのいずれかの方法で検知可能である。酵素はカルボジイ ミド、ジインシアネート、ゲルタールアルデヒド叫の架橋分子との反応によシ、 選ばれた粒子と結合している。これらの方法に使用できる酵素は多く知られてお シ、利用できる。好ましいものはペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β −Ｄ−ｆルコシダーゼ、β−り一カラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコ−ゼオ キシダーゼ　プラスペルオキシダーゼ、ガラフタ−ゼオキシダーゼ　プラスペル オキシダーゼ　及び敵フォスファターゼでめる。米１特許ｉｊｇ３，６５４，０ ９０号；　３，８５０，７５２も；　４，０１６，０４３号は、ラベル物質の開 示の例として年げられるものである。

哺乳動物体に２けるメディエータ−活性の高レベルのものは哺乳動物体に有毒で あＱ１不可逆的なシ璽ツクの原因となることがある。メディエータ−に％有Ｏ抗 体は、この代置異常のある宿主を治療するのに有用である。患者にはメディエー タ−の少くとも一部を中和するため例えば抗体のシ、ツク＃：和可能な有効量を 非経口的に投与して治療をすることができる。投与量はもとよりよく知られてお り医者には理解されているファクターに応じて変史され、これらは、ｔ、者の年 令、体重、一般的な番膿及びメチイエ−ターの濃度でおる。

本発明の更に別の寮九態様においては、医療専門家によｐ使用に適した商業的な 試験キットを訳整し、それによｔＪｋいのある宿主にメチイエ−ター物質が存在 するか否かを法定するようにできる。上述の試駁方法によれは、このようなキッ トの一つのａ！数では、少くともラベルしたメディエータ−或いはこれＫ１１ｉ ！ｉ合した物質、及びこれに特有の抗体を含む。別のキットはラベルしたＡｂ２ と共に少くともＡｂｌを含む。更に別のキットは少くともＡｂｌと、過ばれた方 法、例えば　競争的　、　サンドイッチ、ゝＤＡＳＰ　％の方法にもとより依存 する指令を含む。キットは更に緩衝剤、背定剤等の周辺反応剤も含む。

従って試駄キットは皿悄墓いは水性媒体中のメディエータ−物質を検知するため の種々の素子と共に調製できる。第一キット（ｒＴ：、： ０）　メディエータ−物質或いはその特有の結合パートナ−と直接或いは間接に 結合することによりｍられる少くとも一つのラベルした免疫−化学的反応成分の 所定音←）その他の反応剤；及び （ハ）前記キットの使用のための指令；を含むようにしてｌｉ１製される。

史に特定すると、侵入刺激に対する補乳動物反応の実証のだめの診断試験キット は： （イ）一般的に固体油で免疫ンルベントに結合されているか或いは適当なタグ、 或いは二種Ｏメディエータ−（或いはその結合パートナ−）の一つに結合されて いる上述の一株のメディエータ−物質（或いはその結合パートナ−）の公知倉； （ロ）必較な場合、他の反応剤；及び、（ハ）前記試験部ット使用のための指令 ；を含むようにしてｗ４＃！される。

補足的なキットは種々の現存する免疫学的プロトコル及び方法を利用して構成す ることができ、そのような変更は発明の範囲内でおることが理解されよう。

本発明の更に別の局面においては、上述メディエータ−に特有の抗体に対しては 、ビールス、細菌、原虫類等により発生するシ璽ツクに応答する薬学組成物を投 与するようにして吃よい。これら欠学的組成物は：０ン　薬学的に有効量の抗体 ；及び （ロ）薬学的に受けいれられる担体、からなる。

適当な流体の助けにより抗体は溶液の形で注射用製剤として使用できる。これら 組成物は侵入／シ１１２りの効果を、かシに克服できないにせよ消散するため、 上述の態様でショック緩和量投与するどとができる。

抗体の成長と上述方法によるその使用の手助けとして、本発明は例えばシ望ツク など補乳湘宿主における好ましくない程度に高レベルのメディエータ−物質活性 の結果として考えられるオ重々の条件下の治療方法にもか−わる。

この揚台本発明方法は、特定のメディエータ−物質の存在及び活性の検知、次に 好ましくはメディエータ−物質の活性を中和するため有効量の適当な抗体を宿主 に投与することを含む。

逆に呻乳動物におけるある徨の不利な条件、例えば肥満が過度な抗体活性から生 ずることがある。例えば肥満は、同化酵素であるリボプロティンリパーゼ、アセ チルコエンジムＡカルボキシ〉−ゼ及び脂肪酸シンセターゼの活性が好ましくな い程度に高レベルであることから生ずる。従って本発明は、肥満の治療方法であ って、受けいれられる形態であって適当な体重に復活するために有効な量のメデ ィエータ−物質の投与を含む方法にもか＼わる。このような治療のための投与は 、しかしながら、医者の厳ｌな監視下に行われなければならず、またメディエー タ−の投与量、態様、頻度は注意深く決定され不断に監視されていなければなら ない。

特定のメディエータ−物質によシ生ずる抗体による治療に加え、本発明は、特定 のメディエータ−物質の合成或いは活性を抑制するための例えば薬剤、製剤など の物質の測定系に関する。既に述べたように、例えば３’ｌ’３−Ｌｌ及びフレ ンドビールス変形赤面白血病細胞のような適当な細胞培養体に対して適当なメデ ィエータ−によシー次処理を行って特定の同化活性子の活動を抑制し、その後適 当な薬剤を添加し、得られた細胞培養体を観察して、同化活性子の活性の変化が 生じたか否かを決定する。以上の記載はある測定のための特定の細胞培養体に関 するものではあるけれども、本発明がそれに限定されるものでないことは理解さ れるべきである。

メディエータ−の生産及び／もしくはメディエータ−の効果を抑制するか否かを 決定するため、ある化合物は既に検討されている。試皺された化合物及びそれら 試験の結果を以下の表に示す。

表 デキサツタゾーン１０　Ｍ　＋　− チロイト）惚反ファクリー１０　Ｍ　−−（＋ニイエスであることを示し、−は ノウであることを示す）。

衣かられかるように、デキサメタゾーンのみが効果を有するようである。このデ キサメタゾーンすらもメディエータ−生産に効力があるたけであって、初期にの み効力がある。メチイエ−ターが生産された後では、このデキサメタゾーンはも はやそれ以上のインパクトを与えないように見える。

以下の実施例はある同化酵素部と関連しつつメディエータ−物質の分離、及びそ の活動に関わる。これらを検討することによって本発明の起原及び可能性につい てよシ深い理解が得られるであろう。しかしながら轟然特定の物質及び方法は既 に述べたように変動するものであるから、以下は説明的なものであシ、本発明を 限定するものでＦｉない。

Ａ、試験に使用したマウス二′にの（３Ｈ／ＨｅＮエンドトキシン感性マウス（ ７−１０過：１８−２５ｆ）を、チャ−スス　リバー　ブリーディング研究所（ マサチ、−セッツ州、ウィルミントン）から入手した。雄の（：３Ｈ／Ｈ＠Ｊ、 エンドトキシン耐性マウス（７−１０週：１８−２５ｆ）をザ　ジャクソン研究 所（メイン州、バー　ハーバ−）から入手した。マウスは使用できるまでロープ ントラボラトリ−チャ９（ミズーリ州セントルイス、ラルストン　ビュリナ　カ ンパニー）で任意蓋の給餌を与えた。チャ９の給餌は夫々の実験２４時間前に除 去し、水に、２５％サクロースの溶液と代えた。これらのマウスは一旦注射后は 水にのみ近づきうるようにした。３匹乃至１０匹の（：３Ｈ／ＨｅＮ或いはＣ３ Ｈ／ＨｅＪマウスをぞれぞれの実験群として採用した。

橡々の実験を行うにあたり、夫々のマウスは次のいずれかを腋腔内で注射した： 　（［）　０．０４乃至１００μｔのエンドトキシン；　ｏｉ）エンドトキシン 或いは食塩水で処理したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスから得−らねた血清ｏ、　ｓ　ｗ ｅ　；　ＧＯＤエンドトキシンの存在或いは存在しない状態で保温したマウス腹 膜鍵山細胞の培養体からの血清１−、マウスは首を切ることによシ死んだ。

トリグリセライド１１１度は酵素検定によル測定した（トリグリセライド試験セ ット９６１号、テキサス州ヒ、−ストン、ハイセル　インコーホレイテッド）。

リボプ四ティン　リパーゼ活性はパイカリストハか（ＰＲＯＣ，Ｓ。

Ｃ，ＥＸＰ、ＢＩＯＬ、ＭＥＤ、、１４８号、２９７ページ、１９７１１Ｅ刊） ；及びｐス＊ン＃ｋかＣＤＩＡＢＥＴＯＬＯＧ、ｌＡ１７号、３５１ページ、１ ９７９年刊）による方法に若干の変更を加えることにより検定した。副墨丸脂肪 褥は、夫夫Ｏ−ｒウスの１を切った後直ちに実施した。組織を、２％ボビン血清 アルブミン（フラクシ曹ン■、アリシナ州フェニックスのし／Ｓイス　ケきカル 　カンノくニー）ｔｔ有する殺菌したダルベコ社製モディファイドイーグル媒液 （ＤＭＥ）でゆすぎ、殺菌したフィルター紙に吸わせた。

この組織をはさみで刻み、あらかじめ重量を測った殺菌ポリプロピレン培養管（ １７Ｘ１００■、メリーランド鰯コ、キスビル、ティッキンソン　アントカンパ ニー、ファルコンディビジ、ン　オプ　ベクトン）に入れた。この培養管は２Ｘ ボビン血清アルブミンを補足した１−のＤＭＥＮ体、及びＬ　Ｐ　Ｌ　（Ｌｉｐ −Ｈｅｐｉｎ　、カリフォル；ア州ノースリッジ、リカーラボラトリーズ　イン コーホレーテッド）を解放するためヘパリン２Ｕを含んでいた。

この組織を刺入した管を５％ＣＯ，残りを空気で密閉し室温にて常時ゆるやかな 振動を与えつつ放置した。組織１董は、組織を添加前と添加層との重量差で決定 した。

はＸ　Ｚｏｏ−３００岬の組織がと９だされ、組織から解放されたリボプロティ ンリパーゼの活性が測定された。

酵素検定ハニルンンーエール及ヒシ、ツツ、Ｊ、ＬＩＰＩＤ、ＲＥＳ、１７号、 ５３６ページ、１９７６年、の方法に僅かの変更を加えて実施された。この標本 を３７℃で９０分間培養した。夫々の標本は二重に検定した。酵素活性の１ｔリ ユニｙ　）は１分あたｐ解放された遊離酸の１ナノモルと定義された。湿った組 ９１グラムから解放される酵素活性をそれぞれの研究におする実験群と比較群と の間で比較した。なぜならＬＰＬ活性には日毎に相当の変動があるからでおる。

夾躾相互のテークを比軟するため、データ値を比較群の平Ｓ活性の自分比として 弐示した。

Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスで観察された範囲は脂肪性組織について３２乃、＋５９ｍ Ｕ／？でｈｚたｏ　Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　Ｊ　マウス中に脂肪性組織の３１乃キ１７２ 　ｙｓＵ／ｙの値が観察された。

Ｃ，エンドトキシン処理マウス血清の採取０、１　ｍの食塩水中にエンドトキシ ン（２乃至１００μｔ／マウス）を溶かしカニもの或いは食塩水のみを注射した ２時間後、Ｃ３Ｈ／ＨｓＮマウスの補助小窩から殺菌条件下で血液を得ｆｒ、。

血清は出液后１時間以内に胴側１し、直ちに使用するか使用するまで−・８０° Ｃで保゛存した。

Ｄ、エンドトキシン処理腹膜滲出細胞のｉＡ製履膜滲出紹１胞ｕ　Ｃ３Ｈ／Ｈｅ 　Ｎ　マウス（２５−３３１）から発熱質のない食塩水（イリノイ州ノースジカ ゴ、アボット　ラボラトリ・−ズ）で、腹膜洗浄することにより得た。

これらＮウスに一１ｍ砲生産も：増大させるために洗浄する６日前に、３ｍのプ レワー社製チオグリコレート＆液（ディ７コ　ラボラトリーズ、℃シガン州デト ロイト）１７注射した。このようにして得られた腹膜Ｖ小細胞ははｌ”（６０Ｘ の大食細胞、２０Ｘの小さいリンパ球、１δ九の太きいリンパ球及び５％のニオ シッフイルからなｐ立っている。

この滲出細胞（２Ｘ　１０’細胞／ウエル）を、３７℃で５ＸＣＯ，中に４．５ −ウェルを含有する培養皿中で血清を含まないＲＰＭＩ−４６４０［液にューヨ ーク州グランドアイランド、ギブコ社）中で保温した。３時ルｊ仮この培養体を この培液で３回洗い、非付着細胞を除去した。皿に付着した細胞は主として大食 細胞であった。ｂ々の試験方法において、細胞はエンドトキシン（１０μｆ／ｌ ｌ　）の存在下に或いは存在することなく血清のないＲＰＭＩ−ｉ６４０媒液中 で保温した。この培養液は２６時間の保温で除去し、４℃で５分間１０００　ｆ で遠心分離した。この浮上瞼を直ちに試験に使用するか、或いは試験のために使 用するまで一８０℃で保温した。このような条件下で１力月保蔵して後も活性に は相違がなかった。

種々の研究及び分離方法を以下に貌明する。

Ｅ、マウス中に生じたメディエータ−活性死亡１６時間前に食塩（比較例或いは １００μ？のエンドトキシン）を注射したエンドトキシン感性マウスの脂肪性に ＆及び血清トリグリセライド舛にのＬ　Ｐ　Ｉ、活性を観察した。エンドトキシ ンのこの閂はこの系統のマウスの半数が注射后３日間で死ぬ：ｉｉＫ対応する。

エンドトキシン処理マクスにおける脂肪性組織のＬＰＬ活性は比較例値の４．５ にに低下し、−万エンドトキシン処理ｉウス血清のトリグリセライド濃度は、比 較例におけるマウスの麹の２．６倍に上昇した。

ＬＰＬ活性の低下が、エンドトキシンによる刺激の結果として生ずるメディエー タ−活性に起因するものであってエンドトキシンそれ自体に起因するものでない という事実は、出血前２時間前に１００Ｐｆのエンドトキシンで処理したエンド トキシン感性マウスの血清を他の群のエンドトキシン感性マウスに注射する時に 生ずる結果によシ支持される。この試験０ため、比較群は、発熱質のない食塩水 を注射したエンドトキシン感性マウスの別の群から得られた血ｆｆを注射された 。副畢丸肥犬パッドのＬＰＬ活性を１６時間后に測定した。

第１ＡＩＷで図示したように、エンドトキシン処理マウスからの血清は、比較群 の活性に比し、これら処理マウスのＬＰＬ活性を著しく抑圧した。エンドトキシ ンの９０％以上が１５分以内に循環からはずれることが知られているから、ＬＰ Ｌ活性に及ぼす影響は、注射２時間後に血清中に存在するエンドトキシンの直接 的な影舎でないことは明らかである。これは、エンドトキシン注射の結果として 生ずる体液要因或いはメディエータ−によって生ずるに違い力いと思われる。

＠接的なエンドトキシン効果を更に除去するために、少′ｋ（２μｆ）のエンド トキシンを注射して２時間后のマクスのエンドトキシン感性Ｃ３Ｈ／ＨＩＮ＆’ から得られた血清をエンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／Ｈ＠Ｊマウスに注射した。脂肪 組織のＬＰＬ活性は、直接的なエンドトキシン効果の可能性を最少限にするため に１６時間后に測定し、第１Ｂ図に示す如＜ＬＰＬ活性が５５Ｘ減少しているこ とがわかった。耐性動物はこの少量のエンドトキシンに応答しないから、この結 果は、耐性マウスが応動しうる体液メディエータ−が含まれていることを再び確 証するものである。

Ｆ、マウスの腹膜書出細胞でつくられるメディエータ−の活性 滲出細胞が刺激されてメディエータを生産し、それによりエンドトキシンが脂肪 組織のＬＰＬ活性を抑圧することを示す実験を行った。滲出細胞は、エントドや シン感性（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ　）マウスの腹膜洗浄により得た。これら細胞はエン ドトキシンの１０μｔ／−の存在或いは不存在下に試験管中で保温した。これら 細胞培養体からの媒液１−をＣ８Ｈ／Ｈ＠Ｊマウスのエンドトキシン耐性種に注 射した。第２図に示すように、エンドトキシンで培養した滲出細胞培地を注射し た動物の脂肪組織における平均ＬＰＬ活性は、エンドトキシン添加なしの細胞培 養体からの培地、もしくはエンドトキシンを含有する培地（但し無細胞）のいず れかをうけたマウスにおけるＬＰＬ活性の３２％であった。エンドトキシン処理 細胞培養体からの培地で処理した動物と、食塩水のみで処理した動物との酵素活 性における相違は、他の比較例との差よシもはるかに大きく、このことは、少量 のメディエータ−がエンドトキシンの不存在下における滲出＃ｌ胞にょシ解放さ れたこと、また細胞のない培地中における少量のエンドトキシンがＬＰＬ活性を 部分的に低下させるのに十分であることを示している。

上記からエンドトキシンの投与が、エンドトキシンシ四ツク及び死亡に敏感なマ ウス種における脂肪組織ＬＰＬを看しく抑圧することは明らかである。この作用 は、エンドトキシンシ胃ツクに対して敏感であるマウスのみ々らす敏感なマウス における脂肪組ＥＬＰＬを抑圧することのできる体液ファクターがメディエータ −となｐうる。エンドトキシンに対して敏感な腹膜滲出細胞はまたこの体液メデ ィエータ−を生産する能力をもつ。

培養基は、２４乃至３６時間エンドトキシン１０ｐｙ／ｄにさらされたＲＰＭＩ −１６４０成長培地中で培養されたマウス腹膜船出細胞を４℃で１０分間５００ ｒｐｍで遠心分離することによｐ得た。この表鳩物、１０，０００−ダルトンカ ットオフのアミコンＰＭ−１０膜で限外ろ過をした。これをろ過により磯縮して 約７−とし、セファクリル３００カラム（１，６９５α）上に載置し、４−／時 間、４℃でシん酸塩緩偽食塩水（ＰＢＳ）　（Ｐｉ（７，４）で溶出させた。夫 人の２２クシ璽ン（留分）の容量は８．６−であった。このフラクシ、ンのＬＰ Ｌ活性を分析した。１０８乃至１０１−及び１３３乃至１４０−で溶出したン乏 クシ、ンがＬＰＬ検霞Ｏために電性であみことカーわかった−と打ちフラクショ ンにおけるメディエータ−活性組成物の分子量はそれぞれ約３００　、０００及 び７０　、０００ダルトンであった。

限外ろ過によシ得た親液性化ろ液を蒸留水の最少飯に溶解し、セフテックスＧ５ ０カラム（１，６Ｘ　９５５１　）でクロマトグラフ処理し、６−７時間の流速 で、ＰＢＳ（ｐＨ７，４）により溶出化した。３−のフラクシ冒ンが集められ、 ＬＰＬ活性を分析された。活性は１７０乃至１７９−で溶出するフラクシ曹ンに 位置し、これは分子賃約４００乃至１，０００ダルトンに相当するものである。

平均的な分子製は、既知分子量のプロティンとの比較による標準的な方法によシ 決定された。標準プロティンはフェリチン、分子量４４０，０００ダルトン；ボ ビン血清アルブミン、分子ｆｕｓｓ、ｏｏｏ　；カルボニック　アンヒドラーゼ 、分子ｚａｏ、ｏｏｏ　；及びリボヌクリアーゼ、分子′ｊ！Ｌ１７，０００　 ；すべて単位は夕゛ルトンである。幽業者にはよく知られているように、この方 法で決定される分子量は正確に１約２０％である。

メディエータ−活性組成物は、以下の手順によってミレックスＭ（にリボア　コ ーボレーシ、ン、マブナ、−七ッツ州ペッドフォード）を用いて真空透析により マウスのｉ膜参出細胞から分離すること本できる。

真空透析は分子量カットオフがｉｓ、ｏｏｏ乃至１４，０００ダルトンである透 析管中で実施される。エンドトキシン処理溶出細胞培養体から得られる条件つき 培地棟木を真空下に６時間、＋１！′！Ｉｔｔ−４０Ｘ減じて４℃で放置した。

バラグの内側及び外懺からの部分標本をメディエータ−活性のため検定した。

活性のすべては、１！、００Ｇダルトン孔カツトオフを有する膜で真空透析中保 持されることがわかった。従ってこの方法によシ分離されるメディエータ−組成 物は、１２．０００ダルトン以上の分子量を有する。この組成物は、既に述べた 二つの高い分子量組成物を含有する。もっとも分子量の低い組成物が得られない 理由は明らかではない。おそらくミレックス膜中に吸収されるか或いはアミコン （Ａｍｉｃｏｎ）フィルターを用いた方法の方がより迅速であるからであろう。

熱に対する種々メディエータ−組成物の安定性は、１００℃で１５分間加熱する ことにより検定された。リボプロティン　リパーゼに対するメディエータ−の抑 制効果はこの処理によシ完全に阻止された。

メディエータ−が非処理細胞の細胞内成分であるか否かを決定するために、滲出 細胞を超音波処理し、抽出物をそのメディエータ−活性について検定した。これ ら抽出物は測定可能なメディエータ−を有していなかった。

従ってこのメディエータ−紘滲出細胞の通常の細胞内物質ではなく、エンドトキ シンによる刺激に続き細胞内で合成或いは生成されたものである。

メディエータ−活性組成物が腹膜鍵山細胞の組織培養体の組織培養液中にあると いう本実から、これらが水溶性であることが明らかである。

従ってこのメディエータ−は哺乳動物体におけるＬＰＬ活性を減少させることが でき、標準的な方法で分離することができる。

１．３Ｔ３−Ｌ１ｍ胞培養体 ３Ｔ３−Ｌｌグリ−トポサイトは既に開示されているように（マツカルほか、Ｊ 、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、２５１号、６４６２ページ、１９７６年刊：コー、ケー 、スチ、−プントほか、Ｊ、　ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、　、　２５５号、　４７４ ５−４７５０ページ、１９８０年）、１０％胎児牛血清を含有するダルベニの修 正イーグルス培地（ＤＭＥ培地）中で培養した。アジボサイト　フェノタイプに 至る分化は、スチ、−プント＃丘か、ルピンほか（Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、２ ５３号、７５７０−７５７８ページ、　１９７８年）の方法の修正方法により誘 導された。交会８日後、培地は１−あたシＯ，Ｓ　ｍ　Ｍのインブチル−メチル キサンチン、１＃Ｍデキサメタシン及びｌＯμｔのインシュリンが補充された。

４８時間后、インブチル−メチルキサンチン、デキサメタシン及びインシュリン を含有する培地はインシュリンを１−あたシ５ｏｎｔの低下した濃度を有する培 地と交換された。

培地がインシュリン濃度の低下した培地と交換されて一時間后、エンドトキシン 添加或いは添加しない培養滲出細胞からの条件つき培地を３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養 体に添加した。条件つき接地と共に細胞を２０時間まで保温した。リボプロティ ン　リパーゼ活性の量は所定回数以下の三つの区について決定した：（１）培地 の活性；（至））ヘパリンとの保温に続き細胞から解放された活性（この活性は Ｍ！ｌ１１１０外懺面と関連する酵素を表わす）；及び（３）細胞内活性。

培地を除いて後、皿を新鮮な培地で一度洗浄し、細胞膜と関連するリボプロティ ン　リパーゼを、ヘパリン（１０Ｕ、／ｓｇ　）及びインシュリン（ｓｏ　ａｔ ／　ｍ　）を補光したＤＭＥ培地中で１時間保温することによシ解放した。この 培地を移動して彼、皿をＰＢｓで洗い、細胞をヘパリ：ｙＢＵ／−含有すルｐＨ ８，１テ５０　ｍＭｃ）ＮＨＢ／ＮＨ４ＣＬの１−中に掻き入れ九。

Ｈ，３Ｔｌ−Ｌｌプリーディポサイトの研究メディエータ−組性物の性質紘、本 発明者及び共同研究者であるピー、ペカラ及びエム、ディー、レーンによりよく 知られ九ａＴＢ−Ｌｌ　プリーディポサイ）（ｐ−ｌ　− ｒ＠ｄｉｐｏｃｙｔ＠）　そアル系を用いて更に研究された。

３Ｔｌ−Ｌｌプリーティボサイトはもと本と！ウス胚フイブロプ２ストからクロ ーン化されたもので、これはアジボザイトの生物学的及び形態学的特徴を有する 細胞内の単層培養体から分化した４のである。アジボサイト変換の間、３Ｔ３− Ｌｌ細胞は、デノボ脂肪酸合成及びトリアジルグリセロール合成の酵素中で等位 上昇を示した。

同様に１．脂質ｉｌ′ｒｖＬ代謝の別のキー酵素であるリボプロティン　リパー ゼの活性はアジポーゼ変換の円に８０−１８０倍上昇した。この酵素の活性は、 培地中のインシュリンの存在によって高められ、脂肪組織のリボプロティンリパ ーゼと同様であるように見えた。

３Ｔ３−Ｌｌプリーディポサイト細胞ラインの細胞を使用することによシ、上述 エンドトキシンにさらされたマウス腹膜滲出細胞に由来するメディエータ−組成 物の添加カニ、リボプロティン　リパーゼの活性を抑圧することがわかった。

３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養研究に使用されるエンドトキシンは上述のようにして得ら れた。細胞培地及び胎児牛血清は、ギプコラボラトリーズ（二、−ヨーク州ロン グアイランド）から得られた。３−インジェル−１−メチルキサンチンはオルド リッチケ建カル（ライスコンシン州ミルウォーキー）から得られ、デキサメタシ ンはシグマケミカルカンパニー（ミズーリ州セントルイス）から、またインシュ リンはエリリリーコーボレーシ、ン（イリノイ什アーリントンハイツ）から得ら れた。トリオラインはヌチェック　プレグ　インコーホレーテッド（ミネソタ州 エリシアン）から荀られた。結晶ボビン血清アルブミンはカルビオケミーベーリ ング　コーボレーシ、ン（カリフォルニア州うヨラ）から得られた。

懸濁液社（氷上で）１５秒間超音波処理し、５分間５ＯＯｘｔで遠心分離した。

浮上物をリボプロティン　リパーゼについて検定した。

リボプロティン　リパーゼ検定は、ニルセンーエーレ及びシ璽ツッによる方法（ Ｊ、ＬＩＰＩＤ、ＲＥＳ、１７号。

５８６　Ｘ　５４ｉ　ヘージ、１９７６年）を僅かに修正して、二重に標本をｌ ｉ！ｉ製征８製分８０分以内した。簡単にいうと、７ＳＩＩｔ（Ｄ酵素を、２２ ．７　ｍＭ　Ｃ３Ｈ）　−）リオ之イン（１モルわたｌｉ　１．４　ｕｃｉ、　 ｚ　ｌＩ／；ｌ＞ｆｃ　、り　２．５のレシチン、ｌ−あたｐ４０岬のボビン血 清アルブミン、３３％（■■八へ皿消及び０２７Ｍのトリス−ＭＣＩ　、　ｐＨ ，８，１中における３３％（Ｖ／Ｖグυセロ−八）を含有する基質２５ｐｔと混 合し、３７℃で９０分間保温した。１ミリユニツトの酢先活性に１分間わた多エ ナノモルの脂肪酸の解放として定義された。三つの区すべてにおけるリパーゼ活 性鉱、ｘＭのＮａＣｔの添加により〉９０Ｘに抑制され、酵素活性に必要なアポ リボプロティンＣ−１を源である血清を落すことにより）ＳＯ％に抑制された。

３Ｔ３−Ｌｌ細胞のリボプロティンリパーゼ活性に及ぼすメディエータ−の効果 を試験するため、エンドトキシンの存在或いは不存在のもとて培養されたマウス ＥＬ膜滲出細胞から得られる条件つき培地を、単層培養体中の３Ｔ３−Ｌｌ細胞 に添加した。３７℃で２０９時間保温后、リボプロティンリパーゼ活性は３つの 区で評価された：（１）ｔＧ地；（２）細胞表面（ヘパリン−解放可゛能リパー ゼ活性）及び；＜ｓ＞ｍ胞内７２クシ、ン。

第３図Ｑ＆Ａ及びＣに示されているように、エンドトキシン刺激滲出細胞からの メディエータ−物質を含有するｉ４地の添加は、三つのすべての区でリボプロテ ィンリパーゼ活性を着しく抑圧する。培地、細胞表面上（ヘパリン解放可能）、 及び細胞内室における酵素活性は、同量の新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地で保温 した比較細胞のそれぞれ０．１Ｘ、６Ｎ、１８Ｎであった。アジイボサイトの形 態或いは範曲における差異は、実験群細胞を比較群細胞の間には与られなかった 。研究初期におい１、はぼ２０％の細胞が細胞質におけるトリグリセライド集積 を示した。２０時間后、実験栴及び比較群細胞の両方のｔミソ５Ｇ％がトリグリ セライドを菓検した。

エンドトキシンで処理されていない滲出細胞の培養体からの培地は、３Ｔ３−Ｌ ｌ細胞のリボプロティンリパーゼ活性に殆んど影参を与えなかった。未処理滲出 細胞からの培地は第８図８４１１ｍに示す研究でいくらかの抑制を誘発したが、 別の同様の研究においては、同様にＩＩａされた培地は抑制効果會示さなかった 。エントド井シン自体も、エンドトキシン処理滲出細胞からの条件つ色培地に残 るかもしれぬ蓋に吟しい量を添加した時には、リボプロティンリパーゼ活性に無 視できる根度の抑制効果しか示さなかりた。１９　Ｘ　ｓ　９　Ｘ　％及びＯＸ の減少が培地、ヘパリン離脱可能区及び細胞内置に観察された。この減少＊ａ、 第３図りに示すように大量（４，５倍）のエンドトキシンが使用された時にはよ シ大きいものであった（培地で４５％、ヘパリン離胞可能で１γ％、＃Ｉ胞中で 工ＩＸ）。

上述したリボプロティンリパーゼの減少した活性の説明としては、酵素に及はず メディエータ−の直接的か抑制効果を挙けることができる。これは、エンドトキ シン処理滲出細胞培養体からの条件つき培地と共にリボグロティンリバー（を含 有する３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養体からの培地を保温することにより検査された。酵 素活性は混合時にメディエータ−組成物により抑制されること、酵素活性の衰亡 速度は央験群と比較群とも同じであることがわかった。エンドトキシンもまたリ ボプロティンリパーゼの活性に影替をもたなかった。この結果はメディエータ− 組成物が、酵素の細胞内合成或いは生産を抑制することによ、９３Ｔ３−Ｌｌに おゆるリボプロティンリパーゼ活性を抑圧することを意味している。

メディエータ−組成物の量と３Ｔ３−Ｌｌ細胞のリボプロティンリパーゼ活性と の関係は、エンドトキシン処理滲出細胞からの条件つき培地の増大量と共に細胞 ｆｆ１Ｏ時間３７℃で保温することにより検査された。培地工５−に添加した１ ０１ｉｔの条件つき培地は、リボプロティンリパーゼ活性を実質的に減少妊せる Ｏに十分であった。

即ち培地において５７Ｘの減少、ヘパリン解放可能区において４０％の減少及び 細胞内で８％の減少があ−）九。

酵素活性は、メディエータ−含有培地の量を増大させることによｐ東に抑圧され た。ｗｓｏｐｔが添加された時、三つのすべての区で９６Ｎ以上の減少が観察さ れた。条件つき培地に存在するメディエータ−の量は、調製毎にメディエータ− 添加層リボプロティンリパーゼ活性が低下する速度もまた検査された。メディエ ータ−含有条件つき培地が辿ばれた間隔毎に添加され、そしてリボプロティンリ パーゼ活性が測定された。リパーゼ活性の減少は、ａ’ｒａ−Ｌｌ細胞の松加尼 僅かに３０分で明らかとなった。靴胞内酢苑活性のはｙ十分が２５時に后に失わ れた。メチイエ−ターと共にし、温５時（ト）Ｊ后、最大効果が船艷された。培 地中及び細胞於［Ｌ・上の酵素活性の１もまた、同様の時間で（データは示され ていない）減少することが観察された。

リボプロティンリパーゼ活性の急速な減少は、インタ、リンとの競合も考えられ る。なぜならインシーリンの防去は、ａＴ３−Ｌｌｊ＆＋胞のリボプロティンリ パーゼ活性の迅速な低下を招くことが示されているからである。

しかしながら、培地中のインシーリン濃度を増大させることによるメディエータ −の抑制効果を逆転させようとする試みは成功しなかった。この研究のため、裡 々の濃７７　（５０ｎｙ　／−乃’ｒ＝　５０　ｐｙ／ｍｌ　）のインシーリン 含有培地と共に３Ｔ３−Ｌｌ細胞の保温効果が、リボプロティンリパーゼ活性に ついて検定された。＃索活性に及はずメゾ５．エータ〜の抑かｊ効果は、インシ ュリン濃度を増大することによって変化することはない、橡準条件（５０ｎｙ／ ｄ、）のそれよりも１００Ｏ倍大きいインシーリン濃庇でありＴ′も、抑制効果 は逆転す２．−とはない８゜実施例１ ３Ｔ３−Ｌｌ細胞の他の同化活性がメゾイエ−！−で抑制されるであろうことを 推論して、われわれは二つのキー［：（１）アセテルコＡカルボキシ２−ゼ；及 び（２）脂肪酸シンセターゼ；をデノボ脂肪酸バイオ合成について研究した。本 発明者及び共同ｖｒ死者であるピー、ベカラ。

エム、ティーレーン、及びシー、ダブリ１．アンガスによジ準備された原稿に基 づく以下の実施例は、これら酵素の音域は大食細胞メチイエ−ターの添加によっ ても抑制辿れる証拠を呈示している。この結果はメディエータ−〇大きな役割を 示しており、また免疫細胞と哺乳動物のエネルギー貯蔵細胞との間の連絡系の存 在を指摘するものである。νそらく侵入の間免疫細胞は内分泌系の後を果すこと ができ、侵入を撃退するためにエネルギーを選択的に動員するものであろう。

Ａ、材　料 先述ウエストファルの方法によ多分離しｆＣ，Ｅ、＝ＩＪ　Ｑ１２７：Ｂ８から のエンドトキシン（リポポリサッカライド）をディフコラボラトリーズ（ミシガ ン州デトロイト）〃・ら購入した。＃ｉ細胞地及び胎児牛血清はギブコラボラト リ・−ズ（二、−ヨーク州グランドアイランド）から入手した。３−インブチル −１−メチルキサンチンはオルトリ、チケミカル（ウィスコンシン州ミルウ第一 キー）から；デキサメタシンＬエリリリー（インディアナ州インディアナポリス ）から；　ＩＩＧ−８ＯＲＢＨエンジムセンター、インコーホレーテッド（マサ チ、−セッツ州ボストン）から；　Ｌ　（８５８）メチオニン（８００−１４４ ０Ｃ１／ｍモル）はアメルシャムから；　Ｅｎ”Ｈａｎｏ＠ａエヌイーエヌ、（ マサチ、−セッツ州ボストン）カラ；脂肪酸／シンセタゼに対する抗血清はパパ ニコ２ウ　キャンサー　リサーテインスティチ、−ト（フロリダ州マイアミ）の ７アザルアシマラド博士から提供された。

Ｂ、３Ｔ３−Ｌｌ細胞培養体 ３Ｔ３−Ｌｌプリーディボサイトは１０Ｓ胎児牛血清を含むダルベコの修正イー グル培地（ＤＭＥ培地）中で既に述べたような方法（マツカルほか、Ｊ、ＢＩＯ Ｌ、ＣＨＥＭ、ｌｉ１号、　６４８２ページ、１９７６年）で培養した。

アジボサイトフェノタイプに至る分化は、ルピンほかの方法（Ｊ、ＢＩＯＬ、Ｃ ＨＥＭ、ｚｓｓ号、７５７０ページ、　１９７８年）の修正方法（ニー、クー。

ステ、−プントほか、Ｊ、ＢＩＯ，ＣＨＥＭ、２５６号、　４７４Ｂ　−４７５ ０ページ、１９８０年）によシ誘発された。交会２日後、培地に０．５゜Ｍイソ ブチル−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾーン及びｌ−あた夛１０声ｔの インシュリンを補充した。

４８時間後、インブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾーン、及びインシュ リンを含有する培地をとｐ除き、１ｍｌあたｊ１５０ｎｔの減少１１度のインシ ュリンを含有する培地ととヤ代えた。

Ｃ０腹膜滲出細胞及びメディエータ−物質の駒製腹ａ滲出細胞は死亡６日前に殺 菌したプレワーのチオグリコレート培地（ディフコラボラトリーズ、ミシガン州 デトロイト；マウス１匹あたシ３−）を腹膜的注射したＣ３Ｈ／Ｈ＠Ｎｙウス（ ２５−３３Ｆ；チャールズブリーディング２ボ乏トリーズ、ｉサチ、−セッツ州 つイルミントン）を訳膜洗浄することにより得た。この方法を使用することによ シ得た滲出細胞は、いくらか不純なライモアオサイドを含む主として大食細胞で ある。

この細胞（４Ｘ　１０’細胞１５１”）は３時間血清の力いＲＰＭＩ−１６４０ 培地中で保温し、その後非粘結細胞を培地で８回洗浄することによｐ除去した。

皿に粘着する細胞は主として大食細胞であった。これら細胞は１０μｔ／ｍのエ ンドトキシンの存在下に或いは不存在下に血清のないＲＰＭＩ−１６４（１培地 中で更に保温した。２４時間後、培地を除去し４℃でＳ分間１０００　Ｘ　Ｆで 遠心分離した。エンドトキシンにさらされた細胞から得られり条件つき培地の浮 上物を検定し、３Ｔ３−Ｌｌ細胞のＬＰｂを低下させるメディエータ−唆質を含 有する仁とがわかった。条件つき培地を１力月間−８０℃で保蔵した後、活性に 差が見られた。

Ｄ、Ｂ　Ｔ　３−Ｌ　１細胞に及はすメディエータ−の効果培地を、少い漉度の インシュリンを含有する培地でと多代えた１時間後、添加したエンドトキシンと 共に或いはエンドトキシンなしに培養した滲出細胞から得た条件つき培地を３Ｔ ２１−Ｌｌ細胞培養体に添加した。条件つき培地と共に細胞ｔ−２０時間に至る まで保温した。

５−のメチオニンのない培地で２度洗浄し、Ｏ，１５ｍＣ１のＬ−（３５Ｓ”ｌ −メチオニンを含有する同じ培地ｊ！―を１時間保温した。その間、細胞質プロ ティン中への〔３５Ｓ〕−メチオニンの結合速度は直線的であった。培地を除去 し、細胞単層をｐ）Ｔ、　７．４のシん酸塩緩衝食塩水で二度洗浄し、可溶性テ トソリックプロテインを、既に述べたマカールほかＯディジトニン法により解放 した。膜フラクションを含有する細胞単層Ｏ１！Ｉ、ａを次に、Ｏ，ＩＳＮの非 イオン性浄化薊ＮＰ−４０及び１ｍＭのフェニルメチルスルフォニル−フルオラ イドを含有するｐＨ７，５ＯＺｏ。

ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤２０−中に掻裏入れた。パスツールピペット中に滴定后 、この懸濁液を４℃で１０分間１０゜ｏｏｏ　ｘ　ｔで遠心分離し、浮上物を除 いた。

（”Ｓ〕−メチオニンの不溶性材料中への結合は、２０μＬのディジ）＝ン戒い はＮＰ−４０解放材料を、担体として添加された２５μｔの０５％ボビン血清ア ルブミンと共に０．５１１ｔの氷ｇｏＸＴｃＡに添加することによ如行った。

４℃で１時間坐らせた後、この混合物を５分間２　、０００　Ｘｔで遠心分離し た。このペレットを３７℃で３０分間、０、５　ｄのＩＭのＮＨ２ＯＨ中で保温 した、っこのプロティンを氷コールド１０％ＴＣ人の翫〇−添加により再沈澱さ せワットｉンＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。このろ逸物をジエチルエーテルで 抽出し、ラジオラベルの量を決定した。

Ｆ、免疫紋収電気振動 ＃Ｉ胞単ＮＯ可癖（ディジトニン解放）フック７嘗ンからＯ可溶（３５Ｓ）メチ オニンーラベルブ四ティンの部分橡本七作’）　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　１　ｆＩｓＭ 　Ｎ　Ｎ　Ｐ　４０洗浄剤０．５％を、アセチルＣｏ（コエンジム）Ａカルボキ シラーゼ或いは脂肪酸シンテターゼに特上のアンチロラに添加した。２５℃で２ 時間后、１００μｔの１０％Ｉｙｃ−８ＯＲＢを添加し、ラベル酵素を既に述べ たスチューテントほかの方法によシこの混合物から分離した。ポリアクリルアミ ド−８ＤＳゲルをクエムリ法によシ作シ、製造者の指示によりＥｎ３ハンスの方 法に基づいて間接撮影法が行われるようにした。

アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテターゼ酵素の活性に及ぼすメ ディエータ−物質の効果を検食するために、エンドトキシンの存在下で培養した マウスのａ襖滲出細胞から得た条件つき培地に３Ｔ３−Ｌｌ細胞をさらした。こ の３Ｔ３−Ｌｌ細胞をメディエータ−と共に３．６及び２０時間保温した後、細 胞のディジトニン解放７トンリツク７ツクシ、ン上でアセチルＣｏＡカルボキシ ２−ゼ及び脂肪酸シンテターゼ活性を決定した（第４図）。両酢索の活性は２０ 時間后、最初の値のｔミソ２５％に低下した。

両酵素の活性損失がプロティン合成０直級的な効果の結果であるかどうかを決定 するため、３Ｔ３−ＬＬ細胞を３．６及び２０時間、エンドトキシン処理鍵山細 胞の培養体から得た条件つき培地と共幌保温した。保温の最后の時間の間、細胞 ｙｔ、＋１５８−メチオニンのパルスにさらした。このパルスに続き、Ｓ−メチ オニンをラベルしたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテターゼを 免役吸着によジディジトニン解放可能シトンリック７ラクシロンから分離した。

同定ｉｌ：５Ｄｓ−ボリアクリルーアｉドゲル電気泳動及び間接撮影法（第５人 及び６Ａ図）によシ行われた。免疫吸着可能アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及 び脂肪酸シンテターゼへの３１５８−メチオニンの減少した結合、及びそれにつ づくメディエータ−へＯＩ！出時開時間易に観察された。放射能写真（第５Ｂ及 び６Ｂ図）のａ！ｉ度計測的スキャニングの結果は、メディエータ−に２０時間 さらした後、脂肪酸シンテタしたことを示していた。これらの結果は、メディエ ータ−が酵素の合成に干渉することによジアセチルＣｏＡカルボキシ２−ゼ及び 脂肪酸シンテターゼの活性を抑圧するという考えと両立するものである。

アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテターゼに及ばず観察された効 果は、メディエータ−によるプロティン合成の一般的な抑制により脱明すること ができよう。この可能性を検討するために、プロティン中へのアミノ酸結合に及 ばずメディエータ−の効果を調べた。

３ＴＪＩ−Ｌｌｌ細胞一種々の時間にわた夛、エンドトキシンの存在下に培養し たマウス腹膜滲出細胞から得た条件つき培地で保温した。可溶性のあり膜と結合 するプロティン中への　Ｓ−メチオニン結合を、細胞を１，３及び６時間他のフ ァクターにさらした後決定した。３Ｔ３−Ｌ１細胞がエンドトキシン不存在下で 培養したマウス腹膜滲出細胞から得た条件つき培地にさらした時には、酸不溶性 プロティン中への　Ｓ−メチオニン結合にはなんの効果も観察されなかった。し かしながら、第７図かられかるように、可溶性７ラクシ、ン（ディジトニン解放 可能プロティン）中のＴＣＡ沈澱可能材料中へ８ＢＳ−メチオニン結合すること によって最初の８時間ではｙ１０％増加したが、そのほかの変化社観察されなか った。一方膜フラクシーン（ＮＰ−４０溶出プロテイン）中の酸不溶材料にラベ ル納金する場合にｉｊ　５０　％の減少が観察され友。メディエータ−にさらし た後ＪＩＩＳ８−メチオニンをラベルしたプロティンの分析は５ＤＳ−ゲル電気 泳動を利用して行われ九。ゲイジ）ニン処理により得られた可溶プロティン及び ３　Ｔ　ｌ　−Ｌ　１　ＭａノＮＰ−４０に！　！Ｏ１！出したプロティンの放 射能写真のパターンは、第８図及び９図に示されている。第８図を詳細に検討す ると、分子量ｇｇｏ　、　ｏｏｏダルトンのプロティン帯域のメディエータ−添 加に続いて時間の経過と共に漸次消失してゆくことが観察され、一方他の帯域で は分子量がｔデソ１８，０００で現われる。これらの主要な変化に加え、別の新 しいプロティンははｘ　ｓｏ、ｏｏｏで現われ、第二のプロティンはＦＩｏ、０ ００で消失する。

ＮＰ−４０浴出プロテインの分析は同様の結果を示している（第９図）。九子量 が約ｓｏ　、　ｏｏｏ及びａｏ、ｏｏｏダルトンのプロティン帯域が現われる一 方、約２２０−及び５ｏ、ｏｏｏの帯域は消失した。

ディジトニン解放可能プロティンにおける分子量２２０゜０００のプロティン帯 域の損失は、免役吸着可能アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテタ ーゼの損失と矛盾しない。＃素は同様な分子量を有し、この電気泳動条件下で同 じＲ？ＦＩと共に移動する。現在のところ公知酵素或いはプロティンと共に他の プロティン帯域を同定することは可能ではない。

１１分　析 メディエータ−は酵素の合成を抑圧することにより酵素活性を減少させるように 見える。プロティン合成に及はず効果は極めて特徴的である。なぜなら放射能写 真に観察されるプロティンパターンの大きな動揺がないからである（第８及び９ 図）。メディエータ−に対する応答においていくつかのプロティンの合成が抑制 されるか誘発される。合成かメディエータ−により抑制される二つのプロティン として、免疫沈澱により脂肪酸シンテターゼ及びアセチルＣＯＡカルボキシ２− ゼ（分子量２２０　、０００）を同定することが可能であり九。メディエータ− によｐ調節される他のプロティンの同定は埃在可能ではない。もつともリボプロ ティンリパーゼｔ−ｉ、５０，０００タルトンプロテインとして可能性のある候 補者である。メディエータ−に対する応答として誘発されるプロティンの性質及 び特定のプロティン合成の調整メカニズムは、より深い研究に十分に値いする。

アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンテターゼの合成を調整すること ができるメディエータ−が、リボプロティンリパーゼの活性を抑圧するメディエ ータ−と同じであるかどうかは現在知られていない。筋肉から肝臓ヘア建ノ酸を 新陳代謝させるといわれている白血球７アクターに対するこれらメディエータ− の関係はかなシ興味をひく。なぜならこのファクターもまた組織に異化状態付与 するからである。

実施例■ 本発明者と共同研究者であるササシグルにより単偏された未刊行原稿によシ具体 化されたこの一連の研究において、われわれは実施例Ｉ及び■で観察された大食 細胞メディエータ−が赤血球合成にいずれかの影響を及ぼすものか否かを決定す ることを試みた。貧血は慢性の感染症に悩む哺乳顛に一般的にみられ、赤血球の 再生はエネルギー及びア建ノ酸の消耗を４たらすものであるから、猛烈な侵入に 対して動物体はそＯ応答として、アジボサイトに影響を及ばすリボプロティンリ パーゼ、アセチルコエンジムＡカルボキク２−ゼ及び脂肪酸シンテターゼなどの 同化酵嵩についてみられるのと同じ態様、かつおそらく同じ機構で赤血球の生産 が阻害されることになる、と我々は考えた。

この仮説を検討するため、われわれはマウス大食細胞から得られるエンドトキシ ン誘発ファクターが、モデル赤血球生産細胞−フレンドビールスー変換エリスロ ロイケンア細胞（フレンド、シーほか及び！−クス、ピー。

ニーほか、既述、参照）の細胞増殖及び分化に及ぼす影響を検査した。このモデ ル系において多数の誘発体、例えばジメチルスルフオキシド（フレンド、シー、 ほか、既述）、ヘキサメチレンビスアセトアミド（レイパン。

アール、シーほか、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣ１，。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７３号、８８ｆｆｉ−８６６ページ）、ブチル酸（レダー、ニ ーほか、　１９７！ｉ年、細胞δ号、　３１９−３２２ページ）及びヒボキサン チン（グセ２．ジエー、エフ０，１９フ６年、細胞８号、　２６３−２８９ペー ジ）に対する応答として細胞を分化させヘモグロビンを生成すゐことを誘発させ ることができる。この実施例は、大食細胞が赤血球放出細胞の成長及び分化を抑 制することができるが、非放出幹細胞にはあｔｎ影響がなく、十分に分化した赤 血球細胞に紘集際上影響がないことの証拠を呈示するものである。

Ａ、材　料 ウェスト７アル（既述）の方法によｐ分離されたＥ。

コリ０１２７　：　Ｂ　８から得られるエンドトキシン（リボリサッカ２イド） をディ７コ（ンシガン州デトロイト）から購入した。修正Ｆｉｇ培地を我々の実 験室で調製した（サッサ、ニスほかＪ　、　Ｂ　ＩＯＬ　、　ＣＨＥＭ、　２５ ２号、　２４２８−２４３６ページ、　１９７７年）。胎児牛血清をギプコ（二 瓢−ヨーク州グランドアイランド）から購入した。ジメチルスルフオキシド（Ｍ ｅｚ　Ｓｏ　）　ハ’ｆ−ストマンオーガニック　ケきカルス（二、−ヨーク州 ロチェスター）の製品でありた。ブチル販及びヒボキサンチンはシダ！ケミカル 　カンパニー（ミズー州セントルイス）から得た。ヘキサメチレンビスアセトア ミド（ＨＭＢＡ）はメルク　シャープ　アンド　ドームリサーチ　ラボラトリー ズ（二、−シャーシー州ローウ翼イ）のアール、シー。

ルペン博士から提供された。

Ｂ、細胞培養 鼠のフレンド−ビールス変換エリスロロイケミア細胞（り四−ンＤｆ３−１９） が既に開示された（サッナ、ニス。

グラニック；ジュー。エル１．アイゼン、エイチ、及びオステルターク、ダブリ ュ、１９．７８年、エリスロポイエシスの試験管内の様相、マーフィー、エム、 ジー、ジ。

ニアによｐ−集；スゲリンガ−７エルラータ社、二、−目一り、　２６Ｂ　−２ ７０ページ）ようにして、ＩＯＸ熱不熱性活性胎児牛血清給した修正Ｆ１２培地 で培養した。

Ｃ，マウスの滲出細胞培養体から得たエンドトキシン刺激をうけた条件つき培地 の調製 ＮＣＳマウス（ロックフェラ一二二／（−シティ　フリーディング　コロニーか ら得た体重２５−３３ｆのもの）から得た腹膜滲出細胞の分離、及びエンドトキ シン刺激をうけた条件つき培地の試験管内調製は、既に述べたようにして（実施 例■）実施された。簡単には、複膜滲出細胞は、ディフコラボラトリーズ（ミシ ガン州デトロイト）から得た殺菌したプレワーのチオグリコレート培地で処理し たマウスから、死亡前６６目に１マウスあたシ３−の量で分離して得た。この細 胞を血清のないＲＰＭＩ−１６４０培地中で３時間保温し、次に非粘着細胞を培 地で３回洗浄することによシゆすぎ落した。皿に粘着する細胞は主として大食細 胞であった（カワ力きほか、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、８Ｃ１，、ＵＳＡ 、７９号、９１２−１１１６ベージ；エーデルソン、ビー、ニス、ほか、Ｊ、Ｅ ＸＰ、ＭＥＤ、、１４２号、　１１５０−１１１１４ページ、　１９７５年）。

これら細胞を更にエンドトキシンの存在下に（５μｔ／−）血清のない培地中で ２４時間保温した。保温抜、培地を除去し１０００　Ｘ　ｔで５分間４℃で遠心 分離した。

この条件つき培地の嵌層物はエンドトキシン誘発メディエータ−を含有しておシ 、これは３１Ｔ８−Ｌｌ細胞（実施例Ｉ中に記載）中Ｏリボプロティンリパーゼ の活性を減少させ、更に処理を加えることなく使用された。

Ｄ、赤血球分化０１１発 フレンド細胞の赤血球分化を検定するため、二種の保温成績表が使用された。第 １０−１３図に示す実験において、細胞（ＩＩＸＩＯ’細胞／−）は３７℃、湿 潤空気で５％ＣＯ，下で１８時間保温した。誘発化学剤、即ちＭ・２ｓｏ１ＨＭ ＢＡ、ブチル酸、ヒボキサンチン或いはヘミンが大食細胞メディエータ−と共に 或いはメディエータ−なしに添加し、培養体を成育培地に変化を加えることなく ９６時間保温した。他の実験、例えば第１４図に示す結果を我わすような実験で は、細胞（１０ｓ細胞／−）を１８時間保温し、次にＭｅｚＳＯと大食細胞メデ ィエータ−を上述の如く添加した。この培養体は、化学誘発剤及び大食細胞メデ ィエータ−或いは化学誘発剤のみを含む新鮮な培地で細胞懸濁液を毎日稀釈する ことによｊＤ、２Ｘ１０’細胞／ｗｔに保持した。この手順は、最初Ｏ実験手順 よルも多い大食細胞メディエータ−を必要とじたが、細胞が対数的に一定速度で 成長している間、細胞の成長速度に及ばずメディエータ−の効果を検査すること が可能であった（チャン、シー、ニス、ほか、Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ。

２５７号、　３６５Ｇ−３６５４ページ、　１９８２年）。

細胞中のへム濃度は、鉄分の除去の後ポルフィリン誘導体の蛍光測定検定によシ 決定された（サッサ、ニス、。

／？ニスニス、ｌチャン、シー、及びカバス、ニー、；ジュー。ダブリ１．フィ ッシャー及びエフ、タヵク編集１赤血球造血において　、東京大学出版、東京、 １９７５年、３８３−８９６ページ）。ヘモグルビンを含有する細胞はベンジデ ィンで汚しシトグラフモデル６８ＧＯＡ　（サッサ、ニス、＋り？ニック、シュ ー。エル１．アイゼン。

エイテ、、及びオステルターク、ダブリ１．．＆述）を用いてカウントした。ア ミルプリニック酸（ＡＬＡ）デハイドラターゼ及びボルフォビリノーゲン（ＰＢ Ｇ）デアミナーゼの検定を先述方法（サッサ、ニス０．グ２ニック、ジュー。エ ル、Ｉアイゼン、エイチ、、及びオステルターク、ダブリ１．．既述）により！ ｉｔ！施した。

エンドトキシンと共に或いはエンドトキシンを加えずに保温した大食細胞培養体 から得た条件つき培地は、未処理フレンド細胞の成長を約ａｓ　Ｘ　（第１０図 、パートＡ）抑制した。これら細胞を１．５　％　Ｍ＠　２８０と共に保温した ところ、エンドトキシンにさらされない比較例の条件つき培地は細胞成長を４２ ％抑制し、一方エンドトキシン刺激条件つき培地は成長を６０Ｘまで抑制した（ 第１０図、パー　）Ｂ）　。

エンドトキシン刺激を受けたかｔＬ＜は刺激を受けない培地で処理したこれら細 胞中のヘム含量は、未処理細胞中のヘム含量とあｔｂ相違がなく、このことは、 条件つき培地それ自体はフレンド細胞のき血球分化に影響を及ぼすものでないこ とを示している（第１０図、パー）Ｂ）。

これと対照的に、Ｍ・、ｓｏ及びエンドトキシン刺激培地と共に細胞を保温する と、細胞中のへい含量が著しく減少（〜４０　Ｘ）する（第１０図、パー）Ｂ） 。

の、投与量に依存する抑制 ７ｖンドｌｌｂＪｍが、１．５　Ｘ　Ｍｏ２　ＳＯ及びエンドトキシン刺激大食 細胞メディエータ−と同時に保温された時には、細胞成長の速度は、培養体に増 大量のメディエータ−が添加された時には漸進的に抑制された（第１１図、パー ）Ａ）。細胞成長に及ばずメディエータ−の抑制は、検査されたもりとも低いｆ ｉ！度で検知され＊（Ｘ、Ｘ２容量％が成長培地に添加されたχもっとも高い濃 ｆ（８容量Ｘ）で敵、メディエータ−は、比較例のＭ・ｆｆ１ｓｏ処理培地のそ れＫＩＩＲべ細胞成長を〜６０％抑制した（第１１図、パートＡ）。細胞数の減 少は細胞の死滅によるものではない。

なぜならトリパンブルー排除試験（パウル　ジェー。

Ｖ′細胞培養　）にょシ検定したところ死滅細胞数は未処理比較例と、刺激条件 つき培地で処理した培養体とで同じ（〜ＩＩＮ）であった。エンドトキシンそれ 自体（１５声ｙ／＋ｔｔで）は、ＭｅｌＳＯの存在下でも不存在下でもフレンド 細胞の成長に抑制的な効果を与えなかった（データは示されていない）。これら の事実は、エンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−が未処理細胞よルもＭ　 ＠Ｈ８Ｏ処理細胞の成長にょｐ大きく干渉すること、また赤血球コきツ）（ｅｏ ｍｍ目１・ｄ）ＮＵ胞は刺激を受けた大食細胞メディエータ−に対し未コイット 幹細胞よｐも感性が高いことを示している。

エンドトキシン刺激大食細胞で細胞を処理することによｊ１Ｍｅｌｓｏメディエ ータメディエータを抑制し、その結果、メディエータ−の童が増加するにつれ処 理細胞中のポルフィリン及びヘム含量の漸進的減少が生じた（第１１図、パー） Ｂ）。ＡＬＡテハイドラターゼ及びＰＢＧデアミナーゼの酵素活性もまたメディ エータ−処理にょｐ減少した（第１１図、パートＢ）。酵素検定混合物に直接大 食細胞メディエータ−を添加することにょシ、ＡＬＡデハイドラターゼ或いはＰ ＢＧデアミナーゼの活性を抑制するようなことはなく（データは示されていない ）、これは酵素活性への直接的な抑制効果を除外するもメディエータ−の遅延し た添加の効果 エンドトキシン刺激条件つき培地を程々回数Ｍ・２ｓ。

処理培養体に添加した時には、細胞成長に及ぼす大食細胞の影響は徐々に失われ た（第１２図）。

赤血球分化に及ばず大食細胞メディエータ−の影響は、細胞成長に及ぼす影響よ りも迅速に減少した。例えはエンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−の添加 はヘム及びプロトポルフィリン組成を保温の初期に〜４０Ｘ抑制し、２４時間後 には〜２５Ｘ１また４８時間後或いはそれ板層では影響がなかった。大食細胞メ ディエータ−処１１１１ｃよるＡＩ、Ａデハイドクターゼ及びＰＢＧデアミナー ゼ活性の抑制は、メディエータ−を保温中、彼になって添加し九場合にも斯道的 に減少した（第１２図）。

これらの事実は、赤血球コミット細胞に観察されるような大食細胞に依存した細 胞成長及び分化の抑制型とは対照的に、ＡＬＡテハイドラターゼ及びＰＢＧデア ミナーゼ活性或いはプｐトボルフィリン及びヘム含量の最大増加を抑制するよう なき血球特性で衣わされる細胞は、大食細胞メディエータ−の抑制効果に対して 感性の程度が著しく小さいことを示している。

赤血球コ（ット細胞に及ぼすエンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−の抑制 効果がＭｅｚＳＯ−誘発分化に特有のものであるか否かを検査するため、我々は 、ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒボキサンチン或いはヘミンのいずれかと保温した細胞 に及ばず大食細胞メディエータ−の効果を検査した。われわれはエンドトキシン 刺激大食細胞メディエータ−が、ＨＭＢＡ、ブチル酸或いはヒポキサンチンと保 温した細胞の成長を著しく抑制するが、ヘミン処理細胞の成長については抑制効 果がないことを見出した（第１３図、パートＢ）。

この１＃奥は、エンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−の抑制作用が赤血球 フィツト細胞の成長に及ぼす効果と、Ｍ・２８０．ＨＭＢＡ、ブチル酸或いはヒ ボキサンチンによシ表わされる大抵の化学剤によシ誘発される赤血球分化に及Ｉ Ｘす効果とは同じであるが、しかしへンン処理によシ誘発される赤血球分化は性 質に％異性があシ、大食細胞メチイエ−ターの効果に対して感性をもたないこと を示唆している。実際、大食細胞メディエータ−のみ（３５％、第１０図）によ シ生ずるＭ　ｅ　２　Ｓ　Ｏ処理細胞の成長抑制は、へにン処理（第１３図）に よシ完全に凌駕エンドトキシン感性大食細胞メディエータ−の効果フレンド細胞 が一定速度で成長している間にその成長に及はす大食細胞メゾイエ−！−の効果 を調べるため、メディエータ−を含む或いは含まない新鮮な培地で細胞を２４時 間毎に稀釈し、細胞濃度を２　Ｘ　１０’細胞／−に減するようにした。

このような培誉条件のもとでは、細胞は一定速度で連続的な対数成長率を保持す る（チャン、シー、ニス、ほか、既述）。もとの未処理比較例培養体から生成さ れた細胞の全数は保温９６時間後８２Ｘ　１６’　ｍ胞／−であった（第１４図 ）。大食細胞メディエータ−の添加は細胞成長を著しく抑制した（〜７０Ｘ）。

培養体にＭｅｚＳＯを添加することによｊ）　４２　Ｘ　１０’ｍ胞／−となっ た。この減少はおそらくこれら細胞の末端鰺血球分化と関連する成長停止を反映 したものであろう（チャン　シー、ニス。

既述；口、ニス、シー０．アフト、アール、及びミ１−２−Ｉジー・シー、＋　 Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒ＠１．４１号、８１１４−８７０ページ、　１９８１年）ｏ　 Ｍｅ、８０と大食細胞メディエータ−を共に添加することによシ、これらの細胞 に対しもりとも大きな成長抑制効果（〜９０％）を生じた。メディエータ−のみ で処理した細胞におけるヘム含量は大した影響を受けなかりたが、メディエータ −とＭｓ、Ｓ。

Ｏ画方で処理した場合には、〜４ＧＮのへム住成抑制効果があった。

Ｋ１分　析 研究対象であるメディエータ−智質はマウスのフレンド−ビールス変換細胞の成 長及び赤血球分化を強く抑制するように見える。エンドトキシンにさらされない 培養体からの条件つき培地はいくらかの抑制効果を−っていた。しかしエンドト キシン刺激条件つき培地のフレンド細胞成長及び分化抑制に及ばず効果は著しく 大きいものである。エンドトキシンそれ自体は細胞成長にも分化にも伺ら影響を もたない。

更にメディエータ−の効果は赤血球グロジェニタ−（ｐｒｏｇ＠ｎ１ｔｏｒ）細 胞のある段階に特有のものであるように見える。即ち大食細胞メディエータ−は 、Ｍ・２ＳＯ，ＨＭＢＡ、ブチル酸或いはヒボキサンチン処理によシ誘発された 鰺血球コ（ット細胞の場合よルもコイットされない幹細胞の成長及び赤血球分化 に大きな抑制効果を及ぼしていた。細胞成長に及ぼす大食細胞メディエータ−の 抑制効果は、一定速度で対数的な成長曲線を示す細胞に対しての場合によｐ著し いものであった。フレンド細胞のへξン処理は、へ七グロビン化細胞の発現に導 く赤血球細胞成熟を引き起こすことが知られているが、この場合未分化幹＃１ｉ Ｂｊ！ｉ！の赤血球前駆細胞への変化を伴うものではない（グセ２．ジエー、エ フ９．グアイル、ニス、シー０．チアドグロン、ニー、ニス０．ボｐツホ。

グイ０．ノイｉン、ジェー、アール、及びホクスマン。

デ４−、１１？７６年、　Ｂｌｏｏｄ、　５６号、　４８１−４８７ページ）。

興味深いことは、エンドトキシン刺激大食細胞もまた、へきンの存在下にフレン ド細胞の成長及び分化に殆ど効果をもたないことである。

これらの結果は、エンドトキシン刺激大食細胞メディエータ−が、赤血球分化を 行うことを含む赤血球前駆細胞の成長及び分化に抑制効果を及はすことを示して いる。

一方、ＡＬＡデハイドラターゼ及びＰＢＧデアきナーゼの増大した活性、及びグ ロトボルフィリンとヘムの増大した含量のような赤血球細胞のもつ特性を十分に 示す細胞は、条件つき培地の抑制効果にもはや感性を示さない。

従りて、エンドトキシン刺激条件つき培地の作用は、赤血球前駆細胞のある初期 段階ではあるＳ度１％異性を示すが、十分に分化した赤血球細胞に対してはもは 中影譬を及ぼさなくなる。

我々はまたエンドトキシン刺激大食細胞条件つき培地からメゾイエ−！−を純化 すゐこと試みた。そして、高度に純化されたメディエータ−が、３Ｔ３細胞にお けるリボプロティンリパーゼ活性及びフレンド細胞の成長及び分化の両方に及は ず抑制効果を保持していることを知った。

この例で記載した大食細胞ファクターは、エンドトキセミアや、細網内皮組織の 活性が刺激されるようなガンリウマトイド関節炎などの慢性病的状態と関連する 貧血の病理論に、ある役割を果すと考えられる。ここに記載したフレンド細胞系 は、このような先体内メディエータ−の検知、及びメディエータ−の細胞内効果 の生化学的基礎を説明するために有用である。この検定系もまたこの７アクター の分離、及び侵入に対する応答として化量される他の免疫細胞７アクターとその 関係との同定に役立つ４０である。

２４６１０　２０ 蒔闇 １　４　１Ｌ　１：、ｌ？Ｌ＄障４理？＋２ｔａｉｎｔ！ｅ胞ａ−ｉｙ　４Ｆ− ）イ１つ６子も負Ｌ４ぐ、３Ｔ３−い４−吃の７七）Ｌコエンジ４Ａカル１代“ キンラーｅ”　ｌ＞”―陪蒙ンンテダー（ζ、２灸は°Ｊ“（ｂう巣第５Ｂ図 蒔閏 ｇＳＳ図 蒔　闇 第７　図 蒔閉 第８図 レーン 第８７　：　ｍ　Ｆ＠／ｌ：、−７１７’ｌ　１１７り　フ→ルａ＞　１ｓＳ’ Ｔろ　プ０チ４／令へ１っ臣＋ｇ”Ｉ　ｌもエーダーヵ　ｈ里１　３　５　７　 ９　１１　１’３ Ｖ−２９’Ｗ　五ＩＢ　ａｔ＋　４ｑ巧グン９　ンｔ−ｈ　’ｊ　ｈイ０　”＃ 　Ａ　／令＋％’、５灸ＩＪ〆／ろニーη−／ｌ動鼎 第１０図 第１２図 時開 第１３図 第１４図 手続補正書 昭和５８年　７月２日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 （特許庁審査官　殿） １、事件の表示 ＰＣＴ／１Ｊｓ８２１０１２１１ 、発明の名称 エンドトキシン誘発メディエータ−〈ショック検定）によるリボプロティンリパ ーゼの抑圧 ３、補正をする者 住　所　東京都文京区白山５丁目１４番７号５、補正命令の日付（自発補正） ７、補正の内容 ■明細癩及び請求の範囲翻訳文のタイプの浄書（内容に変更なし）を別紙の通り 提出する。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物ＫｓＰける同化酵素の状態を検定するためイ、＊乳動愉から大★細 胞の標本を桑め；ロ、＃記大食細胞〇一部を、哺乳動物にお妙る侵入事憩と関連 する刺激材料と共に保温（培養）シ；そしてハ、＃記大食細胞を前記メディエー ター物質の組成を誘発させるようにしたことを特徴とする方法。 ２、　前記メディエータ−物質が前記同化酵素活性を抑制することかで會ゐもの であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 駅　前記刺激材料がエンドトキシンを含むことを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。 ４、少くとも一種のメディエーメー瞼質の活性を制定することを特徴とすゐ哺乳 動物における侵入刺激の存在を検知する方法。 翫　請求の範囲第４項記載の方法であって、前記メディエータ−の測定を： イ、少くと４一種のメゾイエ−ター−質を、対応する数の既知侵入刺激から−製 し； ロ、前記メディエーター物質から対応する数の抗体をｗ４製し； ハ、！ＩＩＪ記既知メゾイエー！−物質及び前記抗体から辿けれた物質に検知可 能なラベリング処理を施し；二、前記既知メディエータ−及び前記対応する抗体 を、侵入が疑われている前記哺乳動物から得た生物学的標本と接触させ；そして ホ、前記疑わしいメディエータ−活性の存在Ｋｌｌする生成したマス（ＪｉＬ） を検査する；ことを含んで行うことを特徴とする方法。 ６、　メディエータ−物質の生産及び／もしくは活性を抑制する能力を苓する嫉 剤その他の試剤をスクリーニングするためＯ検定系であって、前記メディエータ −物質と共に保温される観察可能な細胞試験コロニーを含む系。 ７、　人体にお社るシ１ツク治療法であって、あるメディエータ−物質に対しシ 璽ツク緩和量の、特定の抗体を人体に投与することを４Ｉ黴とする方法。 ８、哺乳動物におけるシ璽ツクの発生を防止する方法であって： イ、前１ｉ１２Ｉｌｉ乳動愉における少くとも一種Ｏメディエーター物質の存在 及びシ璽ツク促進活性を検知し；そして、 ロ、前記シ冒ツクの発生を避けるために有効な量の、前記メディエータ−物質の 抗体を投与する；ことを特徴とする方法。 ９、哺乳動物の肥満症の治療方法であって、有効量のメディエータ−物質を投与 することを特徴とする方法。 １０、人間ＯＮ！！ｉｌｌ症治療のため薬剤組成物であって：イ、薬学的に有効 な量の前記メディエータ−１もしくはメディエータ−と一定の結合関係にある試 剤；及びロ、薬学的に有効な量の担体；とを含むことを特徴とすゐ組成物。 １１、血清或いは水性培地におけるメゾイエ−！−活性組成一の実証のための試 験キットであって：イ、メディエーター物質或いはその特定の結合ハードナーに 検知可能なラベルを直接的或いは間接的に付着させることによシ得られる所定量 の、少くとも一種のラベルを旅した免疫化学的に反応性のある成分；口、その他 の反応剤；及び ハ、＃記キットの使用のための指示。 １２　ラベルが酵素である請求の範囲第１１項記載の試験キット。 １ｍ、哺乳動物体のリポプロティンリパーゼ活性を減少させることの可能なメデ ィエータ−活性組成物であって、少くとも約４００ダルトンの分子量でゲルクロ マドグ２フイによシ腹膜滲出！ウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体から分 離することができ；水性培地中で加熱可能であシかつ溶解可能であシ；かつ高濃 度のインシュリンの存在下で活性を保持していることを特徴とする組成物。 １４、　−知可能なラベルを２ベリングした請求の範囲第１３項記載のメディエ ータ−組成物。 ｌ翫　前記２ベルが酵素である請求の範囲第１４項記載のメディエータ−組成物 。 １６、前記２ペルが、パーオキシダーゼ、−一グルクｐニダーゼ、β−Ｄ−グル コシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコ−ゼオキシダーゼ 　プラス　パーオキシダーゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パーオキシ ダーゼ及び酸７オス７アターゼからなる群よシ選ばれることを特徴とする請求の 範囲第１５項記載のメディエータ−組成物。 １７、前記ラベルは紫外線にさらされた時には蛍光を発する化学物質であること ｔ−％像とする請求の範囲第１４項記載のメディエータ−組成物。 １８、化学物質は、フルオレシャイン、ローダミン及ヒオー−）ｉンからなる群 より選ばれることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のメディエータ−組成物 。 １９、前記ラベルが放射性元素である請求の範囲第１４項記載のメディエータ− 組成物。 ２０、前記放射性元素が、１４Ｃ，１２５１，１８１１，５８ＳＡび３Ｈからな る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のメディエータ−組 成物。 ２１、侵入刺激をうけた哺乳動物の血清に存在するメディエータ−活性組成物抗 体であって、前記メディエータ−組成物は約３００，０００．７０，０００及び ４００乃至１　、０００ダル）ｙの分子量レベルでゲルクロマドグ２フィーによ ｐ腹膜滲出！ウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体から分離可能であり、前 記メディエータ−組成物は水性培地中で加熱可能かつ溶解性があシ、高濃度のイ ンシ。 リンの存在下に活性を保持していることを４Ｉ黴とするメディエータ−活性組成 −抗体。 ８２、、検知可能なラベルでラベリングされることを特徴とする請求の範囲第２ １項記載の抗体。 肘　前記ラベルが酵素であることを特徴とする請求の範８第２２項記載の抗体。 Ｕ、前記ラベルが、バーオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコ シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ　 プラス　パーオキシダーゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パーオキシダ ーゼ、及び酸７オメフアターゼからなる群よシ遺ばれることを特徴とする第２３ 項記載の抗体。 鳳　前記ラベルが、紫外線にさらされた時に線蛍光を発する化学物質であること を特徴とする請求の範囲第２１項記載の抗体。 ｓ６．１記化学−員がフルオレシャイン、ローダミン及びオー２インからなる群 よル選ばれることを特徴とする請求の範囲第２Ｓ項記載の抗体。 ２７、前記ラベルが放射性元素でおることを特徴とする請求の範囲第２１項記載 の抗体。 錦、前記放射性元素が、　Ｃ，Ｌ　Ｉ、Ｓｌ及び３Ｈからなる群から選ばれるこ とを特徴とする請求の範囲第２７項記載の抗体。 器、侵入刺激をうけた哺乳動物の血清に存在するメディエータ−活性組成物と反 応する抗体で′＃）０て、齢記メヂｌエーター組成物は約ａｏｏ　、　ｏｏｏ、 ７０　、０００及び４００乃至１　、　Ｇｏｏダルトンの分子量レベルでケルク ロマトグラフィーによｐ腹膜滲出！ウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体か ら分離可能な４のであシ、前記メディエータ−組成物は熱に不安定かつ水性培地 中で溶解性があｐ１高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持していることを 特徴とするメディエータ−活性組成物と反応する抗体。 ３０、検知可能なラベルでラベリング処理されている請求の範８第２９項記載の 抗体。 ３１、前記２ペルが酵素である請求の１／＆ｌ！ｌ第３０項記載の抗体。 ３Ｌ　前記ラベルが、パーオキシダーゼ、β−グルク四ユニダーゼβ−Ｄ−グル コシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ 　プラス　パーオキシダーゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パーオキシ ダーゼ、及び酸７オス７アターセカラなる群よル選ばれることを特徴とする請求 の範囲第３１項記載の抗体。 ３３、前記２ベルが、紫外縁にさらされた時には蛍光を発する化学物質であるこ とを特徴とする請求の範囲第３０項記載の抗体。 ３４、前記化学物質がフルオレシャイン、ローダミン及びオーラインからなる群 よシ選ばれることを特徴とする請求の範囲第３３項記載の抗体。 ３＆　前記ラベルが放射性元素であることを％像とする請求の範囲第３０項記載 の抗体。 ＄６．　Ｉｌｌ記放Ｊ’ｔｉ元嵩＃”Ｃ，１″６Ｉ、””Ｉ、”Ｓ　及び８Ｈか らなる群よシ選ばれることを特徴とする請求の範囲第３Ｂ項記載の抗体。 ３７、哺乳動物体におけるリボプロティンリパーゼ活性を減少させることのでき るメディエータ−活性組成物の存在を決定する方法であって；このような組成物 を保存していないことが疑わしい宿主の血清をあるメディエータ−活性組成−抗 体にさらして複合体を形成せしめて、その複合体の存在を検知することをふくん でなル；この際、前記メチイエ−ター組成物は約３００，０００．７０．Ｇｏ。 及び４００乃至１，０００ダルトンの分子量レベルでゲルクロマイブ２フイーに よシ腹膜滲出マウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体から分離可能なもので あシ、前記メディエータ−組成物は熱に不安定かつ水性培地中で溶解性があシ、 高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持し、ているものであることを特徴と する方法。 ３８、前記複合体の存在は、メディエータ−活性組成物抗体上に検知可能なラベ ルを用いることによシ検知することを特徴とする請求の範囲第３７項記載の方法 。 ３９、前記ラベルが酵素であることｔ特徴とする請求の範囲第３８項記載の方法 。 ４０、ＩＩＩ　記？　ベル力、パーオキシダーゼ、−一グルクロニダーゼ、β− Ｄ−グルコシダーゼ、ｐ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキ シダーゼ　プラス　パーオキシダーゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パ ーオキシダーゼ、及び酸７オスフアターゼからなる群よｐ選ばれることを特徴と する請求の範８第ｓ９項記載の方法。 ４１、前記２ペルが、紫外線にさらされた時には蛍光を発する化学物質であるこ とを特徴とする請求の範囲第８８項記載の方法。 ４２、前記化学物質がフルオレシャイン、ローダミン及びオーラミンからなる群 より選ばれることを特徴とする請求の範囲第４１項記載の方法。 ４Ｌ　前記ラベルが放射性元素であることを特徴とする請求の範囲第３８項記載 の方法。 ・　１４　１２５　１３１　３５ １、前記放射性元素か　Ｃ，Ｉ、Ｉ、　Ｓ及び３Ｈからなる群であることを特徴 とする請求の範囲第３８項記載の方法。 ４＆　前記複合体が、検知可能ガラベルをラベルされておシ前記メディエーター 活性組成物抗体と反応性を有するある抗体との反応により検知されるようにした ことを特徴とする請求の範囲第３７項記載の方法。 ４６、前記ラベルが酵素であることを４１１ｍとする請求の範囲第４５項記載の 方法。 ４７、前記ラベルが、パーオキシダーゼ、−一グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グル コシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ〆−ゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ 　プラス　パーオキシダーゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パーオキシ ダーゼ、及び酸７オス７テターセカラなゐ群よｐ選にれゐことを特徴とする請求 の範囲第４６項記載の方法。 ４８、前記ラベルが、紫外線にさらされた時には蛍光を発する化学物質であるこ とを特徴とする請求の範囲第４５項記載の方法。 ４９、前記化学物質がフルオレシャイン、ローダミン及びオーラミンかもなる群 より選ばれることを特徴とする請求の範囲路３８項記載の方法。 １４　１１５　１３１　３５ ５０、前記放射性元素が　Ｃ１工、■、Ｓ及び３Ｈからなる群よシ選ばれること を特徴とする請求の範囲第４５項記載の方法。 ５１、前記複合体の存在は、メディエータ−上に検知可能なラベルを用いること によシ検知することを特徴とする請求の範囲第４ｓ項記載の方法。 Ｓ２．、ＩＩｔＩ記ラベルが酵素であることを特徴とする請求の範囲第４５項記 載の方法。 ５３、前記ラベルが、パーオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グル コシダーゼ、β−Ｄ−ガンクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ 　プラス　バーオキシダー゛ゼ、ガラクト−ゼオキシダーゼ　プラス　パーオキ シダーゼ、及び酸フォスファターゼからなる群よシ選ばれることを特徴とする請 求の範囲第３０項記載の方法。 Ｓ４．＠記うベルが、紫外線にさらされるｔ１１光を発する化学物質であること を特徴とする請求の範囲第５１項記載の方法。 仏　前記化学物質がフルオレシャイン、ロンダイン及びオー２建ンからなる群よ ｐ選ばれることを特徴とする請求の範囲第４６項記載の方法。 ５６、前記ラベルが放射性元素であることを特徴とする請求の範囲第５１項記載 の方法。 −１４１１１３１３５ ５７、前記放射性元系が　Ｃ，Ｉ、工、Ｓ及び３Ｈからなる群よｐ辿ばれること を特徴とする請求の範囲第５１項記載の方法。 ６８、＠乳動物体におけるリボプロティンリパーゼ活性を減少させることのでき るメディエータ−活性組成物を有毒レベルまで保有する動物体の治療方法であっ て；治療体に対し、メディエータ−活性組成物を中和するために有効な量のメデ ィエータ−活性組成物抗体を投写することを含み；この際、前記組成物は約３０ ０，０００．７０゜０００、及び４００乃至１．Ｇｏｏダルトンの分子量レベル でゲルクロマトグラフィーにより腹膜滲出マウス細胞のエンドトキシン刺激細胞 培養体から分離可能なものであシ；また前記組成物は熱に不安定かつ水性培地中 で溶解性があｐ１高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持している奄のであ ることを４！微とすゐ方法。 ５９、哺乳動物体におけるリボプロティンリパーゼ活性を減少させることのでき るメディエータ−活性組成物の活性を抑制する薬剤の能力を試験すゐ方法であっ て：メデイエ−ター活性組成物を含有する成長培地中で８Ｔ３−ＬＩＭ胞を培養 し；試験に供する薬剤を添加し；次に培地のリボプロティンリパーゼ活性を試験 することをふくんでなシ；この除、前記メディエータ−活性組成物は約１０，０ ００．７０，０００、及び４００乃至１　、０００ダルトンの分子量レベルでゲ ルクロマトグラフィーにより腹膜滲出マウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養 体から分離可能なものであシ；まだ前記組成物は熱に不安定かつ水性培地中で溶 解性があ夛、高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持しているものであるこ とを特徴とする方法。 ６０、哺乳動物におけるリボプロティンリパーゼ活ｉを減少させることのできる メディエータ−活性組成物の存在を検知するために有用なキットであって；検知 可能なラベルをラベリングした少くとも一種のメディエータ−を含んでなシ；こ の際、前記メディエータ−活性組成物は約２１００．０００．７０，０００、及 び４００乃至１，０００ダルトンの分子量レベルでゲルクロマトグラフィーによ ｐ腹膜滲出マウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体から分離可能な庵のであ シ；また前記組成物は熱に不安定かつ水性培地中で溶解性がＴｏシ、高濃度のイ ンシュリンの存在下に活性を保持しているものでおることを４９黴とするキット 。 ６１、哺乳動物にお仕るリボプロティンリパーゼ活ｉｔ−減少させることのでき るメディエータ−活性組成物の存在を検知するために有用なキットであって；検 知可能なラベルを２ベリングした少くとも一種のメディエータ−活性組成物抗体 を含んでなｐ；この際、前記メディエータ−活性組成物は約３００，０００．７ ０，０００、及び４００乃至１，０００ダルトンの分子ｌレベルでゲルクロマト グツフィーによシ腹膜滲出マウス細胞のエンドトキシン刺激細胞培養体から分離 可能なものでおり；また前記組成物は熱に不安定かつ水性培地中で溶解性がめ９ 、高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持しているものであることを特徴と するキット。 ６２、哺乳動物におけるリボプロティンリパーゼ活性を減少させることのできる メディエータ−活性組成物の存在を検知するために有用なキットであって；少く とも一種のメディエータ−活性組成物抗体と、検知可能なラベルを２ベリングさ れておシ前記メディエーター活性組成物抗体と反応しうる第二抗体を含んでなシ ；この際、前記メディエータ−活性組成物は約ｚｏｏ、ｏｏｏ、７０，０００及 び４００乃至１，０００ダルトンの分子量レベルでゲルクロマトグラフィーによ ｃｍ腹膜滲出マウス細胞エンドトキシン刺激細胞培養体から分離可能なものであ υ；また前記組成物は熱に不安定かつ水性培地′中で溶解性があシ、蔓濃度のイ ンシュリンの存在下に活性を保持しているものであることを特徴とするキット。 ６３、哺乳動物体におけゐリボプロティンリパーゼ活性を減少させることができ 、エンドトキシン処理哺乳動峻血清から或いは腹膜滲出！ウス細胞の細胞培養体 から分離することので龜るメディエータ−でありて；このメディエータ−は熱に 不安定で、水性培地中で溶解性があシ、分子量が少くとも１１１．Ｇｏｏであｐ １高濃度のインシュリンの存在下に活性を保持しているものであることを特徴と するメディエータ−０ ６４、哺乳動物体におけるリポプロティンリパーゼ活性を減少させることができ るメチイエ−ター活性組成物でｈ−ｖて；前記組成物は、約３００　、０００． ７０，０００及び４００乃至１，０００ダルトンの分子量レベルでゲルクロマト グツフィーによルエンドトキシン刺激補乳類大食細胞から分離可能であシ、熱に 不安定かつ水性培地中で溶解性があ夛、高濃度のインシュリンの存在下に活性を 保持しているものであることを特徴とする組成物。