JPH11510507A

JPH11510507A - 細胞由来の抗原提示小胞

Info

Publication number: JPH11510507A
Application number: JP9508341A
Authority: JP
Inventors: イェー．ヘウゼ，ヨハネス; イェー．エム．メリエフ，コルネリス
Original assignee: リュークスウニベルジテートトゥライデン; ウニベルジテートユートレヒト
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-05
Publication date: 1999-09-14
Also published as: US20030198642A1; CA2225553A1; AU6632496A; ATE319477T1; DE69635895D1; EP0841945A1; WO1997005900A1; EP0841945B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、予防接種、特にペプチドを抗原とする予防接種に用いる新規な小胞を提供するものである。この新規な小胞はエキソソーム（exosome）と呼ばれる。エキソソームは、抗原提示細胞のＭＨＣ抗原クラスIIに富むコンパートメントから得られる。エキソソームはその表面にＭＨＣ抗原クラスII及び／又はＭＨＣ抗原クラスＩを有する。また該ＭＨＣ抗原と共に、処理された抗原に由来するペプチドを含有していてもよい。従って、エキソソームは、ペプチドを自然と同じ状態で提示しうるという点で完全な予防接種用小胞である。ＭＨＣ抗原と共にエキソソーム中に含有されていてもよいペプチドは、エキソソームの原料となった抗原提示細胞によって処理されたものであってもよい。ＭＨＣ抗原だけを含有するエキソソームに、後からペプチドを導入してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】細胞由来の抗原提示小胞本発明は免疫の分野に関する。詳細には、免疫系における細胞応答、特に主要組織適合性遺伝子複合体抗原クラスＩ及び／又はクラスIIの存在下で提示されるペプチドによって誘導される細胞応答に関する。抗原提示細胞は、エンドサイトーシスによって抗原を細胞内に取り込み、その後、取り込んだ抗原を複数のペプチドに切断し、主要組織適合性遺伝子複合体抗原の存在下で細胞の表面に上記ペプチドを提示することが知られている。このような提示により、元の抗原に由来するペプチドが、例えばヘルパーＴ−リンパ球によって認識され、その結果、細胞免疫応答が活性化される。従って、ヘルパーＴ−細胞は、外因性の抗原を、Ｂ−リンパ球、マクロファージ、樹状細胞などの様々な抗原提示細胞(antigen presenting cells；APC)で発現されている主要組織適合遺伝子複合体抗原クラスII［Major histocompatibili ty complex（ＭＨＣ）class II molecule］に結合した状態で認識する(文献１) 。新たに産生されたＭＨＣ抗原クラスIIのα及びβサブユニットは、細胞膜に到達する前に、インバリアント鎖（invariant chain；I-chain）に結合し、細胞内のコンパートメントに輸送されることが確実に証明されている(文献２、３)。このコンパートメントにおいてI-chainは分解され、ＭＨＣ抗原クラスIIは、APCによって取り込まれた抗原の分解によって生じる抗原性のペプチドを結合することが可能な状態になる(文献１、４)。本発明者ら及び他の研究者らによって、大部分の細胞内ＭＨＣ抗原クラスIIは、リソソーム様であり、且つＭＨＣ抗原クラスIIに富むコンパートメント（ＭＨＣ-class II en riched compartment；ＭIIＣ）中に存在し、このコンパートメントは、特徴的な膜からなる小胞を含有し、同心円状に構成されたシート状の膜からなる構造を有することが明らかとなった（文献５、６、７、８、９、１０）。ＭIIＣおよび関連のあるＣIIＶ(文献１１)は、共にＭＨＣ抗原クラスIIと抗原性ペプチドが接触する場である。一旦ＭＨＣ抗原クラスIIが抗原性のペプチドと結合すると、ＭＨＣ抗原クラスIIは未知の経路によって細胞表面に輸送され、Ｔ−リンパ球に対して提示される。数種のヒトＢ−リンパ芽球様細胞株の細胞の凍結超薄切片を免疫金染色法を用いてラベル（immunogold labeled）し、電子顕微鏡下で観察したところ、ＭIIＣを取り囲む膜が、エキソサイトーシスの際に見られるような状態で（in an exoc ytotic fashion）細胞膜と繋がっているのが観察されたことから、細胞外小胞の存在が明らかになった(図１Ａ及び１Ｂ)。このことから、細胞膜と融合していない小胞がＭIIＣ内に存在すると考えられる。エキソソーム(exosome)と称する、上記と同様の小胞の分泌が網状赤血球において見出されている(文献１３)。Ｂ− 細胞のエキソソームは、リソソーム膜タンパク質LAMP1（図１Ｂ）及びＭIIＣにおいて発現されていることが知られている CD63（図には示していない）に対する抗体を用いる方法によって免疫ラベルされる。LAMP1及びCD63のいずれも、細胞膜の他の部分には存在しない。細胞膜に融合したＭIIＣの境界膜はＭＨＣ抗原クラスIIに対する標識ではほとんど標識されず、高濃度のＭＨＣ抗原クラスIIは、細胞外に出されたエキソソームに存在した（図１Ａ及び１Ｂ）。ＭIIＣの内容物の放出について更に調べるために、ウシ血清アルブミンに結合させた金粒子（ＢＳＡＧ、粒子径５ｎｍ）をＢ−細胞に取り込ませた。その後細胞を洗浄し、ＢＳＡＧの非存在下で再インキュベートした。エンドサイトーシスにより外界から取り込まれた（exocytosed ）ＢＳＡＧを含むエキソソームが、ＢＳＡＧの取り込み開始から３０分後［パルス（pulse）：１０分、チェイス（chase）：２０分］にエキソサイトーシスが起こっている部分の断面（exocytotic profiles）が現れ始め（図１Ｂ）、取り込み開始から５０分後（パルス：１０分、チェイス：４０分）に消失した（図１Ａ）。発明者らは、ヒト由来Ｂ−細胞株の多胞ＭIIＣは細胞膜と融合することができ、これによって高濃度のＭＨＣ抗原クラスIIを含んだエキソソームを細胞外環境に放出する、との結論に達した。更に詳しく特徴付けを行うために、ヒト由来Ｂ−細胞株ＲＮの培地から、分画遠心によってエキソソームを単離した（図２）。得られた膜のペレット（pellet ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング法（Western blotting）による分析に付した。細胞を除去した後に遠心分離を行うと、ＭＨＣ抗原クラス IIを含有する膜の大半が 70,000ｇで沈降する［図２Ａ、６レーン（lane）目］。得られたペレット（70,000ｇ）は、ＭＨＣ抗原クラスIIに対する標識により標識される均質な小胞から構成されていた（図２Ｂ）。小胞は、ＭIIＣ中に存在する小胞や、超薄切片とした細胞のエキソサイトーシスが起こっている部分の断面に存在する小胞と形態的に同様であり（図１Ａ及び１Ｂ）、そのサイズは60〜80 nmの範囲であった。分泌されたＭＨＣ抗原クラスIIが膜に結合していることを生化学的に証明するために、得られたペレット(70,000ｇ)をショ糖密度勾配中で遠心分離することによって分別した（文献１４）。得られた勾配画分を煮沸・還元せずにウェスタンブロット分析に付した。その結果、ＭＨＣ抗原クラスIIは平衡密度 1.13ｇ／ｍｌに相当する位置に浮遊したことが確認された（図Ａ）。また、このことからＭＨＣ抗原クラスIIは膜小胞と結合していることがわかる。ＭＨＣ抗原クラスIIの大半は、ＳＤＳに対して安定な凝集物として勾配画分から回収された。このことは、ＭＨＣ抗原クラスIIが結合ペプチドにより安定化されていることを示している（文献１５）。即ち、これらの結果を総合すると、分泌ＭＨＣ抗原クラスIIは膜小胞と結合しており且つ結合ペプチドを有するということになる。ＭＨＣ抗原クラスIIの動態及び新たに産生されたＭＨＣ抗原クラスIIの媒地への放出の程度を調べるために、ＲＮ細胞を［³⁵Ｓ］−メチオニンを用いて４５分間代謝的にパルス標識した後、標識物質の非存在下で２４時間チェイスを行った（文献１６）。パルス標識の直後には、ＭＨＣ抗原クラスIIはＳＤＳに対して不安定なα−β−Ｉ-chain 複合体として免疫沈降（immun oprecipitated）した（図３Ｂ、レーン０）。チェイス開始後６時間後には、ＭＨＣ抗原クラスIIの一部が他のヒトＢ−細胞株に関して報告されている動態と一致する動態を示し、且つＳＤＳに対して安定なα−β−ペプチド複合体に変換された（文献２及び１７）。更に、チェイス開始後１２時間後には、ペレット状のエキソソームから［³⁵Ｓ］標識されたＭＨＣ抗原クラスIIの凝集物が回収されるようになり始めた。２４時間後迄に回収された［³⁵Ｓ］標識されたＭＨＣ抗原クラスIIの量は、新たに産生されたＭＨＣ抗原クラスIIの合計の１０＋４％（ｎ＝５）であった。新たに産生されたＭＨＣ抗原クラスIIが媒地中に比較的ゆっくりと分泌されていったことから、ＭＨＣ抗原クラスIIが細胞表面に到達するための経路は、恐らく、エキソサイトーシス中にＭIIＣの境界膜から細胞膜中に挿入されるという経路だけではないと考えられる。エキソソームの代わりに、細胞から分離された細胞膜断片、又は細胞破砕物の上清から回収した小胞を用いることができるか否かを調べるために、調製した細胞及びエキソソームをビオチン化し、ビオチン化タンパクのパターンを¹²⁵Ｉ−ストレプトアビジンを用いたウェスタンブロッティング分析により調べた（文献１８）。図３Ｃはエキソソームタンパク及び細胞膜タンパクのパターンの相違を表す。細胞膜のビオチン化タンパクは幅広いスペクトルを示すのに対し（図３Ｃ、レーン２）、エキソソームでは２種類のタンパクの濃縮が起こっていることがわかった（図３Ｃ、レーン３及び４）。抗ＭＨＣ抗原クラスIIモノクロナール抗体とビオチン化エキソソームタンパクとの免疫沈降反応により、これらの濃縮されたタンパクは、α、βサブユニットからなるＭＨＣ抗原クラスIIタンパクと同定された（図３Ｃ、レーン１）。さらに、エキソソームは高分子量のタンパクに相当する位置に２つの小バンドを有するが、細胞膜においては、該当する位置に明確なバンドは検出されない(図３Ｃ、レーン３及び４)。これらのタンパクもまた、抗ＭＨＣ抗原クラスII抗体により免疫沈降する（図３Ｃ、レーン１）。可能性の薄いことではあるが、細胞膜断片が実際には 70,000ｇペレット中にも存在し、この細胞膜断片がエキソソーム中のＭＨＣ抗原クラスIIタンパクの含有率が高いことの一因となっているという可能性について検討するために、ビオチン化細胞をホモジナイズし、ホモジネートを細胞培養上清と同様に処理した（文献１８）。極めて少量の細胞膜を 70,000ｇ遠心分離によりペレットとしたところ、予測通りにビオチン化タンパクのパターンが総細胞膜のパターンと一致することが確認された（図３Ｃ、レーン５）。細胞を［³⁵Ｓ］−メチオニンを用いて４５分間代謝的に標識した後、２４時間チェイスした（文献１６）際に、［³⁵ Ｓ］−トランスフェリンレセプター（TfR）（［³⁵S］−TfR）はチェイス中のどの時点においてもエキソソーム中では検出されなかった(データは示されていない)。この結果、TfRはＢ−細胞の細胞膜には含まれているが、ＭIIＣには含まれていないことがわかった（文献８、１０）。同時に、これらの観察結果は、エキソソームは細胞から分離された細胞膜に由来するものではなく、ＭＨＣ抗原クラスIIを特異的に多く含む膜小胞に対応するものであることを示す。ＭＨＣ抗原クラスIIの膜貫通（luminal）ドメインはエキソソームの外部に露出しているので（文献２０）、エキソソームはＴ−細胞に抗原を提示することができると考えられる。この仮説を検討するために、Mycobacterium Leprae由来のモデル抗原HSP 65の４１８〜４２７番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを、単離したエキソソームに結合させた。このエキソソームを、前記のペプチドをＨＬＡＤＲ１５の存在下で認識するＴ−細胞クローン２Ｆ１０に添加した。これと並行して、ＨＳＰ６５をエンドサイトーシスにより２４時間ＲＮ細胞に取り込ませた後、洗浄し、抗原の非存在下でさらに２４時間インキュベートした。抗原ペプチドと共にインキュベートしたペプチド（図４Ａ及びＣ）及び抗原と共にプレインキュベートしたエキソソーム（図４Ｂ及びＤ）のいずれにおいても、抗原特異的なＴ−細胞応答を誘発することが可能であった（文献２３）。５０％の応答を誘発するのに要したエキソソームの量は、３×１０⁵個のＲＮ細胞から得られる量のエキソソームに相当する量であった（図４Ｄ）。これに対し、もとのＲＮ細胞を用いて５０％の応答を誘発するためには、２×１０⁴個のＲＮ細胞を要した（図４Ｂ、文献２４）。この応答は、ＤＲ遺伝子により拘束されていた。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴ−細胞の増殖を完全に阻害したのに対し、抗ＨＬＡ− ＤＰ抗体は無効であった（図４Ｂ及びＤ）。これらのデータより、本発明者等は、Ｂ−細胞を原料としてＭIIＣ由来の微小胞（エキソソーム）を製造可能であり、これを用いてＴ−細胞応答を誘発することができるとの結論に達した（文献２５）。Ｂ−リンパ球によるＭIIＣ小胞のエンドサイトーシスは、細胞障害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の細胞障害性顆粒に含まれる小胞のエキソサイトーシスを連想させる（文献２６）。ＭIIＣ及び細胞障害性顆粒のいずれもリソソーム様の特性を持ち、内膜（internal membrane）を有する。ＣＴＬの細胞障害性顆粒の内小胞（internal vesicle）は、ＣＴＬが標的細胞と相互作用する際にエキソサイトーシスにより放出される。おそらく、標的細胞を殺す際に何らかの役割を果たしていると思われる。生体内において、Ｂ−細胞由来のエキソソームが細胞外で何らかの役割を果たしているか否かはまだわかっていない。濾胞性樹状細胞は、これを取り囲むＢ−細胞から未知の機構によって放出されるＭＨＣ抗原クラスIIを必要とすることが示唆されている（文献２７）。エキソソームが免疫系の異なる細胞間でＭＨＣ抗原クラスIIペプチドを輸送するための媒体（carrier）として機能している可能性について検討することは有意義である。生理的な条件下において、ＡＰＣが樹状細胞やマクロファージと同様にエキソソームを産生するか否かについて検討する必要がある（文献２８）。しかし、マクロファージにおけるリソソーム内容物の分泌についてはよく検討されており、マクロファージの管状（tubular）リソソームはＭＨＣ抗原クラスIIを多く含有し、且つ膜小胞を有している（文献２９）。生体内において、エキソソームはＭＨＣ抗原クラス IIペプチドを輸送するための媒体（carrier）として機能しており、このことが長期にわたるＴ−細胞における抗原の記憶及びＴ−細胞における寛容状態の維持に関与していると考えられる。以上のように、エキソソームは取得が容易で、又特異的且つ効果的に抗原を提示することができるので、免疫療法における生物学的小胞としての有用性について検討することは有意義である。従って、本発明は、Ｂ−細胞またはマクロファージ、樹状細胞、特に表皮のランゲルハンス細胞等の抗原提示細胞より得ることができ、天然から単離されている抗原提示小胞を提供するものである。好ましくは、これらの小胞は主要組織適合性遺伝複合体抗原クラスＩ及び／またはクラスII[human histocompatibility complex（MHC）Ｉ and/or II]を含有し、また抗原提示細胞により処理され得る抗原に由来する、又は対応するペプチドが更に導入されている小胞が最も好ましい。過去に、同様の小胞を、例えばリポソームの形で合成的に製造することが試みられたがこれまでのところ成功には至っていない。本発明者等は、驚くべきことに該リポソームに酷似する物が天然に存在することを発見した。これらの類似物は当然のことながら該リポソームとして目的に応じいかようにも適用することができる。本発明の小胞の主要な利点は、当然のことながら抗原提示のために必要なあらゆる要素を自動的に含有する点である。このような小胞が発見されたので、該小胞の更なる解析を進めることにより、該小胞における抗原の提示に不可欠な要素が何であるかをよりよく理解することができるようになるであろう。また、本発明の小胞は、当然のことながら細胞からの分離以外の方法によっても得ることができる。従って、製造方法または取得方法を問わず、本発明は、このような抗原提示に不可欠な要素を含有するあらゆる抗原提示小胞を包括する。例えば、少なくとも（組換え）ＭＨＣ抗原クラスＩまたはクラスIIの生物学的活性部分を含み、更に該ＭＨＣ抗原の存在下で提示されるべき抗原を処理する試薬を含有する合成リポソームが考えられる。また当然のことながら、このような小胞を産生する細胞に、組換えＭＨＣ抗原クラスＩまたはクラスIIをコードする遺伝子を含有させ、所望のＭＨＣ抗原クラスＩまたはクラスIIが最終的に得られる小胞等に提示されるようにすることもできる。ＭＨＣ抗原クラスＩまたはクラスIIの存在下でペプチドが提示されている小胞が好ましい。しかし、ペプチドは提示されていないが、該ＭＨＣ抗原クラスＩまたはクラスIIを表面に有する小胞の製造もまた非常に有益である。その場合、これら小胞に各々のＭＨＣ抗原に対し十分な親和性を有する所望のペプチドを導入することができる。当然のことながら、これらの小胞の用途としてまず考えられるものであり、またおそらく最も重要な用途として考えられるのは、それらの小胞の自然界における役割を模倣すること、例えばＴ−細胞を刺激するための抗原としてのペプチドを提示することである。従って、本発明の小胞は、例えばワクチンとして非常に好適に用いることができる。ワクチンは、ＭＨＣ抗原存在下で提示され得るペプチド抗原を有するいかなるタンパク性の物質に対しても、免疫反応を誘発するように設計することができる。当然のことながら、このワクチンは必要であれば、適当なアジュバント、担体，投与のための賦形剤等を含んでいてもよい。このワクチンは、感染症，免疫障害，悪性腫瘍等の様々な疾患の治療又は予防に用いることができる。当然のことながら、極めて重要な用途はエイズの治療又は予防，腫瘍等に対する免疫応答の誘発に用いることである。本発明の小胞の他の重要な用途は、例えば、多量の小胞を経口投与することにより、一定の抗原に対して寛容な状態を誘発するために用いることである。当業者には、具体的な例として以降の実験の部を参照する本発明の説明に基づき、本発明の意図から外れることなく、本発明の小胞の更なる用途を発見することが可能である。図面の簡単な説明図１：ＭIIＣは細胞内から外への輸送に関与するコンパートメントである。（図１Ａ）Ｔ２−DR３細胞を粒子径５nmのＢＳＡＧの存在下で１０分間インキュベートし、細胞を洗浄後、ＢＳＡＧの細胞内における固定化を４０分間行い、文献３０に示される方法で凍結超薄切片を作成した。得られた超薄凍結切片をウサギ抗ＭＨＣ抗原クラスIIポリクローナル抗体（文献５）を用いて免疫ラベルした。抗体結合部位は、金と結合させたプロテイン A（protein A conjugated to go ld；ＰＡＧ）（ＰＡＧの粒子径は図中にｎｍで表示した）を用いて可視化した。ＭＨＣ抗原クラスIIの存在によりラベルされた部分は、エキソサイトーシスが起こっている部分の断面（exocytotic profile）の境界膜部分及びエキソソーム上に見られた。更に、上記エキソサイトーシスが起こっている部分の断面には、細胞外に放出されようとしている多量のＢＳＡＧ粒子の存在も見受けられた。図中、ＰＭは細胞膜を示す。（図１Ｂ）ＲＮ細胞を、ＢＳＡＧを用いて１０分間パルスラベルし、ＢＳＡＧの細胞内における固定化を20分間行った。凍結超薄切片を、抗ＭＨＣ抗原クラスII 抗体とモノクローナル抗ＬＡＭＰ１抗体の両方を用い、文献３１の方法に従い二重に免疫ラベルした。電子顕微鏡写真には、２つの隣接する断面が写っている。即ち、ＢＳＡＧを包含する、エキソサイトーシスが起こっている部分の断面及びＭＨＣ抗原クラスIIとＬＡＭＰ１の存在によりラベルされた多数のエキソソームである。寸法尺度として示したバーは、0.1μｍを表わす。図２：細胞培養培地からのエキソソームの単離（図２Ａ）ＲＮ細胞を遠心分離により洗浄し、新たな培地にて２日間再培養した。２〜５×１０⁸個のＲＮ細胞を含有する細胞培養培地（３５ml）を３００ｇで１０分間ずつ２回遠心分離した（レーン１：１回目；レーン２：２回目）。レーン１は、０．６×１０⁶個の細胞に相当する量の物質を含んでいる。２〜５×１０⁸個の細胞に由来する、培養培地中の膜成分を以下の一連の遠心工程によってペレット化した：1,200ｇで２回（レーン３及び４）；10,000ｇで１回（レーン５）；70,000ｇで１回（レーン６）；及び100,000ｇで１回（レーン７）。ペレットを１００℃、還元条件下で可溶化し、［¹²⁵Ｉ］−プロテインＡを用いてウエスタンブロット分析を行った。各レーンには、１×１０⁵個の細胞に相当する量のサンプルを加えた。ＭＨＣ抗原クラスIIのα鎖及びβ鎖は、主にレーン１の細胞及びレーン６の70,000ｇペレットから得られた。（図２Ｂ）：ＭＨＣ抗原クラスIIを免疫金染色法により標識した70,000ｇペレットのホールマウント（whole mount）電子顕微鏡観察 70,000ｇペレットをＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた後、ホルムバール−カーボン被覆電子顕微鏡用グリッドに吸着させた。次いでこれを０．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液にて固定化し、ウサギ抗ＭＨＣ抗原クラスIIポリクローナル抗体及び粒子径１０ｎｍのＰＡＧを用いて免疫標識した後、文献３０に記載の染色法で凍結超薄切片を染色した。その結果、上記ペレットは、粒子系６０〜８０ｎｍの小胞からなり、またこの小胞にはＭＨＣ抗原クラスII標識法により標識される物質が多く含まれることがわかる。寸法尺度として示したバーは、０．２μｍを表わす。図３：（図３Ａ）培養液にあるＭＨＣ抗原クラスIIは、膜に結合している。 70,000ｇでの分画超遠心後、培養液からペレットとして得た膜は、ショ糖密度勾配に対して浮上させることによって分画した後、煮沸・還元していない各画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウサギ抗ＭＨＣ抗原クラスIIポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット法で分析した(文献１７)。ＭＨＣ抗原クラスIIは、１．２２〜１．１０ｇ／ｍｌの密度に対応する第５〜１２画分に回収された。ＭＨＣ抗原クラスIIの大部分は、分子量が５６〜６０ＫＤ（Ｃｏｃ／β）で、ＳＤＳに対して安定な凝集物であった。（図３Ｂ）新たに産生されたＭＨＣ抗原クラスIIの放出ＲＮ細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンで４５分間パルス標識し（レーン０）、標識物質の非存在下で、６、１２および２４時間チェイスした。ＭＨＣ抗原クラスIIを、細胞の融解物及びペレット化したエキソソームから、抗ＭＨＣ抗原クラスIIＤＡ６．２３１モノクロナール抗体（文献１８）を用い免疫沈降反応で沈降させた。免疫沈降反応で沈降させたＭＨＣ抗原クラスIIをセファロースビーズから非還元条件下室温で分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びフルオログラフィー(fluorography) で分析した。パルス標識直後（レーン０）には、ＭＨＣ抗原クラスIIは免疫沈降反応によりＳＤＳに対し不安定なα−β−インバリアント鎖複合体として細胞から沈降した。チェイス開始６時間後から、ＳＤＳに対し安定なα−βダイマーが細胞から回収され始め、その後信号強度が増加した。ＳＤＳに対し安定なα−βダイマーがエキソソームペレット中に出現し始めたのは、チェイス開始１２時間後であった。（図３Ｃ）エキソソーム及び細胞膜のビオチン化された蛋白質（文献１８）は異なったパターンを示す。細胞膜（レーン２）及び実験的に製造した細胞膜破砕物（レーン５）中の多数の蛋白質が、ビオチン化の後¹²⁵Ｉ−ストレプトアビジンを用いる方法により検出された（文献１８）。エキソソームからは、分子量が６０〜７０ＫＤである二つの主要な蛋白質が検出された（レーン３及び４、エキソソームの濃度を増加させている）。レーン１は、免疫沈降法によりエキソソーム融解物から得た沈降物から得た、ＭＨＣ抗原クラスIIのα及びβ鎖をビオチン化したものを示す。これらの分析において、α及びβ鎖の電気泳動における易動度が高いのは、高度にビオチン化されていることに基づく。分子量が２００〜３００ＫＤの２本の小さいバンドがエキソソーム中から検出された（レーン１，３及び４、矢印）が、細胞膜中からは検出されなかった。図４：ＣＤ４⁺Ｔ−細胞クローン２Ｆ１０に対する、ＨＬＡ−ＤＲ１５陽性のＲＮＢ −細胞及びエキソソームによる、ＨＳＰ６５抗原の提示（文献２２）。未処理細胞（Ａ）、抗原と共にプレインキュベートした細胞（Ｂ）、未処理細胞由来のエキソソーム（Ｃ）及び抗原と共にプレインキュベートした細胞由来のエキソソーム（Ｄ）に対する増殖反応。黒い印はＨＳＰ６５由来のペプチド（第４１８−４２７アミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列に相当）を添加後の増殖量を示し、白抜きの印は、ペプチドを添加しなかった場合の増殖量を示す。ＨＬＡ抗原クラスIIによる拘束の有無は、１０μｇ／ｍｌの抗−ＤＲ抗原(三角)の添加、抗−ＤＰ(円)の添加、並びに抗原を添加しないこと（四角）により確認される。最高濃度のエキソソームは、１．６×１０⁶個の細胞の培養液から得られる。全ての測定は３回行ない、結果はＴ−細胞に取り込まれた[³Ｈ]−チミジンのｃｐｍで表わされている。３回のｃｐｍ測定における平均の標準誤差（ＳＥＭ）は、１０％未満であった。実験結果は、ペプチドを添加した場合とペプチドを添加しなかった場合の両者について、典型的な測定結果が得られた例を２例ずつ示してある。引用文献及び注

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月２８日【補正内容】請求の範囲１．抗原提示細胞の培養上清より得ることができ、天然から単離されている抗原提示小胞。２．主要組織適合性遺伝子複合体抗原クラスＩ又はクラスII、或いはそれらの誘導体の少なくとも生物学的活性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載の小胞。３．少なくとも部分的に処理されている抗原を更に含有することを特徴とする、請求項２に記載の小胞。４．主要組織適合性遺伝子複合体抗原クラスＩ又はクラスIIの存在下に、処理された抗原が提示されていることを特徴とする、請求項３に記載の小胞。５．治療薬として利用されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の小胞。６．Ｂ−リンパ球、マクロファージ又は樹状細胞のいずれかに由来する小胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の小胞。７．請求項１〜４のいずれかに記載の小胞と共に常用のアジュバント又は担体を含有するワクチン組成物。８．免疫異常又は感染症の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の小胞の使用。９．培養細胞上清又は培養細胞融解物を分画遠心にかけて複数の細胞膜画分を得、それらから該小胞を含有する画分を回収することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の小胞の調製方法。１０．請求項３又は４のいずれかに記載の小胞をＴ−細胞に接触させることを含む、Ｔ−細胞免疫応答を刺激する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メリエフ，コルネリスイェー．エム. オランダ国、エヌエル−2312 アーフェーライデン、スタティオンスヴェフ 46、リュークスウニベルジテートトゥライデン

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原提示細胞より得ることができ、天然から単離されている抗原提示小胞。２．主要組織適合性遺伝子複合体抗原クラスＩ又はクラスII、或いはそれらの誘導体の少なくとも生物学的活性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載の小胞。３．少なくとも部分的に処理されている抗原を更に含有することを特徴とする、請求項２に記載の小胞。４．主要組織適合性遺伝子複合体抗原クラスＩ又はクラスIIの存在下に、処理された抗原が提示されていることを特徴とする、請求項３に記載の小胞。５．治療薬として利用されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の小胞。６．Ｂ−リンパ球、マクロファージ又は樹状細胞のいずれかに由来する小胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の小胞。７．請求項１〜４のいずれかに記載の小胞と共に常用のアジュバント又は担体を含有するワクチン組成物。８．免疫異常又は感染症の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の小胞の使用。９．培養細胞上清又は培養細胞融解物を分画遠心にかけて複数の細胞膜画分を得、それらから該小胞を含有する画分を回収することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の小胞の調製方法。１０．請求項３又は４のいずれかに記載の小胞をＴ−細胞に接触させることを含む、Ｔ−細胞免疫応答を刺激する方法。