JPS58109423A - 抗感染剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はサツカロミセス属に属する酵母から得られるマ
ンナンの用途に関し、詳しくは上記マンナンからなる抗
感染性物質に関する。

化学療法、特に抗生物質の進歩により感染症は著るしく
減少したものの、化学療法剤の効かない耐性菌も近年急
速に増加し、そのために次次に新規抗生物質を開発しな
ければならなくなっている。本発明者らはこれらの現状
に鑑みて。

別な観点から感染症の治療薬の研究を重ねた結果、サツ
カロミセス属酵母マンナンに抗感染油性を見出し９本発
明を完成させるに至った。

サツカロミセス属酵母マンナンにけ抗腫瘍効果が認めら
れるζβ家発明者らによ・て見出され、すでに特許出願
中であるが、これらマンナ姑 ンに抗感染着性が存在することは知られていなかったも
ので、全く新規な・知見に基づくものである。

本発明に用いるサツカロミセス属の酵母と１７ては次の
ものが挙げられる。すなわち、サツカロミセス　セリピ
シアエ（Ｓ　ａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒ−ｖｉ
ｓｉａｅ）、　　サツカロミセス　バアイリー（Ｓａ−
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂａｉｌｉｉ）、　　サツカ
ロミセス　バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂ
ａｙａｎｕｓ）、サツカロミセス　ビスポラス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）。

サツカロミセス　セバリエリ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サツカロミセスロウキ
シ（Ｓａ−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ　）
、　　サツカロミセス　ウバルＡ　（Ｓａｃｃｂａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）、　　サソカロミ゛セスエ
クスゲス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｘｉｇｕｓ
）、　　サツカロミセス　イタリクス（Ｓ　ａｃｃｈａ
　ｒｏｍｙｃｅｓ１ｔａｌｉｃｕｓ）、　　サツカロミ
セス　ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）などである。

上記の酵母中、野生株酵母から得られるマンナンは分枝
した構造をもつが、変異株サツカロミセス　セリビシア
エＸ−２１８０−ＩＡ−５から得られるマンナンは直鎖
状であるｒカーボンヒトレート　リザーチ、８３巻、３
６３ページ、　１９８０年参照）。

次にサツカロミセス属酵母菌体からマンナンを抽出精製
する方法を述べる。

サツカロミセス属の酵母を大量に培養するには液体培養
が好都合であり、培地源として通常の微生物の培養に用
いられている各種の培地源が使用される。即ち、炭素源
としてはグルコース、ガラクトース、蔗糖、乳糖、マル
トース。

澱粉、澱粉加水分解物、デキス）　ＩＪン、糖蜜等の糖
類あるいはクエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、酒石酸
ソーダ、酢酸などの有機酸、脂肪酸あるいはこれらの塩
類、グリセリン、ソルビトール、ミオイノシトール、エ
タノール等のアルコールが使用できる。窒素源としては
利用可能な窒素化合物であればいずれでもよく２例えば
、カザミノ酸、カゼイン、カゼイン加水分解物、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスターチプリカー、
大豆粉、魚粉、綿実粉および硫酸アンモン、塩化アンモ
ンなどのアンモニウム塩が使用される。その他硝酸ソー
ダ、硝酸カリ、硝酸アンモニウムなどの硝酸塩、リン酸
二水素カリウム、リン酸二水素ソーダ、塩化ソーダ、塩
化カリ、塩化カルシウム、塩化第二鉄。

硫酸マグネシウム、硫酸ソーダ、硫酸カリ、硫酸マンガ
ンなどの塩類が必要に応じて使用される。

培養は通常好気的に行なわれ２通常振盪または通気攪拌
が好適である。培養温度は菌が発育する範囲内で適宜変
更しうるが２５〜４５℃であり、好適には２８〜３０℃
である。培養時間は種々の条件に呈；て異なるが２通常
２４〜２００時間程度であって、菌体数が最高値に達す
る時間を見計らって適当な時間に培養を終了する。

培養終了後培養物より菌体を採取するには。

これを遠心分離して下層の菌体部分を取り出すか、培養
物を濾過して菌体を取り出す。分離した菌体は蒸留水あ
るいは生理食塩液等で洗うことにより生湿菌を得ること
ができる。

次に培養して得られる酵母菌体からマンナンを抽出精製
する方法を記す。

上記のようにして得られた菌体を熱水抽出する。抽出溶
媒としては９例えば、水あるいは希アルカリ水溶液が挙
げられるが、この場合希アルカリ液で抽出を行なうとマ
ンナンよりグル力／が多く抽出されてくるので好ましく
なく水が好ましい。熱水抽出は加圧下（好適には３気圧
）に行なうのが好捷しく温度は１００〜１５０℃が好ま
しい。抽出時間は１〜５時間である。ついでこの抽出液
を透析後濃縮し、除タンパク操作を行なった後水溶性有
機溶媒を加え、析出する相多糖を得る。用いられる水溶
性有機溶媒と１、ては具体的にはエタノール、メタノー
ル、インプロパノ〜ル、アセトン等が挙げられる。つい
でこの粗多糖を少量の水に溶解し銅錯体溶液。

例えばフェーリング試液などで処理し銅−マンナンコン
プレックス体を得ろうこれを強酸型イオン交換樹脂で処
理し脱銅を行なう。ここで用いられる強酸型イオン交換
樹脂としては具体的にはアンバーライ）ＩＲ１２０，ア
ンバーライ）ＩＲｌｌｇ、　　アンバーライトｌＲ１２
１等が挙げられる。脱銅処理し得られる粗マンナン水溶
液を塩基で中和し濃縮後流水中透析を行なう。

ここで用いられる塩基としては２例えば、炭酸ソーダ、
炭酸カリ、水酸化ソーダ、水酸化カリ。

炭酸水素ンーｌ°、炭酸水素カリ等である。透析を行な
って得られる水溶液を濃縮後除タンパク処理を行ない、
ついで水溶性有機溶媒中に注ぎ込み析出する粉末状物質
を枦取する。この粗性マンナンをカラムクロマトグラフ
ィーにて水で溶出すれば中性マンナンが得られる。使用
されるカラムクロマトグラフィーの分離相としては具体
的にはジエチルアミノエチルセファデックス（ＤＥＡＥ
−ｓｅｐｈａｄｅｘ）、　　カルボキシメチルセルｏ　
−スセ７７デツクス（ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　）、
ジエチル７　ミ／　ｘチルセルａ−ス（ＤＥＡＥ−ｃｅ
ｌｌｕｌｏｓｅ）およびカルボキシメチルセルロース（
ＣＭ−ｃｅ−１１ｕｌｏｓｅ）等を挙げることができる
。

中性マンナンを分離後２食塩水で分画することによね酸
性マンナン（リンを含んでいるので酸性）が得られる。

種々のマンナンは次の略号で示す。

野性株酵母中性マンナン　　：ＷＮＭ 〃　　〃　酸性マンナン　　：ＷＡＮ 変異株　〃　直鎖中性マンナン：ＭＮＭ〃〃〃　　酸性
マンナン：ＭＡＭ これらのマンナンの化学分析結果は表１に示した。

本発明におけるマンナンの有効成分とする抗感染剤の形
態としては種々製剤が挙げられるが。

具体的には注射剤として使用するのが爵適である。注射
剤としては水溶性、非水溶性、懸濁性。

乳化性および粉末注射剤として用いるのがよく。

水溶性注射剤はマンナンを水性溶剤に溶解し。

必要に応じて等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤、溶
解補助剤などを添加し、充てん機を用いてアンプルまた
はビンに充てんし閉封後、゛滅菌することによって得ら
れる。

他の注射剤も常法によって製造することができる。

次に本ｉ明で得られるマンナンの抗感染作用。

有効量、投与方法および急性毒性等について以下説明す
る。

（１）抗感染作用 方法 マンナンは雄性ｄｄＹマウスの腹腔内に細菌接種の５日
前より１５０■、７ｋｇを５回投与シ、。

生存の有無を３０口間観察した。感染に使用した細菌は
黄色ブドウ球菌βＨ２４８株で８Ｘ１０’個をマウスの
静脈内に接種した。

結果 生存率はコントロール群０％（４日で金側死亡）、ＷＡ
Ｍ投与群で８０チ、ＭＮＭ、ＭＡＮ群で７０チ、ＷＮＭ
群で６０チであり。

マンナンに抗感染作用がみられ、酸性マンナンに強い傾
向があった。

（２）血清リゾチーム上昇作用 マンナン１５０ダ／ｋｌ？を１日１回、５ｏ間雄性ｄｄ
Ｙマウスの腹腔内に投与後、血清リゾチーム値を測定し
た。コントロール群の血清リゾチーム値は７４μｇ／−
に対し、マンナン投与群はＷＡＭ、ＷＮＭ、ＭＡＭ、Ｍ
ＮＭ群ともほぼ同じで、１１．０〜１１．３μ９／ｒｔ
ｔｌと血清リゾチームの上昇がみられた。このことから
、マンナンの抗感染作用はＬ部リゾチームの抗菌作用が
働いているものと思われる。

（３）急性毒性 実施例１で得たＭＮＭをｄｄＹ雄性マウス（体重２０±
２ｇ）の皮下、腹腔内、静脈内および経口的に投与し、
２４時間後の急性毒性を観察した。その結果９次に□示
す急性毒性値−（ＬＤ５．値）が得られた。（表３） 表３　急性毒性値（ＬＤ５Ｉ）値） ＭＡＭ、ＷＮＭ、ＷＡＭも同様な結果が得られた。

以上に示すごとく本発明のマンナン類は毒性がきわめて
低く、抗感染剤として非常に有用であることが判明した
。これらのマンナン類の投与量としては１日、３ｏ；ｊ
〜３００ダが適当である（成人）。

次に本発明の参考例および実施例を示すが。

これらによってなんら本発明が限定されるものではない
。

参考例１ ２１の坂ロコルペンに蒸留水１ｅを入れ、これにカザミ
ノ酸３ｇ、グルコース５０．Ｓ／、（−スト抽出物５Ｌ
　クエン酸ＩＬ　クエン酸ノーダ５ｇ、１）ン酸二水素
カリ０．５．５．９．塩化カリ０．４２５．９．硫酸マ
グネシウム７水塩ｏ、＋２５．９゜硫酸マンガン２．５
１＋１１９．塩化カルシウム２水塩０．１２５．！９．
第二塩化鉄６水塩２．５　＋＋タ、硫酸アンモン３．７
４Ｍ／およびイノシトール１０■を加え溶解させた。こ
れを綿栓し、オートクレーブ中１２０℃１５分間滅菌し
た。ついでサツカロミセス−セｌ　ヒシ７工Ｘ　−２１
８０−ＩＡ−５（Ｓａ　−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｘ−２１８０−Ｉ　Ａ　−５）を
無菌的にとの培地に接種し、３０℃にてロータリーシェ
ーカーで振盪し２ながら７２時間培養１２．同菌体含有
の培養物を得た。これを遠心分離器にかけ、３０００ｒ
ｐｍＩ　０分間遠心を行ない下層に分離する菌体を得、
これを生理食塩水１ １５０ｍｌでよく洗浄し、遠心分離を行ない生温菌体２
０９を得たつ 実　　施　　例　　１ 参考例１で得たサツカロミセス・セリビシアエＸ−２１
８０−ＩＡ−５（８ａｃｃＸ−２１８０−ＩＡ−５（８
ａｃｃｈａｒｏ　Ｘ−２１８０−ＩＡ−５）菌体５　ｋ
ｇに蒸留水１０１を加え加圧下（３気圧）１３５℃で２
時間抽出を行ない、冷却後遠心分離を行ない上澄液を分
取する。一方沈澱物にさらに蒸留水１０１を加え同様の
抽出操作を行ない得られる一Ｆ澄液を最初に得られた上
澄液と合Ｌ　ｊ全量が４１になるまで濃縮する。この濃
縮液をクロロホルム−ブタノール（５：１）９６０ｍｌ
で沈澱物が出なくなる壕で１５回洗浄する。ついでこの
濃縮液を０．５１に濃縮し、エタノール２１を加え沈澱
する粉末を炉取する。この粉末を水１１にｒ−□ 溶解！７．これにフェーリング試液をやや過剰に加え析
出する銅−マンナン錯体を枦取する。この銅−マンナン
錯体を２チ水酸化カリウム水溶２ 液で洗浄（７，ついで蒸留水に懸濁しアンバーライトＩ
　Ｒ１２０Ｈ”５００　Ｖを加え４５分間攪拌を行ない
濾過、ろ液を炭酸ソーダで中和し濃縮する。

ついで流水中透析を行な−クた後金竜が８０　＋１　ｍ
ｌになるまで濃縮し、この水溶液をエタノール中に注ぎ
込み沈澱する粉末を炉取し、ついで５％水溶液になるよ
うに水に溶解し、ジエチルアミノエチルセファデックス
１５ｇを用いたカラムクロマトグラフィー（径６　ｃｍ
　Ｘ長さ１００　ｃｒｒ＊　）に付し水で溶出する。と
の溶出液を濃縮後透析を行なう。２回カラムクロマトグ
ラフィー、濃縮および透析を繰り返し、得られる透析を
行なった水溶液を濃縮後エタノール中に注ぎ込み析出す
る粉末状物を炉取、室温下風乾し白色粉末状物としてＭ
ＮＭ９．９を得る。本市の性状は次の通りである。分子
量：約２４，０００．　　旋光度：〔α〕も０＝＋８０
．５°（Ｃ＝１．０．Ｈ２Ｏ中）、構成成分：糖９９，
０チ；窒素０．１チ；リン０．０チ。

３ 実施例２ ＭＮＭを溶出した後のカラムに０．０５Ｍおよび０．１
　Ｍ食塩水で溶出して除去し、０．２５Ｍ食塩水で溶出
した。溶出液を実施例１と同様に処理しＭＡＭ１５ｇを
得た。

実施例３ サツカロミセス　セリビシアエ野生株（Ｓａｃｃ−ｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌体を実施例
１および２のように処理してＷＮＭ９ｇ、ＶＡＮｌ　５
ｇを得た。

実施例４ 実施例１で得たＭＮＭ５９に無菌生理食塩水を加え溶解
し全量をｉ　ｏ　ｏ　ｍｌとし、この液を１ｄずつアン
プルに無菌的に分注、融閉後オートクレーブ中１２１℃
２０分間加熱滅菌を行ない水溶性注射剤を得た。

４ 実　　施　例　　５ 無菌５％注射用ブドウ糖液に実施例２で得たＭ　Ａ　Ｍ
　５．９を溶ｍｌ全量を１００ｍｌトＬ、　？ニー（Ｄ
液をｌ　ｍｅずつバイアルに無菌的に分注し、真空で乾
燥した。このようにして１バイアル中５０■のＭＡＭを
含む粉末注射剤ができた。

用時、注射用蒸留水に溶解して使用する。

実施例６ 実施例３で得たＷＮＭ５．９を無菌的に粉砕し。

これをダイズ油に無菌的に懸濁し全量を１００ｍ１とし
、１ｍｌずつアンプルに無菌的に分注する、融閉を行な
い非水性懸濁注射剤を得だ、実　　施　　例　　７ 実施例３で得たＷＡＭ５ｐを注射用蒸留中１０ｍ１に溶
解し、オートクレーブ中１２１°Ｇ２０分間１Ｊｎ熱域
菌し、これにポリソルベート０．５ｐおよびダイズ油を
加えて全量を１００ｍＪとし、良く攪拌し乳化液を作る
。これを無菌的にｌ　ｍｌｌずつアンプルに分注し、融
閉を行ない油中水滴型乳化性注射剤を得た。

特許出願人 グレラン製薬株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. サツカロミセス属に属する酵母から得られるマンナンか
   らなる抗感染性物質