JPS58183092A - 枝切り酵素 - Google Patents
枝切り酵素Info
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- JPS58183092A JPS58183092A JP57183022A JP18302282A JPS58183092A JP S58183092 A JPS58183092 A JP S58183092A JP 57183022 A JP57183022 A JP 57183022A JP 18302282 A JP18302282 A JP 18302282A JP S58183092 A JPS58183092 A JP S58183092A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、澱粉をＩＩ類に酵素変換する酵素の分野に属
する。詳述すれば、本発８Ａｈアミロペクチン及びプル
ランにおけるアルファー１．６−グリコシド結合を加水
分解しうる新規板切シ酵累に関する。この新規酵素はプ
ルラナーゼ型の板切シ酵素として分類することができる
。本発明は更に新規板切シ酵素の製造方法及び澱粉をデ
キストロース及び／またはマルトースを含む澱粉加水分
解生成物、Ｎ、ｊばｆキストロース及ヒマルトースシロ
、ｆに変換するための該＃木の用途に関する。
する。詳述すれば、本発８Ａｈアミロペクチン及びプル
ランにおけるアルファー１．６−グリコシド結合を加水
分解しうる新規板切シ酵累に関する。この新規酵素はプ
ルラナーゼ型の板切シ酵素として分類することができる
。本発明は更に新規板切シ酵素の製造方法及び澱粉をデ
キストロース及び／またはマルトースを含む澱粉加水分
解生成物、Ｎ、ｊばｆキストロース及ヒマルトースシロ
、ｆに変換するための該＃木の用途に関する。
過去１０年の間に、澱粉をシロ、プに変える全酵素加水
分解は澱粉処理工業に広く、常に増加して受容されてき
た。世界的には、澱粉からデキストロースシロ、グの酵
素による生産鉱、１０都前の約４０万トンに比べて現在
では１年当＃）３００万トン（乾物として計算）を越え
ると思われる。
分解は澱粉処理工業に広く、常に増加して受容されてき
た。世界的には、澱粉からデキストロースシロ、グの酵
素による生産鉱、１０都前の約４０万トンに比べて現在
では１年当＃）３００万トン（乾物として計算）を越え
ると思われる。
澱粉の酵素−酵素加水分解に一般に採用される方法は、
液化及び糖化の連続工程を含み、液化工程はアルファー
アミラーゼ、例えば熱安定性バチルス・リヘニフォルミ
ス（ｉｌ、１１ｃｈ＠ｎｉｆ＠ｒｍｉｓ）アルファーア
ミラーゼ、例えばアンマークのノグオ・インダストリイ
社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒＩ Ａｌ１）によって供給
されたターマミル（ＴＥＲＭＡｌｆｆＬ） ＠ Ｋよっ
て接触サレ、デキストロース（Ｄ−グルコース）への糖
化は前記の会社からも得られるＡＭＣ−１５０Ｌのよう
な、通常、菌に白米するグルコアミラーゼの存在で行な
われる。デキストロースシロ、グ製造者が、酵素及びエ
ネルギーの消費量をできるだけ少なくしながら出来るだ
け高いデキストロース収率を得ることを０指しているこ
とは明らかである。
液化及び糖化の連続工程を含み、液化工程はアルファー
アミラーゼ、例えば熱安定性バチルス・リヘニフォルミ
ス（ｉｌ、１１ｃｈ＠ｎｉｆ＠ｒｍｉｓ）アルファーア
ミラーゼ、例えばアンマークのノグオ・インダストリイ
社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒＩ Ａｌ１）によって供給
されたターマミル（ＴＥＲＭＡｌｆｆＬ） ＠ Ｋよっ
て接触サレ、デキストロース（Ｄ−グルコース）への糖
化は前記の会社からも得られるＡＭＣ−１５０Ｌのよう
な、通常、菌に白米するグルコアミラーゼの存在で行な
われる。デキストロースシロ、グ製造者が、酵素及びエ
ネルギーの消費量をできるだけ少なくしながら出来るだ
け高いデキストロース収率を得ることを０指しているこ
とは明らかである。
３０〜４ＯＳ（重量）の澱粉懸濁液を用いて出発し、３
０％の乾物（Ｄ、Ｓ、）で糖化する従来法により得られ
る最高Ｏｆ′キスドロースレベルは約９６％（重量）Ｏ
ｆ＋スト０−ス（９６ＤＸ）テある。従来の澱粉変換法
がその限度をほとんど越えない理由は本質的に２つある
。
０％の乾物（Ｄ、Ｓ、）で糖化する従来法により得られ
る最高Ｏｆ′キスドロースレベルは約９６％（重量）Ｏ
ｆ＋スト０−ス（９６ＤＸ）テある。従来の澱粉変換法
がその限度をほとんど越えない理由は本質的に２つある
。
第一に１アミロペクチン（トウモロコシ澱粉を含めて、
多くの工業的に重量な澱粉の約８０％を構成する）は、
相当数のアルファー１，６−グリコシド結合を含む点で
分枝鎖構造を示す。アルファーアミラーゼは実際にアル
ファー１，６−ゲルコジメーゼ活性を有しないので、ア
ミロペクチンはアルファーアミラーゼによって部分的に
しか分解されないので、アルファー１．６−グリコシド
結合をも加水分解するグルコアミラーゼによって触媒さ
れるその後の糖化工１において、アルファー制限デキス
トリンを含めて分枝オリが糖の実質的加水分解が起る。
多くの工業的に重量な澱粉の約８０％を構成する）は、
相当数のアルファー１，６−グリコシド結合を含む点で
分枝鎖構造を示す。アルファーアミラーゼは実際にアル
ファー１，６−ゲルコジメーゼ活性を有しないので、ア
ミロペクチンはアルファーアミラーゼによって部分的に
しか分解されないので、アルファー１．６−グリコシド
結合をも加水分解するグルコアミラーゼによって触媒さ
れるその後の糖化工１において、アルファー制限デキス
トリンを含めて分枝オリが糖の実質的加水分解が起る。
しかしながら、糖化反応はアルファー１，４−結合の対
応する加水分解よシ著しく低い速度で進行し、これによ
シ完全な糖化が妨げられる。それより多くのグルコアミ
ラーゼを添加することによって状況を解決する試み社第
二の障害（より高い酵素費を要することを別として）、
即ちデキストロース重合（いわゆる逆反応）を触媒する
グルコアミラーゼの能力と衝突する。
応する加水分解よシ著しく低い速度で進行し、これによ
シ完全な糖化が妨げられる。それより多くのグルコアミ
ラーゼを添加することによって状況を解決する試み社第
二の障害（より高い酵素費を要することを別として）、
即ちデキストロース重合（いわゆる逆反応）を触媒する
グルコアミラーゼの能力と衝突する。
ちなみに、澱粉の変換を約９６ＤＸから約９８ ＤＩに
増加すると（これはデキストランのある用途には著しい
改良とみなされる）、非デキストロース狭雑物の含有率
が約５０％だけ減少するが、このような澱粉の変換は、
基質を約１５％Ｄ、８．に希釈すると共に、比較的高レ
ベルのグルコアミラーゼを使用することによって達成す
ることができる（米国特許第４０１７３６３号明細書参
照）、シかしこのようなデキストロース溶液を後に一層
高い常用の乾物レベルに濃縮するには、エネルギーを消
費する。
増加すると（これはデキストランのある用途には著しい
改良とみなされる）、非デキストロース狭雑物の含有率
が約５０％だけ減少するが、このような澱粉の変換は、
基質を約１５％Ｄ、８．に希釈すると共に、比較的高レ
ベルのグルコアミラーゼを使用することによって達成す
ることができる（米国特許第４０１７３６３号明細書参
照）、シかしこのようなデキストロース溶液を後に一層
高い常用の乾物レベルに濃縮するには、エネルギーを消
費する。
先行文献は、デキストロ−スレベルを着しく増加するた
めグルコアミラーゼ及び板切シ酵素を同時に使用するこ
とを示咬しておシ、板切シｗＩ嵩が分枝鎖オリプ糖中に
存在する特殊なアルファ＝１．６−グリコシド結晶及び
一定のアルファー制限デキストリンを有効に加水分解す
ることが判ったことを根拠にしている。この点について
、米国特許１ｇ３８９７３０５号明細書はグルコアミナ
ーゼ及びエアロバクター・エアログネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔ＠ｒ＠＠ｒａｇ＠１１＠ｌ） （クレプシーラーニ
ューモニアエ（Ｋ１＊ｂｓｉｅｌｌａ ｐｍ＠ａｍｏｎ
ｌａ＊））ゾルラナーゼを併用し、それによシ少なくと
も３０％の乾物を含むシロップに関して２％までのＤＸ
の顕著な増加を達成しうろことを開示している。グルコ
アミラーゼ及び別の板切シ＃票、即ち英国特許出願第８
１０７２８７号明細書に記載されているシュードモナス
・アミロ５ｐラモーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａａｍｙ
ｌ＠ｄ＠ｒａｍｏｓａ）イソアミラーゼの作用を合せて
も同様の結果が証明された。
めグルコアミラーゼ及び板切シ酵素を同時に使用するこ
とを示咬しておシ、板切シｗＩ嵩が分枝鎖オリプ糖中に
存在する特殊なアルファ＝１．６−グリコシド結晶及び
一定のアルファー制限デキストリンを有効に加水分解す
ることが判ったことを根拠にしている。この点について
、米国特許１ｇ３８９７３０５号明細書はグルコアミナ
ーゼ及びエアロバクター・エアログネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔ＠ｒ＠＠ｒａｇ＠１１＠ｌ） （クレプシーラーニ
ューモニアエ（Ｋ１＊ｂｓｉｅｌｌａ ｐｍ＠ａｍｏｎ
ｌａ＊））ゾルラナーゼを併用し、それによシ少なくと
も３０％の乾物を含むシロップに関して２％までのＤＸ
の顕著な増加を達成しうろことを開示している。グルコ
アミラーゼ及び別の板切シ＃票、即ち英国特許出願第８
１０７２８７号明細書に記載されているシュードモナス
・アミロ５ｐラモーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａａｍｙ
ｌ＠ｄ＠ｒａｍｏｓａ）イソアミラーゼの作用を合せて
も同様の結果が証明された。
しかし第一の例では、クレプシーラ・ニエーモニアエの
ゾルラナーゼの一最適範囲によシ糖化を比較的高いｐＨ
（５，５〜６）で行なうことを余儀なくされ、この−で
紘グルコアミラーゼの活性は急激に減少するので、グル
コアミラーゼは実際には節約されない。
ゾルラナーゼの一最適範囲によシ糖化を比較的高いｐＨ
（５，５〜６）で行なうことを余儀なくされ、この−で
紘グルコアミラーゼの活性は急激に減少するので、グル
コアミラーゼは実際には節約されない。
同じ問題は、グルコアミラーゼの最適Ｐ）（Ｋ著しく接
近した最適−を有するイソアミラーゼを用いる場合には
起らず、従ってグルコアンラーゼの用量を実質的に減少
（約５０％だけ）することができ、同時に１〜２−のＤ
Ｉ値の増加を達成しうる。
近した最適−を有するイソアミラーゼを用いる場合には
起らず、従ってグルコアンラーゼの用量を実質的に減少
（約５０％だけ）することができ、同時に１〜２−のＤ
Ｉ値の増加を達成しうる。
しかしながらイソアミラーゼ法（及び現実に社公知のプ
ルラナーゼ法にもある）の重大な欠点は文献に公知の板
切シ酵素が熱に不安定なことである。
ルラナーゼ法にもある）の重大な欠点は文献に公知の板
切シ酵素が熱に不安定なことである。
このことは、従来校切シ酵素の存在での糖化が約５５℃
以上では工業的に行なわれず、グルコアミラーゼ自体が
６０℃でさえ適切に安定であシ、この温度水準で基質の
微生物汚染の危険がそれより低い温度と比べて着しく減
少することを意味する。
以上では工業的に行なわれず、グルコアミラーゼ自体が
６０℃でさえ適切に安定であシ、この温度水準で基質の
微生物汚染の危険がそれより低い温度と比べて着しく減
少することを意味する。
ベーターアミラーゼを用いて澱粉を高いマルトースシロ
ップに変換する際にも前記と同様の障害に遭遇する。ア
ルファーアミラーゼと同様に、ペーターアきラーゼは、
１，６−アルファ分校ＡＫ近づくに従って加水分解が停
止するので、アミロペクチンを部分的にしか分解できな
い。ベーターアミラーゼの作用を板切シ酵素、例えばプ
ルラナーゼまたはインアンラーゼの作用と組合せること
によって、英ｆｆｌ特許第１１４４９５０号及び米国特
許第３６１７８９５号明細書に開示されているように、
マルトース含有率の着しい増加を達成することができる
。しかし５５℃以上の糖化温度は枝切り酵素が熱に不安
定であるため適当でなく、これによｐ細菌汚染の危険が
着しく増加する。
ップに変換する際にも前記と同様の障害に遭遇する。ア
ルファーアミラーゼと同様に、ペーターアきラーゼは、
１，６−アルファ分校ＡＫ近づくに従って加水分解が停
止するので、アミロペクチンを部分的にしか分解できな
い。ベーターアミラーゼの作用を板切シ酵素、例えばプ
ルラナーゼまたはインアンラーゼの作用と組合せること
によって、英ｆｆｌ特許第１１４４９５０号及び米国特
許第３６１７８９５号明細書に開示されているように、
マルトース含有率の着しい増加を達成することができる
。しかし５５℃以上の糖化温度は枝切り酵素が熱に不安
定であるため適当でなく、これによｐ細菌汚染の危険が
着しく増加する。
本発明の目的は、グルコアミラーゼの温度安定性に匹敵
する温度安定性を有し、更にグルコアミラーゼの最適−
に接近した一最適域を有する新規波切シ酵素を供給する
ことによって従来公知の板切シ酵素の欠点を解消するこ
とである。
する温度安定性を有し、更にグルコアミラーゼの最適−
に接近した一最適域を有する新規波切シ酵素を供給する
ことによって従来公知の板切シ酵素の欠点を解消するこ
とである。
本発明は、このような性質を有するプルラナーゼ型の新
規板切り酵素が日本特許出願番号５６−８８３１９に規
定された分類に属するバチルス属の新しく発見された微
生物によって産生されるという意外な発見に基づく。
規板切り酵素が日本特許出願番号５６−８８３１９に規
定された分類に属するバチルス属の新しく発見された微
生物によって産生されるという意外な発見に基づく。
本発明は第一〇Ｉｔ橡によシ、下記の特性を有する；
、）１株バチルスアシドグルリティクス（Ｂａｃｌｌｌ
ｕｓ ａｅｌｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｌｅｕｍ）ＮＣＩＢ
１１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適当
な栄養培地中で培養することによって製造された発酵液
から得られ、 ｂ）バチルスアシドグルリティクス基準株ＮＣＩＢ １
１６０７から誘導され九板切シ＃素と部分的に同一の酵
素化学的性質を示し、 ｃ）ＰＨ４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中チ一定
して最適活性が６５℃〜７０℃にあり、ｄ）最適−が、
約６０℃の酢酸塩緩衝ｉ［（０，０５Ｍ）中で測定して
３５〜５，５の範囲にあシ、・）少なくとも５０−のＰ
Ｈ５のデキストロース溶液（３０重量−乾物として）中
で１１］定して７２時間後６０℃で残留活性を有する、 プルラナーゼ型の新規波切シ酵素を含む板切シ酵素製品
を提供するものである。
ｕｓ ａｅｌｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｌｅｕｍ）ＮＣＩＢ
１１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適当
な栄養培地中で培養することによって製造された発酵液
から得られ、 ｂ）バチルスアシドグルリティクス基準株ＮＣＩＢ １
１６０７から誘導され九板切シ＃素と部分的に同一の酵
素化学的性質を示し、 ｃ）ＰＨ４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中チ一定
して最適活性が６５℃〜７０℃にあり、ｄ）最適−が、
約６０℃の酢酸塩緩衝ｉ［（０，０５Ｍ）中で測定して
３５〜５，５の範囲にあシ、・）少なくとも５０−のＰ
Ｈ５のデキストロース溶液（３０重量−乾物として）中
で１１］定して７２時間後６０℃で残留活性を有する、 プルラナーゼ型の新規波切シ酵素を含む板切シ酵素製品
を提供するものである。
板切シ酵素製品は固体または液体の形であってよく、一
般ＫＩｇ当ｊ）１０〜３５０，０００’ルｊす一ゼ単位
（以下に定義する）の範囲に活性を有する。
般ＫＩｇ当ｊ）１０〜３５０，０００’ルｊす一ゼ単位
（以下に定義する）の範囲に活性を有する。
本発明０ＩＦｆましい夾施馳様では、枝切り酵素製品の
活性＃ｉ１ ｊｍＤ １００〜１５，０００グルラナー
ゼ単位の範囲にある。
活性＃ｉ１ ｊｍＤ １００〜１５，０００グルラナー
ゼ単位の範囲にある。
本発明Ｏ別の態様によれば、約６０Ｃ又はそれ以上で最
適活性、３．５〜５．５の声範囲で最適−及び６０℃で
棗釘な熱安定性を示す板切シ＃素を含む板切シｉ１１票
＃晶を製造する方法が提供され、該方法は訳隼源、窒素
源及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、全ての奥施
上の目的に対し、適当な栄養培地中でバチルス・アシド
ゾルリティクス（Ｉｌａｅｉｌｌｉｓ ａｗｉｄｅｐ
ｍｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）Ｎ：’ＩＢ １１６３９又
は板切シ酵素童生のその突然変異株を培養し、続いて常
法によシ板切）酵素生成物を回収することから成る。
適活性、３．５〜５．５の声範囲で最適−及び６０℃で
棗釘な熱安定性を示す板切シ＃素を含む板切シｉ１１票
＃晶を製造する方法が提供され、該方法は訳隼源、窒素
源及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、全ての奥施
上の目的に対し、適当な栄養培地中でバチルス・アシド
ゾルリティクス（Ｉｌａｅｉｌｌｉｓ ａｗｉｄｅｐ
ｍｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）Ｎ：’ＩＢ １１６３９又
は板切シ酵素童生のその突然変異株を培養し、続いて常
法によシ板切）酵素生成物を回収することから成る。
更に別の態様によれば、本発明はデキストロース及び／
またはマルトースを含むシロ、グに澱粉を変換する方法
を提供するものであシ、該方法は鳩舎によ〉、シかし好
ましくは予め液化工程を行なって澱粉加水分解組成物を
形成してから、前記の新規板切シ＃素の有効量並びにグ
ルコアンラーゼ及びベーターアミラーゼから成る群から
遍択され九糖化醇票から成る酵素系の存在で糖化を行な
うことから成る。
またはマルトースを含むシロ、グに澱粉を変換する方法
を提供するものであシ、該方法は鳩舎によ〉、シかし好
ましくは予め液化工程を行なって澱粉加水分解組成物を
形成してから、前記の新規板切シ＃素の有効量並びにグ
ルコアンラーゼ及びベーターアミラーゼから成る群から
遍択され九糖化醇票から成る酵素系の存在で糖化を行な
うことから成る。
本発明Ｏ板切シＩＩ素を使用する好ましい態様において
は、澱粉加水分解生成物の乾燥固彫分は少なくとも３０
重量−であシ、その糖化は５５〜６５℃の範囲、好まし
くは６３℃以下の温度で３．５〜５．５の声範囲で集施
する。グルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼの好ま
しい用量はそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ ４位及び０
．００５〜Ｑ、３ヘーターアミラーぜ単位の範囲にあシ
、板切ｒ＊素の好ましい用量は澱粉加水分解生成物中の
乾物１９ＡＤ０００５〜５プルラナ一ゼ単位（以下に定
義する）の範囲にある。
は、澱粉加水分解生成物の乾燥固彫分は少なくとも３０
重量−であシ、その糖化は５５〜６５℃の範囲、好まし
くは６３℃以下の温度で３．５〜５．５の声範囲で集施
する。グルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼの好ま
しい用量はそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ ４位及び０
．００５〜Ｑ、３ヘーターアミラーぜ単位の範囲にあシ
、板切ｒ＊素の好ましい用量は澱粉加水分解生成物中の
乾物１９ＡＤ０００５〜５プルラナ一ゼ単位（以下に定
義する）の範囲にある。
好ましい付加的態様では、糖化酵素はグルコアミラーゼ
であシ、これにょ夛澱粉を高いＤＸデキストロースシロ
、グに変える。
であシ、これにょ夛澱粉を高いＤＸデキストロースシロ
、グに変える。
微生物
単離；本発明の板切シ酵素を産生ずる微生物は、日本特
許出願第５６−８８３１９号に開示される方法によって
選択した： 微生物及びその突然変異株を、スコツトランド、アバデ
ィーン０ナシ冒ナル・コレクシ冒ン・オプ・インメスト
リアル・バクテリア、トリイ・リサーチ・スティシ冒ン
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎ ｏｆＩｍ
ｄｕｔｒｉｍｌ Ｂａ＠ｔ＠ｒｉａ ＊ Ｔｏｒｒｙ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ）に寄託し、下記の
第１表に示す受託番号を得た。
許出願第５６−８８３１９号に開示される方法によって
選択した： 微生物及びその突然変異株を、スコツトランド、アバデ
ィーン０ナシ冒ナル・コレクシ冒ン・オプ・インメスト
リアル・バクテリア、トリイ・リサーチ・スティシ冒ン
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎ ｏｆＩｍ
ｄｕｔｒｉｍｌ Ｂａ＠ｔ＠ｒｉａ ＊ Ｔｏｒｒｙ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ）に寄託し、下記の
第１表に示す受託番号を得た。
第 ■ 表
ＮＣｌ１ｌム 寄託年月日 起 源１１６３
９ １９８２年３月３１日 デΔ−り、ヒレロッド（
Ｈ１ｌｌ＠ｒｏｄ）で集め た土壌 １１７７７ １９８坪９月２９日 ＮＣＩＢ １１
６３９の突然変異株 本発明の微生物０黴生物学的性質は、日本特許出願第５
６−８８３１９号で開示した微生物のそれと適合し、そ
れらはその基準株がＮＣＩＢ １１６０７であるバチル
スアシドグルリティクスとして該出願中Ｋｍ定された分
類ダルーゾに属する。
９ １９８２年３月３１日 デΔ−り、ヒレロッド（
Ｈ１ｌｌ＠ｒｏｄ）で集め た土壌 １１７７７ １９８坪９月２９日 ＮＣＩＢ １１
６３９の突然変異株 本発明の微生物０黴生物学的性質は、日本特許出願第５
６−８８３１９号で開示した微生物のそれと適合し、そ
れらはその基準株がＮＣＩＢ １１６０７であるバチル
スアシドグルリティクスとして該出願中Ｋｍ定された分
類ダルーゾに属する。
以十示白
プルラナーゼ活性の測定
１プルラナ一ゼ単位（ＰＵ）は、標準条件（温度６０℃
及びｐ）（５，０）下で毎分１μモルのグルコースと当
量の還元性基の形成に相当する速度でノルランを加水分
解する酵素の量と定義する。
及びｐ）（５，０）下で毎分１μモルのグルコースと当
量の還元性基の形成に相当する速度でノルランを加水分
解する酵素の量と定義する。
酢酸塩緩衝液（０，ＩＭ、ｐ）（５）中のプ５ルラン〔
シグマ・ケミカル社（Ｓｌｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、 ） ＶＣよって供給される〕の４重量チ溶液（
１ｄ）を６０℃で１０分間予め加熱し、続いてｌ ｍｌ
当り０．０４〜０．１５ＰＵに押当する濃度で脱イオン
水に溶かした酵素の溶液（１ｍ１）を添加する。カーボ
ネート緩衝液、Ｐｌ（１０（０，５Ｍ溶液３ｍ１）を添
加することにより３０分後に反応を停止する。次に、遊
離した還元性基の濃度をソモギイーネルソン（Ｓｏｍｏ
ｇｙｉ−Ｎｏｌａｏｎ）法（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、
１５３（１９４４）３７５−８０ 、同、 １６０（１
９４５）、６１−６８により測定する。
シグマ・ケミカル社（Ｓｌｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、 ） ＶＣよって供給される〕の４重量チ溶液（
１ｄ）を６０℃で１０分間予め加熱し、続いてｌ ｍｌ
当り０．０４〜０．１５ＰＵに押当する濃度で脱イオン
水に溶かした酵素の溶液（１ｍ１）を添加する。カーボ
ネート緩衝液、Ｐｌ（１０（０，５Ｍ溶液３ｍ１）を添
加することにより３０分後に反応を停止する。次に、遊
離した還元性基の濃度をソモギイーネルソン（Ｓｏｍｏ
ｇｙｉ−Ｎｏｌａｏｎ）法（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、
１５３（１９４４）３７５−８０ 、同、 １６０（１
９４５）、６１−６８により測定する。
枝切り酵素製品の製造
本発明の枝切り酵素を産生しうる微生物を通常、適当な
発酵培地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、コーンステイープ・リカー
および酵母エキス又はソイビーンミール（液体培地）ま
たはトリプトン（固体基質）のような生長促進栄養素と
一緒に、同化しつる炭素源（例えば液体培地用ＶＣグル
コース及び固体培地用にアミロペクチン〕及び望素源と
して例えば硫酸アンモニウムを含む基礎塩類組成物（前
記参照）を含む。発酵を少し高めた温度で、一般に３０
〜３５℃の範囲で、６以下、好１しくは５，０〜６０の
範囲の−で夷りするのが典型的であり、自動装置により
ほぼ一定に保持するのが好ましい。酵素は培地中に分泌
される。
発酵培地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、コーンステイープ・リカー
および酵母エキス又はソイビーンミール（液体培地）ま
たはトリプトン（固体基質）のような生長促進栄養素と
一緒に、同化しつる炭素源（例えば液体培地用ＶＣグル
コース及び固体培地用にアミロペクチン〕及び望素源と
して例えば硫酸アンモニウムを含む基礎塩類組成物（前
記参照）を含む。発酵を少し高めた温度で、一般に３０
〜３５℃の範囲で、６以下、好１しくは５，０〜６０の
範囲の−で夷りするのが典型的であり、自動装置により
ほぼ一定に保持するのが好ましい。酵素は培地中に分泌
される。
生じる、通常的０．１〜５０ ＰＵ／ｍｌを含む発酵液
から細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒に例えば遠心
分離により除去することができる。酵素を含む上澄液を
更に例えば濾過または遠心分離により清澄にし、次に必
要に応じνすえｒｌｆ：、限外濾過によるか、または減
圧下に蒸発器中で洟縮し、得られた濃縮液を必要に応じ
て、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥するこ
とができる。生ずる粗製酵素製品は、１００−１５，０
００ ＰＵ／ｇの範囲の活性を示すのが代表的である。
から細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒に例えば遠心
分離により除去することができる。酵素を含む上澄液を
更に例えば濾過または遠心分離により清澄にし、次に必
要に応じνすえｒｌｆ：、限外濾過によるか、または減
圧下に蒸発器中で洟縮し、得られた濃縮液を必要に応じ
て、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥するこ
とができる。生ずる粗製酵素製品は、１００−１５，０
００ ＰＵ／ｇの範囲の活性を示すのが代表的である。
本発明の粗板切り酵素は、例えば下記の例１で得られる
濃縮液から、例えば例３で述べる方法を用い、電気泳動
的均質性まで精製できる。精製酵素は、ナトリウムドデ
シルスルフェートポリアクリルアミドダル電気泳動〔ブ
ラウン（Ｓ、Ｇ、Ｂｒａｕｎ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇ
）’、１０巻（１９７２年）２２１頁〕で、単一の蛋白
質バンドを示した。分子量は約９５．０００ダルトンす
なわち基準株ＮＣＩＢ １１６０７によって産生される
枝切り酵素の分子量よりも約５０００ダル゛トン小さい
。
濃縮液から、例えば例３で述べる方法を用い、電気泳動
的均質性まで精製できる。精製酵素は、ナトリウムドデ
シルスルフェートポリアクリルアミドダル電気泳動〔ブ
ラウン（Ｓ、Ｇ、Ｂｒａｕｎ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇ
）’、１０巻（１９７２年）２２１頁〕で、単一の蛋白
質バンドを示した。分子量は約９５．０００ダルトンす
なわち基準株ＮＣＩＢ １１６０７によって産生される
枝切り酵素の分子量よりも約５０００ダル゛トン小さい
。
本発明の酵素および日本特許出願第５６−８３１９号で
開示されたＮＣＩＢ １１６０７ （又はそれらの突然
変異株、例えば株ＮＣＩＢ １１６３８および基準株Ｎ
ＣＩＢ １１６４７ ）によって産生される酵素との差
異を実証するため、次の試験結果を示す。
開示されたＮＣＩＢ １１６０７ （又はそれらの突然
変異株、例えば株ＮＣＩＢ １１６３８および基準株Ｎ
ＣＩＢ １１６４７ ）によって産生される酵素との差
異を実証するため、次の試験結果を示す。
ん 等電点（ｐＩ）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀
（ＰＭＢ ）を用いて処理することによる抑制ＮＣＩＢ
１１６３９ ５．６ −ＮＣＩＢ
１１７７７ ５．６ −これらの結果
は、次の事実を示す。すなわち、本発明の酵素の活性は
、基準体からの醇累に反し、その活性部位付近のスルホ
ヒドリル基の存在と独立である、ということである。
（ＰＭＢ ）を用いて処理することによる抑制ＮＣＩＢ
１１６３９ ５．６ −ＮＣＩＢ
１１７７７ ５．６ −これらの結果
は、次の事実を示す。すなわち、本発明の酵素の活性は
、基準体からの醇累に反し、その活性部位付近のスルホ
ヒドリル基の存在と独立である、ということである。
Ｂ、温度の関数としてのプルラナゼ活件（他の反応条件
は、プルラナーゼ活性の検査に対する上述の記載条件で
ある） 活性は６０℃の活性の７４−セントとして示される。
は、プルラナーゼ活性の検査に対する上述の記載条件で
ある） 活性は６０℃の活性の７４−セントとして示される。
Ｃ１−および温度レベルを変化させた場合のグルコース
溶液（約３０％の乾物）中の熱安定性の比較 酵素製品を、脱イオン水に溶解もしくは脱イオン水で希
釈し、１ｄに対し約３ ＰＵ金含有る溶液を得た。酵素
溶液（１１）を、選定したーの０１Ｍミドレート−ホス
フェート緩衝液（１ｄ）と混合し次いでその溶液中にグ
ルコース（ｏ、ｓｙ）を溶解することにより試料を調製
した。選定した温度で試料を７２２時間インキュベージ
ンした後、残留アミロ硬りチン板切り活性（後記参照）
を測定した。残留アミロペクチンは、４℃で保持された
同＝の試料の活性度のパーセントとして示され６°
、Ｔ、。
溶液（約３０％の乾物）中の熱安定性の比較 酵素製品を、脱イオン水に溶解もしくは脱イオン水で希
釈し、１ｄに対し約３ ＰＵ金含有る溶液を得た。酵素
溶液（１１）を、選定したーの０１Ｍミドレート−ホス
フェート緩衝液（１ｄ）と混合し次いでその溶液中にグ
ルコース（ｏ、ｓｙ）を溶解することにより試料を調製
した。選定した温度で試料を７２２時間インキュベージ
ンした後、残留アミロ硬りチン板切り活性（後記参照）
を測定した。残留アミロペクチンは、４℃で保持された
同＝の試料の活性度のパーセントとして示され６°
、Ｔ、。
アミロ（クチンのアルファー１．６−結合の加水分屏は
、青色沃素−アミロペクチン錯体の色強度（６１０ｎｍ
で測定）の増加を起す。この増加は加水分解したアル７
７−１＋６−結合の量に左右される・ 枝切り酵素及びイソアミラーゼについてそれぞれ１〜２
ＰＵ／ｄ及び２０〜４０ ＩＡ／ｍ／に相当する濃度
に脱イオン水で希釈した酵素溶液（１反）を酢酸塩緩衝
液（０，５Ｍ、ｐｉ−１４，５、ｌ ｍｌ ）及びアミ
ロ（クチン〔ＣＰＣ１スノウ７Ｌ／（り（５ＮＯＷＦＬ
ＡＫＥ ）０４２０１澱粉〕のｌチ溶液（５１）と混合
する。混合物を５０℃で３００分間インキュページンす
る。
、青色沃素−アミロペクチン錯体の色強度（６１０ｎｍ
で測定）の増加を起す。この増加は加水分解したアル７
７−１＋６−結合の量に左右される・ 枝切り酵素及びイソアミラーゼについてそれぞれ１〜２
ＰＵ／ｄ及び２０〜４０ ＩＡ／ｍ／に相当する濃度
に脱イオン水で希釈した酵素溶液（１反）を酢酸塩緩衝
液（０，５Ｍ、ｐｉ−１４，５、ｌ ｍｌ ）及びアミ
ロ（クチン〔ＣＰＣ１スノウ７Ｌ／（り（５ＮＯＷＦＬ
ＡＫＥ ）０４２０１澱粉〕のｌチ溶液（５１）と混合
する。混合物を５０℃で３００分間インキュページンす
る。
少量（０，５１１１１）を０．０２ Ｎ Ｈ２ＳＯ４１
５Ｋｌ及び沃素溶液（０，２％沃化カリウム中の０．０
１Ｍ沃素）０．５１と混合する。
５Ｋｌ及び沃素溶液（０，２％沃化カリウム中の０．０
１Ｍ沃素）０．５１と混合する。
室温で１５分後、６１０ ｎｍでの光学密度を酵素を含
まないブランクのそれと比較する。
まないブランクのそれと比較する。
Ｄ、 ｐＨおよび温度が予じめ定められた値に調整し
た反応混合物を用い、種々の温度レベルでの３．５〜５
．５の範囲におけるーに対する本発明の枝切り酵素の作
用の依存性を、上記のプルラナーゼ活性を測定するため
の方法によりて測定した。６０℃、６５℃、および７０
℃における声に対しプロ、トしたＮＣＩＢ １１６３９
の枝切り酵素の相対的活性を示す添附図面を参照された
い。
た反応混合物を用い、種々の温度レベルでの３．５〜５
．５の範囲におけるーに対する本発明の枝切り酵素の作
用の依存性を、上記のプルラナーゼ活性を測定するため
の方法によりて測定した。６０℃、６５℃、および７０
℃における声に対しプロ、トしたＮＣＩＢ １１６３９
の枝切り酵素の相対的活性を示す添附図面を参照された
い。
これらの結果は次の内容を示している。すなわち、本発
明の枝切り酵素は日本特許願第５６−８８３１９に従っ
た基準体およびその突然変異株によって産生される酵素
よりも６０℃以上の温度でかつｐＨ４，５以下でより安
定である。
明の枝切り酵素は日本特許願第５６−８８３１９に従っ
た基準体およびその突然変異株によって産生される酵素
よりも６０℃以上の温度でかつｐＨ４，５以下でより安
定である。
免疫学的性質
本発明の酵素製品を、基準法、すなわちＮＣｌＢ１１６
４７の突然変異株に対し生じた単因子抗血清を用い、日
本特許出願第５６−８８３１９号に開示した免疫学的試
験に委ねた。本発明の酵素のイムノグラムは、基準法の
それ［４！！２べ部分的免疫化学的同一性を示す。
４７の突然変異株に対し生じた単因子抗血清を用い、日
本特許出願第５６−８８３１９号に開示した免疫学的試
験に委ねた。本発明の酵素のイムノグラムは、基準法の
それ［４！！２べ部分的免疫化学的同一性を示す。
次に、本発明の例を非制限的に示す。
例１
菌株ＮＣＩＢ １１６３９の増殖、培養および発酵を、
日本特許出ｌ！ｉ第５６−８８３１９号の例１で開示し
た如く行なった。
日本特許出ｌ！ｉ第５６−８８３１９号の例１で開示し
た如く行なった。
発酵培地は次の組成を有した。
大豆ミールエキス杓 ２０％コーンステイ
ープリカー ０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，０２５％ に２ＨＰＯ４０，１％ （ＮＨ４） ２Ｓｏ４０．０５％ 本）大豆ミールの抽出はｐ）１４．５および５０℃で４
時間で可能である。不溶性物質は遠心分離によって除去
さる。
ープリカー ０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，０２５％ に２ＨＰＯ４０，１％ （ＮＨ４） ２Ｓｏ４０．０５％ 本）大豆ミールの抽出はｐ）１４．５および５０℃で４
時間で可能である。不溶性物質は遠心分離によって除去
さる。
１３０℃で６０分、オートクレーブ処理する前に、−を
４．０に調整した。
４．０に調整した。
培養の間、水酸化ナトリウム溶液（２％）を添加して−
を５．６±０．１に保持した。温度は３０．０±０．１
℃であり、攪拌速［５３０〜５６５ ｒｐｎ＋のもと通
気速ｆは３２０１７／分であった。
を５．６±０．１に保持した。温度は３０．０±０．１
℃であり、攪拌速［５３０〜５６５ ｒｐｎ＋のもと通
気速ｆは３２０１７／分であった。
発酵は、０．０３〜０．０５ ｈｒ の希釈速度で１
８６時間連続的に行なったが、その時溢流培養液の採取
が始ま・った。培養液（５１０Ｍ’、０．４７ ＰＵ／
１Ｌｔ）を、次の条件のもと更に９７時間ドライアイス
上に集めた； 希釈速ｆ Ｏ，０４９±０．００８ ｈｒ−’０
Ｄａｓｏ １０．６ｆ１．１細胞密度
２．９±１．５１／Ａ枝切り酵素活性 ０５±０
． Ｉ ＰＵ／ｍｌ細胞を遠心分離により除去する。上
澄み液をワ、） マｙ （Ｗｈａｔｍａｎ ） ＧＦＡ
ガラスフィルター（１１１）で−過し、次いでＨＩＰＩ
Ｏ膜を有するアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ） ＤＣ２ホロ
ーファイ／Ｊ−モジュールで２００１に濃縮した。濁り
をＧＦＡフィルターで除去し、そしてＰ液を更［２０２
−ＤＤＳ ６００膜（ＤＤＳ、コインハーグン、デンマ
ーク）ヲ用い、アミコンモジュールで濃縮い ６５ Ｐ
Ｕｆｉｒｌの活性を有する最終濃縮物（３０ｍＡ）を得
た。この礎縮物を急速冷凍して保存した。
８６時間連続的に行なったが、その時溢流培養液の採取
が始ま・った。培養液（５１０Ｍ’、０．４７ ＰＵ／
１Ｌｔ）を、次の条件のもと更に９７時間ドライアイス
上に集めた； 希釈速ｆ Ｏ，０４９±０．００８ ｈｒ−’０
Ｄａｓｏ １０．６ｆ１．１細胞密度
２．９±１．５１／Ａ枝切り酵素活性 ０５±０
． Ｉ ＰＵ／ｍｌ細胞を遠心分離により除去する。上
澄み液をワ、） マｙ （Ｗｈａｔｍａｎ ） ＧＦＡ
ガラスフィルター（１１１）で−過し、次いでＨＩＰＩ
Ｏ膜を有するアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ） ＤＣ２ホロ
ーファイ／Ｊ−モジュールで２００１に濃縮した。濁り
をＧＦＡフィルターで除去し、そしてＰ液を更［２０２
−ＤＤＳ ６００膜（ＤＤＳ、コインハーグン、デンマ
ーク）ヲ用い、アミコンモジュールで濃縮い ６５ Ｐ
Ｕｆｉｒｌの活性を有する最終濃縮物（３０ｍＡ）を得
た。この礎縮物を急速冷凍して保存した。
例２
菌株ＮＣＩＢ １１７７７からの砂切り製品の！Ｒ造全
溶ｆｆ５５Ｃ１のステンレス鋼ファーメンタ−内で発酵
を行なった。作東谷１ｉ３４０〜４３５！を用いた。
溶ｆｆ５５Ｃ１のステンレス鋼ファーメンタ−内で発酵
を行なった。作東谷１ｉ３４０〜４３５！を用いた。
培地組Ｍ、 電池Ａ 培地Ｂ酵母
抽出液ペースト（８０％乾物）３９大豆ミール
２５９ −コーンステイーグリカー（５０
％乾切） ５＆ １５ｇＫＨ２ＰＯ４１，８＃
１．０Ｎ （ＮＩ（４）２８０４１．０．９ １．３５ＩＣａＣ
１２，２Ｈ２０−０，２５１ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０−０，２５ｊ プルロニ、り（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６１ ０．
１１ＬｌＯ，１１１Ｌｌ水道水で
１！ １！培地の−を水酸化ナトリウム溶液
・で５．４〜５．６に調節した。澱粉をターマミル（Ｔ
ＥＲＭＡＭＹＬ ）Ｌ −６０（乾燥澱粉１ｋｌ？当た
ｖ２ｍｌ）で６０分間９０℃で液化した。くえん酸（乾
燥澱粉１ゆ当たｒ）１ｇ）を添加して液化を終了させ次
いで沸点まで加熱した。
抽出液ペースト（８０％乾物）３９大豆ミール
２５９ −コーンステイーグリカー（５０
％乾切） ５＆ １５ｇＫＨ２ＰＯ４１，８＃
１．０Ｎ （ＮＩ（４）２８０４１．０．９ １．３５ＩＣａＣ
１２，２Ｈ２０−０，２５１ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０−０，２５ｊ プルロニ、り（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６１ ０．
１１ＬｌＯ，１１１Ｌｌ水道水で
１！ １！培地の−を水酸化ナトリウム溶液
・で５．４〜５．６に調節した。澱粉をターマミル（Ｔ
ＥＲＭＡＭＹＬ ）Ｌ −６０（乾燥澱粉１ｋｌ？当た
ｖ２ｍｌ）で６０分間９０℃で液化した。くえん酸（乾
燥澱粉１ゆ当たｒ）１ｇ）を添加して液化を終了させ次
いで沸点まで加熱した。
フェルンパッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）培養フラスコ中で
例１に使用した閤じ栄養寒天基質上で２日間生育した菌
株ＮＣＩＢ １１７７７の培養物を、培地Ａの５８！を
接種するため使用した。発酵を３５℃で冥施したが、そ
の際攪拌機の速度は１０７ ｒｐｍで、通気速度は０．
５バールの圧力で毎分３０標準す、トルにした。
例１に使用した閤じ栄養寒天基質上で２日間生育した菌
株ＮＣＩＢ １１７７７の培養物を、培地Ａの５８！を
接種するため使用した。発酵を３５℃で冥施したが、そ
の際攪拌機の速度は１０７ ｒｐｍで、通気速度は０．
５バールの圧力で毎分３０標準す、トルにした。
この接種培養物が１０８時間のエイジに達したら、培地
Ａ３４０Ｊを含有する、５５０ｔのファーメンタ−を接
種するため核接袖培養物を用いた。
Ａ３４０Ｊを含有する、５５０ｔのファーメンタ−を接
種するため核接袖培養物を用いた。
５５０ｊの７アーメンター内の湯度を２９〜３１℃に維
持した。攪拌速度を１２ Ｏｒ、ｐ、ｍ、に設定した。
持した。攪拌速度を１２ Ｏｒ、ｐ、ｍ、に設定した。
空気流を、０．５パールの圧力で毎分１５０標準り、ト
ルに調節した。４４時間から１９４時間まで、培地Ａが
毎時１４〜１９！の速度でファーメンタ−に供給された
。プロスの容積が４３５１に達したら、培養液を自動的
に除去した。
ルに調節した。４４時間から１９４時間まで、培地Ａが
毎時１４〜１９！の速度でファーメンタ−に供給された
。プロスの容積が４３５１に達したら、培養液を自動的
に除去した。
接種１９４時間から実験の終了の５２５時間まで、培地
Ｂを毎時１１〜１９！の速度でファーメンタ−に供給し
た。容積物を上述のように４３５ｊＫ保持した。
Ｂを毎時１１〜１９！の速度でファーメンタ−に供給し
た。容積物を上述のように４３５ｊＫ保持した。
接種後約３８時間に激しい生長を００２の発生および顕
微鏡により観察した。プルラナーゼ活性は生成６９時間
ニ１１Ｒ１当たり０．２ＰＵＫ達りそして培地を交換す
るまでこのレベルにあった。接種後２１９時間に、プル
ラナーゼ活性は１ ｍｌ当たり１．４ＰＵ以上に達した
。活性は、接種後４９５時間に実験中の最大の１ｄ当た
り３．２ＰＵに達した。
微鏡により観察した。プルラナーゼ活性は生成６９時間
ニ１１Ｒ１当たり０．２ＰＵＫ達りそして培地を交換す
るまでこのレベルにあった。接種後２１９時間に、プル
ラナーゼ活性は１ ｍｌ当たり１．４ＰＵ以上に達した
。活性は、接種後４９５時間に実験中の最大の１ｄ当た
り３．２ＰＵに達した。
培養物のｐ）（は５．４〜５．８の範囲で変化した。２
２５時間から３１２時間まで、培養液を集めそして水中
で冷却した。
２５時間から３１２時間まで、培養液を集めそして水中
で冷却した。
発酵液（ＩＦ当たり１．７３ＰＵの活性度を有する）１
４５（ｌを、塩化カルシウムの１５ｋｇ、フィルトｏッ
クス（Ｆｌ １ｔｒｏｘ） ＸＬ Ｏ１の１ｋｇおよび
ナルコ（Ｎａｌｃｏ） ６７３の０．２５に＆を用いて
ｐＨ６，０で凝集させた。
４５（ｌを、塩化カルシウムの１５ｋｇ、フィルトｏッ
クス（Ｆｌ １ｔｒｏｘ） ＸＬ Ｏ１の１ｋｇおよび
ナルコ（Ｎａｌｃｏ） ６７３の０．２５に＆を用いて
ｐＨ６，０で凝集させた。
スラッジを遠心分離で除去し、次いで最後のかすみ状の
ものを、濾過助剤として珪藻土を用いサプラ（５ｕｐｒ
ａ ） １００ 濾過板で濾過した。
ものを、濾過助剤として珪藻土を用いサプラ（５ｕｐｒ
ａ ） １００ 濾過板で濾過した。
酢酸を用いＰ液をｐ）（４，８に調整し、次いでＧＲ６
０膜を備えたＤＤＳ ３５モジー−レを用いて濃縮した
。最終濃縮物（１５ｋｌＩ）は乾物１０．６チを含有し
ていた。
０膜を備えたＤＤＳ ３５モジー−レを用いて濃縮した
。最終濃縮物（１５ｋｌＩ）は乾物１０．６チを含有し
ていた。
珪藻土を用いて更に加圧濾過し、１膜当たり９５ ＰＵ
の活性度を有する酵素濃縮物（１２，８ｋｇ、乾物９．
８％を含有）を得た。
の活性度を有する酵素濃縮物（１２，８ｋｇ、乾物９．
８％を含有）を得た。
例３
出発材料は、上記例２で集められた冷却発酵液（３りで
あった。全ての連続工程は４℃〜８℃の温度範囲で行な
われた。
あった。全ての連続工程は４℃〜８℃の温度範囲で行な
われた。
次いで、液体を、べ、クマンＪ６遠心機内で３００ Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離した。ＨＩＰ １０膜を備えた
アミコンホローファイバーｍ縮ｓ、ｍＤ Ｃ４（アミコ
ン社、マサッチューセット州、米国）を用いて、上澄み
液を２０００ｍ１に磁線した。
ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離した。ＨＩＰ １０膜を備えた
アミコンホローファイバーｍ縮ｓ、ｍＤ Ｃ４（アミコ
ン社、マサッチューセット州、米国）を用いて、上澄み
液を２０００ｍ１に磁線した。
次いでＤＣ４の設定を、透析に変え次いで誘導率を２ｍ
５Ｉに低下させそしてｐ）ｌを酢酸で３８に調整した。
５Ｉに低下させそしてｐ）ｌを酢酸で３８に調整した。
次いで得られた酵素溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（０
，０２Ｍ、 Ｐｉ（３，８） Ｔ平衡化したＣＭ−（！
ファロースＣＬ−６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ 、 Ｓ
ｗｅｄｅｎ）カラムに供給し、これにより大部分の酵素
が吸収された。
，０２Ｍ、 Ｐｉ（３，８） Ｔ平衡化したＣＭ−（！
ファロースＣＬ−６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ 、 Ｓ
ｗｅｄｅｎ）カラムに供給し、これにより大部分の酵素
が吸収された。
ＮＪＬ２ＨＰＯ２緩衝液（０，０２Ｍ）と粉状に混合し
た同じ緩＃猷で溶離を実施して、３８〜７．２のｌ勾配
を得た。プルラナーゼ活性について、フラクシ目ンヲ分
析した。活性なフラクシｌンをプールシ、次いでＰＩＯ
ホローファイバー濃縮器で３５０１ｉｌに濃縮した。
た同じ緩＃猷で溶離を実施して、３８〜７．２のｌ勾配
を得た。プルラナーゼ活性について、フラクシ目ンヲ分
析した。活性なフラクシｌンをプールシ、次いでＰＩＯ
ホローファイバー濃縮器で３５０１ｉｌに濃縮した。
濃縮物を同量の９６％の冷（４０’Ｃ）エタノールと混
合した。沈澱物を、ベックマン５６遠心器内で３０００
ｒｐｒｎで遠心分離した。沈澱物を水（１５０ａ＋Ａ
り中に溶解した。
合した。沈澱物を、ベックマン５６遠心器内で３０００
ｒｐｒｎで遠心分離した。沈澱物を水（１５０ａ＋Ａ
り中に溶解した。
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｅｌｍ ） （スウｘ−ｙ
ン）から購入されたクロマトフォーカシイング用キ。
ン）から購入されたクロマトフォーカシイング用キ。
トを、最後の精製工程に対し用いた。１５ｏＷＬｔのＰ
ＢＥ ９４を２５Ｘ４００■カラムに２５フアルマシア
中に充填し次いで流速１５０ｄ／ｈで２５ｍＭイミダゾ
ール緩衝液（ｐｉ−１７，４）で平衡化した。次いで１
；８に希釈したポリパワファー７４を適用しく１５０ｍ
ｊ）、絖いて試料（可溶化されるエタノール沈澱物を適
用した。次いで２０００ｄのポリバッファ７４（１：８
に希釈）を適用し勾配法を開始した。
ＢＥ ９４を２５Ｘ４００■カラムに２５フアルマシア
中に充填し次いで流速１５０ｄ／ｈで２５ｍＭイミダゾ
ール緩衝液（ｐｉ−１７，４）で平衡化した。次いで１
；８に希釈したポリパワファー７４を適用しく１５０ｍ
ｊ）、絖いて試料（可溶化されるエタノール沈澱物を適
用した。次いで２０００ｄのポリバッファ７４（１：８
に希釈）を適用し勾配法を開始した。
１７０ｄの全量中、酵素をｐＨ５，４付近で溶出し、次
イでＤＤＳ５００膜を有するアミコン型２０２濃縮セル
で２０１Ｌｌに濃縮した。
イでＤＤＳ５００膜を有するアミコン型２０２濃縮セル
で２０１Ｌｌに濃縮した。
ＩＷＬｌ当たりタン・臂り１０■を含有する、得られた
溶液は１１当た１５００ＰＵのゾルラナーゼ活性を有し
ており、従ってタン・やりＩＩ当たり１５０．０００の
特異活性を有した。
溶液は１１当た１５００ＰＵのゾルラナーゼ活性を有し
ており、従ってタン・やりＩＩ当たり１５０．０００の
特異活性を有した。
例４
ＤＥ７．０を有する、噴霧乾燥したマルトデキストリン
のパッチを調製した。
のパッチを調製した。
このマルトデキストリンの過当量を脱イオン水に再溶解
させ、約３０％Ｄ、 Ｓ、にすることにより糖化用基質
を調製した。次にこの基質の少量を６０℃に加熱し、−
を４．８．４．５又は４．’０１／ｌ：調節した。
させ、約３０％Ｄ、 Ｓ、にすることにより糖化用基質
を調製した。次にこの基質の少量を６０℃に加熱し、−
を４．８．４．５又は４．’０１／ｌ：調節した。
０．１１３ＡＧ単位／Ｉ Ｄ Ｓ ｕｎ−ｊル、則用量
ノクルコアミラーゼについてこの７リーズの平行した糖
化実験を行なった。第一のシリーズでは、ＩＰＵ／１１
ＤＳに対応する、ＮＣＩＢ １１６４７からの枝切り
酵素の量を添加した。躯二のシリーズでは１ＰＵ／ｉ
ＤＳ Ｋ対応する、ＮＣＩＢ １１７７７からの枝切り
＃累の量を添加した。試＃＋混合物を一定時間間隔で採
取し、各試料中のデキストロース含有率（＠をＨＰＬＣ
によって測定した。下記の結果が得られた。
ノクルコアミラーゼについてこの７リーズの平行した糖
化実験を行なった。第一のシリーズでは、ＩＰＵ／１１
ＤＳに対応する、ＮＣＩＢ １１６４７からの枝切り
酵素の量を添加した。躯二のシリーズでは１ＰＵ／ｉ
ＤＳ Ｋ対応する、ＮＣＩＢ １１７７７からの枝切り
＃累の量を添加した。試＃＋混合物を一定時間間隔で採
取し、各試料中のデキストロース含有率（＠をＨＰＬＣ
によって測定した。下記の結果が得られた。
ＮＣＩＢ １１６４７からの枝切り酵素ＮＣＩＢ １１
７７７からの枝切り酵素これらの結果は、次の事実を示
している。すなわち、…約４．４で糖化を開始した場合
、ＮＣｌＢ１１６４７およびＮＣＩＢ １１７７７から
の枝切り酵素については、類似の結果を得ることができ
る。…約４．０以下では、ＮＣＩＢ １１６４７からの
枝切り酵素とは異ってＮＣＩＢ １１７７７からの板切
ジ酵素はその活性を保持している。
７７７からの枝切り酵素これらの結果は、次の事実を示
している。すなわち、…約４．４で糖化を開始した場合
、ＮＣｌＢ１１６４７およびＮＣＩＢ １１７７７から
の枝切り酵素については、類似の結果を得ることができ
る。…約４．０以下では、ＮＣＩＢ １１６４７からの
枝切り酵素とは異ってＮＣＩＢ １１７７７からの板切
ジ酵素はその活性を保持している。
例５
例４で記載した少量の基質を、ｐＨ４，５に調整し次い
で６０℃に加熱した。０．１１３ＡＣ単位／ｌ１Ｄｓに
相当する量およびＮＣＩＢ １１６３９から得られた枝
切り酵素の変化量を添加した。反応混合物を採取し、実
施例４におけると同様に分析した。
で６０℃に加熱した。０．１１３ＡＣ単位／ｌ１Ｄｓに
相当する量およびＮＣＩＢ １１６３９から得られた枝
切り酵素の変化量を添加した。反応混合物を採取し、実
施例４におけると同様に分析した。
以下余白
これらの結果は次の事実を示している。３０％Ｄ、 Ｓ
、マルトデキスト、リンを６６℃でかつｐＨ４〜４．５
で糖化することにより、９７０過剰ＤＸが、グルコアミ
ラーゼの１ ＃Ｄ８当たり０．１１３ＡＧおよび本発明
の枝切り酵素ｌＩＤ８当たり少なくともＩＰＵからなる
酵素系について達成できる。
、マルトデキスト、リンを６６℃でかつｐＨ４〜４．５
で糖化することにより、９７０過剰ＤＸが、グルコアミ
ラーゼの１ ＃Ｄ８当たり０．１１３ＡＧおよび本発明
の枝切り酵素ｌＩＤ８当たり少なくともＩＰＵからなる
酵素系について達成できる。
図は、種々の−および温度における本発明の酵素のプル
ラナーゼ活性を示すグラフである。 特許出願人 ノボ インダストリ アクテイーゼルスカプ特許出願代
理人 弁理士 青 木 朗 弁理士 西舘和之 弁理士 内 １）幸 男 弁理士 山 口 昭 之 図面の浄書（内存に変更なし） °へ全１へも−を約馴 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５７年特許顧 第１８３０２２号 ２、発明の名称 板切ｐ＃素製品 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ノボインダストリ アクテイーゼルスカブ４
、代理人 ６、補正の対象 図 面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面 １通
ラナーゼ活性を示すグラフである。 特許出願人 ノボ インダストリ アクテイーゼルスカプ特許出願代
理人 弁理士 青 木 朗 弁理士 西舘和之 弁理士 内 １）幸 男 弁理士 山 口 昭 之 図面の浄書（内存に変更なし） °へ全１へも−を約馴 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５７年特許顧 第１８３０２２号 ２、発明の名称 板切ｐ＃素製品 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ノボインダストリ アクテイーゼルスカブ４
、代理人 ６、補正の対象 図 面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｌ 下記の特性を有する； 凰）パチルスアシドグルリティクス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｅｉｄｏｐｕ１１ｕｌｙｔｉｅ
ｕ＠）ＮＣＩＢ１１６３９又はその変異株もしく祉突然
変異株を適当な栄養培地中で培養することによって製造
された発酵液から得られ、 ｂ）バチルスアシドプルリティクス （ｉｌａｅｌｌｌａｓ ａｃｉｄｏｐａｌｌｕｌｙｔｌ
ｃｕｓ）基準法ＮＣｌＢ１１６０７から誘導された枝切
り酵素と部分的に同一〇酵素化学的性質を示し、 ｃ）ｐａ４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中でイン
キ為ベージ璽ンすることによシ測定して最適活性が６５
℃〜７０℃にあり、 ｄ）最適−が、約６０℃の酢酸塩１１衝液（０，０５Ｍ
）中で掬定して３．５〜５．５の範囲にあシ、・）少な
くとも５０９６のＰ［（５のガキストロース溶液（３０
重量％・乾物として）中で橋」定して７２時間後６０℃
で残留活性を有する、ゾルラナーゼ型の新規枝切り酵素
を含むことを特徴とする枝切シ酵素製品。 ２、枝切り酵素活性がｌＩ轟クシ１０〜３５００００、
プルラナーゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第２項記
載の枝切り酵素製品。 ３ 活性が１ｇ轟クシ１００〜１５，０００ゾルラナー
ゼ単の範囲にある特許請求の範囲第２項記載の枝切シ酵
素製品。 ４、全ての実施上の目的に対し、適当な栄養培地中でバ
チルス・アシドグルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｅｉｄｏｐ＠１ｌｕｌｙｔｉ暑ｕａ）ＮＣＩ８１１６３
９、又はその枝切シ酵素童生突然変異株と同一でありか
つそれに含まれる菌株の培養および培養物を會む培地か
ら枝切シ酵素の回収。 ５、下記の特性を有する； ａ）菌株バチルスアシドグルリティクス（Ｌａｅｌｌｌ
ｕｍ ａｅｉｄｏｐｕｌｌｍｌｙｔｉｅｕｓ）ＮＣＩｉ
ｌ １１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適
当な栄養培地中で培養することによって製造された発酵
液から得られ、 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｌｄｅｐｉｌｌｕｌｙｔｉｅ
ｕｓ）基準株ＮＣｌＢ１１６０７から誘導され九板切シ
酵素と部分的に同一の酵素化学的性質を示し、 ｃ）−４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中でインキ
エペーシ■ンすることにより測定して最適活性が６５℃
〜７０℃にあシ、 ｄ）１ｍ４が、約６０℃の酢ｗｋ塩ａＳ液（０，０５Ｍ
）中で測定して３．５〜５．５の範囲にあり、す少なく
とも５０チのｐＨ５のデキストロース溶液（３０重量−
・乾物として）中で測定して７２時間後６０℃で残留活
性を有する、プルラナーゼ型の新規板切シ酵累を含んで
なる板切シ酵素製品の製造方法であって、炭素源９ｇｉ
素源及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、菌株バチ
ルス・アシドプルリティクスＮＣＩＢ １１６３９、又
はその板切シ陣嵩意生変異株もしくは突然変異株を培養
し、続いて板切シ′ｔ＃素生成物を回収することを特徴
とする板切シ酵素製品の製造方法。 ６ 前記バチルス・アシドプルリテイクス曹株が突然変
異株ＮＣＩＢ １１７７７である特許請求の範囲第５項
記載の方法。 ７、全ての実施上の目的に対し、適嶺な栄養培地中でバ
チルス・アシド！ルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｃｌｄｅｐｉｌｌｕｌｙｔｉｅｕｓ）ＭＣＩ８１１６３
９、又はその板切り酵素産生突然変異株と同一でありか
つそれを含有する菌株の培養シに゛に培養物を含む培地
から板切シ酵素を回収することによって得られる新規板
切シ酵素の有効量並びにグルコアンラーゼ及びベータア
ミラーゼから成る群から選択した糖化酵素を含む酵素系
の存在で澱粉または澱粉加水分解生成物の糖化を行なう
ことを特徴とする、デキストロース及び／ｌたはマルト
ースを含むシロ、グに澱粉を変える方法。 ８、更に１乾物重量で少なくとも３０チＯ澱粉加水分解
生成物を糖化する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、糖化を４．０〜４．５の声範門で少なくとも６０℃
の温度で行なう特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０ グルコアミラーゼ及びベータアミラーゼの用量
が乾物１ｇ当シそれぞれ００５〜０５ＡＧＭｉ位及びｏ
、ｏｏｓ〜０３ベータアミラーゼ巣位の範囲にある特許
請求の範囲第７項記載の方法。 １１ 板切）酵素の用量が乾物１ｇ当り０．００５〜
５プルラナ一ゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第１０
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK1728/82 | 1982-04-19 | ||
| DK172882A DK153569C (da) | 1981-04-20 | 1982-04-19 | Enzymprodukt indeholdende en alfa-1,6-glucosidase og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58183092A true JPS58183092A (ja) | 1983-10-26 |
| JPS6225037B2 JPS6225037B2 (ja) | 1987-06-01 |
Family
ID=8107581
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57183022A Granted JPS58183092A (ja) | 1982-04-19 | 1982-10-20 | 枝切り酵素 |
| JP60174392A Pending JPS6143995A (ja) | 1982-04-19 | 1985-08-09 | 枝切り酵素製品 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60174392A Pending JPS6143995A (ja) | 1982-04-19 | 1985-08-09 | 枝切り酵素製品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS58183092A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57174089A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
-
1982
- 1982-10-20 JP JP57183022A patent/JPS58183092A/ja active Granted
-
1985
- 1985-08-09 JP JP60174392A patent/JPS6143995A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6225037B2 (ja) | 1987-06-01 |
| JPS6143995A (ja) | 1986-03-03 |
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