JPH1152252A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ダイクロイックミラーを切換えることによっ
て、多重染色した試料の位置ずれのないしかも明るい多
重蛍光画像を得る。 【解決手段】 励起レーザ光を出射する光源１と、励起
レーザ光を反射させるとともに、蛍光を透過させ、光路
中に切換え可能に設けられた複数のダイクロイックミラ
ー１３と、励起レーザ光を試料上で２次元走査するＸＹ
スキャナ１４と、ＸＹスキャナ１４と試料との間に配置
された対物レンズ１８と、蛍光を観察するモニタ４０と
を備える蛍光顕微鏡において、画像取得時に光路に配置
されているダイクロイックミラー１３の種類に関する情
報を入力するコントローラ５０と、ダイクロイックミラ
ー１３における画像取得時の画像ずれ情報を記憶するメ
モリ３３と、コントローラ５０からの情報に基づいてメ
モリ３３に記憶された画像ずれ情報を読み出すととも
に、異なる種類のダイクロイックミラー１３によって得
られる画像が重ね合わさるようにＸＹスキャナ１４を制
御するコンピュータ３０とを設けた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は蛍光顕微鏡に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来の蛍光顕微鏡は、励起光を出射する
光源と、励起光を反射させるとともに、蛍光を透過さ
せ、光路中に切換え可能に設けられた複数のダイクロイ
ックミラーと、ダイクロイックミラーと試料との間に配
置された対物レンズと、ダイクロイックミラーを通過し
た蛍光を観察する観察装置とを備える。

【０００３】従来、多重蛍光染色された試料を観察する
ために、使用されている蛍光色素毎にダイクロイックミ
ラーを切換えて画像を取得し、取得した複数の画像を重
ね合わせて多重蛍光画像を取得する方法や、異なる２波
長での励起が可能なデュアルバンドフィルタや３波長で
の励起が可能なトリプルバンドフィルタ等のいわゆるマ
ルチバンドフィルタを使用し、多重蛍光画像を一度に取
得する方法等が用いられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の蛍光色素毎にダ
イクロイックミラーを切り換える方法では、各ダイクロ
イックミラーの加工精度、取付精度等の機械的精度に起
因して少しずつミラーの反射角が変わるため、取得した
画像間にも位置ずれが生じてしまい、複数の画像を正確
に重ね合わせることができないという問題があった。

【０００５】この問題を解決する方法として、取得した
各画像をコンピュータに取り込み、画像処理ソフトを用
いて操作者が目測で各画像のずれ量を補正することが考
えられる。

【０００６】しかし、この作業は非常に手間のかかるも
のであるとともに、各画像に写し出された試料の形状も
全く同じものではないため、非常に困難な作業である。

【０００７】また、上記のマルチバンドフィルタを使用
して多重蛍光画像を一度に取得する方法では、透過波長
域と反射波長域とが交互に現れるため、透過できる波長
域が制限される。

【０００８】図５はトリプルバンドフィルタの透過・反
射特性の一例を示す図、図６は蛍光色素ＦＩＴＣの吸収
度及び蛍光強度特性を示す図、図７は蛍光色素Ｃｙ３．
５の吸収度及び蛍光強度特性を示す図、図８は蛍光色素
Ｃｙ５の吸収度及び蛍光強度特性を示す図である。

【０００９】例えば、上記図５に示したトリプルバンド
フィルタを使用して蛍光色素ＦＩＴＣ、Ｃｙ３．５、Ｃ
ｙ５で三重染色した試料を観察する場合、トリプルバン
ドフィルタと試料から放出される蛍光との特性が完全に
は一致しないため、検出器で検出される蛍光が少なくな
ってしまう。

【００１０】試料から放出される蛍光は微弱であるの
で、蛍光の減少によって観察装置で観察される試料の画
像が暗くなってしまう等の問題がある。

【００１１】この問題はデュアルバンドフィルタであっ
ても同様に起きる。

【００１２】また、デュアルバンドフィルタやトリプル
バンドフィルタは透過波長及び反射波長の組合せを細か
く指定して製造することが困難であるため、蛍光色素に
応じて最適のフィルタを入手することは難しく、場合に
よっては不可能になってしまう（例えば使用する試薬の
波長が非常に接近しているときには対応するフィルタを
製造できない）という問題がある。

【００１３】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題はダイクロイックミラーを切り換え
ることによって、多重染色した試料の位置ずれのないし
かも明るい多重蛍光画像を得ることが可能な蛍光顕微鏡
を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明の蛍光顕微鏡は、励起光を発する
光源と、試料を載置するステージと、光路中に切換可能
に設けられ、前記光源からの励起光を反射するととも
に、前記試料からの蛍光を透過する複数の光分離手段
と、前記光分離手段を透過した蛍光の画像を得る観察手
段とを有する蛍光顕微鏡において、画像取得時に前記光
路に配置されている前記光分離手段の種類に関する情報
を入力する入力手段と、前記各光分離手段における画像
取得時の画像ずれ情報を記憶する記憶手段と、前記入力
手段からの情報に基づいて、前記記憶手段に記憶された
画像ずれ情報を読み出すとともに、異なる種類の前記光
分離手段によって得られる画像が重ね合わさるように前
記観察手段又は前記ステージを制御する制御手段とを有
することを特徴とする。

【００１５】入力手段によって制御手段に入力された、
光分離手段の種類に応じた誤差等の情報を記憶してお
き、画像取得時、この情報に基づいて観察手段又はステ
ージを制御して取得画像のずれを補正する。

【００１６】請求項２記載の発明の蛍光顕微鏡は、励起
レーザ光を出射する光源と、前記励起レーザ光を反射さ
せるとともに、蛍光を透過させ、光路中に切換え可能に
設けられた複数の光分離手段と、前記励起レーザ光を試
料上で２次元走査する走査手段と、前記走査手段と試料
との間に配置された対物レンズと、前記光分離手段を透
過した蛍光の画像を得る観察手段とを備える蛍光顕微鏡
において、画像取得時に前記光路に配置されている前記
光分離手段の種類に関する情報を入力する入力手段と、
前記各光分離手段における画像取得時の画像ずれ情報を
記憶する記憶手段と、前記入力手段からの情報に基づい
て前記記憶手段に記憶された画像ずれ情報を読み出すと
ともに、異なる種類の前記光分離手段によって得られる
画像が重ね合わさるように前記走査手段を制御する制御
手段とを備えていることを特徴とする。

【００１７】入力手段によって制御手段に入力された、
光分離手段の種類に応じた誤差等の情報を記憶してお
き、画像取得時、この情報に基づいて走査手段を制御し
て取得画像のずれを補正する。

【００１８】請求項３記載の発明の蛍光顕微鏡は、請求
項１又は２に記載の蛍光顕微鏡において、前記入力手段
は前記光路に配置される前記光分離手段の種類を識別す
る検出手段を備えることを特徴とする。

【００１９】光路に配置される光分離手段の種類を識別
する検出手段によって光分離手段の種類を識別する。

【００２０】請求項４記載の発明の蛍光顕微鏡は、請求
項２記載の蛍光顕微鏡において、前記走査手段は、ガル
バノ式走査ミラーを備え、前記制御手段は、前記記憶手
段に記憶されたずれ情報に基づいて、前記ガルバノ式走
査ミラーの反射角を制御するオフセット電圧を調整する
ことを特徴とする。

【００２１】記憶手段に記憶されたずれ情報に基づいて
ガルバノ式走査ミラーの反射角を制御するオフセット電
圧を調整するので、ガルバノ式走査ミラーをアナログ制
御して正確にずれ量を補正できる。

【００２２】請求項５記載の発明の蛍光顕微鏡は、請求
項１に記載の蛍光顕微鏡において、前記観察手段は、前
記光源からの光が前記試料に照射される領域から画像取
得領域を選択し、前記制御手段は、前記記憶手段に記憶
されたずれ情報に基づいて、前記観察手段による画像取
得を開始するタイミングを制御することを特徴とする。

【００２３】光源からの光が試料に照射される領域から
実際に画像として取得する画像取得領域を選択し、記憶
手段に記憶されたずれ情報に基づいて、観察手段による
画像取得領域をずらす。

【００２４】請求項６記載の発明の蛍光顕微鏡は、請求
項１に記載の蛍光顕微鏡において、前記制御手段は、前
記記憶手段に記憶されたずれ情報に基づいて、前記ステ
ージの位置を制御することを特徴とする。

【００２５】記憶手段に記憶したずれ情報に基づいて、
ステージを垂直方向及び水平方向にオフセットし、画像
を重ね合わせる。

【００２６】請求項７記載の発明の蛍光顕微鏡は、請求
項１〜６のいずれかに記載の蛍光顕微鏡において、前記
対物レンズの１次像面に配置された図形パターンを更に
有し、前記観察手段は、前記各光分離手段毎の前記図形
パターンの画像を取得し、取得した画像の１つを基準と
して他の画像のずれ量を算出するとともに、ずれ情報と
して前記記憶手段に記憶させることを特徴とする。

【００２７】光分離手段毎のずれ量を図形パターンのず
れ量から算出して記憶し、画像取得時、記憶されたずれ
量に基づいて前記観察手段、ステージ又は走査手段を制
御する。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施形態を添付
図面に基づいて説明する。

【００２９】図１はこの発明の蛍光顕微鏡の一実施形態
である共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図であ
る。

【００３０】この共焦点レーザ走査顕微鏡は、レーザ光
源１と、共焦点レーザ走査顕微鏡本体（顕微鏡本体）１
０と、コンピュータ３０とを備える。

【００３１】顕微鏡本体１０は、励起フィルタ１１と、
ビームエクスパンダ１２と、ダイクロイックミラー（光
分離手段）１３と、ＸＹスキャナ（走査手段）１４と、
スキャナドライバ１５と、集光レンズ１６と、図形パタ
ーンターゲット１７と、対物レンズ１８と、バリアフィ
ルタ１９と、集光レンズ２０と、ピンホール２１と、検
出器２２とを備える。

【００３２】励起フィルタ１１はレーザ光源１から出射
される所定の波長のレーザ光だけを通過させる特性を有
する。

【００３３】ビームエクスパンダ１２はレンズ１２ａ，
１２ｂからなり、レーザ光を対物レンズの瞳面を満たす
大きさにする。

【００３４】ダイクロイックミラー１３はレーザ光を反
射させ、励起された試料が発する蛍光を透過させる。ダ
イクロイックミラー１３は特性の異なる複数のダイクロ
イックミラーＡ，Ｂ，Ｃ…からなり、それぞれが光路中
に挿脱可能に設けられている。

【００３５】ＸＹスキャナ１４はガルバノ式走査ミラー
１４Ａ，１４Ｂからなり、試料に入射するレーザ光を２
次元走査する。

【００３６】スキャナドライバ１５はガルバノ式走査ミ
ラー１４Ａ，１４Ｂを駆動するガルバノメータドライバ
１５Ａ，１５Ｂからなる。ガルバノメータドライバ１５
Ａ，１５Ｂは後述する画像処理装置の信号に基づいてガ
ルバノ式走査ミラー１４Ａ，１４Ｂの駆動を制御する。

【００３７】図形パターンターゲット１７は集光レンズ
１６で形成される１次像面に、スライダ１７Ａによって
挿脱可能に配置される。

【００３８】対物レンズ１８は図形パターンターゲット
１７を通過したレーザ光を試料面２３に集光させる。

【００３９】バリアフィルタ１９はダイクロイックミラ
ー１３で反射されず、透過したレーザ光をカットする。

【００４０】集光レンズ２０はダイクロイックミラー１
３とバリアフィルタ１９とを透過した蛍光を集光させ
る。

【００４１】ピンホール２１は対物レンズ１８の焦点面
（試料面２３）と共役な位置に設けられ、試料面２３の
結像部で発した蛍光だけを通過させる。

【００４２】検出器２２はピンホール２１を通過した蛍
光を検出し、入力した蛍光を光強度を表す信号に変換
し、モニタ（観察手段）４０によって試料面２３の画像
化を図る。

【００４３】コンピュータ３０は画像化のための画像処
理装置３１、Ｄ／Ａコンバータ３２及びメモリ（記憶手
段）３３を備える。画像処理ボードや演算回路、汎用Ｉ
／Ｏボード等で画像処理装置３１が構成され、この画像
処理装置３１には図形パターンターゲット１７の図形の
位置ずれを定量化するための画像処理用ソフトウエアが
インストールされている。

【００４４】画像処理装置３１は、ガルバノ式走査ミラ
ー１４Ａ，１４Ｂの制御電圧に対する位置、及び制御電
圧の変化に対するガルバノ式走査ミラー１４Ａ，１４Ｂ
の移動量を予め記憶しており、これに基づいて、図形パ
ターンターゲット１７の画像ずれを補正するための制御
信号をＤ／Ａコンバータ３２を介してガルバノメータド
ライバ１５Ａ，１５Ｂに出力し、ガルバノメータ制御信
号１５ａ，１５ｂのオフセット電圧を微調整する。

【００４５】コンピュータ３０は光路中に配置されてい
るダイクロイックミラー１３の種類を入力するコントロ
ーラ（入力手段）５０を備える。このコントローラ５０
は光路中に配置されているダイクロイックミラー１３の
種類を識別するセンサ（検出手段）２５を備える。

【００４６】図２は図形パターンターゲットのパターン
例を示す図である。

【００４７】図形パターンターゲット１７にはガラス平
板に後述する反射パターンが描かれている。

【００４８】図２（ａ）は中心付近に１つの点を配置し
た例を示し、この１つの点を基準としてＸ，Ｙ方向のず
れ量を算出する。

【００４９】図２（ｂ）はグリッドパターンを配列した
例を示し、グリッドの交点のうちの数点を基準として
Ｘ，Ｙ方向のずれ量を算出する。

【００５０】図２（ｃ）は複数の点を格子状に配列した
例を示し、各点のうちの数点を基準としてＸ，Ｙ方向の
ずれ量を算出する。

【００５１】図２（ｄ）は十字を複数個格子状に配列し
た例を示し、十字の中心のうちの数点を基準としてＸ，
Ｙ方向のずれ量を算出する。

【００５２】上記構成の共焦点レーザ走査顕微鏡の動作
を説明する。

【００５３】光源１から出射された励起レーザ光は、励
起フィルタ１１を通過した後、ビームエクスパンダ１２
に入射し、このビームエクスパンダ１２で対物レンズ１
８の瞳面を満たせる大きさに拡大される。

【００５４】この励起レーザ光は、ダイクロイックミラ
ー１３によって反射された後、ＸＹスキャナ１４によっ
て２次元的に振られ、集光レンズ１６、図形パターンタ
ーゲット１７及び対物レンズ１８を介して試料面２３上
に照射され、試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生さ
せる。

【００５５】この蛍光は励起レーザ光とともに対物レン
ズ１８、図形パターンターゲット１７及び集光レンズ１
６からＸＹスキャナ１４へと光路を逆行し、ダイクロイ
ックミラー１３で励起レーザ光と分離される。

【００５６】バリアフィルタ１９でレーザ光がカットさ
れた蛍光は集光レンズ２０で集光され、試料面２３の所
定のスライス面の蛍光だけがピンホール２１を通過す
る。その後、蛍光は検出器２２で受光されて電気信号に
変換され、モニタ４０で画像として表示される。

【００５７】図３はコンピュータによる顕微鏡本体の制
御手順を説明するフローチャートである。なお、Ｓ１〜
Ｓ２１は各ステップを示す。まず、図形パターンターゲ
ット１７を用いて基準座標を算出し、記憶する工程につ
いて説明する。

【００５８】操作者は、スライダ１７Ａを駆動して所定
の図形パターンターゲット１７を一次像面に挿入する
（Ｓ１）。

【００５９】次に操作者は、任意のダイクロイックミラ
ーＡを光路に設置する（Ｓ２）。

【００６０】以下、Ｓ３〜Ｓ７はコンピュータ３０によ
る制御フローである。

【００６１】コンピュータ３０は、このダイクロイック
ミラーＡを用いて図形パターンターゲット１７の画像を
取得する（Ｓ３）。

【００６２】取得した画像を画像処理装置に入力する
（Ｓ４）。

【００６３】図形パターンターゲットから任意の複数の
点を指定する（Ｓ５）。

【００６４】指定した全ての点の位置情報（ＸＹ座標）
を算出する（Ｓ６）。

【００６５】このＸＹ座標を基準座標としてメモリ３３
に記憶させる（Ｓ７）。

【００６６】次に、この基準座標に基づいて上記ダイク
ロイックミラーＡ以外のダイクロイックミラーＢ，Ｃ…
のずれ量を算出し、記憶する工程について説明する。

【００６７】操作者は、ダイクロイックミラーＢを光路
に設置する（Ｓ８）。

【００６８】以下、Ｓ９〜Ｓ１３はコンピュータ３０に
よる制御フローである。

【００６９】コンピュータ３０は、このダイクロイック
ミラーＢを用いて図形パターンターゲット１７の画像を
取得する（Ｓ９）。

【００７０】取得した画像を画像処理装置に入力する
（Ｓ１０）。

【００７１】図形パターンターゲット１７からダイクロ
イックミラーＡと同じ複数の点を指定する（Ｓ１１）。

【００７２】指定した全ての点の位置情報を算出する
（Ｓ１２）。

【００７３】この位置情報と基準座標とのずれ量を算出
し、メモリに記憶する（Ｓ１３）。

【００７４】上記ステップ８〜ステップ１３を他の全て
のダイクロイックミラー１３Ｃ…に対して行う。

【００７５】その後、スライダ１７Ａを駆動して図形パ
ターンターゲット１７を１次像面から外す（Ｓ１４）。

【００７６】次に、多重染色した試料を載置し、その多
重画像を取得する工程について説明する。

【００７７】操作者は、ダイクロイックミラーＡを光路
に設置する（Ｓ１５）。

【００７８】コンピュータ３０は、試料の画像を取得す
る（Ｓ１６）。

【００７９】次に操作者は、ダイクロイックミラーＢを
光路に設置する（Ｓ１７）。

【００８０】コンピュータ３０は、ダイクロイックミラ
ーＢのダイクロイックミラーＡとのずれ量をＤ／Ａコン
バータ３２でアナログ信号に変換し（Ｓ１８）、ガルバ
ノメータドライバ１５Ａ，１５Ｂに出力する（Ｓ１
９）。

【００８１】このアナログデータ信号に基づいてガルバ
ノメータドライバ１５Ａ，１５Ｂはガルバノメータ制御
信号１５ａ，１５ｂのオフセット電圧を微調整し、ガル
バノ式走査ミラー１４Ａ，１４Ｂの位置を補正する（Ｓ
２０）。

【００８２】補正後、試料の画像を取得する（Ｓ２
１）。

【００８３】上記ステップ１７〜ステップ２１を他の全
てのダイクロイックミラーＣ…に対して行う。

【００８４】なお、ダイクロイックミラー１３は、同じ
ダイクロイックミラーであれば、何度切り換えしても位
置ずれを起こさないので、予め全てのダイクロイックミ
ラー１３に関して上記のようにずれ量を記憶しておけ
ば、ダイクロイックミラー１３を切り換える度に、図形
パターンターゲット１７を用いて位置ずれを補正してか
ら画像を取得する必要はない。

【００８５】この実施形態によれば、ダイクロイックミ
ラー１３を切り換えるだけで位置ずれのない画像を取得
することができる。しかも、蛍光色素毎に最適なダイク
ロイックミラー１３を使用できるので、検出器２２で検
出される蛍光量を増大でき、画像がマルチバンドフィル
タのように暗くなってしまうこともない。

【００８６】図４は多重画像の取得方法（Ｓ１５〜Ｓ２
１）の変形例を説明する図である。

【００８７】上記実施形態では画像毎にガルバノメータ
ドライバ１５Ａ，１５Ｂを駆動して補正しながらずれの
ない画像を取得するようにしたが、この変形例では画像
取得時にはガルバノメータドライバ１５Ａ，１５Ｂを駆
動せず、画像取得を開始するタイミングをずらす。

【００８８】すなわち、図４に示すようにメモリ３３に
記憶したずれ量に基づいて垂直方向オフセットＶｏ及び
水平方向オフセットＨｏを微調整し、各ダイクロイック
ミラー使用時に得た画像を重ね合わせるようにした。

【００８９】図４において、領域Ａ１はスキャン領域、
領域Ａ２は画像取得領域、領域Ａ３は垂直方向オフセッ
トＶｏ及び水平方向オフセットＨｏをメモリ３３に記憶
されたずれ量に応じて変更した後の領域である。

【００９０】この変形例によれば上記実施形態と同様の
効果を発揮することができるとともに、画像の重合せ処
理が省略され、処理時間を短縮することができる。

【００９１】また、多重画像の取得方法（Ｓ１５〜Ｓ２
１）の更なる変形例を以下に説明する。

【００９２】上記実施形態ではガルバノメータドライバ
１５Ａ，１５Ｂを駆動して画像ずれを補正したが、この
変形例ではステージ２４の位置を移動して画像ずれを補
正する。

【００９３】図１に示すように、画像処理装置３１は、
各ダイクロイックミラーでの画像取得時に、メモリ３３
に記憶したずれ量に基づいて、Ｄ／Ａコンバータ３２を
介してステージ駆動装置２６に制御信号を送信する。

【００９４】ステージ駆動装置２６はこの制御信号に応
じて、各ダイクロイックミラーでの画像取得時にステー
ジ位置を調整する。

【００９５】このステージ位置の調整により、各ダイク
ロイックミラーで得た画像のずれが正確に補正される。

【００９６】この変形例によっても、上記実施形態と同
様の効果を発揮することができる。

【００９７】更に、ステップ１〜ステップ１４に示すよ
うに図形パターンターゲットを用いてずれ量を算出する
のではなく、各ダイクロイックミラー１３の傾斜角の誤
差量を予め計測しておき、その計測値からずれ量を算出
し、これらのずれ量をコントローラ５０を介してメモリ
３３に記憶しておき、上記実施形態と同様にステップ１
５〜ステップ２１によってずれのない画像を取得するよ
うにしてもよい。

【００９８】なお、上記実施形態では、図形パターンタ
ーゲット１７を１次像面に設けたが、一定位置に保持で
きれば１次像面に限らず光路上の任意の位置に設けても
よく、例えば試料面２３に設けることも可能である。

【００９９】また、上記実施形態ではコンピュータを用
いソフトウェア処理を行う構成例を示したが、ランダム
ロジック回路を用いてガルバノメータドライバ１５Ａ，
１５Ｂの駆動を制御するようにしてもよい。

【０１００】また、本発明は上記実施形態及びその変形
例で示した共焦点レーザ走査顕微鏡に限るものではな
く、超高圧水銀灯やハロゲンランプ等を用いた通常の蛍
光顕微鏡に用いることができる。

【０１０１】この場合、ＸＹスキャナが無いため、この
部材によるずれ補正はできないが、ステージの位置制御
によるずれ補正は可能である。

【０１０２】また、観察手段としてＣＣＤカメラを用い
た場合、図４に示すＡ１をＣＣＤカメラの受光領域、Ａ
２，Ａ３を実際に画像として取得する画像取得領域とす
れば、この画像取得領域をずらすことにより、画像ずれ
を補正することができる。

【０１０３】

【発明の効果】以上に説明したように請求項１に記載の
発明の蛍光顕微鏡によれば、入力手段によって制御手段
に入力された、光分離手段の種類に応じた誤差等の情報
を記憶しておき、画像取得時、この情報に基づいて観察
手段又はステージを制御して取得画像のずれを補正する
ので、ずれのないしかも明るい多重画像を得ることがで
きる。

【０１０４】請求項２に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、入力手段によって制御手段に入力された、光分離手
段の種類に応じた誤差等の情報を記憶しておき、画像取
得時、この情報に基づいて走査手段を制御して取得画像
のずれを補正するので、ずれのないしかも明るい多重画
像を得ることができる。

【０１０５】請求項３に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、光路に配置される光分離手段の種類を識別する検出
手段によって光分離手段の種類を容易に識別できる。

【０１０６】請求項４に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、記憶手段に記憶されたずれ情報に基づいてガルバノ
式走査ミラーの反射角を制御するオフセット電圧を調整
するので、ガルバノ式走査ミラーをアナログ制御して正
確にずれ量を補正できる。

【０１０７】請求項５に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、光源からの光が試料に照射される領域から実際に画
像として取得する画像取得領域を選択し、記憶手段に記
憶されたずれ情報に基づいて、観察手段による画像取得
領域をずらすので、画像ずれが補正される。

【０１０８】請求項６に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、記憶手段に記憶したずれ情報に基づいて、ステージ
を垂直方向及び水平方向にオフセットし、画像を重ね合
わせるので、画像ずれが補正される。

【０１０９】請求項７に記載の発明の蛍光顕微鏡によれ
ば、光分離手段毎のずれ量を図形パターンのずれ量から
算出して記憶し、画像取得時、記憶されたずれ量に基づ
いて観察手段、ステージ又は走査手段を制御するので、
取得画像のずれが補正される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はこの発明の蛍光顕微鏡の一実施形態に係
る共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。

【図２】図２は図形パターンターゲットのパターン例を
示す図である。

【図３】図３はコンピュータによる顕微鏡本体の制御手
順を説明するフローチャートである。

【図４】図４は多重画像の取得方法の変形例を説明する
図である。

【図５】図５はトリプルバンドフィルタの透過・反射特
性の一例を示す図である。

【図６】図６は蛍光色素ＦＩＴＣの吸収度及び蛍光強度
特性を示す図である。

【図７】図７は蛍光色素Ｃｙ３．５の吸収度及び蛍光強
度特性を示す図である。

【図８】図８は蛍光色素Ｃｙ５の吸収度及び蛍光強度特
性を示す図である。

【符号の説明】

１ レーザ光源 １３ ダイクロイックミラー（光分離手段） １４ ＸＹスキャナ（走査手段） １４Ａ，１４Ｂ ガルバノ式走査ミラー １８ 対物レンズ ２５ センサ（検出手段） ３０ コンピュータ（制御手段） ３３ メモリ（記憶手段） ４０ モニタ（観察手段） ５０ コントローラ（入力手段）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 励起光を発する光源と、 試料を載置するステージと、 光路中に切換可能に設けられ、前記光源からの励起光を
   反射するとともに、前記試料からの蛍光を透過する複数
   の光分離手段と、 前記光分離手段を透過した蛍光の画像を得る観察手段と
   を有する蛍光顕微鏡において、 画像取得時に前記光路に配置されている前記光分離手段
   の種類に関する情報を入力する入力手段と、 前記各光分離手段における画像取得時の画像ずれ情報を
   記憶する記憶手段と、 前記入力手段からの情報に基づいて、前記記憶手段に記
   憶された画像ずれ情報を読み出すとともに、異なる種類
   の前記光分離手段によって得られる画像が重ね合わさる
   ように前記観察手段又は前記ステージを制御する制御手
   段と、を有することを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 励起レーザ光を出射する光源と、 前記励起レーザ光を反射させるとともに、蛍光を透過さ
   せ、光路中に切換え可能に設けられた複数の光分離手段
   と、 前記励起レーザ光を試料上で２次元走査する走査手段
   と、 前記走査手段と試料との間に配置された対物レンズと、 前記光分離手段を透過した蛍光の画像を得る観察手段と
   を備える蛍光顕微鏡において、 画像取得時に前記光路に配置されている前記光分離手段
   の種類に関する情報を入力する入力手段と、 前記各光分離手段における画像取得時の画像ずれ情報を
   記憶する記憶手段と、 前記入力手段からの情報に基づいて前記記憶手段に記憶
   された画像ずれ情報を読み出すとともに、異なる種類の
   前記光分離手段によって得られる画像が重ね合わさるよ
   うに前記走査手段を制御する制御手段とを備えているこ
   とを特徴とする蛍光顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記入力手段は前記光路に配置される前
   記光分離手段の種類を識別する検出手段を備えることを
   特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記走査手段は、ガルバノ式走査ミラー
   を備え、 前記制御手段は、前記記憶手段に記憶されたずれ情報に
   基づいて、前記ガルバノ式走査ミラーの反射角を制御す
   るオフセット電圧を調整することを特徴とする請求項２
   に記載の蛍光顕微鏡。
5. 【請求項５】前記観察手段は、前記光源からの光が前記
   試料に照射される領域から画像取得領域を選択し、 前記制御手段は、前記記憶手段に記憶されたずれ情報に
   基づいて、前記観察手段による画像取得を開始するタイ
   ミングを制御することを特徴とする請求項１に記載の蛍
   光顕微鏡。
6. 【請求項６】前記制御手段は、前記記憶手段に記憶され
   たずれ情報に基づいて、前記ステージの位置を制御する
   ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
7. 【請求項７】 前記対物レンズの１次像面に配置された
   図形パターンを更に有し、 前記観察手段は、前記各光分離手段毎の前記図形パター
   ンの画像を取得し、取得した画像の１つを基準として他
   の画像のずれ量を算出するとともに、ずれ情報として前
   記記憶手段に記憶させることを特徴とする請求項１〜６
   のいずれかに記載の蛍光顕微鏡。