JPH11510389A - 細胞タンパク質の機能を不活性化するためのタンパク質−タンパク質相互作用表面の拡張 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）結合タンパク質多量体への酸性アミノ酸拡張配列が、細胞タンパク質の機能を阻害し、これにより細胞の増殖を調節および制御しうる、新規な核酸結合タンパク質を提供する。核酸結合タンパク質は、一般にアミノ末端の多量体化または二量体化ドメインにおける拡張配列としてこれらのタンパク質に付加された、複数の酸性アミノ酸を含むように工学処理される。酸性拡張された核酸結合タンパク質は有効な優性ネガティブ体として作用し、これらはＡＰ１などの内因性トランス作用因子の活性化を阻害することが証明された。本発明は、特異的かつ安定に細胞調節タンパク質とヘテロ二量体化して細胞の増殖を制御しうるＤＮＡ結合タンパク質を形成するための新規方法を提供する。酸性拡張に適する核酸結合タンパク質には、転写調節タンパク質ファミリーの構成員子、たとえばそれぞれ特徴的なロイシンジッパーモチーフおよびヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフをもつｂＺＩＰおよびｂＨＬＨタンパク質が含まれる。核酸結合タンパク質の塩基性領域のアミノ末端拡張配列は、全部または一部が酸性であって細胞内の対応する天然タンパク質に対する強力な優性ネガティブ体を生成するアミノ酸残基配列からなる。酸性アミノ末端拡張配列は特異なタンパク質−タンパク質相互作用表面を付与し、天然タンパク質と酸性拡張タンパク質との安定な多量体化または二量体化を可能にし、これにより植物、動物、微生物およびウイルスを含めた多様な種の細胞タンパク質産物の阻害または不活性化によって、その機能を制御する。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞タンパク質の機能を不活性化するための タンパク質−タンパク質相互作用表面の拡張 発明の分野 本発明は、真核生物転写因子として機能する配列特異性ＤＮＡ結合タンパク質 、すなわち転写調節タンパク質の製造に関する。より詳細には本発明は特に、核 酸（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）結合ドメインをもち、その結合ドメインまた はタンパク質相互作用表面が酸性になるように工学処理または修飾された多量体 タンパク質の製造に関する。このような酸性多量体化ドメインをもつ核酸結合タ ンパク質は、それが結合する標的核酸配列または遺伝子の機能を調節し、これに より遺伝子転写ならびに細胞の成長および増殖に対する有効な優性ネガティブ（ ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）調節因子として作用することができる。 発明の背景 優性ネガティブタンパク質は、核酸結合タンパク質、すなわちＤＮＡ結合タン パク質、たとえば転写調節タンパク質が標的ＤＮＡ配列に結合するのを阻害して 、遺伝子機能を不活性化することができる（I.Herskowitz,1987,Nature,329:219 -222）。 塩基性領域ロイシンジッパー（“ｂＺＩＰ”）ＤＮＡ結合タンパク質は核酸結 合タンパク質の１ファミリー／クラスであり、二量体として特異的ＤＮＡ配列に 結合することにより遺伝子の転写を調節する真核転写調節タンパク質である。ｂ ＺＩＰタンパク質は２ドメイン、すなわちロイシンジッパー構造ドメインおよび 塩基性アミノ酸に富む塩基性ドメインをもつのが特徴である（C.Vinson et al., 1989,Science,246:911-916）。これらの２ドメインはフォークとして知られる短 いセグメントで分離されている。２つのｂＺＩＰタンパク質は、ロイシンジッパ ードメインが二量体化した超らせん（ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ）領域を形成する ことにより二量体化する。次いで塩基性領域が、特異的ＤＮＡ配列部位のＤＮＡ 分子の主溝と相互作用する。ＤＮＡへの結合によりこの二量体は安定化する。こ の 二量体化とＤＮＡ相互作用事象が真核生物遺伝子転写を調節する。 ロイシンジッパーモチーフは、酵母転写因子ＧＣＮ４、哺乳動物転写因子ＣＣ ＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質Ｃ／ＥＢＰ、ならびに核トランスフォーミ ング癌遺伝子産物ＦｏｓおよびＪｕｎを含めた多数のＤＮＡ結合タンパク質の一 次構造に共通であり、７残基ごとにロイシンアミノ酸が反復すること（すなわち ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）を特徴とし、この領域の残基は両親媒性α−ヘリ ックスを形成することができる。このロイシンに富む両親媒性ヘリックスは、カ ルボキシル末端で相互作用してロイシンジッパーと呼ばれる二量体複合体を形成 し（W.H.Landschultz et al.,1988,Science,240:1759-1764；A.D.Baxevanis and C.R.Vinson,1993,Curr.Op.Gen.Devel.,3:278-285）、その結果この二量体化領 域は超らせんを形成する（E.K.O'Shea et al.,1989,Science,243:538-542）。 ｂＺＩＰモチーフに類似する他のクラスのＤＮＡ結合タンパク質は塩基性領域 −ヘリックス−ループ−ヘリックス（“ｂＨＬＨ”）タンパク質である（C.Murr e et al.,1989,Cell,56:777-783）。ｂＨＬＨタンパク質も別個のドメインから 構成され、その構造によりそれらは特異的ＤＮＡ配列を認識してそれと相互作用 することができる。このヘリックス−ループ−ヘリックス領域は、その両親媒性 ヘリックスによりｂＺＩＰタンパク質のロイシンジッパー領域と同様な様式で二 量体化を促進する（R.I.Davis et al.,1990,Cell,60:733-746；A.Voronova and D.Baltimore,1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4722-4726）。限定ではないが 、ｂＨＬＨタンパク質の例はｍｙｃ、ｍａｘおよびｍａｄである。ｍｙｃおよび ｍａｄはヘテロ二量体として知られている。 ｂＺＩＰタンパク質の二量体化領域にロイシンジッパーが存在することにより 、ホモ二量体およびヘテロ二量体両方の形成によって高度の生物学的制御が可能 になる。たとえばヘテロ二量体は、ＦｏｓとＪｕｎ間で（D.Bohmann et al.,198 7,Science,238:1386-1392）、ＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーの構成員子間で（T.H ai et al.，1989,Genes Dev.,3:2083-2090）、Ｃ／ＥＢＰファミリーの構成員子 間で（Z.Cao et al.,1991,Genes Dev.,5:1538-1552；S.C.Williams et al.,1991 ,Genes Dev.,5:1553-1567；およびC.Roman et al.,1990,GenesDev.,4:1404-1415 ）およびＡＴＦ／ＣＲＥＢとＦｏｓ/Ｊｕｎファミリーの構成員子間で（T.Hai 及 びT.Curran，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3720-3724）形成されることが 知られている。一般にｂＺＩＰタンパク質の二量体化は、個々のカルボキシル末 端α−ヘリックス両方が互いに適正な位置で整列して対称超らせんを形成する可 能性に依存する。これによりアミノ末端塩基性領域が対称配向で配置され、こう してそれらがＤＮＡと相互作用しうる状態になる（A.D.Baxevanis and C.R.Vins on,1993,Curr.Op.Gen.Devel.,3:278-285）。超らせん内でヘリックスが互いに適 正な位置を見出す可能性は、本来個々のヘリックス自体により制御され、ＤＮＡ に対して塩基性領域を配置することによるものではないことが示されている（W. Pu and K.Struhl,1993,Nucleic Acids Research,21:4348-4355）。しかし、対称 超らせん構造の形成が種々のタイプの核酸結合タンパク質の多量体化または二量 体化ドメインの相互作用にとって必須要件でないことは自明であろう。 ｂＺＩＰタンパク質は真核生物界で高度に保存されており、酵母、植物および 動物において単離および同定された。これらのタンパク質は発癌、記憶、セグメ ンテーションおよびエネルギー調節を含めた多様な生物学的プロセスを仲介する （R.Boussoudan,1994,Cell,79:59-68；S.Cordes and G.Barsh,1994,Cell,79:102 5-1034；S.McKnight et al.,1989,Genes Dev.,3:2021-2024；およびI.Verma,198 6,Trends in Genetics,2:93-96）。したがって、たとえば発癌および細胞の異常 な成長や増殖に伴うこれらのタンパク質の活性を阻害できることが、この分野で 望まれている目標である。 さらに、細胞、組織、そして最終的には全生物体において有害であるか、また は望ましくない、もしくは不適切な表現型に影響を与える他の細胞タンパク質の 産生または機能を阻害することが、当業者の目的である。 現在までに同定されている約７０のｂＺＩＰタンパク質（H.Hurst,1994,Prote in Profiles,1:123-168）のうち大部分は、それらのＤＮＡ認識特性およびアミ ノ酸配列の類似性に基づいて５つの主なサブファミリーのいずれかに分類するこ とができる（P.F.Johnson,1993,Mol.Cell.Biol.,13:6919-6930）。これらのｂＺ ＩＰサブグループには、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ、Ｃ／ＥＢＰ、ＰＡＲおよ び植物Ｇボックスタンパク質が含まれる。各サブファミリーのタンパク質は、コ ンセンサス配列が２つの５塩基対ハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）から構成 される９または１０塩基対パリンドロームである、類似性または同一性の高いＤ ＮＡ部位を認識する。種々のクラスのｂＺＩＰタンパク質の結合部位は、それら のハーフサイト配列またはそれらのハーフサイトスペーシング特性により異なる 可能性がある。ＡＰ−１タンパク質、たとえばＦｏｓ、ＪｕｎおよびＧＣＮ４は 、１塩基対がオーバーラップした２つのハーフサイトとみることができる９塩基 対の偽パリンドローム配列に結合し、一方、他の４ファミリーに関するコンセン サス結合部位は直接に隣接したハーフサイト対をもつ（N.B.Haas et al.,1995,M ol.Cell.Biol.,15:1923-1932）。さらに、甲状腺刺激性胚因子（ｔｈｙｒｏｔｒ ｏｐｈ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＴＥＦ）、すなわち発生中の下垂 体前葉に発現する転写因子、および肝濃縮アルブミンのＤボックス結合タンパク 質（ＤＢＰ）（C.R.Mueller et al.,1990,Cell,61:279-291）が他のクラスのｂ ＺＩＰタンパク質を構成すると報告された（D.W.Drolet et al.,1991,Genes Dev .,5:1739-1753）。 転写ドメインを欠如するｂＺＩＰタンパク質は、一般にトランス作用（ｔｒａ ｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメインの遺伝的欠失により生じる天然の優性ネガ ティブ体である（A.Clark and K.Dougherty,1993,Biochem.J.,296:521-,541；P. Descombes and U.Schibler,1991,Cell,67:569-579；N.Foulkes et al.,1991,Cel l,64:739-749；およびJ.Yin et al.,1994,Cell,79:49-58）。これらのトランケ ートしたｂＺＩＰタンパク質は二量体化してＤＮＡに結合することができ、過剰 発現した場合には優性ネガティブ体として作用することができる。これは、内因 性ｂＺＩＰタンパク質とプロモーターＤＮＡ結合部位に対して、このタンパク質 が競合することによるのであろう。したがって、トランケートしたｂＺＩＰタン パク質は質量作用によって、正常なトランス作用因子をＤＮＡから遮蔽する作用 をもつ。さらに、トランス作用ドメインの欠失によって、ＤＮＡ結合性が低下す るのではなく増大したタンパク質が産生される可能性もある。この場合、このタ イプのトランケートした天然の優性ネガティブ体は特定の表現型を形成するため に過剰発現させる必要はないであろう（A.Braiser and A.Kumar,1994,J.Biol.Ch em.,269:10341-10351）。 当技術分野で要望されているのは、細胞内で発現しかつ作動性であって遺伝子 の転写を制御する優性ネガティブ機能をもち、または細胞内でＲＮＡの産生およ び機能を調節するタンパク質である。発現したこのようなタンパク質は、植物、 動物、哺乳動物（ヒトを含む）、昆虫、微生物およびウイルスを含めた多様な真 核生物において、異常な細胞増殖の調節に使用できる。本発明は、遺伝子調節を 制御するために特定の方法で修飾できるタンパク質を当技術分野に提供する。こ の特定の種類の修飾により遺伝子機能を制御して、たとえば異常な細胞または癌 細胞の成長または増殖を阻害し、また微生物、特に酵母などの真核微生物または ウイルスにより起きる病原性疾患を抑制することができ、病原性疾患や癌の治療 のための治療剤として利用できる。 発明の概要 本発明は、それらの多量体化またはタンパク質相互作用ドメイン中に少なくと も１個のアミノ末端酸性アミノ酸残基を含むように工学処理された多量体核酸（ すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）結合タンパク質、たとえば転写調節タンパク質を 提供する。このような核酸結合タンパク質の酸性は、他のタンパク質へのそれら のタンパク質の結合、たとえばヘテロ二量体またはヘテロ多量体の形成に影響を 与え、最終的には標的とするＤＮＡまたはＲＮＡ配列、または遺伝子へのそれら のタンパク質の結合に影響を与える。酸性アミノ酸残基の拡張配列（ｅｘｔｅｎ ｔｉｏｎ）を含む核酸結合タンパク質は、拡張したタンパク質相互作用表面また は多量体化もしくは二量体化界面をもつ。ＤＮＡ結合タンパク質は、本発明に適 した核酸結合タンパク質の具体例である。ＲＮＡ結合タンパク質も本発明に用い るのに適する。本発明によれば、このタンパク質の酸性により、形成されるヘテ ロ多量体またはヘテロ二量体複合体の安定性が増す。 本発明の目的は、細胞タンパク質の機能を不活性化するために、タンパク質− タンパク質相互作用表面または二量体化界面に酸性拡張配列を付与することであ る。本発明によれば、インビトロおよびインビボのいずれで用いた場合にも細胞 タンパク質（その作用が細胞の増殖および生存にとって危険、有害であり、致命 的ですらある）の発現および活性を阻害することができ、薬物、阻害分子、また は増殖を制御する薬物もしくは化合物として有用なタンパク質が提供される。 本発明の他の目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に結合する塩基性領域を もつ多量体複合体、特にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに、多量体化 または二量体化表面または拡張配列を形成するために、酸性アミノ酸残基を付加 することである。より詳細には、多量体タンパク質に付加される酸性拡張配列が それらのタンパク質の塩基性領域と置換して、細胞増殖を調節および制御する分 子を形成することができる。 本発明の他の目的は、インビボで天然タンパク質と特異的にヘテロ二量体化し てその天然タンパク質の正常な作用を妨害する酸性表現型をもつ好適な優性ネガ ティブ突然変異分子を提供することにより、遺伝子の転写および発現を調節し、 これによりその後細胞の遺伝子産物を不活性化することである。 本発明の他の目的は、タンパク質−タンパク質相互作用表面を拡張してそれを 酸性することによって優性ネガティブ転写調節タンパク質を形成し、天然タンパ ク質をＤＮＡとそれの正常な結合から特異的かつ化学量論的に排除することによ り、またトランス作用を阻害して最終的に遺伝子転写およびタンパク質産生を阻 害することにより、細胞タンパク質の機能を不活性化することである。 本発明の他の目的は、ＤＮＡ結合タンパク質、たとえばｂＺＩＰおよびｂＨＬ Ｈタンパク質ならびに構造的に関連するタイプのタンパク質のＤＮＡ結合を化学 量論的に阻害する、改良された遺伝子工学処理した優性ネガティブ転写因子タン パク質を提供し、天然の優性ネガティブ過剰発現に普通に伴う多面的作用を制限 することである。本発明の優性ネガティブ突然変異タンパク質は、多量体タンパ ク質、最も好ましくはＤＮＡ結合タンパク質のＮ末端に酸性残基を付加すること により形成される。 本発明の他の目的は、細胞遺伝子産物を特異的に不活性化するための、また遺 伝子療法に用いるための、本明細書に記載する優性ネガティブタンパク質を産生 および発現させるのに適した方法および合理的に設計された構築体を提供するこ とである。 本発明の他の目的は、工学処理されたＤＮＡ結合タンパク質の酸性拡張配列を 利用してタンパク質の多様な塩基性領域を安定化し、種々のＤＮＡ結合タンパク 質ファミリーの強い優性ネガティブタンパク質を形成することである。 本発明のさらに他の目的は、酸性のＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ 配列を含む遺伝子工学処理されたプラスミド構築体またはベクター少なくとも１ つを宿したトランスジェニック動物を提供し、遺伝子発現を組織特異的に制御す ることである。 本発明の他の目的は、野生型タンパク質に対して優性ネガティブ体として挙動 しかつ生存可能な表現型を与える酸性のＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮ Ａ配列を含む遺伝子工学処理されたプラスミド構築体またはベクター少なくとも １つを宿したトランスジェニック動物を提供し、タンパク質のインビボ効果を評 価および判定することである。このような動物は合理的な薬物設計のために（す なわち薬物と考えられる優性ネガティブ体を用いて）、また付加的または補助的 処置、薬物、療法などを試験および評価するために、また産生されたトランスジ ェニック表現型を改良または緩和するために、利用することもできる。 他の目的は、核酸結合タンパク質を標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、すなわち特 異的遺伝子に結合させることができる酸性多量体化ドメインをもち、これにより それが結合した遺伝子の機能を調節する、植物および動物由来の二量体および多 量体核酸結合タンパク質を提供することである。このようなタンパク質は本明細 書に記載するように、酸性拡張配列を含む二量体化および多量体化ドメインをも つ核酸結合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含むように分子を工 学処理した真核または原核細胞発現ベクター構築体により発現される。 本発明の他の目的は、核酸結合タンパク質に対してなされた種類の酸性修飾に より遺伝子の調節を制御し、これにより標的遺伝子またはＤＮＡもしくはＲＮＡ 配列が異常または病的な細胞および組織ならびにそれらに対応する正常な細胞お よび組織中に存在する場合の療法を提供することである。工学処理された酸性の 核酸結合タンパク質は、癌療法、真核微生物、たとえば酵母、原生動物、藻類、 寄生生物またはウイルスにより起きる疾患に用いる道具、また薬物の開発、合理 的な薬物設計、ならびに薬物療法および遺伝子療法のための道具を提供する。 本発明により提供される他の目的および利点は、以下の詳細な記述から明らか になるであろう。 図面の説明 図１は、ＣＥＢＰロイシンジッパー、ならびに優性ネガティブ４ｈｅｐｔａｄ −Ｆと混合した、ＣＥＢＰ、ＶＢＰおよびＧＢＦ由来の３つのｂＺＩＰ塩基性領 域（ＣＥＢＰ、ＶＢＰ−ＣＥＢＰ、およびＧＢＦ−ＣＥＢＰ）を含むキメラタン パク質の熱融解を示す。これらの結果は、４ｈｅｐｔａｄ酸性拡張配列が３種類 の異なる塩基性タンパク質と類似の相互作用をすることを示す。すなわち３種類 すべての楕円率（ellipticity）が６５℃である。 図２は、４ｈｅｐｔａｄ拡張配列のタンパク質配列（最上列）、ならびにタン パク質ＪｕｎおよびＣＲＥＢに対するより良好な優性ネガティブ因子を生じる、 １アミノ酸の変更（ＮからＬに）を含む４ｈｅｐｔａｄ拡張配列の修飾形（新た な拡張配列：４ｈｅｐｔａｄ）を示す。詳細には、最初の酸性ｈｅｐｔａｄのａ の位置のアスパラギンがロイシンに変更されると、同じａの位置に疎水性アミノ 酸を含むｂＺＩＰタンパク質、たとえばＪｕｎ、ＣＲＥＢ、ｏｐａｑｕｅ、およ びＡＴＦ２に対する、より有効な優性ネガティブ因子を生じる。 図３は、ＣＲＥＢの熱融解曲線を示す。図示されるように、修飾されていない ＣＲＥＢホモ二量体の融解温度は４７℃であり（Ｔｍ＝４７℃）、ＣＲＥＢタン パク質のアミノ末端に付加された４ｈｅｐｔａｄアミノ酸残基反復配列を含むＣ ＲＥＢ（４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢホモ二量体）の融解温度は２２℃である（Ｔｍ ＝２２℃）。ＣＲＥＢタンパク質と４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢの二量体の融解温度 は５３℃である（Ｔｍ＝５３℃）。酸性拡張されたＣＲＥＢは、図２に示すよう に、アスパラギンがロイシンに変更された新たな酸性拡張配列を含むように設計 された（Ｎｅｗ４ｈｅｐＣＲＥＢ）。図示されるように、ＣＲＥＢ＋Ｎｅｗ４ｈ ｅｐｔａｄＣＲＥＢは６９．５℃の融解温度を示す（白丸）。アスパラギンを含 む酸性拡張配列と比較してこの著しい温度安定性増大は、不活性化すべき当該ｂ ＺＩＰタンパク質に応じて利用できることを示唆する。 図４は、アミノ末端酸性アミノ酸残基拡張配列を含むように発現ｃ−Ｆｏｓタ ンパク質を工学処理または修飾した結果としての、発癌性のｂＺＩＰクラスＤＮ Ａ結合タンパク質であるｃ−Ｆｏｓとｃ−Ｊｕｎとの二量体化の程度を表す熱融 解曲線を示す。図４に示すように、修飾されていないｃ−Ｆｏｓとｃ−Ｊｕｎの 混合物は５０℃で融解した（黒丸）。塩基性領域を欠失した工学的処理ｃ−Ｆｏ ｓタンパク質（０ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏｓ）は、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ複合体の融解温度 を５３℃に高めた（白四角）。塩基性領域が４ｈｅｐｔａｄ反復配列を含む酸性 領域で置換された工学処理ｃ−Ｆｏｓタンパク質（４ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏｓ）は 、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ複合体の融解温度を６１℃に高めた（白丸）。４ｈｅｐｔａｄ −ＦｏｓをコードするＤＮＡを保有するプラスミドはアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号９７５８３で 寄託された。図２に示すように酸性領域の１アミノ酸がアスパラギンからロイシ ンに変更された工学処理ｃ−Ｆｏｓタンパク質［ｎｅｗ４ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏｓ （またはＮ４ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏｓ）と呼ぶ］は、より高い７２℃の融解温度を もつ、より安定なヘテロ二量体化を、ｃ−Ｊｕｎと形成した（黒四角）。Ｎ４ｈ ｅｐｔａｄ−ＦｏｓをコードするＤＮＡを保有するプラスミドはアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号９ ７５８４で寄託された。同様に図４に示すように、修飾されていないｃ−Ｊｕｎ のホモ二量体は２９．４℃の融解温度を示し、酸性修飾されたｃ−Ｆｏｓ（ｃ− Ｆｏｓタンパク質のアミノ末端に４つの酸性反復配列が付加されたもの）のホモ 二量体は２５℃の融解温度を示した。 図５Ａおよび５Ｂ：図５Ａは、タンパク質ＣＥＢＰの塩基性ジッパー領域（ｂ ＺＩＰ）およびタンパク質４ｈｅｐｔａｄＦｏｓのロイシンジッパーのＮ末端酸 性拡張配列の特異性が、塩基性および酸性ジッパー領域をもつＤＮＡ結合タンパ ク質（ＺＩＰクラスのタンパク質）に関してロイシンジッパーにより決定される ことを示す。Ｎ末端に酸性拡張配列を付加したＺＩＰ ＤＮＡ結合タンパク質は 酸性に修飾されたタンパク質であり、本明細書中でａＺＩＰと呼ばれる。図５Ａ に示すように、ｂＺＩＰ ＣＥＢＰタンパク質と不適合性ジッパーをもつａＺＩ Ｐ ４ｈｅｐｔａｄＦｏｓタンパク質とを混合しても相互作用は起きない。すな わち４ｈｅｐｔａｄＦｏｓとＣＥＢＰは相互作用しない。図５Ｂは、ｂＺＩＰＶ ＢＰタンパク質とａＺＩＰ ３ｈｅｐｔａｄＦ（ＣＥＢＰ特異性）タンパク質 を混合した場合もヘテロ二量体化相互作用は起きないことを示す。図５Ａおよび ５Ｂにおいて、実線は２つのホモ二量体曲線の単純な和を表す。実際の混合物が 和曲線と等しい結果を与えたという事実は、ヘテロ二量体が形成されないことを 証明する。 図６は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと酸性アミノ酸拡張配 列をもつように工学処理した種々のＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配 列とを含むように設計された発現構築体でヒト細胞を一時的トランスフェクショ ンし、酸性修飾されたＤＮＡ結合タンパク質を発現させた結果を示す。これらの 構築体は、酸性拡張配列を含まないクローン化および単離したＦｏｓ遺伝子（０ ｈｅｐ−ｆｏｓ）、または１〜４つの酸性拡張配列が付加されたものをコードす るように修飾されたＦｏｓ遺伝子配列（すなわち、それぞれ１ｈｅｐ−ｆｏｓ、 ２ｈｅｐ−ｆｏｓ、３ｈｅｐ−ｆｏｓ、および４ｈｅｐ−ｆｏｓ）をコードする ＤＮＡ配列を宿していた。他の構築体は、修飾されていないＦｏｓ（ｂＺＩＰ− Ｆｏｓ）；４つの酸性拡張配列を含むＣＲＥＢ（４ｈｅｐ−ＣＲＥＢ）；４つの 酸性拡張配列を含むＶＢＰ（４ｈｅｐ−ＶＢＰ）；および４つの酸性拡張配列を 含むＪｕｎ（４ｈｅｐ−Ｊｕｎ）をコードするＤＮＡを含んでいた。これらの実 験においては、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）を最高３種類のプラスミド、たとえ ば単一のＡＰ１シス−トランス作用要素で推進されたクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミド、およびＤＮＡ結合タンパク 質をコードする種々のＤＮＡで一時的トランスフェクションした。ＣＭＶ５６６ およびＣＭＶ５００は、それらのＮ末端にそれぞれ赤血球凝集素またはＦＬＡＧ エピトープを含むＤＮＡ結合タンパク質の発現を推進するサイトメガロウイルス プロモーターを含むプラスミドである（実施例４）。このヒストグラムは、異な る組合わせの発現したトランス作用因子および種々の酸性拡張された発現した優 性ネガティブ（ＤＮ）ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で観察された、トランス作 用の程度を表す。ＤＮ不在下では、ＡＰ１トランス作用は約１０〜３０倍であっ た。トランス作用は１〜３ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏｓによって阻害された。図６の結 果は、ＡＰ１シス要素がＪｕｎトランス作用により活性化されることを示す。こ の活性化は、Ｆｏｓジッパータンパク質（ａＦｏｓ）における酸性拡張配列によ り阻害される。他のロイシンジッパータンパク質に付加した酸性拡張配列はＡＰ １トランス作用を阻害せず、したがって阻害の特異性を示す。 図７は、他の細胞系（ジャーカット）における相対ＣＡＴ活性を示し、酸性拡 張配列を含む発現Ｆｏｓタンパク質（ａＦｏｓ）が酸性拡張配列を含まない発現 Ｆｏｓタンパク質（ｂＦｏｓ）より良好な優性ネガティブ体であることを証明す る。ジャーカット細胞（Ｂ細胞モデル）は高度の内因性Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ＡＰ１ ）活性をもつ。細胞を２種類のプラスミド（１μｇ）、すなわちＡＰ１シス要素 を含むリポーター構築体、ならびにトランケートした形のＦｏｓ（ｂＺＩＰＦｏ ｓ）または４ｈｅｐｔａｄ酸性拡張配列を含むＦｏｓロイシンジッパー（ａＦｏ ｓ）のいずれかの発現を推進するＣＭＶ５００プロモーターを含む第２構築体で 、一時的トランスフェクションした。ＡＰ１活性は１２−Ｏ−テトラデカノイル ホルボール（ＴＰＡ）の添加により誘導され、その結果リポーター遺伝子の誘導 が４０倍になった。このリポーター遺伝子のトランス作用は内因性ＡＰ１活性に より起きる。図７に示されるように、ｂＺＩＰＦｏｓ構築体によるｂＺＩＰＦｏ ｓタンパク質の発現により優性ネガティブ活性が生じる。しかしａＺＩＰＦｏｓ 構築体によるａＺＩＰＦｏｓタンパク質の発現の方がより効果的であり、ＡＰ１ 活性をより完全に阻害する。 図８は、図７に記載したジャーカット細胞系を示すが、さらにロイシンジッパ ー（“ｚｉｐ”）構築体のみを同様に細胞にトランスフェクションした。ジャー カット細胞を２種類のプラスミドでトランスフェクションし、ＴＰＡで刺激した 。Ｆｏｓロイシンジッパーを含む３種類の有効な優性ネガティブ体（すなわちＢ ｚｉｐ、ｚｉｐおよびＡｚｉｐ）の有効性を比較した。これら３種類の優性ネガ ティブ体は、トランス作用ドメインを含まないＦｏｓＢｚｉｐドメイン（Ｂｚｉ ｐ）、塩基性領域を含まないＦｏｓロイシンジッパー（ｚｉｐ）、および４ｈｅ ｐｔａｄ酸性拡張配列を含むＦｏｓロイシンジッパー（Ａｚｉｐ）である。これ らのデータは、ジャーカット細胞系において発現ａＦｏｓが発現Ｆｏｓジッパー タンパク質または発現ｂＦｏｓタンパク質の場合より著しく良好にＡＰ１トラン ス作用を阻害することを示す。 図９は、ｂＨＬＨクラスのＤＮＡ結合タンパク質であるＭａｘの二量体化ドメ インに酸性拡張配列を付加した結果を示す。図９に示したヘテロ二量体化試験で 用いたこれらの２ｈｅｐｔａｄＭａｘタンパク質は、下記の酸性拡張配列をもつ 発現Ｍａｘタンパク質である： ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａｘ（ ７８３）と呼ぶ；（配列番号：１）。この酸性拡張Ｍａｘタンパク質をコードす るＤＮＡを保有するプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ ｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号９７５８５で寄託された。 ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａｘ （７８４）と呼ぶ；（配列番号：２）。この酸性拡張Ｍａｘタンパク質をコード するＤＮＡを保有するプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ ａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号９７５８２で寄託された。 ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＥＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａ ｘ（７８５）と呼ぶ；（配列番号：３）。この酸性拡張Ｍａｘタンパク質をコー ドするＤＮＡを保有するプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号９７５８６で寄託された。 ＡｃｉｄＭａｘは、Ｎ末端に下記の酸性拡張配列を付加した発現Ｍａｘタンパク 質である：ＤＰＤＥＥＥＤＤＥＥＥＬＥＥＬＥＤＳＦ；（配列番号：４）。この 酸性拡張Ｍａｘタンパク質をコードするＤＮＡを保有するプラスミドは、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄ ｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）にＡＴＣＣ受 託番号９７５８１で寄託された。 ０ｈｅｐｔａｄＭａｘは、下記の酸性拡張配列をもつ発現Ｍａｘタンパク質であ る：ＤＰＤＬＥＥＬＥＤＳＦ；（配列番号：５）。 図９から分かるように、ポリグルタミン酸配列を付加した発現Ｍａｘタンパク質 （すなわちＡｃｉｄＭａｘ）は、上記の酸性拡張配列をもつ発現２ｈｅｐｔａｄ Ｍａｘタンパク質の場合よりｃ−Ｍｙｃと良好にヘテロ二量体化した。 図１０Ａ〜１０Ｄは、ＤＮＡを含む場合と含まない場合の両方につき、ｂＺＩ Ｐタンパク質Ｃ／ＥＢＰ二量体化を模式的に示した図である。タンパク質中の活 性化領域、塩基性領域、およびロイシンジッパーの相対位置を示す。このタンパ ク質のＮＨ₂（アミノ）末端が活性化ドメインである。ロイシンジッパーのｄ位 置のアミノ酸間にある点線は、物理的相互作用を表す。 図１０Ａ：Ｃ／ＥＢＰ二量体化。太線で表した塩基性領域はらせん状でない。図 １０Ｂ：ＤＮＡへのＣ／ＥＢＰの結合。ＤＮＡの存在により塩基性領域がα−を 形成するのが誘発され、これにより複合体の安定性が約１０倍増す。図１０Ｃ： 野生型Ｃ／ＥＢＰと、Ｆジッパー（Ｃ／ＥＢＰロイシンジッパーと優先的にヘテ ロ二量体化する）を含むＣ／ＥＢＰ突然変異体とのヘテロ二量体化。図１０Ｄ： Ｃ／ＥＢＰと０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ（すなわち、図１０Ｃに示したＦジッパー、た だし塩基性領域が除去されている）とのヘテロ二量体化。 図１１Ａ〜１１Ｃは、ロイシンジッパーの酸性らせん拡張配列が野生型ｂＺＩ Ｐタンパク質との二量体化を安定化することを証明する。図１１Ａは、試験した ｂＺＩＰタンパク質の４ｈｅｐｔａｄ酸性ヘリックス拡張配列および３種類の異 なる塩基性領域のアミノ酸配列を示す。ジッパーの最初のロイシンの位置、塩基 性領域の不変のアスパラギンおよびアルギニン、ならびにＶＢＰ ｂＺＩＰタン パク質のトリプトファンを太字タイプで表す。ロイシンジッパーから伸びる塩基 性領域の超らせん命名を下方に示し、疎水性のａおよびｂの位置を太字タイプで 示す。図１１Ｂは、提唱された３ｈｅｐｔａｄ酸性ヘリックス拡張配列とＣ／Ｅ ＢＰ塩基性領域との間のヘテロ二量体超らせん構造を表す。両方とも均等でない 側面を示す。ｆの位置のアミノ酸を両方の図に示す。３ｈｅｐｔａｄ拡張配列中 の母体Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域から変化させたアミノ酸を太字タイプで示す。ジッ パーの最初のロイシンの位置、塩基性領域の不変のアスパラギンおよびアルギニ ンを点描する。設計したｇ⇔ｅ′およびｇ⇔ａ′静電相互作用を、アミノ酸間の 黒線で示す。図中に矢印で示した最右ｄアミノ酸はロイシンジッパーの最初のｄ 位置である（Ｃ／ＥＢＰについてはＴ、３ｈｅｐｔａｄについてはＬ）。超らせ ん７文字表示（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）を右側に示す。２ヘリックスの超 らせんは示されていない。図１１Ｃは、図１１Ｂに示した相互作用の超らせんヘ リックスホイール図をＣ末端からＮ末端へ向かって見た図である。超らせん配列 は、ｅの位置から出発し、続いてロイシンジッパーの最初のｄの位置へ、ホイー ルの周りをＣ末端からＮ末端に向かって外側へ読む。推定したｇ⇔ｅ′およびｇ ⇔ａ′間の静電相互作用を示す。 図１２は、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆの存在下または不在下に３７℃で沈降平衡分析 により測定したＣ／ＥＢＰオリゴマー化を示す。Ｃ／ＥＢＰ単独（白四角）は見 掛け分子量３３，０００ダルトンの単一種として挙動し、ホモ二量体構造である ことを示唆する。Ｃ／ＥＢＰと３ｈｅｐｔａｄ−Ｆの等モル混合物（黒丸）は見 掛け分子量２８,０００ダルトンをもち、ヘテロ二量体が形成されたことを示す 。 図１３Ａおよび１３Ｂ：図１３Ａは、Ｃ／ＥＢＰ ｂＺＩＰドメイン(４μＭ) 、０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ（４μＭ）、およびＣ／ＥＢＰと異なる長さの酸性拡張配 列（０、１、２、３、４）を含むＦジッパーの等モル混合物（４μＭ＋４μＭ） の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。２０８および２２２ｎｍの最小値はα− ヘリックスを示す。Ｃ／ＥＢＰと０ｈｅｐｔａｄ−Ｆのスペクトルの和（２試料 が相互作用しない場合に見られる）を点線で示す。異なる混合物につき２２２ｎ ｍの信号の上昇は、α−ヘリックス含量の増加を示唆する。２１０ｎｍより下方 のノイズはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の吸収によるものである。図１３Ｂは 、図１３Ａに示した試料の２２２ｎｍにおけるＣＤ熱融解曲線を示す。各組のデ ータに適合する曲線を用いてＴ_mを計算した。これらの混合物はＣ／ＥＢＰ単独 より安定であり、これはこれら２タンパク質間の安定化相互作用を示唆する。棒 は、ロイシンジッパーをヘテロ二量体の両タンパク質につき１ｈｅｐｔａｄ拡張 することにより生じる２２２ｎｍでの楕円率（ellipticity）の量を示す。 図１４Ａおよび１４Ｂは、酸性拡張配列がＤＮＡへのＣ／ＥＢＰの結合を阻害 することを示す。図１４Ａ：３ｈｅｐｔａｄ−ＦはＣ／ＥＢＰとＤＮＡの結合を 阻害する。左のパネルは、長さ２８ｂｐの特異的ＤＮＡプローブへのＣ／ＥＢＰ 結合のゲル遅延アッセイを示す。各列でタンパク質を逐次４倍希釈した。右のパ ネルは左のパネルと同じアッセイを示すが、ただし３ｈｅｐｔａｄ−ＦをＣ／Ｅ ＢＰと同じ濃度で添加し、その結果Ｃ／ＥＢＰとＤＮＡの結合は全く生じなかっ た。図１４Ｂ：蛍光により測定した５種類の優性ネガティブ体（ＤＮ）によるＤ ＮＡからのＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰの排除。ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰの塩基性領域に位置 する１個のトリプトファンの蛍光が、ＤＮＡ結合に際して増加した(５〜１０分) 。１．１モル当量のＦジッパーまたは４種類の異なる酸性拡張配列を添加すると 、蛍光が減少した。２０分後に、さらに１０モル当量を添加したところ、ＤＮＡ からさらにＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰが排除された。太線で示した４ｈｅｐｔａｄ−Ｆ は、最も著しくＶＢＰ：Ｃ／ＥＢＰを排除した。最下部の線は、ＶＢＰ−Ｃ／Ｅ ＢＰと４ｈｅｐｔａｄ−Ｆの混合により新たなベースラインが生じたことを示す 。これは他の４種類の混合物には見られず、これらはＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰ単独の ベースラインに戻る。 図１５は、酸性拡張配列がＣ／ＥＢＰトランス作用を阻害することを示す。ヒ ト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）を３種類のプラスミド、すなわち単一Ｃ／ＥＢＰシス 要素で推進されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） 発現プラスミド、Ｃ／ＥＢＰトランス作用因子、および種々のＤＮで一時的トラ ンスフェクションした。このヒストグラムは、種々の組合わせのトランス作用因 子と優性ネガティブ体の存在下で見られたトランス作用の程度を表す。ＤＮが存 在しない場合、発現Ｃ／ＥＢＰは単一Ｃ／ＥＢＰ部位のトランス作用を約１０倍 活性化した。このトランス作用は、トランス作用ドメイン（△Ｃ／ＥＢＰ）、ヘ テロ二量体化ジッパー（０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）、および通常のＣ／ＥＢＰジッパ ーに付加された酸性拡張配列（３ｈｅｐｔａｄ−Ｃ／ＥＢＰ）を欠如するＣ／Ｅ ＢＰにより部分的に阻害された。トランス作用は発現３ｈｅｐｔａｄ−Ｆによっ て完全に阻害された。このヒストグラムの最後の２本の棒は、代替ロイシンジッ パーであるＧＣＮ４ジッパーを含む発現Ｃ／ＥＢＰタンパク質のトランス作用を 示す。このタンパク質はプロモーターを含むＣ／ＥＢＰをトランス活性化するこ とができ、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆによって阻害されなかった。 図１６Ａおよび１６Ｂは、上記のトランス作用試験に用いたプラスミドベクタ ーの模式図である。図１６Ａは、ＤＮＡ結合タンパク質（酸性拡張配列を含むも の、または含まないもの）をコードするＤＮＡがＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位の間に挿入されたベクターｐＥＴ３ｂ．ｓｅｑを示す。図１６Ｂは、ＣＭ Ｖプロモーター、ならびにＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入された ＦＬＡＧ配列およびＪｕｎｂＺｉｐ配列を含むベクターＣＭＶ５００−ｊｕｎ ｂＺｉｐを示す。このベクターの配列範囲は１〜５８０９である。制限酵素開裂 部位、酵素当たりの切断部位の数、およびそれらの配列位置は、下記のとおりで ある：ＢａｍＨＩ：位置９６５、１５７１および３６１５の３カ所；ＥｃｏＲＩ ：位置２１０６の１カ所；ＨｉｎｄＩＩＩ：位置１２４５の１カ所；ＮｃｏＩ： 位置６１０、８９８、２３４２および３０７７の４カ所；ＮｄｅＩ：位置４８４ および９２８の２カ所；ならびにＸｈｏＩ：位置１５６２および３６２８の２カ 所。 図１６Ｃは、ＣＭＶプロモーター、ならびにＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部 位の間に挿入されたＦＬＡＧ配列およびＣＲＥＢｂＺｉｐ配列を含むベクターＣ ＭＶ５００−ＣＲＥＢｂＺｉｐを示す。このベクターの配列範囲は１〜５７４６ である。制限酵素開裂部位、酵素当たりの切断部位の数、およびそれらの配列位 置は下記のとおりである：ＢａｍＨＩ：位置９６５、１５０８および３５５２の ３カ所：ＥｃｏＲＩ：位置２０４３の１カ所；ＨｉｎｄＩＩＩ：位置１１８２の １カ所；ＮｃｏＩ：位置６１０、８９８、２２７９および３０１４の４カ所；Ｎ ｄｅＩ：位置４８４および９２８の２カ所；ならびにＸｈｏＩ：位置１４９９お よび３５６５の２カ所。 図１７は、酸性拡張配列を付加したＣＲＥＢタンパク質の単離されたヌクレオ チド配列（配列番号：６）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：７）を表 す。５′側ＢａｍＨＩ制限部位および３′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌ クレオチド配列を発現ベクター、たとえば図１６ＡのｐＥＴ３ｂ．ｓｅｑベクタ ーに挿入するための部位として作用する。 図１８は、酸性拡張配列を付加していないＣＭＶ５００−ＣＲＥＢｂＺＩＰタ ンパク質の単離されたヌクレオチド配列（配列番号：８）および翻訳されたアミ ノ酸配列（配列番号：９）を表す。５′側ＮｃｏＩ制限部位および３′側Ｈｉｎ ｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現ベクター、たとえば図１６Ｃ のＣＭＶ５００−ＣＲＥＢｂＺｉｐベクターに挿入するための部位として作用す る。 図１９は、図２に記載した４ｈｅｐｔａｄの酸性拡張配列を付加したＣＭＶ５ ００−４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢ（Ｎｅｗ４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢと呼ぶ；図３） タンパク質の単離されたヌクレオチド配列（配列番号：１０）および翻訳された アミノ酸配列（配列番号：１１）を表す。５′側ＮｃｏＩ制限部位および３′側 ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現ベクター、たとえば図 １６Ｃに示すものと類似のベクターに挿入するための部位として作用する。 図２０は、図４〜６に記載および図示した実験に用いたヒトｃ−Ｆｏｓタンパ ク質をコードする単離されたヌクレオチド配列（配列番号：１２）および翻訳さ れたアミノ酸配列（配列番号：１３）を表す。５′側ＢａｍＨＩ制限部位および ３′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現ベクター、たと えば図１６Ａに示すものと類似のベクターに挿入するための部位として作用する 。 図２１は、図６に記載および図示した実験に用いたＣＭＶ５００−ＦｏｓｂＺ ＩＰ（ＭＯ）タンパク質の単離されたヌクレオチド配列（配列番号：１４）およ び翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：１５）を表す。５′側ＮｃｏＩ制限部位 および３′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現ベクター 、たとえば図１６Ｃに示すものと類似のベクターに挿入するための部位として作 用する。このヌクレオチド配列は、図示するようにＦＬＡＧエピトープをコード するヌクレオチド配列、Φ１０をコードするヌクレオチド配列、およびＦｏｓｂ ＺＩＰをコードするヌクレオチド配列を含む。 図２２は、図２に記載し、図４、５Ａ、６および７に記載および図示した実験 に用いた、４ｈｅｐｔａｄの酸性拡張配列を含む４ｈｅｐｔａｄＦｏｓタンパク 質をコードする単離されたヌクレオチド配列（配列番号：１６）および翻訳され たアミノ酸配列（配列番号：１７）を表す。 図２３は、図２に記載し、図６に記載および図示した実験に用いた、４ｈｅｐ ｔａｄの酸性拡張配列を含むＣＭＶ５００−４ｈｅｐｔａｄＦｏｓロイシンジッ パータンパク質の単離されたヌクレオチド配列（配列番号：１８）および翻訳さ れたアミノ酸配列（配列番号：１９）を表す。５′側ＮｃｏＩ制限部位および３ ′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現ベクター、たとえ ば図１６Ｃに示すものと類似のベクターに挿入するための部位として作用する。 この配列は、図示するようにＦＬＡＧエピトープをコードする配列、Φ１０をコ ー ドする配列、４ｈｅｐｔａｄ酸性拡張配列をコードする配列、およびＦｏｓロイ シンジッパーをコードする配列を含む。 図２４は、ＣＭＶ５００−ＪｕｎｂＺＩＰタンパク質の単離されたヌクレオチ ド配列（配列番号：２０）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：２１）を 表す。５′側ＮｃｏＩ制限部位および３′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌ クレオチド配列を発現ベクター、たとえば図１６Ｂに示すベクターに挿入するた めの部位として作用する。この配列は、図示するようにＦＬＡＧエピトープをコ ードする配列、Φ１０をコードする配列、およびＪｕｎｂＺｉｐタンパク質をコ ードする配列を含む。 図２５は、ＡｃｉｄＭａｘ、すなわち図示するようにＭａｘの二量体化ドメイ ンに付加されたポリグルタミン酸領域を含む酸性拡張配列を含むｂＨＬＨ Ｍａ ｘタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列（配列番号：２２）およ び翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：２３）を表す。 図２６は、２ｈｅｐｔａｄＭａｘ（７８３）、すなわち図示するようにＭａｘ の二量体化ドメインに付加された２つの両親媒性酸性拡張配列を含むｂＨＬＨＭ ａｘタンパク質（図９および実施例６に記載）をコードする単離されたヌクレオ チド配列（配列番号：２４）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：２５） を表す。 図２７は、２ｈｅｐｔａｄＭａｘ（７８４）、すなわち図示するようにＭａｘ の二量体化ドメインに付加された２つの両親媒性酸性拡張配列を含むｂＨＬＨＭ ａｘタンパク質（図９および実施例６に記載）をコードする単離されたヌクレオ チド配列（配列番号：２６）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：２７） を表す。 図２８は、２ｈｅｐｔａｄＭａｘ（７８５）、すなわち図示するようにＭａｘ の二量体化ドメインに付加された２つの両親媒性酸性拡張配列を含むｂＨＬＨ Ｍａｘタンパク質（図９および実施例６に記載）をコードする単離されたヌクレ オチド配列（配列番号：２８）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：２９ ）を表す。 図２９は、図４〜６に記載および図示した実験に用いたマウスｃ−Ｍｙｃ ｂ ＨＬＨタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列（配列番号：３０） および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：３１）を表す。マウス、ラットおよ びヒトのｃ−ｍｙｃ配列は高度に保存され、実質的に等しい。５′側ＢａｍＨＩ 制限部位および３′側ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が、このヌクレオチド配列を発現 ベクター、たとえば図１６Ａに示すものと類似のベクターに挿入するための部位 として作用する。 図３０は、星印（★）で示したように制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切 断することにより線状化したプラスミドベクター（約１１．９ｋｂ）の模式図で ある。得られた線状プラスミドＤＮＡは、図示するようにＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓ ｔＩ部位内に含まれる４２２またはａＰ２プロモーター（約７．６ｋｂ）を含む 。４２２またはａＰ２プロモーターは、脂肪細胞の分化に際して脂肪細胞特異性 遺伝子発現の調節に関与することが知られている。４２２／ａＰ２遺伝子は脂肪 細胞の脂肪酸結合タンパク質をコードする。４２２／ａＰ２遺伝子の５′側フラ ンキング配列は、脂肪細胞特異性発現に対する調節領域を含む（Bernlohr et al .,1985,J.Biol.Chem.,260:5563-5567;Spiegelman et al.,1983,J.Biol.Chem.,25 8 :10083-10089;Cook et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2949-2953）。こ のプラスミドは、これと作動的に結合した前記の本発明による３ｈｅｐｔａｄＣ ／ＥＢＰ優性ネガティブ体をコードするヌクレオチド配列（約０．３ｋｂ）（Ｆ ｌａｇΦ１０ ３ｈｅｐｔａｄＦ）（図示するようにＫｐｎＩ−ＳａｍＩ部位内 に含まれる）、およびＳＶ４０の初期領域に由来するポリアデニル化部位を含む 約１ｋｂのフラグメント、およびＳＶ４０のスモールｔ抗原イントロンに由来す るスプライスードナー受容体配列をも含んでいた（Gorman et al.,1982,Mol.Cel l.Biol.,2:143-190）。４２２／ａＰ２プロモーター、ＦｌａｇΦ１０ ３ｈｅ ｐｔａｄＦ Ｃ／ＥＢＰ、ポリアデニル化部位、およびスプライス部位を含むこ の挿入配列を、ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（ストラタゲン（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎ））のポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に クローン化した。この線状プラスミドを、当技術分野で一般に知られている方法 により用いて、トランスジェニックマウスの形成および繁殖のためにマウスをト ランスフェクションした。 図３１は、図３０に記載および図示したプラスミドＤＮＡ構築体を用いたトラ ンスジェニックマウス実験結果を示す。トランスジェニック動物の繁殖の成功に より得た２匹の同腹子を示す。ケージの左側付近の小さい方のマウスはトランス ジェニック表現型を示し、トランスジーンを保有しない右側の正常サイズのやせ ていない同腹子と比較して、やせた（skinny or thin）マウスの貧相な骨ばった 外観をもつ。この図に示したやせた貧相なトランスジェニックマウスは、サザー ンブロットハイブリダイゼーションにより評価して数コピーのトランスジーンを 保有することが認められた。 発明の説明 本発明は、遺伝子の発現を調節し、細胞タンパク質の産生および機能を阻害す る有効な優性ネガティブタンパク質として機能する新規な多量体の核酸（すなわ ちＤＮＡまたはＲＮＡ）結合タンパク質および転写調節タンパク質の製造方法を 提供する。本発明のタンパク質が結合しうるＤＮＡおよびＲＮＡをポリ核酸とも 呼ぶことは当業者に周知であろう。これらの新規なタンパク質は、二量体または 多量体タンパク質、たとえばｂＺＩＰまたはｂＨＬＨ転写調節タンパク質に酸性 アミノ酸残基（たとえばグルタミン酸、アスパラギン酸）を付加し、これにより 酸性アミノ酸を含む工学処理された酸性拡張配列をこれらのタンパク質に付加す ることにより製造される。たとえば多量体ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質の 塩基性領域を酸性領域で置換して、優性ネガティブ機能を得ることができる。あ るいはたとえば複数の酸性アミノ酸を核酸結合タンパク質、好ましくはタンパク 質のＮ末端に付加して、得られるタンパク質に酸性を付与することができる。当 業者に自明のとおり、かつ本明細書に例示および記載されるように、本発明の酸 性拡張した核酸結合タンパク質は、タンパク質の二量体化または多量体化ドメイ ンをコードするＤＮＡ配列が１またはそれ以上の酸性アミノ酸残基をコードする ヌクレオチドを含むように、核酸結合タンパク質をコードする単離したＤＮＡ配 列を通常の分子的技術で操作することにより製造される。酸性拡張配列を含む核 酸結合タンパク質をコードするＤＮＡまたはそのようなＤＮＡの一部、たとえば 酸性拡張配列をコードするＤＮＡも、当技術分野で一般に知られているＤＮＡ合 成技術により合成的に製造することができる。 酸性領域が拡張または付加されたタンパク質は多様なタイプのタンパク質から 誘導することができ、限定ではないが、その例にはＤＮＡまたはＲＮＡ結合タン パク質、転写調節タンパク質、たとえばｂＺＩＰおよびｂＨＬＨクラスのタンパ ク質、たとえばｆｏｓ、ｊｕｎ、ｏｐａｑｕｅ、ＤＢＰ、ＡＴＦ２、ＣＲＥＢ、 ＭａｘおよびＭｙｃ（たとえばＮ−ｍｙｃ、Ｃ−ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ）が含まれ る。ｂＺＩＰクラスの幾つかの転写因子の構成員子、またはこれらと構造的に類 似するタイプのタンパク質は、遺伝子の転写を活性化する機能的役割をもち、そ れらの遺伝子のタンパク質産物がその後発現し、細胞の増殖応答に際して機能す る。これらの転写調節タンパク質のうちあるものは、腫瘍形成、発癌、および細 胞の増殖と分化の多様な段階に関与するタンパク質の産生の仲介に密接に関連す る。このような転写因子は、それらに対応する野生型の活性を制御し、最終的に はその細胞タンパク質産物の機能を調節または不活性化するために、優性ネガテ ィブ因子に変換する主な候補である。本明細書中で用いる野生型タンパク質、天 然タンパク質、天然に存在するタンパク質、および非突然変異体または非突然変 異タンパク質という語は同義語であることは当業者に自明であろう。本発明の核 酸結合タンパク質が植物、動物（哺乳類とヒトを含む）、微生物、たとえば酵母 および真菌、原生動物、藻類および寄生虫、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡウイル スのいずれに由来するものであってもよいことも当業者に理解されるであろう。 より詳細には、哺乳動物以外の真核生物、たとえば植物が植物の生理に関与す る核酸結合タンパク質をもつことは、当業者に自明である。ＧＢＦ−１はｂＺＩ ＰクラスのＤＮＡ結合タンパク質の植物性核酸結合タンパク質の例であり、これ はｂＺＩＰタンパク質の最も分岐したシス要素に関連する。植物性核酸結合タン パク質への酸性拡張配列の付加も、遺伝子転写を変更または調節するための本発 明に包含される。事実、ＧＢＦ−１に付加した酸性拡張配列によって安定なヘテ ロ二量体が形成された（実施例１１および表２参照）。他の生物、好ましくは真 核生物および哺乳動物において、本発明に従ってタンパク質またはポリペプチド などの分子に酸性拡張配列を付加して、特定のタイプの細胞および組織において その生物の生理および内因性成長に付随する細胞タンパク質を制御調節すること により、組織特異性調節を行うことができる。 本発明による酸性拡張タンパク質の用途には、植物の生育中に発現するタンパ ク質を選択的に調節することにより、特定の器官や組織を生長させることが含ま れる。たとえば貯蔵タンパク質を修飾して、より健康な、より著しく生長する植 物、野菜および作物を得ることができる。限定ではないが他の例として、本発明 に従って好適な内因性調節分子に酸性拡張配列を付加して、たとえばジャガイモ 塊茎などにおける炭水化物の産生を増加させることにより、植物または作物の生 長を補助し、または他の形で変更することができる。特定のタンパク質、ポリペ プチドおよび細胞調節分子に付加した酸性拡張配列の利用は、植物界全体に広く 適用できると考えられる。たとえば単子葉および双子葉植物をともに利用でき、 また茎菜および葉菜（たとえばブロッコリ、レタス、ホウレンソウ、キャベツ） 、果実および種子野菜（たとえばトマト）、繊維質作物および穀物（たとえばト ウモロコシ、オームギ、コムギ）、ならびに森林植物および観賞植物（たとえば ワタ）も利用できると考えられる。さらに他の用途には、たとえば果実（ブドウ 、柑橘類、リンゴ、セイヨウナシ、アンズなど）において生長に付随する内因性 タンパク質の発現または効力を低下させることにより植物の特定の器官および組 織の生長を増進または低下させ、あるいは葉、根、茎または葉柄（たとえばキャ ベツ、ホウレンソウ、セロリ、ビート、ダイズ、サトウキビ、花柄）を調節する ための、タンパク質の制御調節が含まれる。本発明により生長および生育を調節 できる植物組織では、耐久性、大きさ、多肉質、外見および寿命など、種々の形 質を変更することができる。本発明に従って特定の遺伝子の発現を制御すること により、生長調節遺伝子または遺伝子の発現を調節する遺伝子制御要素の発現を 低下させることができ、その結果、耐久性または機械的安定性の増大を達成する ための茎の矮小化、遺伝的な剪定、生育抑制、または望ましくない植物器官の排 除に利用できるが、これらは例示であって、限定ではない。 本発明により阻害性および調節性の化合物または薬物として用いる優性ネガテ ィブ体の形成に適する核酸結合タンパク質および転写調節タンパク質の候補の例 には、酸性拡張配列を付加できるか、または酸性アミノ酸残基を含むように操作 できる、いかなる二量体または多量体ＤＮＡ結合タンパク質も含まれる。限定で はないが、このようなタンパク質の例は、塩基性ドメインおよびロイシンジッパ ードメインを含むｂＺＩＰファミリーの転写調節タンパク質、特にＪｕｎおよび Ｆｏｓファミリーのタンパク質、ＬＲＦ−１（肝再生因子１）（J.C.Hsu et al. ,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3511-3515）；Ｃ／ＥＢＰ、ＧＣＮ４、ＤＢ Ｐ、ＣＨＯＰ−１０、ＧＢＦ−１；ならびに塩基性ドメインおよびヘリックス− ループ−ヘリックスモチーフを含むｂＨＬＨファミリー、たとえばＩＤ、Ｍｙｏ Ｄ１、 Ｅ１２、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｉ−ｍｙｃ、ｍａｘ、ＡＰ−４、ＴＦＥ３、 ＵＳＦ、およびＦＩＰ（A.D.Baxevanis and C.R.Vinson,1993,Curr.Op.Gen.Deve l.,3:278-285）；ならびに構造的に類似する他のタンパク質である。 一般に本発明は、核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに結合する、酸性拡張さ れた核酸結合多量体複合体、たとえばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド の製造を包含する。これらの生成物は、多量体複合体の二量体化または多量体化 ドメインに酸性アミノ酸拡張配列を含む核酸結合タンパク質である。多量体複合 体は通常は塩基性領域をもち、これを酸性拡張配列で置換して、細胞に導入して 発現させた場合に細胞の成長および増殖を制御できる分子を形成することができ る。これは、最終的に発現するタンパク質の塩基性領域または多量体化もしくは 二量体化ドメインに対しＮ末端拡張配列中に酸性アミノ酸残基をコードするヌク レオチドが存在するように、核酸結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列 を工学処理することにより達成される。 塩基性領域を含み、ロイシンジッパーモチーフを含むか、または含まないｂＺ ＩＰおよびｂＨＬＨタンパク質の両方に対する優性ネガティブ（ＤＮ）体は、本 発明に従って野生型タンパク質の正常な塩基性ドメインを１またはそれ以上の酸 性領域で変更および置換することにより開発され、遺伝的に工学処理されたもの である。細胞に導入した場合に細胞の増殖を調節または制御する機能をもつ（た とえば遺伝子転写の阻害または遺伝子活性化による）酸性修飾されたＤＮタンパ ク質を産生するＤＮＡ配列を含む発現構築体を記載する。 本発明の１態様においては、発現した核酸結合タンパク質に酸性拡張配列を付 加する。本発明に用いるのに特に有用な核酸結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タン パク質である。一般に１またはそれ以上の酸性アミノ酸残基が、付加された酸性 拡張配列に含まれる。拡張配列は反復ドメインまたは領域を含むことができ、そ の際、各領域またはドメインはその一部または全部が酸性アミノ酸残基であるア ミノ酸配列を含む。付加された拡張配列に含まれるドメインまたは領域はそれぞ れ、合計２個から約１００個のアミノ酸を含むことができ、各ドメインまたは領 域は少なくとも１個、好ましくは２個以上の酸性アミノ酸を含むように工学処理 される。付加された酸性拡張配列は、一般にＤＮＡ結合タンパク質に付加された 複数のアミノ酸を含む２以上の酸性ドメインまたは領域を含む。タンパク質に付 加された酸性拡張配列に含まれる酸性ドメインまたは領域の数、ならびに各ドメ インまたは領域に含まれるアミノ酸残基の総数は、最適な優性ネガティブまたは 阻害機能を生じるように、目的または要求に従って変更できる。一般に２以上の 酸性領域（たとえばｈｅｐｔａｄ）をもち、各領域に少なくとも１個（たとえば ２〜５個）の酸性アミノ酸を含む付加拡張配列によって、より有効な優性ネガテ ィブまたは阻害機能が得られる。限定ではないが、具体例として、酸性拡張配列 は合計２８個のアミノ酸残基を含む４ｈｅｐｔａｄアミノ酸領域またはドメイン を含み、各領域またはドメイン中の少なくとも２〜４個のアミノ酸は酸性である （図２）。 本発明によれば、少なくとも１個、好ましくは２個以上が酸性アミノ酸残基で あるアミノ酸残基配列をＤＮＡ結合タンパク質に付加して、酸性である拡張した タンパク質相互作用表面または拡張した二量体化界面を得ることができる。本発 明は、そのすべてが酸性、たとえばグルタミン酸および／またはアスパラギン酸 である酸性アミノ酸残基配列を含む、酸性拡張配列を包含する。本発明はまた、 その一部が酸性である酸性アミノ酸残基配列を含む、酸性拡張配列を包含する。 一般的指針として、拡張配列中のすべてのアミノ酸が酸性というわけではない場 合、付加された配列中の約１〜約９８％のアミノ酸が酸性であってもよい。この ように、付加された拡張配列は必ずしも領域またはドメインに分類されないアミ ノ酸配列を含むことができ、そのうちの一部または全部が酸性残基である。限定 ではない簡単な例として、付加された酸性拡張配列は、核酸結合タンパク質の多 量体化または二量体化ドメインに付加された１５〜２０個のグルタミン酸残基を 含むことができる。したがってそのタンパク質に拡張されるアミノ酸残基の配列 中のアミノ酸の総数は、たとえば約２〜１００アミノ酸残基、好ましくは約３〜 ５０アミノ酸残基、より好ましくは約３〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは約 ４〜２８アミノ酸残基の長さで変更でき、その一部または全部が酸性アミノ酸で ある。酸性拡張配列の長さは、得られるＤＮＡ結合タンパク質の二量体化および ＤＮＡ結合機能の特異性に影響を与える可能性があることを理解すべきである。 さらに、得られる優性ネガティブタンパク質の力価を増大または低下させるため にタンパク質に種々の長さの酸性拡張配列（すなわち長い拡張配列または短い拡 張配列）を付加しうることは当業者に自明であろう。すなわち本発明の酸性拡張 されたＤＮＡ結合タンパク質を含む、より強力な、またはより毒性の高い“薬物 ”を形成するために、必要に応じて拡張配列中の酸性アミノ酸の数を増加するこ とができる。専門家の要望に合わせるために酸性アミノ酸の数を変更して酸性拡 張タンパク質の効力を変更しうることは当業者に自明であろう。たとえば短い酸 性拡張配列（たとえば３〜１３アミノ酸）を含む優性ネガティブＤＮＡ結合タン パク質、および長い酸性拡張配列（たとえば２０〜１００アミノ酸）を含む優性 ネガティブＤＮＡ結合タンパク質を形成することができる。一般に長い酸性拡張 配列ほど、それが付加される優性ネガティブＤＮＡ結合タンパク質に、より高い 力価、毒性または安定性を付与すると予想できる。拡張配列に含まれる酸性アミ ノ酸の数を増加させることにより本発明の酸性拡張ＤＮＡ結合タンパク質が与え る薬物の効力を変更しうるので、得られるタンパク質に細胞の成長および増殖の 調節剤および制御剤として種々の効力をもたせることができる。 他の態様においては、酸性拡張ＤＮＡ結合タンパク質は塩基性領域およびロイ シンジッパーを含む発現したｂＺＩＰ転写調節タンパク質である。本発明により このタンパク質は、発現したｂＺＩＰタンパク質のロイシンジッパー領域からＮ 末端へ伸びるように設計された酸性アミノ酸配列を含むように工学的処理がなさ れている。アミノ酸拡張配列は２〜１００アミノ酸残基、好ましくは約３〜５０ アミノ酸残基、より好ましくは約３〜３０アミノ酸残基を含むことができ、その 一部または全部が酸性アミノ酸である。これにより、付加されたアミノ酸拡張配 列が酸性になる。あるいは酸性拡張配列は全部が酸性であるアミノ酸、たとえば グルタミン酸の配列を含むことができ、この場合酸性アミノ酸配列は約２〜８０ アミノ酸残基、好ましくは約３〜５０アミノ酸残基、より好ましくは約５〜３０ アミノ酸残基を含む。ｂＺＩＰタンパク質の酸性拡張配列に含まれるアミノ酸残 基全部が酸性アミノ酸であってもよく、または付加された拡張配列を含むアミノ 酸領域それぞれにおいて少なくとも１個のアミノ酸残基が酸性アミノ酸である（ たとえば拡張配列に含まれる４ｈｅｐｔａｄ反復配列それぞれにおいて、少なく とも１個のアミノ酸残基が酸性アミノ酸残基である；図２）ことを理解すべき である。ｂＺＩＰタンパク質に付加された拡張配列の特定領域内の２個以上のア ミノ酸残基が酸性である場合の方が多い（図２；図１１Ａ）。 他の態様においては、アミノ酸の拡張配列が両親媒性であってもよい。前記の ように、拡張配列が１またはそれ以上の反復ドメインまたは領域として生じるよ うに設計することもできる。酸性拡張配列は１またはそれ以上のアミノ酸ドメイ ンまたは領域を含み、各ドメインまたは領域のアミノ酸残基が、各領域に含まれ るアミノ酸中に少なくとも１個の酸性アミノ酸残基、好ましくは２個以上の酸性 アミノ酸残基を含むことが好ましい。たとえば、４つの反復領域を含み、各領域 が酸性アミノ酸残基を含めた７個のアミノ酸の配列を含む酸性拡張配列は、本発 明に従ってタンパク質に付加された４ｈｅｐｔａｄ反復配列である。 前記のように、酸性アミノ酸配列はタンパク質のＮ末端から１またはそれ以上 のｈｅｐｔａｄ反復配列として伸びることができ、かつたとえば３個のグリシン 残基を含むＮ末端キャップをもつことができる（たとえばＤＰ−ＧＧＧ）。本明 細書に記載するように（実施例１Ｆ）、Ｎ末端キャップはＤＰ−ＧＧＧキャップ の代わりに他の配列、すなわちＤＰ（アスパラギン酸およびプロリンのみ）；Ｄ Ｐ−Ｄ（アスパラギン酸およびプロリンおよびアスパラギン酸）；ＤＰ−ＥＥ（ アスパラギン酸およびプロリンおよび２個のグルタミン酸残基）；ＤＰ−ＤＥＥ Ｅ（アスパラギン酸およびプロリンおよび３個のグルタミン酸残基）を含むこと もできる。 本発明の他の態様においては、酸性拡張したＤＮＡ結合タンパク質は塩基性領 域およびヘリックス−ループ−ヘリックス構造をもつ発現した転写調節ｂＨＬＨ タンパク質である。本発明によりこのｂＨＬＨタンパク質は、タンパク質の多量 体化または二量体化ドメインからＮ末端へ伸びるように設計された酸性アミノ酸 配列を含むように工学的処理がなされている。これらのタンパク質においては、 Ｎ末端のＤＮＡ結合アミノ酸が欠失し、酸性拡張配列で置換されている。酸性拡 張配列は、各反復領域に少なくとも１個の酸性アミノ酸をもつアミノ酸配列から 構成される反復ドメインまたは領域を含む。あるいは酸性拡張配列は、その一部 または全部が酸性、たとえばグルタミン酸および／またはアスパラギン酸である アミノ酸の配列を含む。このような酸性拡張配列は２〜８０アミノ酸、好ましく は３〜５０アミノ酸、より好ましくは４〜３０アミノ酸を含むことができる。酸 性拡張配列が単に核酸結合タンパク質のＮ末端多量体化または二量体化ドメイン に付加されたアミノ酸の配列を含むこともでき、付加された拡張配列中の一部ま たは全部のアミノ酸残基が酸性であることも理解すべきである。一例にすぎない が、ｂＨＬＨタンパク質に付加される酸性拡張配列は１５個の反復グルタミン酸 残基からなる。ｂＨＬＨタンパク質Ｍａｘについて記載した他の例では（図９お よび実施例６）、そのＮ末端にポリグルタミン酸アミノ酸残基のストレッチが付 加されたＭａｘタンパク質を発現する発現構築体はｃ−ｍｙｃタンパク質との優 れたヘテロ二量体化をもたらすことが認められた。酸性修飾されたＭａｘタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を宿したプラスミドベクターは、Ｎ末端ＤＰＤアミ ノ酸配列（ＢａｍＨＩクローン化部位である）を用いて形成された（実施例６） 。 タンパク質、たとえばロイシンジッパータンパク質に付加した設計された酸性 領域は、塩基性領域とロイシンジッパー領域を含む転写因子に対し優性ネガティ ブ体として機能した；塩基性領域とヘリックス−ループ−ヘリックスの構築体、 および他のＤＮＡ結合タンパク質（標的とするＤＮＡまたは遺伝子に二量体化お よび／または結合し、これらのＤＮＡ結合タンパク質が結合する標的ＤＮＡ配列 または遺伝子の機能を調節または制御することができるもの）を含むものについ ても同様である。一般に、特異性は優性ネガティブ中の二量体化ドメインに由来 する。酸性である核酸結合タンパク質の製造を本明細書に具体的に記載および例 示した以外のタンパク質−タンパク質相互作用系に適用できることは自明であろ う。限定ではない一例にすぎないが、ｂＨＬＨファミリーの転写因子はその塩基 性領域が二量体化領域の延長であるので、ｂＺＩＰタンパク質ファミリーの場合 と同様な様式で二量体化モチーフを拡張するのに好適な候補であると考えられる 。 他の態様において本発明者らは、野生型ｂＺＩＰ転写因子Ｃ／ＥＢＰ、すなわ ちラット肝臓中に存在する熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質(W.H.Landschultz et al.,1988,Genes Dev.,2:786-800；C.R.Vinson et al.,1993,Genes Dev.,7:1047- 1058)と優先的にヘテロ二量体化するｂＺＩＰロイシンジッパー含有タンパク質 （Ｆジッパーまたはヘテロ二量体化ジッパーと呼ばれる）をコードする単離され たＤＮＡを含み、かつ発現する構築体を設計した。Ｆジッパーは、超らせん構造 体のｅおよびｇの位置に帯電したアミノ酸を配置することにより作成され、これ により上記C.R.Vinson et al.,1993に記載されるホモ二量体よりヘテロ二量体が 優先的に形成される。興味深いことに、天然Ｃ／ＥＢＰと、塩基性領域なしに構 築したＦジッパーとの複合体形成により形成されたヘテロ二量体（すなわちＣ／ ＥＢＰ：０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）は、ＤＮＡ不在下では野生型、すなわち天然Ｃ／ ＥＢＰホモ二量体より安定であった。しかしこのヘテロ二量体はＤＮＡに結合し た天然Ｃ／ＥＢＰホモ二量体ほど安定でなく、したがって酸性両親媒性拡張配列 を含まない等モル量のヘテロ二量体化Ｆジッパー（０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）は、天 然Ｃ／ＥＢＰをＤＮＡへの結合から排除することができなかった。したがって、 これまでに製造されたＦジッパーは、化学量論的濃度で良好または有用な優性ネ ガティブ体であるとは考えられなかった。 本発明に従って酸性拡張配列を含む新規な多量体核酸結合タンパク質を形成す ると、この拡張配列によりタンパク質−タンパク質多量体化または二量体化界面 または表面を拡大することができる。最終的に形成されるヘテロ二量体複合体は 、１００倍以上（すなわち２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）安定化される可能性がある 。塩基性領域をもつタンパク質、たとえばｂＺＩＰおよびｂＨＬＨタンパク質に ついては、酸性拡張配列によりこの拡張配列がタンパク質の塩基性領域内へタン パク質−タンパク質相互作用界面を拡大するのを可能にする。酸性拡張配列は、 酸性拡張配列を含む工学処理したタンパク質と天然タンパク質とのヘテロ二量体 複合体の相互作用の安定性をも高めることができる。ヘテロ二量体の安定性が高 まると、本発明の優性ネガティブ体が野生型、すなわち天然のタンパク質産物に 対する有効な化学量論的競合物質となる。 本発明によれば、限定ではないが具体例として、野生型Ｃ／ＥＢＰタンパク質 とＦジッパータンパク質との間に形成されるヘテロ二量体の安定性は、設計され た３ｈｅｐｔａｄ長さの両親媒性α−をＦジッパーのＮ末端に付加することによ り増大した（本明細書中では３ｈｅｐｔａｄ−Ｆと略記する）（図１１Ａ〜Ｃ） 。この方法で、酸性拡張配列はＤＮＡを静電的に模倣し、こうしてＣ／ＥＢＰ塩 基 性領域に代替となる相互作用表面を付与することができる。具体的なＣ／ＥＢＰ の例では、Ｃ／ＥＢＰロイシンジッパーを塩基性領域内へ拡張することにより、 疎水性アミノ酸を含む新たなａおよびｄの位置が形成される。ｂＨＬＨタンパク 質など他のタンパク質については、酸性拡張配列が代替または拡張された相互作 用表面を提供し、これが最終的に標的ＤＮＡ配列（すなわち遺伝子）へのタンパ ク質の結合の程度を制御する。 ｂＺＩＰタンパク質について、Ｃ／ＥＢＰの塩基性領域と結合するためのタン パク質相互作用表面を形成する酸性拡張配列のアミノ酸配列を、側面および末端 の両方から図示する（図１１Ｂ〜１１Ｃ）。Ｎ末端拡張配列は、塩基性領域との 不都合な立体的または静電相互作用を阻止し、適切な相互作用表面を形成する好 都合な静電的および疎水性相互作用を生じるように設計された。分子設計を補助 するために、市販のＣＰＫ分子モデルを用いた。潜在的な疎水性相互作用を推進 するために、拡張配列のすべてのｄ位置にロイシンを配置した。天然Ｃ／ＥＢＰ 塩基性領域はａ位置に２個のアスパラギンを含むので、塩基性領域のアスパラギ ンと酸性拡張配列との好ましいａ⇔ａ′相互作用を生じさせるために、ＧＣＮ４ ロイシンジッパー構造体につき報告されるように（T.Ellenberger et al.,1992, Cell,71:1223-1237）、酸性拡張配列中にアスパラギンを配置した。天然Ｃ／Ｅ ＢＰ塩基性領域の第２および第４のａ位置にはアルギニンがあり、第２の位置の アルギニンはすべてのｂＺＩＰタンパク質において保存されている。本発明によ れば、立体的衝突を避けるために酸性拡張配列の対向するａ位置にアラニンを配 置した。好都合なｇ⇔ａ′静電相互作用を生じさせるためにｇ位置にグルタミン 酸を配置して、ｃ−Ｆｏｓ：ｃ−Ｊｕｎヘテロ二量体のジッパーにおいて起きる 種類の相互作用に対応させた（M.Glover and S.Harrison,1995,Nature,373:257- 261）。さらに、好ましいｇ⇔ｅ′相互作用を生じさせるために、ｅおよびｇ位 置にグルタミン酸を配置した。ヘテロ二量体構造の静電的中和を補助するために 、ｂおよびｃ位置にさらにグルタミン酸を挿入した。得られた３ｈｅｐｔａｄ Ｎ末端拡張配列およびＦジッパーを含むタンパク質を、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆと呼 ぶ。ハイフンは塩基性領域とロイシンジッパーの接合部を表す。ヘテロ二量体に ついては、ヘテロ二量体を構成する個々のタンパク質の名称をコロンで分ける； たと えばＣ／ＥＢＰ：３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ。 また本発明に従って、発現ｂＨＬＨタンパク質、たとえばＭａｘの二量体化ド メインに酸性拡張配列を付加し、発現ｃ−ｍｙｃタンパク質とのヘテロ二量体化 を観察した（図９、実施例６）。酸性拡張配列をｂＨＬＨタンパク質に３つの異 なる配向で付加したところ、ヘテロ二量体化の安定性の増大が認められた。これ により、核酸結合タンパク質、特にＤＮＡ結合タンパク質の核酸結合ドメインの タンパク質−タンパク質相互作用界面を拡張することに対する、酸性拡張配列の 普遍性が示される。 本発明によれば、７個のアミノ酸配列（ｈｅｐｔａｄ）１またはそれ以上をロ イシンジッパータンパク質のＮ末端に付加すると、本明細書に記載する円二色性 （ＣＤ）スペクトルおよび熱融解アッセイにより測定されるように、ヘテロ二量 体形成を安定化することが認められた。この酸性アミノ酸拡張配列は、ロイシン ジッパーを含む野生型、すなわち天然タンパク質の塩基性領域とのタンパク質相 互作用表面を拡張し、天然タンパク質に対する優性ネガティブ体の形成を可能に し、これはＤＮＡから天然タンパク質を化学量論的に排除して天然タンパク質に よるトランス作用を阻害した。 当業者に自明のとおり、少なくとも１個のｈｅｐｔａｄ（１ｈｅｐｔａｄ）、 好ましくは２〜４個またはそれ以上のｈｅｐｔａｄ、すなわち２ｈｅｐｔａｄ、 ３ｈｅｐｔａｄ、４ｈｅｐｔａｄなど（最大数は当業者がルーティンに実験によ り判定することができる）を、適切なＤＮＡ結合タンパク質のＮ末端領域に付加 して、本発明により製造されるタンパク質の最適なヘテロ二量体結合安定性を達 成することができる。しかし酸性拡張配列が長いほど、より多数の同一または類 似の核酸結合タンパク質との相互作用が増大する結果として、非特異性が生じる 可能性があることも注意すべきである。そのような非特異性は、より少量のタン パク質を発現させることによって、および／またはより少数の酸性アミノ酸拡張 配列を用いることによって、緩和されるであろう。このような方法を組み合わせ て、非特異的または多面的作用が最も少ない優性ネガティブ体を形成することが できるであろう。 本発明によれば、前記の優性ネガティブ核酸結合タンパク質を産生および発現 するためのプラスミド構築体、すなわちベクターが提供される。これらの核酸結 合タンパク質は、所望により多様な発現系、特に真核生物系および哺乳動物系、 たとえば酵母、昆虫、ヒト、ハムスター、マウス、ラットなどにおいて、当技術 分野で既知の試薬および方法を用いて発現させることができる。インビトロ系お よびインビボ系のいずれにおいても、用いる構築体は少なくとも１個のプロモー ター、エンハンサー配列（哺乳動物発現系については任意）、ならびに適正な転 写および遺伝子発現の調節に必要な、または要求される他の配列（たとえば転写 開始配列および終止配列、複製起点部位、ポリアデニル化配列）を含むように設 計される。当業者に自明のとおり、真核生物および原核生物発現系において産生 されるタンパク質の適正な転写、発現および単離のための適切なベクターおよび プラスミド成分の選択方法は既知であり、当業者によりルーティンに判定および 実施される。 最終的に、その転写調節タンパク質および生成物を本発明の優性ネガティブ体 で阻害または負に調節する予定の遺伝子（１またはそれ以上）の転写に適切な環 境をもつ当該細胞タイプに、本発明の優性ネガティブ核酸結合タンパク質をコー ドする核酸配列を含む構築体を導入する。この構築体は所望により、優性ネガテ ィブタンパク質を特定の細胞タイプ中で発現するのに適切かつ必要なＤＮＡ要素 を含むように設計することができる。 たとえば、酸性アミノ酸拡張配列をもつ優性ネガティブ核酸結合タンパク質（ たとえばＤＮＡ結合タンパク質）の発現を、ウイルスプロモーター、たとえばサ イトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ホスホグリセ ロールキナーゼ（ＰＧＫ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、またはα−作用プロモ ーターの制御下におくことができる。さらに、調節的プロモーター、たとえばマ ウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のグルココルチコイド反応要素（ＧＲＥ）は、グ ルココルチコイドによる誘導性を付与するであろう（V.Chandler et al.,1983,C ell,33:489-499）。あるいは組織特異性プロモーターまたは調節要素を用いるこ とができる（G.Swift et al.,1984,Cell,38:639-646）。その例には以下のもの が含まれるが、これらは限定ではない：Ｎ−ＣＡＭプロモーター（脳および中枢 神経系に特異的）；ＰＩＴ−１プロモーター（下垂体特異性転写因子）；クリ スタリンプロモーター（目の水晶体におけるタンパク質発現の調節に特異的）； ケラチンプロモーター（皮膚におけるタンパク質発現の調節に特異的）；アルブ ミンプロモーター（肝特異性）；α−またはβ−グロブリンプロモーター（赤血 球特異性）；Ｉｇエンハンサー（Ｂリンパ球特異性）；Ｔ細胞受容体α−または β−プロモーター（Ｔ細胞特異性）;インシュリンプロモーター（膵細胞特異性 ）；ガストリンプロモーター（胃の細胞に特異的）；心臓アクチンプロモーター （心臓特異性）；トロポミオシンプロモーター（骨格筋特異性）；ならびにラク トアルブミンプロモーターおよび乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター（ A.C.Andres et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：1299-1303；C.W.Pittius et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5874-5878）（胸部組織における発現 に特異的）。 調節的な組織特異性プロモーターを用いると、突然変異−優性ネガティブ表現 型の発現を条件つきにすることができ、一般にこれによりその遺伝子発現の誘導 の有無および時期が提示される。これにより優性ネガティブ表現型の発現の存在 しない状態で、本発明の優性ネガティブ核酸結合タンパク質を増加させることが でき、したがって誘導性優性ネガティブ体を温度感受性突然変異体の場合と同様 な様式で使用できる。さらに、ＤＮＡ結合タンパク質になされた修飾は優性であ り、その表現型は機能性野生型遺伝子の存在下で提示されるので、多数のコピー 中に存在する遺伝子の機能を不活性化した結果は遺伝子のコピーそれぞれを不活 性化する必要なしに評価することができる(I.Herskowitz,1987,Nature,329:219- 222)。 前記のように、多様なプロモーター、エンハンサーおよび遺伝子が本発明の構 築体に用いるのに適すること、また本発明の構築体はその構築体を細胞に導入し た場合に目的遺伝子を適正に転写およびプロセシングするのに必要な開始、終止 および制御配列を含むであろうということは、当業者に自明であろう。本発明の 構築体は当業者に既知の多様な遺伝子伝達法、たとえば一般的な遺伝子トランス フェクション法、たとえばリン酸カルシウム共沈法、リポソームトランスフェク ション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および感染また はウイルス形質導入により、細胞に導入できる。さらに本発明は、特定の組織を 標的として遺伝子を送達するために、ウイルス配列含有ベクター、たとえば米国 特許第５，１１２，７６７号（Ｐ．ロイ・バーマンおよびＤ．Ａ．スポディック ）の全部または一部に記載されるものを包含しうると考えられる。この方法の選 択は当業者が容易になしうる範囲のものである。細胞内で発現させるためのＤＮ Ａ配列を保有する１またはそれ以上の構築体を、その後、発現生成物が細胞内に 産生され、および／または細胞から得られるように細胞にトランスフェクション しうることは、当業者に自明であろう。 本発明の構築体においては、酸性拡張配列をもつ核酸結合タンパク質をコード する核酸配列を天然源から得て単離するか、または合成法により得ることができ る。たとえば分子生物学の分野において一般に既知の方法で、核酸結合タンパク 質等を発現することが知られている広範な種より生じたゲノムクローンまたはｃ ＤＮＡクローンなどから適切なＤＮＡ配列を切除し、単離し、そして精製するこ とができる。前記の酸性拡張配列を含むアミノ酸残基をコードするようにこれら のヌクレオチド配列を遺伝子工学処理し、次いで得られた核酸をプラスミドまた はベクターの構築に適切な、または望ましい少なくとも１つのＤＮＡ配列セグメ ント（たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター部位、およびポリ アデニル化部位を含む）と連結させることができる。あるいは本明細書中の配列 番号および添付の図面に示した配列の全部または一部に従って、一般的なＤＮＡ 合成法、たとえばホスファイトトリエステル化学法により、構築体に用いる核酸 配列を合成することができる(たとえば米国特許第４，４１５，７３２号、カル ーテルら；およびSinha,N.D．et al.,1984,Nucl.Acids Res.,12:4539-4557参照) 。 本発明の他の態様においては、本発明により構築された酸性拡張した優性ネガ ティブ体を、それらが関連ファミリーの転写因子を不活性化するインビトロおよ びインビボ機能につきインビトロまたはインビボ環境で試験する。インビトロ試 験に関しては、本発明により製造される発現した核酸結合タンパク質が細胞増殖 に付随する細胞タンパク質を阻害する効力を、前記の一時的トランスフェクショ ン法および形質転換法によりアッセイすることができる。このような技術および アッセイ法は、抗癌薬または抗疾患薬の候補として、また療法用として用いるた めの、工学処理した本発明の酸性拡張された核酸結合タンパク質をスクリーニン グするのにも採用できる。 インビボ試験に関しては、実施例１３に記載するように、一時的トランスフェ クション実験につき記載した構築体（実施例１Ｆおよび８Ｃ）をトランスジェニ ック動物、たとえばマウスの構築に用いる。ＤＮＡ結合タンパク質、たとえばｂ ＺＩＰおよびｂＨＬＨタンパク質（たとえば４ｈｅｐｔａｄＦｏｓ、４ｈｅｐｔ ａｄＣＲＥＢ、２ｈｅｐｔａｄＭａｘ、および３ｈｅｐｔａｄ−Ｆタンパク質） をコードするＤＮＡ配列の発現を推進するためのＣＭＶプロモーターを保有する プラスミド構築体を、動物に導入する。次いで酸性拡張した優性ネガティブ体（ ＤＮ）の発現効果を、これらのＤＮトランスジーンを宿した動物において監視す る。これらの動物を細胞中のトランスジーンの存在およびＤＮタンパク質の発現 につきアッセイする。あるいは本発明の酸性拡張した優性ネガティブタンパク質 をコードするＤＮＡ配列を、この異種遺伝子の発現をトランスジェニック動物の 特定の組織にターゲティングするための組織特異性プロモーター、および完全な ベクター構築体に必要な他の成分を含むベクター内に構築する。 本発明の他の態様では、酸性拡張配列を含む核酸結合タンパク質を発現させた い組織をターゲティングする組織特異性構築体が提供される。このような構築体 は、特定のタイプの細胞および組織内での発現のために、先に列挙したような組 織特異性プロモーター、および酸性拡張配列をもつＤＮＡ結合タンパク質、たと えば４ｈｅｐｔａｄＦｏｓ、４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢ、３ｈｅｐｔａｄＭａｘを コードするＤＮＡ配列、またはその発現が組織特異性プロモーターにより推進さ れる他の転写因子、ならびに転写の開始部位および終止部位、ならびに必要なら ばポリアデニル化部位を含むように設計される。したがって本発明によれば、Ｄ ＮＡ結合タンパク質ファミリーの構成員子、たとえばｂＺＩＰおよびｂＨＬＨフ ァミリーを、個々の組織において、当技術分野で既知であって採用されているト ランスジェニック生物の形成法および遺伝子療法によって選択的に発現させ、そ の機能を調べることができる。 本発明の遺伝子療法への利用に関しては、本明細書に記載した酸性拡張した核 酸結合タンパク質、たとえばＤＮＡ結合転写調節タンパク質、ＲＮＡ結合タンパ ク質などを保有するように設計された構築体は、幹細胞、分化した細胞、生殖細 胞、および癌細胞またはトランスフォームした細胞を含めた多様なタイプの細胞 に対し前記のＤＮタンパク質による不活性化機能を及ぼすことができる。本発明 の優性ネガティブ体によりこのような不活性化または阻害機能を及ぼすことによ り、多様なタイプの細胞、特にたとえばＦｏｓ−Ｊｕｎ二量体化（実施例２およ び４、ならびに図１および４）、またはＭｙｃ−Ｍａｘ二量体化（実施例６およ び７、ならびに図９）の相互作用および活性化の結果として増殖性が変化した細 胞の悪性増殖抑制を誘導および／または誘起することができる。さらに、本発明 により提供されるＤＮ構築体はＤＮＡ結合タンパク質の生物学的由来が多様なの で、ヒト生物学、非ヒト哺乳動物生物学、昆虫生物学および植物生物学の分野に 利用できる。後者の場合、優性ネガティブ体は植物ストレス、抗真菌薬、殺虫薬 および農薬に関連する有用な遺伝子産物の発現を調節することができる。 本発明による優性ネガティブ体、またはその優性ネガティブ機能性部分もしく はフラグメントをベクター中において細胞内へ、そのＤＮＡセグメントが染色体 外に滞在し、細胞内のその染色体外の位置から細胞により発現されるように、導 入することができる。組換えおよび染色体外滞在にともに適した遺伝子およびＤ ＮＡセグメントを導入するためのベクターは、当技術分野で既知である。ＤＮを 含む本発明の構築体で形質転換またはトランスフェクションした細胞は、癌また は腫瘍の鎮静を研究するモデル系として利用できる。 当技術分野で既知の遺伝子伝達系を本発明の実施に利用できる。ウイルス法お よび非ウイルス法がともに適している。多数のウイルスが遺伝子伝達ベクターと して利用されており、これにはトリ、ネズミおよびヒトに由来するパポーバウイ ルス、たとえばＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウ イルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶおよびＥＢＶを含む）、およびレトロウイル スが含まれる。当業者に自明のとおり、大部分のヒト遺伝子療法プロトコールは 不能にしたネズミレトロウイルスを基礎とする。組換えレトロウイルスＤＮＡも 、無ヘルパー組換えレトロウイルスの高力価ストックを形成しうる両種性（ａｍ ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系と共に使用できる（たとえばR.Cone and R.Mulligan,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6349）。 受容体仲介遺伝子伝達法によれば、構築体中のＤＮＡを直接に特定の組織にタ ーゲティングすることができる。これはＤＮＡ（しばしば、共有結合閉環した超 らせんプラスミドの形）をポリリシンによりタンパク質リガンドに結合させるこ とにより達成される。適切または適するリガンドは、標的とするタイプの細胞ま たは組織の細胞表面に、対応するリガンド受容体が存在することに基づいて選択 される。これらのリガンド−ＤＮＡ結合体を所望により直接に血液中へ注入する ことができ、これらは標的組織へ向かって移動し、そこで受容体結合およびＤＮ Ａ−タンパク質複合体インターナリゼーションが起こる。細胞内でのＤＮＡ破壊 の問題を克服するために、エンドソーム機能を妨害するアデノウイルスとの同時 感染を利用できる。 当技術分野で既知の非ウイルス法による遺伝子伝達には、化学的方法、たとえ ばリン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡの直接取込みおよび受容体仲介によるＤＮＡ 伝達、ならびに機械的手段、たとえばマイクロインジェクションおよび膜融合仲 介−リポソーム伝達が含まれる。さらに、ウイルス仲介による遺伝子伝達方法を リポソームによる直接インビボ遺伝子伝達法と組み合わせ、これによりウイルス ベクターを周囲の非増殖細胞には送達することなく、たとえば腫瘍細胞へ送達す ることができる。レトロウイルスベクター産生細胞系を、特定の細胞タイプ、た とえば腫瘍に直接に注入して、ウイルス粒子の連続供給源を提供することができ る。これはたとえば手術不可能な脳腫瘍に罹患した患者に採用することが証明さ れている。 生物学的遺伝子伝達方法と物理的方法を組み合わせる方式では、アデノウイル スヘキソンタンパク質と特異的に反応するポリリシン結合抗体と組み合わせた任 意のサイズのプラスミドＤＮＡを利用する。得られた複合体をアデノウイルスベ クターに結合させる。この３分子複合体を次いで細胞の感染に用いる。このアデ ノウイルスベクターは効果的に細胞に結合し、インターナリゼーションし、そし て結合したＤＮＡが損傷を受ける前にエンドソームを破壊する。 上記の構築体を、薬剤学的に許容しうるキャリヤーおよび生理学的賦形剤を含 有する薬剤配合物または組成物の形で投与することができる。この配合物におい てベクターは、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含めた当該受容生物の細胞、組 織または器官をターゲティングするために、ウイルスベクター構築体などであっ てよい。この組成物は、上記成分を薬剤学的に許容しうる好適な液体または溶液 、たとえば無菌の生理的食塩水その他の注射用水性液体に分散させることにより 調製できる。このような組成物に用いられる成分の量は、当業者がルーティンに 決定できる。これらの組成物は、皮下、静脈内、筋肉内および胸骨内を含めた非 経口的な注射経路で投与できる。他の投与様式には鼻内、くも膜下、皮内、経皮 、腸内および舌下投与が含まれる。注射投与のためには、組成物は無菌の溶液も しくは懸濁液の形であり、または薬剤学的および生理学的に許容しうる水性もし くは油性の担体中に乳化してもよく、これらは保存薬、安定剤、および溶液また は懸濁液を受容生物の体液（すなわち血液）と等張にするための物質を含有して もよい。用いるのに適した賦形剤は、水、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）０． １５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセリン、希エタノールなど 、およびその混合物である。安定剤の具体例は、ポリエチレングリコール、タン パク質、糖類、アミノ酸、無機酸および有機酸であり、これらは単独または混合 物として使用できる。 本発明の核酸結合タンパク質は、発現した酸性拡張された核酸結合タンパク質 またはその機能性結合フラグメントを多様な薬物スクリーニング法で用いて化合 物をスクリーニングするために使用できると考えられる。たとえばこのような試 験に用いる工学処理した発現ＤＮＡ結合タンパク質またはフラグメントは、溶液 中で遊離しているか、固体状支持体に固定されているか、または細胞表面に提示 されるか、いずれであってもよい。薬物スクリーニング法のひとつでは、上記タ ンパク質またはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転 換される真核または原核宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイにおいて用い る。このような細胞を、生存可能な形または固定した形で、標準結合アッセイに 用いることができる。たとえば核酸結合タンパク質もしくはフラグメントと被験 物質との複合体の形成を定量するか、または核酸結合タンパク質もしくはフラグ メントと既知リガンドとの複合体の形成が被験物質で妨害される程度を調べるこ とができる。 したがって本発明は、薬剤を本発明の核酸結合タンパク質もしくはフラグメン トと接触させ、そして(ｉ)その薬剤と核酸結合タンパク質もしくはフラグメント との複合体の存在、または(ii)核酸結合タンパク質もしくはフラグメントとリガ ンドとの複合体の存在を、当技術分野で周知の方法でアッセイすることを含む、 薬剤のスクリーニング法を提供する。このような競合結合アッセイ法においては 、核酸結合タンパク質もしくはフラグメントを一般に標識する。遊離の核酸結合 タンパク質もしくはフラグメントをタンパク質：タンパク質複合体中に存在する ものから分離すると、遊離（すなわち複合体を形成していない）標識の量は、そ れぞれ核酸結合タンパク質への被験物質の結合の尺度、または核酸結合タンパク 質：リガンドの結合の、被験物質による妨害の尺度として用いられる。 薬物スクリーニングのための他の方法は、ＤＮＡ結合タンパク質への好適な結 合親和性をもつ化合物の高処理量スクリーニング法を提供し、欧州特許第出願８ ４／０３５６４号（ガイセン、１９８４年９月１３日発行）に詳述されている。 要約すると、多数の異なる小ペプチド系の被験化合物を固体状支持体、たとえば プラスチックピンまたは他のいずれかの表面で合成する。ペプチド被験化合物を 前記のＤＮＡ結合タンパク質と反応させ、洗浄する。洗浄したのち、結合したＤ ＮＡ結合タンパク質を当技術分野で周知の方法により検出する。あるいは精製し たＤＮＡ結合タンパク質を、上記の薬物スクリーニング法に用いるプレートに直 接に塗布してもよい。しかし、そのポリペプチドに対する非中和抗体を利用して 抗体を捕獲させ、ＤＮＡ結合タンパク質を固相に固定化することもできる。 本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質を特異的に結合しうる抗体をＤＮＡ結合タン パク質またはそのフラグメントへの結合に対して被験化合物と競合させる、競合 薬物スクリーニングアッセイ法の使用を包含する。この方法では、これらの抗体 を利用して、ＤＮＡ結合タンパク質と１またはそれ以上の抗原決定因子を共有す るペプチドの存在を検出することができる。 合理的な薬物設計も本発明の用途と考えられる。合理的な薬物設計の目標は一 般に、たとえば活性もしくは安定性がより高い形のタンパク質もしくはポリペプ チドである薬物、またはたとえばインビボでタンパク質もしくはポリペプチドの 機能を高め、もしくはそれと相互作用する薬物を製造するために、生物学的に有 効な当該ポリペプチドおよびタンパク質の構造類似体、またはそれらが相互作用 する小分子（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質）を製造すること である。たとえばHodgson,1991を参照されたい。１方法においては、まず当該タ ンパク質（たとえば本発明の酸性拡張したＤＮＡ結合タンパク質）の三次元構造 をＸ線結晶学的方法、コンピューターモデリング、または最も一般的には組合わ せ方法で決定する。これより頻度は低いが、ポリペプチドの構造に関する有用な 情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによっても得られる。酸性ア ミノ酸拡張配列をもつ核酸結合タンパク質の製造および設計により、同族細胞タ ンパク質への結合に関して、対応する正常な修飾されていない細胞タンパク質の 場合より高い親和性をもつ生成物を発現、産生および検出することができる。本 発明の酸性拡張した核酸結合タンパク質は、それの天然の同族細胞核酸（たとえ ばＤＮＡ）結合タンパク質と複合体を形成して、その同族タンパク質の機能を阻 害または阻止し、最終的には細胞の遺伝子転写および発現に影響を与えることが できる。したがって本発明に従って設計および製造した生成物は、野生型、すな わち天然のタンパク質の、より有効な優性ネガティブ体となりうる。 したがって、改良されたＤＮＡ結合機能、活性または安定性をもち、またはよ り有効な二量体形成分子として、もしくはＤＮＡタンパク質結合活性の阻害物質 、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物を設計することができる 。このＤＮＡ結合タンパク質配列を分子合成することにより、Ｘ線結晶学などの 分析研究を行うのに十分な量のタンパク質を製造することができる。さらに、Ｄ ＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ配列により、Ｘ線結晶学的方法の代わりに、または そ のほかに、コンピューターモデリング技術の採用が可能となる。 有効な核酸結合タンパク質分子を、たとえばマイクロインジェクションまたは リポソームの使用により細胞に導入することができる。あるいは若干の機能性分 子を細胞が能動的に、または拡散により取り込むことができる。遺伝子産物が核 内に局在化するならば、腫瘍の増殖に影響を与えるためには、本発明の酸性拡張 したＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子産物を細胞外適用することで十分であろう。 酸性拡張したＤＮＡ結合タンパク質の活性をもつ分子を供給すると、新生物状態 が部分的には逆転するはずである。酸性拡張した核酸結合タンパク質の活性をも つ他の分子（たとえばペプチドまたはその機能性部分）を用いてこのような逆転 作用を及ぼすこともできる。実質的に類似の機能をもつ修飾ポリペプチドも、ペ プチド療法に用いられる。 実施例 本明細書中の実施例は、本発明の多様な実施態様を例示するものであって、本 発明を限定するためのものではない。実施例１ 材料および方法 Ａ．核酸、プラスミドおよびタンパク質 細胞による発現のために、核酸結合タンパク質（酸性拡張配列をもつもの、お よびもたないものの両方）をコードするＤＮＡを含むプラスミド構築体を、当技 術分野で用いられている方法、プロトコールおよび試薬を用いて製造した。サイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＦＬＡＧエピトープ（インビトロゲ ン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、および配列番号：３２に示した核酸配列を含む 、４ｈｅｐｔａｄ−Ｆジッパータンパク質発現のための構築体を構築した。配列 番号：３２で示したＤＮＡ配列は、Ｎ末端リーダー配列（下記の配列番号：３３ に記載）、３個のグリシン（ＧＧＧ）残基（ヌクレオチド４３〜５１）（本明細 書に記載するように、これが欠如するとより有効な優性ネガティブ体が生成する ）（実施例１Ｆ参照）、配列番号：３８に示した４ｈｅｐｔａｄ配列、および配 列番号：３４に含まれるＦジッパーＤＮＡ配列を含む。 配列番号：３２は下記のとおりである： 下記に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中へ形質転換した構築体から発現させ、 インビボで産生させ、単離、精製したタンパク質配列を下側に挙げる。各タンパ ク質において、イニシエーターであるメチオニンは大腸菌中でプロセシング除去 される。本明細書においては、アミノ酸残基略記のために慣用される下記の一文 字記号を用いる： Ａ（アラニン）；Ｃ（システイン）；Ｄ（アスパラギン酸）；Ｅ（グルタミン酸 ）；Ｆ（フェニルアラニン）；Ｇ（ジリシン）；Ｈ（ヒスチジン）；Ｉ（イソロ イシン）；Ｋ（リシン）；Ｌ（ロイシン）；Ｍ（メチオニン）；Ｎ（アスパラギ ン）；Ｐ（プロリン）；Ｑ（グルタミン）；Ｒ（アルギニン）；Ｓ（セリン）； Ｔ（トレオニン）；Ｖ（バリン）;Ｗ（トリプトファン）；およびＹ（チロシン ）。 Ｃ／ＥＢＰおよびＧＢＦ−Ｃ／ＥＢＰ以外のタンパク質はすべて、下記の１３ アミノ酸Ｎ末端リーダー配列をもつ： ＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＰ−（配列番号：３３） Ｆジッパーアミノ酸配列は下記のとおりである： （配列番号：３４） 多重ｈｅｐｔａｄ含有ジッパーのアミノ酸配列を以下に示す。ｈｅｐｔａｄ配 列中の最後から２番目の位置のＬは、Ｆロイシンジッパーの最初の“Ｌ”の位置 である。本明細書に示した、本発明に用いる種々のアミノ酸配列に対応する核酸 配列、すなわちトリプレットコドンは常法により遺伝子コードに従って決定しう ることは、当業者に自明であろう。 本明細書に記載し、使用する３種類のｂＺＩＰドメインを下記の１）〜３）に 示す。別途明記しない限り、キメラｂＺＩＰタンパク質のタンパク質配列に対応 する核酸配列は、参考文献に報告されたものである。 １）イタリック体のＧＣＮ４配列を含むキメラＧＣＮ４−Ｃ／ＥＢＰタンパク質 配列を示す： ＧＣＮ４のクローン化およびそれに対応する核酸配列は、A.G.Hinnebusch,1984, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6442により記載されている。Ｃ／ＥＢＰをコードす る遺伝子の単離および核酸配列は、W.H.Landschulz et al.,1988,Genes Dev.,2: 786-800に記載されている。 ２）ＧＢＦ−Ｃ／ＥＢＰキメラタンパク質のポリペプチド配列： Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｂＺＩＰタンパク質であるＧ ＢＦのクローン化およびそれに対応する核酸配列は、U.Schindler et al.,1992, The EMBO J.,11:1261-1273に記載されている。 ３）ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰキメラタンパク質のポリペプチド配列： ニワトリ−ビテロゲニン遺伝子結合タンパク質であるＶＢＰのクローン化および それに対応する核酸配列は、S.Iyer et al.,1991,Mol.Cell.Biol.,11:4863-4875 に記載されている。Ｂ）タンパク質の発現および精製 酸性拡張配列を含むタンパク質および含まないタンパク質を大腸菌内で発現さ せ、培養上清から単離、精製した。より詳細には、ファージＴ７発現系を用いて 大腸菌内でタンパク質を合成した（F.Studier and B.Moffatt,1986,J.Mol.Biol. ,189:113-130）。細菌培養物（約４００ｍＬ）を１ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ− チオガラクトピラノシド）により６００ｎｍでの光学濃度０．６で約２時間誘導 した。次いで細胞を遠心分離により回収し、６ｍＬの細胞溶解用緩衝液（５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、１ ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および０．２ｍＭフッ化フェニルメチルス ルホニル（ＰＭＳＦ））に再懸濁し、凍結し、融解し、２ｍＬの４Ｍ ＫＣｌの 添加によって徐々に１Ｍ ＫＣｌにした。試料をベックマンＴ４２ローターによ り２５，０００ｒｐｍで遠心し、上清を分離し、単離した。次いで単離した上清 を６５℃に１０分間、加熱し、遠心し、上清を単離した。ＤＮＡを結合しうるタ ンパク質を１００ｍＭ ＫＣｌに希釈し、D.Krylov et al.,1994,EMBO J.,13:18 49-1861の記載に従ってヘパリン−アガロースカラムで精製し、次いでレイニン （Ｒａｉｎｉｎ）ＨＰＬＣ系で精製した。ＤＮＡ結合ドメインを欠如するタンパ ク質をモノＱセファロース（Ｍｏｎｏ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで、２ ００ｍＭ、４００ｍＭおよび６００ｍＭ ＫＣｌにより溶離して精製した。次い でこれらのタンパク質に富む画分を、レイニンＨＰＬＣ系で、０．１％トリフル オロ酢酸中０％から１００％までのアセトニトリルによるＣ１８カラムクロマト グラフィーにより精製した。２３０ｎｍにおけるアミノ酸の分子吸光度（３００ ／残基）を用いてモル濃度を計算した。必要に応じて２３０ｎｍにおける吸光度 にチロシン（４９８０）およびトリプトファン（６８１８）の関与を含めた（C. CantorおよびP.Schimmel,1980，Biophysical Chemistry、Ｗ．Ｈ．フリーマン社 、ニューヨーク；G.Fasman,1976,CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,第３版、ＣＲＣプレス社）。Ｃ．分析用超遠心 D.Krylov et al.,1994,EMBO J.,13:2849-2861の記載に従って分析用超遠心を 行った。ただしタンパク質の吸光度を２６０ｎｍで監視した。３種類の濃度のタ ンパク質試料を２４，０００ｒｐｍで平衡に達するまで遠心し、４８時間後にデ ータを収集した。チロシン１個を含むＣ／ＥＢＰ試料（ＭＷ＝１６，１０４）は ２６０ｎｍの波長で吸収するが、芳香族アミノ酸を含まない３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ （ＭＷ＝９，８４７）は２６０ｎｍでは吸収しない。この吸収の差により３ｈｅ ｐｔａｄ−Ｆの存在下または不在下でのＣ／ＥＢＰのオリゴマー化を監視するこ とができた。Ｄ．円二色性（ＣＤ） D.Krylov et al.,1994,EMBO J.,13:2849-2861の材料と方法の記載に従ってＣ Ｄ分析を行った。D.Krylov et al.,1994（前掲）の記載に従って、本明細書に記 載したすべてのタンパク質につきＴ_m値を計算し、Ｔ_m値対△Ｈのプロットから計 算した−０．９６ｋｃａｌ／ｍｏｌ℃^-1の△Ｃ_pを用いてＫ_d(25)および△Ｇ(２ ５)に変換した。すべての熱融解が可逆的であった。表２は種々の塩条件下での ヘテロ二量体形成ジッパー（Ｆ）とＣ／ＥＢＰの混合物の安定性を示す。 表１は、ホモ二量体または２種類のタンパク質の等モル混合物としての種々の タンパク質のＣＤ熱融解に関する融解温度（Ｔ_m、℃）、△Ｇおよびｋ_d（２５℃ ）を示す。混合物がいずれかのホモ二量体単独より高い融解温度をもつ場合、混 合物試料はヘテロ二量体からなると推定された。（Ｌ）は“低い”塩条件（５０ ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）、（Ｈ）は“通常の”塩条件（１２．５ｍＭリン酸カルシウム、ｐＨ７ ．４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ）を 表す。表２では後者の条件を用いた。“０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ”は塩基性領域を欠 如したＦジッパーを表す。△Ｇで表されるＲＭＳ誤差は、ホモおよびヘテロ二量 体につきそれぞれ０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである 。Ｅ．トリプトファン蛍光 ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域のトリプトファンの蛍光を、アミンコ(Ａｍｉ ｎｃｏ)ＳＬＭ８０００光子計数分光蛍光計により、低速モード２５℃において 、それぞれ２９６および３４２ｎｍの励起および発光で監視した。試料はＣＤ測 定につき記載したものと同じ条件の塩を含有していた。１０^-6Ｍ ＶＢＰ：Ｃ／ ＥＢＰモノマーを含有する試料を、長さ２８塩基対であり、その配列にＶＢＰ塩 基性領域が特異的に結合するＣ／ＥＢＰ結合部位（０．５×１０^-6Ｍのデュプレ ックス）を含むＤＮＡプローブと混合した（N.B.Haas et al.,1995,Mol.Cell.Bi ol.,15:1923-1932）。このプローブの配列は、５′ＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＴＴＧ ＣＧＣＡＡＴ ＡＴＣＧＧＴＣＡＧ ３′（配列番号：４６）である。共通のＣ／ Ｅ ＢＰ ＤＮＡ結合部位を下線および太字で示す。 ＣＤ熱融解から計算したホモおよびヘテロ二量体のＫ_dから、蛍光平衡実験に ＤＮ（優性ネガティブ体）を添加した場合にＤＮＡから排除されるＶＢＰ−Ｃ／ ＥＢＰの画分が判定された。たとえばＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰのＤＮＡ結合定数は、 下記の方程式によりＤＮＡからのＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰの排除におけるＤＮの有効 性を判定することによって計算された： [DNA_bound]/[DNA_free]＝(K_hetero/K_DNA)²[ヘテロ二量体]²/{K_DN[DN]} 式中のK_heteroはヘテロ二量体解離定数であり、Ｋ_DNはＤＮ解離定数であり（両 者ともＣＤ熱融解により測定）、Ｋ_DNAは転写因子のＤＮＡ結合定数である。 ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰのＤＮＡ結合定数は、１１モル過剰の０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ 、または１．１モル過剰の１ｈｅｐｔａｄ−Ｆ、２ｈｅｐｔａｄ−Ｆもしくは３ ｈｅｐｔａｄ−Ｆについてのデータを用いた場合、１０^-10と計算された。ＤＮ Ａ結合定数の計算値が一致することは、ＣＤ熱融解から測定したヘテロ二量体に ついての△Ｇ’が有効性に関する有用な指標であることを示唆する。Ｆ．一時的トランスフェクション 本明細書で用いたＭＳＶプロモーターを含むＣ／ＥＢＰファミリーのトランス 作用因子プラスミド（ｐＭＥＸ−Ｃ／ＥＢＰα、ｐＭＥＸ−Ｃ／ＥＢＰβ、ｐＭ ＥＸ−Ｃ／ＥＢＰδ）は、S.Williams et al.,1991,Genes and Devel.,5:1553-1 567に記載されたものであった。これらのプラスミドを、Ｎ末端にＦＬＡＧエピ トープ（インビトロゲン）を含むように修飾した。Ｃ／ＥＢＰα−ＧＣＮ４キメ ラはｂＺＩＰタンパク質ＧＣＮ４に由来するロイシンジッパーを含んでいた。Ｃ ＡＴリポータープラスミドは、最小プロモーターの前に共通Ｃ／ＥＢＰ結合部位 （すなわちＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴ、配列番号：４７）を含んでいた。ＤＮはすべ て、核局在化配列（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＫＫＲＫ、配列番号：４８）をもつＮ末 端ＦＬＡＧエピトープを含むように修飾されたｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン ）中へクローン化された。同様にＣ／ＥＢＰαをｐＲｃ／ＣＭＶ中へクローン化 して、トランス作用アッセイおよび阻害アッセイの両方につき、ｐＭＥＸ−Ｃ／ Ｅ ＢＰαを用いて得たものと類似の結果を得た。ＦＬＡＧエピトープで修飾したプ ラスミドと、ＦＬＡＧエピトープを含まないものとで類似の結果が得られた。 これらの実験では、１０μｇのリポータープラスミド、０．３μｇのトランス 作用因子、および５μｇのＤＮを一時的トランスフェクションそれぞれに際し添 加した。ＤＰＤキャップをもつ３ｈｅｐｔａｄ−Ｆは、Ｃ／ＥＢＰトランス作用 を１：１のモル比で完全に阻害した。せん断したサケ精子ＤＮＡを添加して、Ｄ ＮＡ濃度を２０μｇにした。製造業者の指示（ギブコ）に従ってリン酸カルシウ ムトランスフェクションを実施した。 一時的トランスフェクションで得た細胞抽出液のウェスタンブロッティングで は、酸性拡張配列の５′末端すなわちＮ末端に配置されたＦＬＡＧエピトープを 含む３ｈｅｐｔａｄ−Ｆは、この構築体がＣ／ＥＢＰトランス作用を完全に阻害 したにもかかわらず、ブロット上に見られないことを示した。考えられる説明は 、酸性拡張配列を停止するために用いたグリシン３個のＮ末端キャップがタンパ ク質分解感受性のタンパク質配列であったことである。したがってさらに４種類 の配列、すなわちＤＰ−、ＤＰ−Ｄ、ＤＰ−ＥＥおよびＤＰ−ＤＥＥＥをＤＰ− ＧＧＧの代わりにＮ末端キャップとして用いた（J.Richardson and D.Richardso n,1988,Science,240:1648-1652）。Ｃ／ＥＢＰとのヘテロ二量体としてのそれら の熱安定性を監視し、それらを一時的トランスフェクションで得た細胞抽出液の ウェスタンブロットにより検出しうる可能性を判定した。すべての配列がウェス タンブロット中に検出された。興味深いことに、ＤＰ−およびＤＰ−Ｄキャップ はＤＰ−ＧＧＧキャップより３倍安定であった。 ｂＺＩＰタンパク質Ｃ／ＥＢＰのトランス作用は、ヘテロ二量体形成Ｆジッパ ー（すなわち０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）またはＣ／ＥＢＰロイシンジッパー領域に付 加された３ｈｅｐｔａｄ酸性拡張配列（すなわち３ｈｅｐｔａｄ−Ｃ／ＥＢＰ） のいずれによっても完全には阻害されないことを本発明者らは見出した。しかし 、３ｈｅｐｔａｄ−Ｃ／ＥＢＰは測定可能な程度には阻害した。ロイシンジッパ ーと酸性拡張配列の両方を変化させると、Ｃ／ＥＢＰのＤＮＡ結合とトランス作 用の両方を競合阻害するのに十分なほど安定なヘテロ二量体を形成するタンパク 質（３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）が生成した。しかしｂＺＩＰファミリーの他のタンパ ク 質および構造的に類似する他のファミリーのタンパク質については、ヘテロ二量 体形成ジッパーにより得られる付加的な安定性なしに酸性拡張配列のみで、優性 ネガティブ体を形成するのに十分な安定化エネルギーを得るのが可能であること は自明であろう。これは、特定の個々のｂＺＩＰタンパク質に対するＤＮＡ結合 の相対的な安定化効果に依存するであろう。本発明によれば、任意のｂＺＩＰロ イシンジッパーのＮ末端に単に酸性拡張配列を付加することにより、塩基性領域 とさらに強固に二量体形成する酸性拡張配列を設計し、これにより任意のｂＺＩ Ｐタンパク質に対する優性ネガティブ体を形成することができる。実施例２ 酸性拡張配列はｂＺＩＰクラスのタンパク質のヘテロ二量体化を増進する 酸性拡張配列がｂＺＩＰクラスのＤＮＡ結合タンパク質であるｃ−Ｆｏｓ、Ｃ ＲＥＢおよびＣＥＢＰに与える影響を調べるために実験を行った。ｃ−Ｆｏｓお よびＣＲＥＢタンパク質は酸性４ｈｅｐｔａｄ反復配列を含むように設計された （図３および４）。酸性拡張ＣＲＥＢは、図３に記載したようにアスパラギンを ロイシンに代えた新たな酸性拡張配列を含むように設計された（Ｎｅｗ４ｈｅｐ ＣＲＥＢ）。図示するように、ＣＲＥＢ＋Ｎｅｗ４ｈｅｐｔａｄＣＲＥＢは６９ ．５℃の融解温度を示した（白丸）。アスパラギンを含む酸性拡張配列と比較し てこの著しい熱安定性増大は、不活性化すべきｂＺＩＰタンパク質そのものに応 じて、ｂＺＩＰタンパク質のＮ末端二量体化ドメインに付加するために種々のク ラスの酸性拡張配列を利用できることを示唆する。 図４において、塩基性領域を欠如した工学処理ｃ−Ｆｏｓタンパク質（０ｈｅ ｐｔａｄ−Ｆｏｓと呼ぶ）はＦｏｓ／Ｊｕｎ複合体の融解温度を５３℃に高めた （白四角）。塩基性領域が酸性領域で置換された工学処理ｃ−Ｆｏｓタンパク質 （４つの酸性反復配列を含む、“４ｈｅｐｔａｄＦｏｓ”と呼ぶ）はＦｏｓ−Ｊ ｕｎ複合体の融解温度を６１℃に高めた（白丸）。図２に示すように酸性領域の １個のアミノ酸をアスパラギンからロイシンに代えた工学処理ｃ−Ｆｏｓタンパ ク質（ｎｅｗ４ｈｅｐｔａｄＦｏｓと呼ぶ）はより高い７２℃の融解温度を生じ 、ｃ−Ｊｕｎとより安定なヘテロ二量体を形成した（黒四角）。同様に図４に示 す ように、修飾されていないｃ−Ｊｕｎのホモ二量体化は２９．４℃の融解温度を 示し、酸性修飾したｃ−Ｆｏｓ（ｃ−Ｆｏｓタンパク質のアミノ末端に４つの酸 性反復配列が付加されたもの）のホモ二量体化は２５℃の融解温度を示した。同 様に図４に示すように、ｃ−Ｊｕｎホモ二量体についてはＫｄ（３７℃）は２０ μＭ；ｃ−Ｊｕｎ／ｃ−Ｆｏｓヘテロ二量体については０．２μＭ：ｃ−Ｊｕｎ ／４ｈｅｐｔａｄＦｏｓヘテロ二量体についてはは６ｎＭであった。実施例３ ｂＺＩＰおよび酸性拡張配列の特異性はジッパーにより決定される ｂＺＩＰタンパク質の塩基性領域、およびロイシンジッパーのＮ末端の酸性拡 張配列（すなわちａＺＩＰと呼ぶ）の特異性はロイシンジッパーにより決定され ることが認められた。図５Ａに示すように、不適合性ジッパーをもつｂＺＩＰＣ ＥＢＰタンパク質とａＺＩＰ ４ｈｅｐｔａｄＦｏｓタンパク質を混合しても相 互作用は起きない。すなわち４ｈｅｐｔａｄＦｏｓはＣＥＢＰと相互作用しない 。図５Ｂは、ｂＺＩＰ ＶＢＰタンパク質とａＺＩＰ ３ｈｅｐｔａｄＦ（ＣＥ ＢＰ特異性）タンパク質の混合もヘテロ二量体化相互作用を生じないことを示す 。図５Ａおよび５Ｂにおいて、実線はこれら２つのホモ二量体の単純な和である 。実際の混合物が等しい結果を与えたという事実は、ヘテロ二量体は形成されて いないことを証明する。実施例４ ＡＰ１シス要素によるトランス作用はＤＮＡ結合タンパク質に付加された酸性拡 張配列により阻害される ＡＰ１活性はｂＺＩＰ ＤＮＡ結合タンパク質であるｃ−Ｆｏｓに付加された 幾つかの酸性拡張配列によって阻害されることが、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２） およびＡＰ１依存性ＣＡＴリポーター発現構築体を用いてＣＡＴ活性を測定する 一時的トランスフェクション実験で証明された（図６）。ＨｅｐＧ２細胞を、ｃ −Ｆｏｓタンパク質発現のために最高３種類のプラスミド構築体でトランスフェ クションした。これら３種類のプラスミドは以下のものであった：Ｊｕｎトラン ス作用因子を発現するための構築体、ＣＡＴ発現を推進するＡＰ１シス要素を含 むリポーター構築体、および優性ネガティブ体をコードするＤＮＡならびに適切 な発現配列および調節配列を含む構築体。ＣＭＶ５６６およびＣＭＶ５００プラ スミドは、Ｎ末端にそれぞれヘマグルチニン（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号 ：４９）またはＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号：５０）エピトープを 含むＤＮＡ結合タンパク質の発現を推進するサイトメガロウイルスプロモーター を含むプラスミドである。ｃ−Ｆｏｓタンパク質は、塩基性領域からＮ末端へ付 加された酸性ｈｅｐｔａｄ反復配列を含まない（０ｈｅｐ−Ｆｏｓ）、塩基性領 域からＮ末端へ付加された酸性ｈｅｐｔａｄ反復配列１個を含む（１ｈｅｐ−Ｆ ｏｓ）、塩基性領域からＮ末端へ付加された酸性ｈｅｐｔａｄ反復配列２個を含 む（２ｈｅｐ−Ｆｏｓ）、塩基性領域からＮ末端へ付加された酸性ｈｅｐｔａｄ 反復配列３個を含む（３ｈｅｐ−Ｆｏｓ）、または塩基性領域からＮ末端へ付加 された酸性ｈｅｐｔａｄ反復配列４個を含む（４ｈｅｐ−Ｆｏｓ）ように設計さ れた。トランスフェクションは、図６に示すようにＣＭＶ５６６またはＣＭＶ５ ００、およびＮ末端拡張配列をもつｂＺＩＰをコードするＤＮＡ配列を含むプラ スミド３または１５μｇを用いて実施された。これらの３種類の実験の結果は、 発現ｃ−Ｊｕｎタンパク質によるＡＰ１トランス作用が酸性拡張配列をもつ発現 ｃ−Ｆｏｓタンパク質により阻害されることを示す。これらの結果は、ＡＰ１ト ランス作用の阻害が特異的であることも証明する。他のｂＺＩＰタンパク質（す なわちＣＲＥＢ、ＶＢＰまたはＪｕｎ）に付加した酸性拡張配列はＡＰ１トラン ス作用を阻害しなかったからである。実施例５ 酸性拡張配列を含むｂＺＩＰタンパク質（ａＺＩＰ）は酸性拡張配列を含まない ｂＺＩＰタンパク質より良好なＡＰ１活性化阻害因子である 他の一時的細胞系においてジャーカット細胞拡張配列（ｂＦｏｓ）を用いて、 実施例４に記載したと同様な実験を行った。ジャーカット細胞（Ｂ細胞モデル） は高水準の内因性Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ＡＰ１）活性をもつ。２種類のプラスミド（ 各１μｇ）、すなわちＡＰ１シス要素を含むリポーター構築体、およびトランケ ートした形のＦｏｓ（ｂＺｉｐＦｏｓ）または４ｈｅｐｔａｄ酸性拡張配列を含 むＦｏｓロイシンジッパー（ａＦｏｓ）の発現を推進するＣＭＶ５００プロモー ターを含む構築体で、細胞を一時的トランスフェクションした。ＡＰ１活性は １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール（ＴＰＡ）の添加によって誘導され、こ れにより遺伝子の誘導は４０倍になった。リポーター遺伝子のトランス作用は内 因性活性のため起きた。図７および８に証明されるように、ｂＺｉｐＦｏｓ Ｄ ＮＡ配列構築体がコードするｂＺｉｐＦｏｓタンパク質の発現により優性ネガテ ィブ活性が生じた。しかしａＺｉｐＦｏｓ構築体がコードするａＺｉｐＦｏｓタ ンパク質の発現はより効果的であり、著しく高い水準のＡＰ１活性阻害を示した 。これらの実験において、ａＺＩＰタンパク質ｃ−ＦｏｓはＮ末端に付加した４ つの酸性ｈｅｐｔａｄ反復配列を含むように設計された（４ｈｅｐｔａｄ−Ｆｏ ｓ）。発現したａＺＩＰタンパク質の阻害活性を、酸性拡張配列を含む工学処理 がなされていないｃ−Ｆｏｓタンパク質（ｂＺＩＰ）の場合と比較した。実施例６ ＤＮＡ結合タンパク質に付加した酸性拡張配列は遺伝子機能の制御および調節の ための化合物を提供する ｂＨＬＨクラスのＤＮＡ結合タンパク質の二量体化ドメインに、酸性拡張配列 を付加した（図９）。両親媒性酸性拡張配列をもつ発現ｂＨＬＨタンパク質、Ｍ ａｘ（すなわち２ｈｅｐｔａｄＭａｘ）の塩基性領域の置換により、ＨＬＨタン パク質に付加した酸性拡張配列の配向に関係なくＭａｘとｃ−Ｍｙｃのヘテロ二 量体化が増大した。図９に示したヘテロ二量体化試験に用いた２ｈｅｐｔａｄＭ ａｘタンパク質は、下記の両親媒性酸性拡張配列をもつ発現Ｍａｘタンパク質で ある： ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａｘ（ ７８３）と呼ぶ；（配列番号：１）； ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａｘ （７８４）と呼ぶ；（配列番号：２）；および ＤＰＤＬＥＫＥＡＥＥＬＥＱＥＮＡＥＬＥＥＥＬＥＤＳＦ；２ｈｅｐｔａｄＭａ ｘ（７８５）と呼ぶ：（配列番号：３）。 ＡｃｉｄＭａｘは、Ｎ末端に下記の酸性拡張配列を付加した発現Ｍａｘタンパク 質である：ＤＰＤＥＥＥＤＤＥＥＥＬＥＥＬＥＤＳＦ；（配列番号：４）。 ０ｈｅｐｔａｄＭａｘは、その酸性拡張配列として配列ＤＰＤＬＥＥＬＥＤＳＦ （配列番号：５）をもつ発現Ｍａｘタンパク質である。０ｈｅｐｔａｄＭａｘは 酸性拡張配列をもたないＭａｘの二量体化ドメインである。遺伝子クローン化の ため、発現したこのタンパク質は短い酸性拡張配列ＤＰＤＬＥＥＬＥＤＳＦ（配 列番号：５）をもつ。酸性拡張配列をＭａｘに付加することによりｃ−Ｍｙｃと の二量体化が増大するのは、本発明方法が有用であることを示す。 さらに、ポリグルタミン酸配列をもつ発現ＡｃｉｄＭａｘタンパク質は、上記 ３種類の両親媒性拡張配列のいずれを含むＭａｘタンパク質の場合より良好にｃ −Ｍｙｃと二量体化した。図９において、酸性修飾したＨＬＨタンパク質および 修飾していないものについてのＫｄ（Ｍ）は下記のとおりである： Ｍａｘ ＤＮＡ配列を保有するように設計されたプラスミドベクターにおいて は、“ＤＰＤ”アミノ酸配列がＢａｍクローン化部位である。このタンパク質構 築体は、ＢａｍＨＩクローン化部位ＤＰＤのＮ末端側に隣接してΦ１０ファージ 由来の１３アミノ酸配列（ＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲ）（配列番号：５１）を含む 。この真核細胞発現ベクターは、Φ１０タンパク質配列の５′側に付加したＮ末 端タンパク質配列を含むことができる。この付加的なＮ末端タンパク質配列は、 哺乳動物細胞内での発現を監視するために用いられるエピトープである。その配 列はＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：４９）である。 Ｍａｘ拡張配列の最後のアミノ酸はＭａｘの二量体化ドメインの１にあるフェ ニルアラニン（Ｆ）である。このアミノ酸は大部分のｂＨＬＨタンパク質におい て保存されており、したがってＭａｘタンパク質構築体においてＭａｘの二量体 化ドメインに付加した設計された酸性配列の位置を知るのに好都合な目印となる 。 この実施例に記載した実験では、両親媒性酸性タンパク質配列をＭａｘ二量体化 ドメインのＮ末端に付加した。酸性拡張配列と二量体化ドメインの間のリンカー は、異なる個数のグルタミン酸を含んでいた。このリンカーの長さの差が、酸性 両親媒性配列を二量体化ドメインに対して回転させる作用をもっていた。 これらの結果は、酸性拡張配列の普遍性により、種々のクラスのＤＮＡ結合タ ンパク質が最終的に遺伝子機能を制御および調節するのが可能になることを証明 する。実施例７ 付加された酸性拡張配列を含むＤＮＡ結合タンパク質を挿入した構築体で細胞を 安定にトランスフェクションすることにより細胞の増殖およびトランスフォーメ ーションに及ぶ影響 細胞（たとえばＣ３Ｈ１０Ｔ１／２）を平板培養し、平板当たり５０ｎｇのＤ ＮＡでトランスフェクションする細胞トランスフェクションアッセイを行った。 これらの実験で用いたフォーカスアッセイ法はS.Min et al.,1993,Oncogene,8:2 691-2701に記載されている。潜在的ＤＮ（優性ネガティブ）を用いた２実験を行 った。まず細胞を前記の構築体で形質転換し、一般的な組織培養プラスチック皿 （たとえばペトリ皿）で平板培養した。これらのアッセイ法で、酸性拡張ＤＮを コードするＤＮＡを含む構築体が細胞の生存性に与える影響を調べた。細胞の生 存性はこれらの構築体によって影響されないことが認められた。次いで同じ細胞 を、Ｍａｘ ＤＮ ＤＮＡ（実施例６に記載）を挿入した構築体を、Ｒａｓおよ び／またはＭｙｃをコードするＤＮＡを挿入した構築体と共にトランスフェクシ ョンし、細胞が接触阻止に依存しない様式で増殖する能力を調べた。細胞を高濃 度においてプラスチック皿で平板培養し、それらが接触阻止された増殖を克服し うる能力を評価した。本発明のＭａｘ ＤＮ（すなわち酸性拡張Ｍａｘ）をＲａ ｓ（１０ｎｇ）および／またはＭｙｃ（３００ｎｇ）と同時トランスフェクショ ンすると、ＤＮの作用が明瞭に観察された。０ｈｅｐｔａｄＭａｘ（１μｇ）は ７３コロニーから３４コロニーにフォーカス形成を阻害し、一方２ｈｅｐｔａｄ Ｍａｘはコロニー数をゼロに減少させた。ポリ酸性Ｍａｘ構築体は、これらのア ッセイにおいて２ｈｅｐｔａｄＭａｘの阻害活性と同様か、またはより良好にフ ォ ーカス形成を阻害する傾向がある。実験に用いたｒａｓ構築体は、それを構造的 に活性に維持する突然変異を含むｒａｓ遺伝子を含む（E.Taparowsky et al.,19 82,Nature,300:762-765に記載）。このｒａｓ遺伝子はその正常なプロモーター により推進される。ｍｙｃ構築体はＲＳＶ ＬＴＲにより推進される通常のｍｙ ｃ遺伝子である。３日後に平板を固定し、１４日後に染色した。同様に１４日後 にＧ４１８耐性コロニーを定量し、結果を以下に示す。 下記に示すように、本発明のＦｏｓ構築体を用いて実施した同じ種類の実験で 、フォーカス形成阻害が示された。Ｍａｘと異なりＦｏｓ発現構築体は、これら のアッセイでコロニー形成とフォーカス形成をともに阻害できた。コロニーアッ セイにおいては、ネオマイシン遺伝子を保有し、その産物を発現する細胞を選択 するための、ネオマイシン遺伝子のみを保有する対照プラスミド構築体（ｐＫＯ ｎｅｏと表示）についても結果を示す。この対照プラスミドは１２７コロニーを 形成した。当業者に既知のとおり、ｎｅｏ遺伝子は他の発現可能な遺伝子を含む 構築体内へ組み込まれる一般的なマーカー遺伝子であり、前記プラスミド構築体 で細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションしたのちネオマ イ シンに対する細胞の耐性により測定されるｎｅｏ遺伝子の発現に関する選択マー カーとして用いられる。 実施例８ 競合アッセイ ３種類の競合実験で、酸性拡張配列はｂＺＩＰタンパク質Ｃ／ＥＢＰの活性に 対し、強力なＤＮ（優性ネガティブ）を形成することが証明された。２つの生化 学的アッセイはＤＮＡ結合を目標にしたものであり（すなわちゲルシフトおよび 蛍光アッセイ）、１つの生化学的アッセイはトランス作用機能を目標にしたもの である（すなわち一時的トランスフェクションアッセイ）。Ａ．ゲルシフト ゲルシフト実験は、Ｃ／ＥＢＰがその同族ＤＮＡ配列に結合するのを３ｈｅｐ ｔａｄ−Ｆが阻害するか否かを調べるために行われた。ゲルシフトデータは、Ｃ ／ＥＢＰがＫ_d＝１０^-9ＭでＤＮＡに結合することを示した（Z.Cao et al.,1991 ,Genes Dev.,5:1538-1552）。本明細書に提示したＣＤ（円二色性）実験は、３ ｈｅｐｔａｄ−ＦがＣ／ＥＢＰとＫ_d＝４×１０^-11Ｍでヘテロ二量体化すること を示した。したがって、ＤＮＡ、Ｃ／ＥＢＰ二量体、および３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ 二量体の等モル混合物はＣ／ＥＢＰ：３ｈｅｐｔａｄ−Ｆヘテロ二量体を形成す るので、Ｃ／ＥＢＰがＤＮＡを結合するのを阻止すると予想された。ゲルシフト データから、この等モル混合物が放射性標識した共通オリゴヌクレオチドへのＣ ／ＥＢＰの結合を完全に阻害することが確認された（図１３Ａ）。Ｂ．蛍光 第２の競合アッセイでは、ＶＢＰの塩基性領域にみられる唯一のトリプトファ ンの内在蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を監視した。 ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰキメラのＤＮＡ結合により、このトリプトファンの蛍光が約 ４０％増加した。トリプトファンがより束縛された環境、すなわちＤＮＡ結合に 際して予想される状況にある場合に、蛍光の増加が予想される（CantorおよびSc himmel,1980,Biophysical Chemistry、Ｗ．Ｈ．フリーマン社、ニューヨーク） （図１３Ｂ）。ＤＮＡ結合に際して生じるこのＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰの内在蛍光の 変化により、このｂＺＩＰ ＤＮＡ複合体に一連のＦジッパー−酸性拡張配列を 付加した際の速度論的および平衡的結果を調べることができる。ＶＢＰ−Ｃ／Ｅ ＢＰはＤＮＡに速やかに結合すること（約５秒）、およびＦジッパー−酸性拡張 タンパク質の添加によりトリプトファンの蛍光が減少することが認められた。Ｆ ジッパー−酸性拡張タンパク質がＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰとヘテロ二量体化してＤＮ Ａ結合を阻害した場合に、これが予想される。 Ｆジッパーに付加した種々の長さの酸性拡張配列を含むタンパク質を、ＶＢＰ −Ｃ／ＥＢＰとＤＮＡの複合体に１：１のモル比で混合した。長い酸性拡張配列 ほど蛍光をより大きく減少させ、したがってＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰとより効果的に ヘテロ二量体化することが示された。約２０分で反応が平衡に達したのち、さら に１０モル当量のＤＮを添加した。０ｈｅｐｔａｄ−Ｆおよび１ｈｅｐｔａｄ− Ｆは、１１倍過剰ですらＤＮＡからＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰを完全に排除することは できなかった。しかし２ｈｅｐｔａｄ−Ｆおよび３ｈｅｐｔａｄ−Ｆは、１１倍 過剰でＤＮＡからＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰを完全に排除することができた。４ｈｅｐ ｔａｄ−Ｆは１．１モル当量で８５％のＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰをＤＮＡへの結合か ら排除したので、最も有効であった。 ＶＢＰ塩基性領域のトリプトファン残基の位置は、ロイシンジッパーから４ｈ ｅｐｔａｄである。トリプトファンは比較的短い酸性拡張配列、たとえば１、２ または３ｈｅｐｔａｄ拡張配列をもつもの（すなわち０〜３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ） とのヘテロ二量体としてはランダムらせん立体配座にあると考えられるが、より 酸性の拡張配列をもつもの（すなわち４ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）とのヘテロ二量体と しては超過らせん立体配座にあると考えられる。トリプトファンは疎水性表面の 一部であると考えられる。すなわちトリプトファンはａの位置を占め、したがっ てより大きな蛍光を発するであろう。これが観察された。０、１、２または３ｈ ｅｐｔａｄ−Ｆとの混合物中のＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰのトリプトファンの蛍光は、 ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰのみの場合と類似する。これを本発明者らはランダムらせん 状態でのトリプトファンの蛍光と解釈する。４ｈｅｐｔａｄ−Ｆとの混合物中に おいては、ＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰの蛍光は約１０％増加し、これはトリプトファン が超らせんの疎水性界面にある場合に起きるように、より束縛されていることを 示唆する。Ｃ．一時的トランスフェクション 第３の競合アッセイは、酸性拡張配列およびｂＺＩＰ ＤＮＡ配列を含む構築 体を肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）に一時的トランスフェクションして、単一のＣ／ ＥＢＰ結合部位を含むプロモーターに対するＣ／ＥＢＰのトランス作用特性を監 視することを伴う（実施例１Ｆも参照）。Ｃ／ＥＢＰはこのプロモーターのトラ ンス作用を１０倍活性化しうることが示された（図１４）。４種類の異なる潜在 的ＤＮを含む構築体は、１５：１の比率でＣ／ＥＢＰトランス作用を阻害するこ とができた。これら４種類のＤＮはトランス作用ドメインのトランケーション（ △Ｃ／ＥＢＰ）、０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ、および３ｈｅｐｔ ａｄ−Ｃ／ＥＢＰである。△Ｃ／ＥＢＰ、０ｈｅｐｔａｄ−Ｆおよび３ｈｅｐｔ ａｄ−Ｃ／ＥＢＰを保有する構築体は、Ｃ／ＥＢＰトランス作用をわずかかに阻 害したにすぎない。これと著しく対照的に、３ｈｅｐｔａｄ−ＦはＣ／ＥＢＰ仲 介によるトランス作用を完全に阻害することができた。この完全阻害は、Ｃ／Ｅ ＢＰプラスミド対３ｈｅｐｔａｄ−Ｆプラスミドの比率１：１でもみられた。し たがって、Ｃ／ＥＢＰの完全不活性化にはヘテロ二量体形成Ｆジッパーと酸性拡 張配列の両方が必須であることが見出された。さらに、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆを含 む構築体は、試験したすべてのＣ／ＥＢＰファミリーの構成員子（Ｃ／ＥＢＰα 、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ）のトランス作用活性を阻害することが認められ た。 ３ｈｅｐｔａｄ−ＦによるＣ／ＥＢＰトランス作用阻害がＣ／ＥＢＰロイシン ジッパーに依存するか否かを調べるために、Ｃ／ＥＢＰロイシンジッパーをＧＣ Ｎ４ロイシンジッパーで置換したＣ／ＥＢＰトランス作用タンパク質を形成した 。このキメラタンパク質は、Ｃ／ＥＢＰシス要素依存性様式で最小プロモーター のトランス作用を活性化することができた。このトランス作用は３ｈｅｐｔａｄ −Ｆによっては阻害されず、したがって３ｈｅｐｔａｄ−ＦのＤＮ特性は特異的 ロイシンジッパー相互作用に依存することが示された。実施例９ 酸性拡張配列はロイシンジッパー含有タンパク質、たとえばｂＺＩＰの塩基性領 域と超らせんを形成する ロイシンジッパーのＮ末端に１またはそれ以上のｈｅｐｔａｄの酸性アミノ酸 配列を付加すると、本明細書に記載する円二色性（ＣＤ）スペクトルおよび熱融 解アッセイにより測定したヘテロ二量体形成が安定化されることが見出された。 この酸性タンパク質（またはポリペプチドもしくはペプチド）拡張配列は、ロイ シンジッパーを含む野生型、すなわち天然タンパク質の塩基性領域とヘテロ二量 体超らせんを形成し、天然タンパク質に対する優性ネガティブ体を作成すること ができ、これが天然タンパク質をＤＮＡから化学量論的に排除し、天然タンパク 質によるトランス作用を阻害した。 Ｃ／ＥＢＰと３ｈｅｐｔａｄ−Ｆの等モル混合物のオリゴマー化状態を調べる ために、沈降平衡分析を行った（図１１）。データを単一分子種に適合させた。 計算分子量はＣ／ＥＢＰについては３３，０００ダルトン（二量体の分子量は約 ３２，２０８）、Ｃ／ＥＢＰ−３ｈｅｐｔａｄ−Ｆ混合物については２８，００ ０ダルトン（ヘテロ二量体の分子量は約２６，２００）である。これらのデータ は、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆと混合した場合にヘテロ二量体を形成しているＣ／ＥＢ Ｐと一致する。 円二色性（ＣＤ）を用いて、Ｃ／ＥＢＰと種々の長さの酸性拡張配列がＦジッ パーに付加されたものとの混合物中に存在するα−の量を測定した（図１２Ａ） 。Ｃ／ＥＢＰと長さが漸増する酸性拡張配列との混合物は、α−含量の漸増を示 した。本明細書に記載するヘテロ二量体化混合物のα−ヘリックス含量の増加は 、ロイシンジッパー二量体化界面が塩基性領域内へ拡張していることを明らかに する。すなわち、酸性拡張配列が長いほど、超らせん構造はロイシンジッパーか ら塩基性領域内へいっそう拡張する。ホモ二量体としての一連の酸性拡張配列（ ０ｈｅｐｔａｄ−Ｆから３ｈｅｐｔａｄ−Ｆまで）の６℃におけるＣＤスペクト ルは同様な量のα−ヘリックス含量を示し、したがって長さの漸増する酸性拡張 配列がヘリックスではなかったことを示す。４ｈｅｐｔａｄ−ＦのＣＤ融解は２ 相性であった。これは、この酸性拡張配列がロイシンジッパーと無関係に、１３ ℃で融解する超らせん構造を形成することを示すと考えられる。 Ｃ／ＥＢＰと種々の長さの酸性拡張配列との混合物の安定性をＣＤ熱融解によ り測定した（表２および図１２Ｂ）。すべての混合物がそれぞれのホモ二量体よ り高いＴ_mをもち、これはヘテロ二量体が形成されたことを示唆する。０ｈｅｐ ｔａｄ−Ｆ：Ｃ／ＥＢＰヘテロ二量体はＣ／ＥＢＰホモ二量体より安定であるが 、 前者は付加的なヘリックスを含有しなかった。これはロイシンジッパー構造がよ り安定であることを示唆する。酸性拡張配列が長いほど、より安定な複合体を形 成した。これらの拡張配列はＴ_mを約１０℃高めた。これは２．５ｋｃａｌ／ｍ ｏｌ、すなわち１００倍を越える安定化に相当する。 最高４ｈｅｐｔａｄの酸性タンパク質配列をＦロイシンジッパーのＮ末端に付 加したエネルギーおよび構造上の結果を、円二色性（ＣＤ）スペクトルおよび熱 融解によりアッセイした。Ｆジッパーに付加した最初の酸性ｈｅｐｔａｄは、Ｃ ／ＥＢＰとのヘテロ二量体を１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上安定化した。この安定性増 大にともなって楕円率が増大した。これはα−の形成を示す。酸性ｈｅｐｔａｄ 拡張配列を付加する毎に、ロイシンジッパー超らせんの１ｈｅｐｔａｄ拡張と一 致して楕円率が増大した。しかしこの安定性への寄与は、ｈｅｐｔａｄ拡張配列 の増加にともなって次第に小さくなった。楕円率の増大と安定性への寄与の漸減 は、Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域と酸性拡張配列の間の超らせん構造はこの構造がロイ シンジッパーから遠ざかるほど弱くなることを示唆する。Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域 を他の塩基性領域、たとえばＶＢＰまたはＧＢＦ塩基性領域と交換した場合にも 、類似の結果が得られた。これらの知見に基づいて、ｂＺＩＰタンパク質および これと構造的に類似するタンパク質の一連の塩基性領域と特異的に二量体化する 拡張配列を設計および作成することができる。実施例１０ Ｃ／ＥＢＰとヘテロ二量体化するジッパー（Ｆ）の安定性 Ｃ／ＥＢＰとＦロイシンジッパーとの間に形成されるヘテロ二量体(C.Vinson et al.,1993に記載、前掲）−−Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域とのキメラとして（Ｃ／ ＥＢＰ−Ｆ）または単独で（０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）−−の熱安定性を測定した（ 表１および図９Ｃ〜９Ｄ参照）。ゲルシフト条件（５０ｍＭ ＫＣｌ）を用いる と、ＦジッパーおよびＣ／ＥＢＰ塩基性領域を含むキメラ（Ｃ／ＥＢＰ−Ｆ）は 、Ｃ／ＥＢＰホモ二量体より５倍安定なヘテロ二量体をＣ／ＥＢＰと形成した。 しかし、より生理的な塩条件（１５０ｍＭ ＫＣｌ）を用いると、Ｃ／ＥＢＰ− ＦはＣ／ＥＢＰホモ二量体よりわずか２倍安定なヘテロ二量体をＣ／ＥＢＰと形 成したにすぎない。塩基性領域が欠如すると（０ｈｅｐｔａｄ−Ｆ）、Ｃ／ＥＢ Ｐとのヘテロ二量体の安定性は０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ増大したが、このヘテロ 二量体はなお、ＤＮＡに結合した野生型Ｃ／ＥＢＰホモ二量体ほど安定ではなか った。これらの結果は、ロイシンジッパーのみを修飾することによりＣ／ＥＢＰ をＤＮＡから排除しうるＤＮを作成する初期の試みが失敗であったことを示す。 野生型Ｃ／ＥＢＰホモ二量体は、１５０ｍＭ ＫＣｌと比較して５０ｍＭ Ｋ Ｃｌ中では安定性が４℃低かった。これは塩基性領域間の反発によるものであろ う。この低下はＣ／ＥＢＰ：Ｃ／ＥＢＰ−Ｆヘテロ二量体についてはみられなか った。Ｆジッパーと野生型Ｃ／ＥＢＰジッパーとの静電引力の増大が２つのＣ／ ＥＢＰ塩基性領域間の反発増大を補償したためであろう。Ｃ／ＥＢＰ：Ｃ／ＥＢ Ｐ−Ｆヘテロ二量体の安定性と比較してＣ／ＥＢＰ：０ｈｅｐｔａｄ−Ｆヘテロ 二量体の安定性が増大したのも、同じ相互作用によるものであろう。０ｈｅｐｔ ａｄ−Ｆ突然変異体は反発性の塩基性領域を欠如するからである。実施例１１ 酸性拡張配列は追加した２つのｂＺＩＰ塩基性領域と超らせんを形成する 酸性Ｎ末端拡張配列が他のｂＺＩＰ塩基性領域と超らせんを形成するか否かを 調べるために、天然Ｃ／ＥＢＰロイシンジッパーに結合したさらに２つの塩基性 領域を含むキメラを作成した。第１の塩基性領域はニワトリビテロゲニン遺伝子 結合タンパク質（ＶＢＰ）（S.Iyer et al.,1991,Mol.Cell.Biol.,11:4863-4875 ）、すなわちＴＥＦ（D.Drolet et al.,1991,Genes Dev.,5:1739-1753）のニワ トリ対応因子に由来し、第２はＧＢＦ−１、すなわちｂＺＩＰタンパク質の最も 分岐したシス要素に結合することが知られている植物ｂＺＩＰタンパク質に由来 するものであった（U.Schindler et al.,1992,EMBO J.,11:1261-1273）。ホモ二 量体としてのこれらのキメラ（すなわちＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰおよびＧＢＦ−Ｃ／ ＥＢＰ）の熱融解の結果は、Ｃ／ＥＢＰから１℃以内のＴ_mを示した。これは、 二量体の強度がロイシンジッパーにより決定されたことを示す（表２）。表２は 、異なる長さの酸性拡張配列をもつＦジッパーと、Ｃ／ＥＢＰジッパーに付加し た３種類の異なるｂＺＩＰ塩基性領域を含むキメラとのヘテロ二量体の安定性を 示す。 表に示すように、４つの酸性ｈｅｐｔａｄ拡張配列は、試験した３種類の異な るｂＺＩＰ塩基性領域と好ましい相互作用を示した。酸性拡張配列との超らせん 形成に関して、Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域はＧＢＦおよびＶＢＰ塩基性領域より良好 な候補であると推定されていたので、最初はこれは意外であった。ＧＢＦおよび ＶＢＰを含めた大部分のｂＺＩＰはロイシンジッパーのＮ末端の最初のｄ位置に 塩基性アミノ酸を含むのに対し、Ｃ／ＥＢＰはアラニンを含む。塩基性アミノ酸 は超らせん形成に適さず、アラニンの方が適すると予想されていた。ＣＤ熱融解 は、これが正しいことを示した。すなわち、Ｃ／ＥＢＰは１ｈｅｐｔａｄ−Ｆと １．７±０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌでヘテロ二量体化し、これは０ｈｅｐｔａｄ− Ｆとの場合より良好であった。一方、ＶＢＰおよびＧＢＦの塩基性領域は、それ ぞれ０．９±０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび１．３±０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ安 定化されたにすぎにい。興味深いことに、３種類の塩基性領域間のこの安定性の 差は、塩基性領域がより長い酸性拡張配列で“ジッパー閉じ”されるのにともな って、より目立たなくなった。 ロイシンジッパードメインに対する酸性拡張配列は多様な異なる塩基性領域で 効果的に安定化され、したがってこのタンパク質配列は塩基性ドメインおよびロ イシンジッパードメインを含む多様なタイプのタンパク質に対する優性ネガティ ブ体の作成に利用できるということを示唆する。本明細書に例示する生物学的ア ッセイは、酸性拡張配列を含むように設計および製造されたＣ／ＥＢＰ転写因子 タンパク質が、ｂＺＩＰファミリーまたは構造的に類似するタンパク質ファミリ ーの他のタンパク質構成員子の代表例であると考えられるＣ／ＥＢＰファミリー の、強力な優性ネガティブ体であることを証明する。 ２キメラ体を、Ｆジッパーに付加した４つの異なる長さの酸性拡張配列と混合し 、ＣＤ熱融解からそれらの安定性を測定した。興味深いことに、他の２種類の塩 基性領域も酸性拡張配列によって安定化された。その安定化の程度は試験した３ 種類の塩基性領域の場合と同じであり、したがってこの相互作用は塩基性領域の 比較的保存された部分で起きたことが示唆される。 したがって２系統の証拠が、本発明に従って発現およびアッセイしたタンパク 質中の塩基性領域と酸性拡張配列が超らせんを形成することを示唆した。第１は 、酸性拡張配列を塩基性領域と混合してキメラ構造体を形成させた場合にα−ヘ リックス含量が増大したことにある。第２は、ＶＢＰおよびＣ／ＥＢＰ ｂＺＩ Ｐタンパク質のキメラとＦジッパー−酸性拡張配列系列との間に形成されたヘテ ロ二量体の例の蛍光分析から判定された（実施例１Ｅおよび８Ｂ参照）。ＶＢＰ −Ｃ／ＥＢＰキメラ中のトリプトファンは、ロイシンジッパーから４ｈｅｐｔａ ｄの塩基性領域に位置する。ＶＢＰの塩基性領域と酸性拡張配列の間に超らせん が形成された場合、４ｈｅｐｔａｄ−ＦとＶＢＰ−Ｃ／ＥＢＰとのヘテロ二量体 のみがトリプトファンを超らせん構造内に配置し、これにより新たな蛍光信号を 発することは予想される。事実、この結果が観察された。ただし、このような蛍 光信号の変化はより短い酸性拡張配列を含むヘテロ二量体にはみられなかった。実施例１２ 酸性拡張配列はＤＮＡ擬似配列である 天然Ｃ／ＥＢＰとのヘテロ二量体の安定性に対する酸性拡張配列内の種々の超 らせん位置（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）の重要性を、４種類の突然変異タン パク質の製造により調べた。各タンパク質は、３ｈｅｐｔａｄ−Ｆの作成に用い たＣ／ＥＢＰ塩基性領域に対する一連の突然変異を含んでいた。ヘテロ二量体の 安定性に対する最大の寄与は、ａとｇの位置に配置されたグルタミン酸により得 られた。これらの負に帯電したアミノ酸は、塩基性領域に多数みられる正に帯電 したアミノ酸と相互作用するらしい。これは、酸性拡張配列がＤＮＡの静電特性 に調和することによりＤＮＡ擬似体として作用することを示唆する。他の３種類 の突然変異タンパク質は、３個のグリシンからなるＮ末端らせんキャップ、キャ ッ プと疎水性コア（ａとｄ）、ならびにキャップと全般的な静電関係および形成関 係（ｂ、およびｃ）が関与することを証明した。これらすべての突然変異タンパ ク質が、ある程度は野生型Ｃ／ＥＢＰ塩基性領域とのヘテロ二量体の安定性に寄 与した（実施例１Ｆ参照）。実施例１３ トランスジェニックマウス試験 実施例１Ｆおよび８Ｃに一時的トランスフェクションアッセイに関して記載し た構築体を用いて、トランスジェニック動物、特にマウスを形成した。要約する と、この構築体を動物またはその動物の祖先に胚の段階、すなわち１細胞期に、 または一般にほぼ８細胞期以前に導入する。本発明の構築体を保有するトランス ジェニック動物は、当業者に既知の幾つかの方法で形成できる。１方法は、優性 ネガティブ（ＤＮ）核酸配列をトランスジーンとして挿入した完全シャトルベク ターを得るために、優性ネガティブロイシンジッパーを含むタンパク質をコード するＤＮＡ配列を含むように構築したレトロウイルスをトランスフェクションす ることによる。他の方法は、トランスジーンを直接に胚に注入することによる。 第３の方法は、胚幹細胞の使用による。トランスジーンまたは構築体を導入しう る動物の例には、マウス、ラット、他のげっ歯類、ヒツジ、ブタ、および霊長類 が含まれるがこれらに限定されない（参照：Recombinant DNA、“マウスへの外 来遺伝子の導入”、並びにその中の引用文献、J.D.Watsonら編、Ｗ．Ｈ．フリー マン社、ニューヨーク州ニューヨーク、p.254-272）。本発明のＤＮをコードす るトランスジーンを保有し、かつ安定に発現するトランスジェニック動物は、た とえば癌や腫瘍の退行または萎縮の研究のための生物モデルとして利用できる。 トランスジェニック動物の適切な組織を、当技術分野で確立した方法で細胞中の ＲＮＡまたはＤＮＡの存在につきアッセイすることにより、構築体またはその成 分の統合を監視することができる。 さらに、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞変換に際して発現する３種類のＣ／ＥＢ Ｐイソ形のうち１種類またはそれ以上に対する優性ネガティブ体として作用させ るために、ｂＺＩＰまたはそれと構造的に類似するタンパク質のジッパーに対す る酸性拡張配列をコードするＤＮＡ配列を含む構築体中に、組織特異性プロモー ターまたは他の関連配列を用いたトランスジェニックマウスを形成することがで きる（Z.Cao et al.，Genes Dev.,5:1538-1552）。この系における機能性優性ネ ガティブ体を製造することにより、細胞を脂肪細胞に変換する際に関与する遺伝 子（１またはそれ以上）またはその突然変異体を不活性化することができる。上 記構築体は、モデル動物およびヒトにおいて、病的肥満および病的肥満の症状に 付随する１１型糖尿病の状態を軽減または緩和する可能性を提供するであろう。 組織特異性プロモーター、たとえば乳腺組織をターゲティングするホエー（wh ey）活性化タンパク質（ＷＡＰ）を用いて、ＤＮが乳腺組織に局在化してそこで 特異的に機能するトランスジェニック動物を形成することができる。たとえば細 胞内での適正な遺伝子転写およびタンパク質発現に適切な要素のほかに、マウス ＷＡＰプロモーター、および本発明のＤＮタンパク質をコードする単離ＤＮＡを 含む、構築体を設計することができる。そのＤＮが細胞タンパク質の異常な活性 を不活性化する活性を、雌トランスジェニックマウスの乳腺組織において監視で きる。 さらに、前記構築体を当技術分野で知られているヒト遺伝子療法に利用して、 その調節がロイシンジッパー構造体をもつ転写調節タンパク質により制御される か、またはそれに関連をもつ細胞タンパク質生成物を不活性化することができる 。本発明の構築体を使用するのに必要なように変更できる遺伝子療法は、たとえ ば米国特許第５，３９９，３４６号（Ｗ．フレンチ・アンダーソンら）に記載さ れている。実施例１４ “やせた”表現型のマウスを形成するための、優性ネガティブＣ／ＥＢＰを用い るトランスジェニックマウス試験 実施例１３に記載したように、トランスジェニックマウス試験を実施し、トラ ンスジェニック表現型を示すマウスの子が産まれた。これは、本発明に従って製 造および発現した優性ネガティブ体が動物のインビボ環境で機能したことを示す 。トランスジェニックマウスはトランスジェニック動物形成の技術分野で実施さ れているルーティンな方法により形成された。 これらの試験では、初期のマウス胚に図３０に記載した構築体を注入すること によりトランスジェニックマウスを形成した。前記のように、このプラスミド構 築体は、４２２／ａＰ２プロモーター（脂肪細胞の脂肪酸結合タンパク質）、本 発明の優性ネガティブ３ｈｅｐｔａｄＦ Ｃ／ＥＢＰをコードするＤＮＡ配列（ これは翻訳および発現されると、非突然変異Ｃ／ＥＢＰタンパク質に対する優性 ネガティブとして機能する酸性拡張されたｂＺＩＰ Ｃ／ＥＢＰタンパク質を産 生する）、および図３０に示す他の調節配列を含むように設計された。Ｃ／ＥＢ Ｐは脂肪細胞の発生と分化に関係するとされている。優性ネガティブ３ｈｅｐｔ ａｄＦ Ｃ／ＥＢＰ配列は４２２／ａＰ２脂肪細胞特異性プロモーターの制御下 に置かれ、本明細書に記載するＦＬＡＧΦ１０エピトープをも含んでいた。 マウスの胚に、優性ネガティブＣ／ＥＢＰタンパク質を発現しうる構築体を注 入することにより、最初の創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウス４匹を形成した。これ らの創始マウスを用いて、１またはそれ以上のトランスジーンコピーを保有する 子孫を得た。創始マウスの子孫のうち１匹はやせて骨張った表現型を示した。こ れは優性ネガティブ体の発現が正常なＣ／ＥＢＰタンパク質の発現に影響を与え 、その結果、脂肪細胞ならびに組織の発生および分化に負の調節および影響が生 じた場合に予想される。 より詳細には、雄創始トランスジェニックマウスが２匹の雌マウスを妊娠させ た。これら２匹の雌が産んだ２つの同腹子には表現型の異なるタイプの２匹の子 が含まれていた：第１のタイプは貧相な毛をもつ、やせた小柄なマウスであり、 第２のタイプは正常な外見の毛をもつ、正常な体格のものであった。小柄でやせ た貧相な子はすべてトランスジーンのコピーを含み、これに対しそれらの正常な 同腹子は含まなかった。これらの結果は、酸性拡張した優性ネガティブをコード するＤＮＡを含み、かつ動物においてインビボでトランスジーンを発現するよう に設計された構築体は、たとえば正常な遺伝子がコードする正常な対応タンパク 質の発現および／または機能を不活性化することにより、それらに影響を与えう ることを示す。さらにこのような優性ネガティブ体はトランスジェニック創始動 物から産まれたトランスジーン保有動物の表現型に、立証可能なほどに影響を与 えることができる。 本明細書に含まれる特許明細書、報文、テキストおよび参考文献の内容全体が 、 参考として本明細書に含まれるものとする。 以上、明確に理解するために図面および実施例により本発明をかなり詳細に記 載したが、本明細書および請求の範囲に記載した本発明の精神および範囲から逸 脱することなく特定の変更および修飾をなしうることは当業者に自明であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項 【提出日】１９９７年３月３１日 【補正内容】 請求の範囲 １．そのアミノ末端に付加された複数の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基 の拡張配列を有する、単離および精製された核酸結合タンパク質。 ２．タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。 ３．タンパク質がＲＮＡ結合タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。 ４．酸性アミノ酸残基が細胞ＤＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体化し て、ＤＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項１記載のタンパク質。 ５．酸性アミノ酸残基が細胞ＲＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体化し て、ＲＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項１記載のタンパク質。 ６．タンパク質が天然に存在する細胞タンパク質に対する優性ネガティブ体で ある、請求項４記載のタンパク質。 ７．タンパク質がｂＺＩＰタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。 ８．ｂＺＩＰタンパク質がＦｏｓ、Ｊｕｎ、ＧＣＮ４、ＶＢＰ、ＧＢＦ、ｏｐ ａｑｕｅ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＰＡＲ、ＡＴＦ２および植物Ｇボックスタン パク質よりなる群から選択される、請求項７記載のタンパク質。 ９．タンパク質がｂＨＬＨタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。 １０．ｂＨＬＨタンパク質がＭｙｃ、ＭａｘおよびＭａｄよりなる群から選択 される、請求項８記載のタンパク質。 １１．酸性アミノ酸残基がグルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項 １、２または３記載のタンパク質。 １２．酸性拡張配列が２〜１００個のアミノ酸残基を含む、請求項１、２また は３記載のタンパク質。 １３．酸性拡張配列が３〜５０個のアミノ酸残基を含む、請求項１２記載のタ ンパク質。 １４．酸性拡張配列が４〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１３記載のタ ンパク質。 １５．酸性拡張配列が２８個のアミノ酸残基を含む、請求項１４記載のタンパ ク質。 １６．本質的に配列番号：１〜５２に示す配列からなる、単離されたＤＮＡ分 子。 １７．そのＮ末端に付加された複数の酸性アミノ酸残基を有する核酸結合タン パク質をコードする、単離されたＤＮＡ分子。 １８．請求項１６または１７記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位 、転写終止部位、複製起点部位、およびポリアデニル化部位を含む、真核細胞内 での発現のためのプラスミドベクター構築体。 １９．真核細胞が植物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択 される、請求項１８記載のベクター。 ２０．請求項１６または１７記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位 および転写終止部位を含む、原核細胞内での発現のためのプラスミドベクター構 築体。 ２１．プロモーターが組織特異性である、請求項１８記載の構築体。 ２２．核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１６または １７記載のＤＮＡ分子。 ２３．細胞の成長および増殖を阻害するための優性ネガティブ核酸結合タンパ ク質の製造方法であって： （ａ）配列中の少なくとも１個のアミノ酸が酸性であるアミノ酸の配列を調製 して、酸性アミノ酸拡張配列を調製し；そして （ｂ）核酸結合タンパク質の多量体化または二量体化ドメインのＮ末端に前記 の酸性拡張配列を付加して、優性ネガティブタンパク質を形成する ことを含む方法。 ２４．優性ネガティブタンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２３ 記載の方法。 ２５．酸性拡張配列が２〜１００個のアミノ酸を含む、請求項２３記載の方法 。 ２６．酸性拡張配列が３〜５０個のアミノ酸を含む、請求項２５記載の方法。 ２７．酸性拡張配列が４〜３０個のアミノ酸を含む、請求項２６記載の方法。 ２８．天然に存在する細胞タンパク質の機能を阻害することにより細胞の増殖 を制御する方法であって： （ａ）請求項１８記載の構築体を、酸性拡張された核酸結合タンパク質の発現 が可能な条件下で細胞に導入し； （ｂ）天然に存在する同族の細胞核酸結合タンパク質がその標的核酸配列に結 合するのを、発現した酸性拡張された核酸結合タンパク質と天然に存在する細胞 タンパク質との多量体または二量体複合体形成により阻害する ことを含む方法。 ２９． そのアミノ末端に付加された、タンパク質−タンパク質相互作用表面 のあるいは二量体化または多量体化表面への酸性アミノ末端拡張配列を形成する 、酸性アミノ酸残基を有する、単離および精製された核酸結合タンパク質であっ て、上記酸性拡張されたタンパク質が天然に存在する細胞タンパク質に対する優 性ネガティブ体である核酸結合タンパク質。 ３０． タンパク質が内生の活性化分子の活性化を阻害する、請求項２９記載 のタンパク質。 ３１． タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２９または３０記 載のタンパク質。 ３２． タンパク質がＲＮＡ結合タンパク質である、請求項２９記載のタンパ ク質。 ３３． 酸性アミノ酸残基が細胞ＤＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体 化して、ＤＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項２９から３２に記載 のタンパク質。 ３４． 酸性アミノ酸残基が細胞ＲＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体 化して、ＲＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項９２から３２に記載 のタンパク質。 ３５． タンパク質がｂＺＩＰタンパク質である、請求項２９から３１に記載 のタンパク質。 ３６． ｂＺＩＰタンパク質がＦｏｓ、Ｊｕｎ、ＧＣＮ４、ＶＢＰ、ＧＢＦ、 ｏｐａｑｕｅ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＰＡＲ、ＡＴＦ２および植物Ｇボックス タンパク質よりなる群から選択される、請求項３５記載のタンパク質。 ３７． タンパク質がｂＨＬＨタンパク質である、請求項２９から３１に記載 のタンパク質。 ３８． ｂＨＬＨタンパク質がＭｙｃ、ＭａｘおよびＭａｄよりなる群から選 択される、請求項３７記載のタンパク質。 ３９． 酸性アミノ酸残基がグルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求 項２９から３１に記載のタンパク質。 ４０． 酸性拡張配列が少なくとも２〜１００個のアミノ酸残基を含む、請求 項２９から３１に記載のタンパク質。 ４１． 酸性拡張配列が少なくとも３〜５０個のアミノ酸残基を含む、請求項 ４０記載のタンパク質。 ４２． 酸性拡張配列が４〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項４１記載の タンパク質。 ４３． 酸性拡張配列が２８個のアミノ酸残基を含む、請求項４２記載のタン パク質。 ４４． 酸性拡張配列が、核酸結合タンパク質の塩基性領域に取って代わる、 請求項２９記載のタンパク質。 ４５． 酸性拡張配列が両親媒性である、請求項２９記載のタンパク質。 ４６． アミノ末端の複数の酸性アミノ酸が、タンパク質−タンパク質相互作 用表面のあるいは二量体化または多量体化表面への酸性拡張配列を形成して、そ れによって天然に存在する細胞タンパク質に対する優性ネガティブ体を生成する ように、そのＮ末端に付加された複数の酸性アミノ酸を有する核酸結合タンパク 質をコードする単離されたＤＮＡ分子。 ４７． 請求項４６記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位、転写終 止部位、複製起点部位、およびポリアデニル化部位を含む、真核細胞内での発現 のためのプラスミドベクター構築体。 ４８． 真核細胞が植物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選 択される、請求項４７記載のベクター。 ４９． 請求項４６記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位および転 写終止部位を含む、原核細胞内での発現のためのプラスミドベクター構築体。 ５０． プロモーターが組織特異性である、請求項４７記載の構築体。 ５１． コードされる核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請 求項４６記載のＤＮＡ分子。 ５２． 酸性拡張配列が、コードされる核酸結合タンパク質の塩基性領域に取 って代わる請求項４６記載のＤＮＡ分子。 ５３． コードされる核酸結合タンパク質の酸性拡張配列が両親媒性である、 請求項４６記載のＤＮＡ分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／６９０，０１１ (32)優先日 1996年７月31日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クリロフ，ドゥミトリ アメリカ合衆国メリーランド州20851，ロ ックヴィル，アルダーブルック・コート 5603 【要約の続き】 であって細胞内の対応する天然タンパク質に対する強力 な優性ネガティブ体を生成するアミノ酸残基配列からな る。酸性アミノ末端拡張配列は特異なタンパク質−タン パク質相互作用表面を付与し、天然タンパク質と酸性拡 張タンパク質との安定な多量体化または二量体化を可能 にし、これにより植物、動物、微生物およびウイルスを 含めた多様な種の細胞タンパク質産物の阻害または不活 性化によって、その機能を制御する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．そのアミノ末端に付加された複数の酸性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基 の拡張配列を有する、単離および精製された核酸結合タンパク質。 ２．タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。 ３．タンパク質がＲＮＡ結合タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。 ４．酸性アミノ酸残基が細胞ＤＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体化し て、ＤＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項１記載のタンパク質。 ５．酸性アミノ酸残基が細胞ＲＮＡ結合タンパク質の塩基性領域と二量体化し て、ＲＮＡへの該タンパク質の結合を阻害する、請求項１記載のタンパク質。 ６．タンパク質が天然に存在する細胞タンパク質に対する優性ネガティブ体で ある、請求項４記載のタンパク質。 ７．タンパク質がｂＺＩＰタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。 ８．ｂＺＩＰタンパク質がＦｏｓ、Ｊｕｎ、ＧＣＮ４、ＶＢＰ、ＧＢＦ、ｏｐ ａｑｕｅ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＰＡＲ、ＡＴＦ２および植物Ｇボックスタン パク質よりなる群から選択される、請求項７記載のタンパク質。 ９．タンパク質がｂＨＬＨタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。 １０．ｂＨＬＨタンパク質がＭｙｃ、ＭａｘおよびＭａｄよりなる群から選択 される、請求項８記載のタンパク質。 １１．酸性アミノ酸残基がグルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項 １、２または３記載のタンパク質。 １２．酸性拡張配列が２〜１００個のアミノ酸残基を含む、請求項１、２また は３記載のタンパク質。 １３．酸性拡張配列が３〜５０個のアミノ酸残基を含む、請求項１２記載のタ ンパク質。 １４．酸性拡張配列が４〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１３記載のタ ンパク質。 １５．酸性拡張配列が２８個のアミノ酸残基を含む、請求項１４記載のタンパ ク質。 １６．本質的に配列番号：１〜５２に示す配列からなる、単離されたＤＮＡ分 子。 １７．そのＮ末端に付加された複数の酸性アミノ酸残基を有する核酸結合タン パク質をコードする、単離されたＤＮＡ分子。 １８．請求項１６または１７記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位 、転写終止部位、複製起点部位、およびポリアデニル化部位を含む、真核細胞内 での発現のためのプラスミドベクター構築体。 １９．真核細胞が植物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択 される、請求項１８記載のベクター。 ２０．請求項１６または１７記載のＤＮＡ分子、プロモーター、転写開始部位 および転写終止部位を含む、原核細胞内での発現のためのプラスミドベクター構 築体。 ２１．プロモーターが組織特異性である、請求項１８記載の構築体。 ２２．核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１６または １７記載のＤＮＡ分子。 ２３．細胞の成長および増殖を阻害するための優性ネガティブ核酸結合タンパ ク質の製造方法であって： （ａ）配列中の少なくとも１個のアミノ酸が酸性であるアミノ酸の配列を調製 して、酸性アミノ酸拡張配列を調製し；そして （ｂ）核酸結合タンパク質の多量体化または二量体化ドメインのＮ末端に前記 の酸性拡張配列を付加して、優性ネガティブタンパク質を形成する ことを含む方法。 ２４．優性ネガティブタンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２３ 記載の方法。 ２５．酸性拡張配列が２〜１００個のアミノ酸を含む、請求項２３記載の方法 。 ２６．酸性拡張配列が３〜５０個のアミノ酸を含む、請求項２５記載の方法。 ２７．酸性拡張配列が４〜３０個のアミノ酸を含む、請求項２６記載の方法。 ２８．天然に存在する細胞タンパク質の機能を阻害することにより細胞の増殖 を制御する方法であって： （ａ）請求項１８記載の構築体を、酸性拡張された核酸結合タンパク質の発現 が可能な条件下で細胞に導入し； （ｂ）天然に存在する同族の細胞核酸結合タンパク質がその標的核酸配列に結 合するのを、発現した酸性拡張された核酸結合タンパク質と天然に存在する細胞 タンパク質との多量体または二量体複合体形成により阻害する ことを含む方法。