JPS58201711A - ユビデカレノン含有リポソ−ム被覆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はユビデカレノン含有リポソームおよび当該リポ
ソームの膜表面を被覆する多糖質相肪酸エステルよりな
る５ピデ力レノン含有リポソーム被覆体に関する。

ユビデカレノン、別名コエンザイムＱ　＋ｏは心機能の
改善に有効な医薬品として近年臨床上広く利用されるに
至ったものである。

しかしながら、この物質を静脈内投与あるいは経口投与
した場合における血液中から目標臓器への移行速度につ
いてはまだ改善されるべき余地が残され□ている。すな
わち２例えば当該物質を従来技術に基づいて製剤化して
投与した場合、血液中からの消失速度はかなり小さく、
目標臓器への移行速度および移行量も小さい。

そもそも当該物質は、４８〜５２℃の融点を有する常温
で固体状の脂溶性物質であるから、静脈内投与に便なら
しめるために界面活性剤２例えばＨＣＯ（ポリオキシエ
チレン硬化ヒマシ油）を使用するごとき従来技術によっ
て当該物質を可溶化しなければならない。しか′しなが
う、かくのごとく可溶化して投与した場合には、後記実
験例において示されるごとくユピデカレノ／の血液中か
らの消失速度は小さく、またユビデカレノンの目標臓器
である心臓、牌臓、肝臓、特に心臓への初期移行速度も
小さい、 かかる事情にかんがみ、先に本発明者は血液中から所定
の目標臓器への移行を上昇せしめる上で有効なユビデカ
レノン含有組成物について種々検討しその結果ユビデカ
レノンをリポソーム中に含有せしめることによって所期
の解決手段力上提供されることを知り、当該知見に基づ
〈発明を特願昭５６−１０５６８９に係るものとして特
許出願した。

すなわち、投与後における血液中からの消失速度および
所定時間内における臓器移行積な求めると、ユビデカレ
ノン含有リポソームを投与した場合には、従来技術に係
る可溶化液の投与の場合に比較して、血液中からの消失
速度がいちぢるしく大ぎく、また肺、腎を除く諸臓器に
おいて高い移行量を示すのである。

的を達成するための一つの手段としてリポソームを利用
する技術が重要視されるに至っていることは周知のとお
りである。すなわち、リポソームは臓器毎にそれぞれ固
有のリポソームとして存在しているという点に着目し、
所定の薬物を所定のリポソームに含有せしめて投与する
ことにより、薬物を目標臓器に選択的かつ集中的に連撮
せしめようと意図する技術が開発されつつあるのである
。

かかる発明として例えば特開昭５２−１４３２１８゜特
開昭５２−１５１７１８．特開昭５３−１３３６１６．
特公昭５５−＝８４８８における発明を挙げることがで
きる。

いずれもリポソームを担体として、これに特定の生体成
分あるいは医薬成分を保持させる技術に関する神明であ
り、いずれこれらの技術は医学薬学における他の生体成
分、医薬成分にまで応用されるものと予想される。

特願昭５６−１０５６８９に係る発明はリポソームを臓
器指向の目的で使用するものであり、そのこと自体はす
でに公知であるが、リポソーム技術を９にユビデカレノ
ンに応用し、新規なユビデカレノン含有リポソームを収
得し、それによってユビデカレノンにおける前記の基本
的問題を解決し。

ユビデカレノンの利用価値ないちぢるしく高めることに
成功した。

さて８本発明者はリポソーム自体の理化学性状により臓
器指向が異なることに着目し、引続き。

ユビデカレノンを特に肺、腎に対して選択的に臓器指向
させるための方法について検討をおこなった。その結果
、ユビデカレノン含有リポソームを多糖質脂肪酸エステ
ルによって被覆せしめ、ユビデカレノン含有リポソーム
被覆体とすることによって所期の目的が達成されること
を知り２本発明を完成した。すなわち本発明の目的は血
液中から肺、ｗ等の目標臓器へのユビデカレノンの移行
を速やかならしめるためのユビデカレノン含有リポソー
ム被覆体を提供することである。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に係るリポソームにおいてユビデカレノンは、リ
ポソームを構成する膜の中に含まれる。

リポソーム膜を構成する基本物質は主としてリン脂質お
よびステロールであり、ユビデカレノンはこれらと共存
して、膜の中に均一に分散している。

本発明において使用されるリン脂質としては２例えばホ
ス７アチヂルコリン、ホスファチデルエタノールアミン
、ホスファチデルセリン、スフインゴミエリン、ジセチ
ルリン酸、ステアリルアミン。

ホスファチデルグリセロール、ホス７アチヂン酸。

ホスファチデルイノシトール、およびこれらの混合物を
あげることができるが、特にこれらに限定されない、１
ステロールとしてはコレステロールがもっとも好ましい
。

ユビデカレノン、リン脂質、ステロールの組成比につい
ては、ユビデカレノン１モル比に対してリン脂質は１０
モル比以上、ステロールは１モル比以上あれば十分であ
り２例えばユビデカレノン１モル比に対して、リン脂質
として卵黄ホスファチデルコリンを使用する場合には１
０〜３０モル比またステロールとしてコレステロールを
使用する場合には１〜１０モル比が好ましい使用範囲で
ある。

ユビデカレノン１モル比に対するリン脂質とコレステロ
ールの好ましいモル組成比の例を示せば以下１〜７のご
とくである。

ＰＣ：ホスファチデルセリン ＤＣＰ　：　ジセチルリン酸 ＰＳ　、ホスファチデルセリン ＳＡ　：ステアリルアミン 本発明に係るリポソームは、電子顕微鏡的には０．１〜
５．０μ程度の粒経をもつ球体である。凍結乾燥物は凝
集して外観上はブロック状を呈しているが、水または塩
類溶液に投入するとよく分散し。

均質な溶液を与える。。

次に本発明に係るリポソームは、リポソームの製造に関
する従来技術を準用して製造することができる。

例えば、リポソームの膜構成成分とユビデカレノンをナ
スフラスコにとり、クロロホルムを加工て一旦溶解し２
次に溶媒溜去し、生成膜をガラスピーズおよび適当な緩
衝液−を加えて剥離し、超音波処理後セファデックスあ
るいはセファローズカラムに通して、リボンーム分側を
集め溶媒除去すればよい。溶媒除去には例えば凍結乾燥
処理を適用することができる。

凍結乾燥処理は２．０Ｔｏｒｒ以下で３時間以上おこな
えば、所定の目的が達成され、リポソームを粉末状にと
り出すことができるが２本発明はこの条件に限定される
ものではない。望ましい条件としては、後記実施例に示
されるごとく２例えば０．３Ｔｏｒｒで５時間凍結乾燥
処理する方法が選ばれる。

次に本発明に係る多糖質脂肪酸エステルにおいて多糖質
とは分子量が４万以上のポリサッカライドを言い、具体
的にはデキストラン、アミロペクチン、プルラン、が好
ましく、その他にデキストラン硫酸、キト酸、プルラン
硫酸等がある。本発明において多糖質は分子量の異なる
二種類以上のものの組合わせあるいはアミロペクチンと
デキストランの組合わせのごとく複数の多糖質を合わせ
て使用してもよい。

また本発明に係る多糖質脂肪酸エステルにおける脂肪酸
はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリ
ン酸であり、特に好ましいのはパルミチン酸である。本
発明に係る多糖質脂肪酸エステルをもってリポソームを
被覆した場合に、脂肪酸のアルキル鎖はリポソームの脂
質層に楔形に配向することが推定される。従って上記脂
肪酸が特に好ましいとされるのは、そのアルキル鎖の長
さがリボンーム脂質層への楔形配向にとって適当なもの
であるためであると考えられる。

次に多糖質脂肪酸エステルの製造は、概略以下のごとく
おこなうことができる。まず、多糖質を無水ジメチルホ
ルムアミドに６０〜７０℃で加温溶解スる。無水ピリジ
ンと無水ジメチルホルムアミドに脂肪酸塩化物をあらか
じめ溶解したものを加え、６０〜７０℃で数時間、続い
て室温で２４時間攪拌する。反応終了後２反応混合物に
エタノールを加えると白色沈殿が析出するので、これを
Ｐ取し、エタノールで洗浄し、さらにエーテルに分散し
て再びｆ取する。減圧乾燥し、所定のエステルを得る。

ここに得られるエステルは、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ法
）、Ｈ’−ＮＭＲスペクトル（溶媒ｄ６−ＤＭ８０．内
部標準ＴＭ８　）によって特定することがてきるが、さ
らに脂肪酸置換度を求めることができる。

脂肪酸置換度とは糖単位１００個に対する脂肪酸の導入
個数を言い、これは以下のようにｕｌ−ＮＭＲによって
測定される。例えばバルミトイル基が導入されている場
合、その導入量はＨ’　−ＮＭＲスペクトルにおいて０
．９　ｐｐｍおよび１．２８ｐｐｍに現われるバルミト
イル基のプロトンのピーク面積と３．５〜５．２ｐｐｍ
に現われる糖中のプロトンのピーク面積との比によって
与えられる。すなわち糖単位１００個中に１個のバルミ
トイル基が置換されている場合には、糖のプロトン数は
９　ｘ＋１０（１００・−Ｘ）であり、またバルミトイ
ル基のプロトン数は３１ｘである。従ってＨ’　−Ｎ　
Ｍ　Ｒスペクトルの積分曲線から求められる糖のプロト
ン数をｙ、またバルミトイル基のプロトン数を２とする
と。

１．０００　ｚ である。かくのごとくして求められる置換度を本発明に
おいて使用されるエステルについて測定してみると、置
換度は低い方が好ましい結果を与えることが判明し１例
えば０．５〜５程度で十分である。

また２本発明に係るエステルをリポソームに被覆させる
Ｋは、リポソームが形成している水溶液にエステル含有
水溶液を加えて攪拌すればよい。

被覆に当たっては単一のエステルを被覆すればよいが、
２種以上の本発明に係るエステルを組合わせ、いわゆる
複合エステルとして被覆してもよい。

本発明ユビデカレノン倉有リポソーム被覆体の効果を以
下に記載する実験例をもって説明する。

実験例１ 試料 実施例１乃至実施例３記載においてＣｏＱｔａの代わり
に”ＣＣｏＱｔｎを使用した点を除いて実施例１乃至実
施例３と同様の方法によって下記ａ　−ｄの検体試料を
用意した。

ａ、　　１℃−ＣＯＱＩＯ含有リポソーすｂ、　　”Ｃ
ＣＯＱ＋ａ含有リボンーす被覆体、ただし被覆エステル
はＯ−パルミトイルアミルペクチン（分子量１１２，０
００．脂肪酸置換度４９）Ｃ，”ＣＣｏＱｍ含有リボン
すム被覆体、ただし被覆エステルは０−バルミトイルプ
ルラン（分子量ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、脂肪酸置換度３．
４）ｄ、　　′４Ｃ−ＣｏＱ１６含有リポソーム被覆体
、ただし被覆エステルは０−バルミトイルプルラン（分
子量２３０，０００．脂肪酸置換度１．０）またｇ　”
ＣＣｏＱｍＫ　４倍量のＨＣＯ−６０を加えて超音波処
理して可溶化し、生理食塩液を加えて０．６１１１／ｄ
ｌに調整したものを試料ｅとして用意し対照試料とした
。なお、　１４Ｃ−ＣｏＱｍは下記式によって示される
放射ラベル化ユビデカレノンである１゜また、この比放
射能は４８μＣ１／９であり、放射化学的には２種類の
展開溶媒（クロロホルム／ベンゼン＝　１／１．酢酸／
ベンゼン＝　１／９　）を用いた薄層クロマトグラフィ
ーで単一であった。

方法 動物実験 雄性モルモット（体重３００〜３５０＃）の左大腿部静
脈に検体試料０．６＃”Ｃ−ＣｏＱｔｏ／ｋｌ？を注入
し縫合した。また同じ投与量の対照試料を、同様の方法
で投与した。その後は１モルモットを飼育ケージに放置
し、所定時間経過ごとに、耳静脈から採血した。採取し
た血液中の１４Ｃ（：　ｏ　Ｑｔ。濃度を以下に記載す
る方法で測定した。

血液中放射能の測定 耳静脈より２０μｌまたは５０μｌの血液を採取し０．
７５ｍｌの８ｏ１ｕｅｎｅ３５０／イソプロピルアルコ
ール（１／１　）で可溶化し、数滴の過酸化水素水を加
え脱色後、　　ｉｎｓｔａｇｅｌｌｏ、５ＮＨ（Ｊ（９
／１）５繊加え。

液体シンチレーショ／・カウンターを用い放射能を測定
した。

結果 検体試料または対照試料を投与した場合の＋４Ｃ−（ｏ
Ｑ＋。の血雇中放射濃度の経時推移を示すグラフを図１
に示す。

はそれぞれ試料ａ、試料す、試料ｅ、試料ｄ、および試
料・、を投与した場合の推移（２例の平均値）を示す。

図１に示されるように、リポソーム中に含有されること
によってユビデカレノンが血中から速やかに消失して臓
器移行する事実は特願昭５６−１０５６８９に係る発明
においてすでに知られた現象であるが、この現象は、リ
ポソームの膜表面を多糖質脂肪酸エステルによって被覆
した場合においても失なわれることはなく、むしろある
場合には被覆によって血中消失速度がかえって促進され
ることが認められる。

実験例２ 試料 実験例１試料の項の記載と同じ検体試料および対照試料
を用いた。

方法 動物実験 雄性モルモット（体１重３００ｇ〜３５０．９）７）左
大腿部静脈に、前記試料をそれぞれ０．６１Ｖ′ｋｇ注
入し縫合した。その後は、飼育ケージに放置し、投与後
２４時間経過後に断頓と殺し、各臓器を摘出し？＝なお
、脳および心臓への血液の汚染を除去する目的で、生理
食塩水を左心室から頚静脈にかけて環流し、脱血後、脳
および心臓を摘出した。

組織内放射能の測定 臓器的１００１ｎ９４０．５＋ＦＬ／の５ｏｌｕｅｎｅ
　３５０に加え。

５０℃２時間のインキ−ベートで組織を溶解後□６ｄの
ｉｎａｔａｇｅｌｌｏ、５Ｎ　ＨＣＩ　（９／１　）を
加え、液体シンチレーション・カウンターを用い放射能
を測定した。

結果 検体試料中の’Ｃ−ＣｏＱ、（１および対照試料中の”
Ｃ−ＣｏＱ、ｏをそれぞれ静脈内に注入後２４時間にお
ける主要臓器中の放射能濃度なＣＯＱ＋ｏ換算量で表わ
し両者の臓器移行性を比較したのが図２乃至図４である
。

図２乃至図４の説明 ロー＋・［ｌ・−・および口・の 各カラムは試料ａ、試料す、試料Ｃ０試料ｄ、および試
料ｅ、をそれぞれ投与した場合の臓器移行量を示す。

図２乃至図４より示されるように、リポソーム中に含有
されることによってユビデカレノンが脳、心。

肝、ｐｓ、副腎へ速やかにかつ高濃度に分布する事実は
特願昭５６−１０５６８９　に係る発明においてすでに
知られた現象であるが、リポソームの膜表面をさらに多
糖質脂肪酸エステルによって被覆した場合においては、
肺、牌、腎の各臓器に高濃度に分布するようになること
が認められる。すなわち、肺。

牌、腎への移行について比較してみると、試料社に対し
て試料Ｃではそれぞれ１．８倍、４．７倍、１．６倍と
高濃度に分布しており、また試料ｄでは同じ＜３．８倍
、５．４倍、１．４倍と高濃度に分布しており。

さらに試料すでは６２．５倍、８．８倍、１．４倍とい
ちぢるしく高濃度に分布しているのが判明する。これに
反し、その他の臓器への移行について比較してみると、
試料す、ｃ、ｄは試料ａと同等もしくは減少しているの
が判明する。従って本発明被覆体は肺。

牌、腎へより選択的にユビデカレノンを移行せしめるこ
とを可能にするものであることが知られる。

以下に記載する実施例をもって本発明を具体的に説明す
る。

実施例１ 卵黄ホスファチデルコリン３６■（４，５Ｘ　１０−’
ｍｏｌ）コレステロール５．８５■（１，５Ｘ　１０　
ｍｏｌ）およびユビデカレノンすなわちＣｏＱ、。２．
１５１ｎ９（２，５Ｘ　１０−’ｍｏｌ）を２ｒａｔの
クロロホルムに溶解し、ロータリー・エバポレーターを
用い減圧下でクロロホルムを除去した。

得られた薄膜を減圧デシケータ−で−夜乾燥し。

クロロホルムを完全に除去した。底に残った薄膜に３．
０ＩＩｌＪずつ２回計６．０ｍｌの緩衝液Ａおよびグラ
スビーズ１個を加えて、膜が完全にはがれるまでポルテ
ックス・ミキサーで振った。

次に、この溶液を枝付き試験管に移し、アルゴン気流下
水浴中でプローブ型ンニケーターを用い。

３０秒ごと断続的に５３分間、４２Ｗで超音波処理を行
うと、半透明なうす黄色の溶液が得られた。

この溶液を５ｅｐｈａｒｏａｅ　４　Ｂカラム（１，６
Ｘ４５ｃｒＩＬ）に移し、緩衝液Ａで溶出し、１．８−
ずつ６０本の試験管に分取し試料を採取した。このカラ
ムの排除体積付近より少し遅れて溶出して来たものを０
０３μｍのボア・サイズを有するポリカーボネート製メ
ンブレンを用いて最終体積２．３ｍ／　（Ｃ０ＱＩＱと
して１．３７１１１１ｉＪ含有）まで濃縮した。得られ
たリポソームの直径は電顕観察により２５〜３０ｎｍで
あった。なお、緩衝液Ａとは、　　０．ＩＭ　ＮａＣＪ
？を含む０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）である
。

次に０−バルミトイルアミロペクチン（分子量１１２．
０００．脂肪酸置換度４．９　）　３０■を緩衝液Ａ１
．０ｄ中に分散した溶液０．２ｍｌと前記のごとくにし
て得られたリボンーム濃縮液０．７−とを混合し。

室温で３０分間攪拌し、ユビデカレノン含有リポソーム
被覆体（Ｃ０ＱＩ。とじて０．４２１１９）を得た。

実施例２ 実施例１記載において、０−バルミトイルアミロペクチ
ン（分子量１１２，０００．脂肪酸置換度４９）の代わ
りにＯ−バルミトイルプルラン（分子量５０．０００　
、　　脂肪酸置換度３．４）を使用した点を除いて実施
例１と同様におこない、ユビデカレノン含有リポソーム
被覆体（ＣｏＱ＋ｏとして０．４２Ｍ９）を得た。

実施例３ 実施例１記載において、Ｏ−バルミトイルアミロペクチ
ン（分子量１１２，０００　、脂肪酸置換度４，９）の
代わりに０−バルミトイルプルラン（分子量２３０．０
００　、脂肪酸置換度１．０）を使用した点を除いて実
施例１と同様におこない、ユビデカレノン含有リポソー
ム被覆体（Ｃ０ＱＩ。とじて０．４２　■）を得ｔム実
施例４ 卵黄ホスファチデルコリン６０．０■（３モル比）。

コレステロール９．８ダ（１モル比）、ユビデカレノン
６．５９（０，３モル比）を２００ｄのナス型フラスコ
にとり、クロロホルム４ＩＩｌ／を加えて溶解し、溶媒
を減圧溜去する。生理食塩水４１とグラスビーズな加え
、ポルテックスミキサーを用いて拡散させる。得られる
多重層膜を桟付試験管に移し、窒素ガス雰囲気下、水浴
中で超音波処理（２５’ｋｗ、１５分）を行う。次にセ
ファデックスＧ−５０カラムに負荷し、生理食塩水を溶
出液として溶出せしめ、リポソーム公開を集め、３０ｄ
に希釈する。これを凍結乾燥処理（０，３Ｔｏｒｒ、　
５時間）、するとリポソームが得られる。

ここに得られるリポソームを、０−バルミトイルアミロ
ペクチン（分子量１１２，０００．脂肪酸置換度４，９
）の水分散液１０ＩＩＬｌに加え、室温で３０分間攪拌
し、再び凍結乾燥してユビデカレノン含有リポソーム被
覆体を得る。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１．結果の項に記載の図１に相当する図面
であり、ユビデカレノンの血液中消失速度を示す。 図２乃至図４は実施例２．結果の項に記載の図２乃至図
４に相当する図面であり、ユビデカレノンの各臓器への
移行分布を示す。 特許出願人 工−ザイ株式会社 図　　　２ − 珊 図　　　３ 唾 雪 置 図　　　４ ７ 試料　　　　試料 試料 ７４−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ユビデカレノン含有リポソームおよび当該リ
   ポソームの膜表面を被覆する多糖質相肪酸エステルより
   なるユビデカレノン含有リポソーム被覆体 （２）　　リポソームの膜がリン脂質およびステロール
   より構成される膜である特許請求の範囲第１項記載のユ
   ビデカレノン含有リポソーム被覆体（３）　　リン脂質
   がホスファチデルコリン、ホスファチデルエタノールア
   ミン、ホスフナチヂルセリン、スフィンゴミエリン、ジ
   セチルリン酸、ステアリルアミン、ホス７アチヂルグリ
   セロール、ホスファチヂン酸、ホスファチデルイノシト
   ール。 およびこれらの混合物である特許請求の範囲第２項記載
   のユビデカレノン含有リポソーム被覆体（４）　　ステ
   ロールがコレステロールテアル％　許請求の範囲第２項
   または第３項記載のユビデカレノン含有リポソーム被覆
   体 （５）　　ユビデカレノン１モル比に対してリン脂質が
   １０モル比以上、ステロールが１モル比以上である特許
   請求の範囲第２項乃至第４項記載のユビデカレノン含有
   リポソーム被覆体 （６）多糖質相肪酸エステルが、アミロペクチン。 プルラン、デキストランのいづれかの多糖質とパルきチ
   ン酸とのエステルである特許請求の範囲第１項乃至第５
   項記載のユビデカレノン含有リポソーム被覆体