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JPH11501636A - Pharmaceutical composition - Google Patents

Pharmaceutical composition

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Publication number
JPH11501636A
JPH11501636A JP8527186A JP52718696A JPH11501636A JP H11501636 A JPH11501636 A JP H11501636A JP 8527186 A JP8527186 A JP 8527186A JP 52718696 A JP52718696 A JP 52718696A JP H11501636 A JPH11501636 A JP H11501636A
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JP
Japan
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lipid
containing substance
hbp
protein
binding
Prior art date
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Ceased
Application number
JP8527186A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
フロガールド，ハンス
バード ラスムッセン，ポール
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
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Ceased legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又は治療のための薬学組成物において、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似している脂質含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質と接合させたもの及び（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、を含んで成る薬学組成物に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or condition involving stress damage to cells, wherein (a) a lipid-containing substance structurally identical or similar to ceramide, (B) conjugation with a protein capable of binding said lipid-containing substance in such a way that the lipid-containing substance activates the ceramide-activated protein phosphatase upon contact with the cells that have become dead, resulting in down-regulation of cell metabolism And (c) a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.

Description

【発明の詳細な説明】 医薬組成物 発明の分野 ヘパリン結合タンパク質(HBP)及びセラミド類似体から成るタンパク質−脂質 接合体、及び細胞に対するストレス損傷が関与する状態の治療におけるその薬学 的利用。 発明の背景 サイトカインカスケードの付隨する活性化を伴う局所的な感染又は炎症部位（ 例えば腹腔）における例えばグラム陰性菌といった重症の感染に対する全身的応 答の結果として生じる敗血症性ショックは、過去50年にわたり発生頻度が増大し てきており、現在米国における集中治療室での死亡の最も一般的な原因となって いる。敗血症性ショックのこの増大及び高い発生率の理由は、脈管内カテーテル といったような侵入的装置の使用の増大、細胞毒及び免疫抑制薬の使用の増加、 敗血症を発生しやすい患者の寿命の延長、及び抗生物質耐性をもつ生物によりひ き起こされる感染の増大、にあると考えられている。 敗血症に付隨する疾患は、陽性血液培養により特徴づけられる菌血症（敗血症 としても知られている）；頻呼吸、頻脈、高体温、低体温の形での感染に対する 全身性応答によって特徴づけられる敗血症；敗血症の臨床的証拠及び乳酸塩レベ ルの異常増加、尿量過少、又は精神状態の急変の形での器官灌流変化の徴候が存 在する敗血症候群；敗血症候群の臨床的証拠ならびに１時間未満の時間持続し従 来の療法に対する応答性をもつ低血圧が存在する早期敗血症性ショ ック；及び敗血症候群及び従来の療法にもかかわらず１時間以上持続する低血圧 の臨床的証拠が存在する治療抵抗性の敗血症性ショック、である。 グラム陰性敗血症に起因して高い死亡率及び羅患率が続いていることから、循 環する細菌LPSの潜在的な致死効果を妨げることのできる治療用作用物質に対す る集中的な探究が鼓舞されてきた。数多くの論文が、静脈内投与された高用量の 免疫グロブリンの著しい治療効果について報告している。しかしながら、治療に は、核LPSに対する自然に発生する高レベルの抗体についてスクリーニングされ たドナーの血漿から又はきわめて大きなドナーのプール（＞1000）から由来する IgGが必要である。菌血症の治療用としても提案されてきたLPSに対するモノクロ ーナル抗体は、おそらくはLPSにより誘発されたサイトカインカスケードを阻害 しないことを理由として、ほとんど又は全く効果を示さなかった。その上、比較 的わずかな敗血症患者しか循環する内毒血症及び菌血症を示さず、従って、循環 LPSを中和する抗体は敗血症が発生する部位に適用されない。 酸化攻囲(oxidatine siaye)段階が持続する結果として高等脊椎動物において は、穏やかな酸化ストレスが正常の特長である。正常な条件下では、精巧な抗酸 化剤の蓄積から成る効果的な防御系が、酸素を含まないラジカルと抗酸化剤の間 のバランスを保つことによって無酸化ラジカルに生体が対処できるよう保証して いる。しかしながら、感染又は損傷部位においては、感染をひき起こす外来性の 侵入病原体を殺すための必要条件として食細胞（活性化された好中球、白血球、 マクロファージ及び単球）により数多くの攻撃的酸化種（無酸素ラジカル）が分 泌される。これらの部位では、無酸素ラジカルの生成は、周囲の細胞の抗酸素能 力をはるかに超え、これらの細胞は、無酸素ラジカルにより媒介された壊死又は アポプトーシ ス（プログラムされた細胞死滅）により損傷されたり死んだりする可能性がある 。 感染又は損傷部位においては、サイトカインカスケードが開始され、これが今 度は好中性白血球を活性化させる。（グラム陰性菌中の）サイトカインカスケー ドのインジエータは、感染性又は炎症性部位で放出された内毒素(LPSと略される リポ多糖体としても知られている)であり、この部位でこの内毒素はマクロファ ージその他の細胞からの腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−１、イン ターロイキン−６、インターロイキン−８及び血小板活性化因子(PAF)の放出を 誘発する。TNFα、インターロイキン−１及びPAFの放出後、アラキドン酸が代謝 されてロイコトリエン、トロンボキサンＡ2及びプロスタグランジンを形成する 。インターロイキン−１及びインターロイキン−６はＴ細胞を活性化してインタ ーフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４及び顆粒球−単 球コロニー刺激因子を産生する。好中球は、これらの媒介物質の大部分によって 直接活性化され得る。かくして、好中球により誘発された損傷は、無酸素ラジカ ル及びリソソーム酵素の放出による脱顆粒の間、及び感染又は炎症部位での凝集 の間に発生しうる。 サイトカインカスケードのLPS媒介された開始の原因である分子メカニズムは 完全に理解されていないものの、サイトカインTNFα、vitD3及びINF-γのシグナ ル形質導入に関する最近の報告書は、この現象について幾分かの光明を与えた。 サイトカインvitD及びINF-γは、セラミド及びホスフォリルコリンに対し膜ス ルフィンゴミエリンを加水分解する膜結合中性スフィンゴミエリナーゼを刺激す ることによって、HL−60細胞内のセラミドの産生を刺激するものであることが示 された。（T．Okazaki et al.，J ．Biol．Chem. 265，1990，p15823〜15831参 照）、セラミ ドは、それ自体X Ser/Thr Proタンパク質キナーゼの一族に属するセラミド活性 化タンパク質キナーゼを活性化する第２のメッセンジャであることがわかった(S ．Mathias et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88，1991年、pp.1009〜10013 参照)。セラミドはさらに、セラミド活性化Ser/Thrタンパク質ホスファターゼを 活性化することが示されてきた(R．T．Dobrowski及びY．A．Hannun，J ．Biol．C hem. 267，1992，p5048〜5051参照)。これらの初期反応は、MAPキナーゼカスケ ードの活性化、cMyc及びc-Fosといったような転写因子の刺激、NF−KB活性化、 及びアラキドン酸誘導体の形成を導くPLA2の刺激が関与する、複雑でありかつ今 だによく理解されていない要領で、さらなる下流シグナリングを導くものである ことが示された。 循環中のリポタンパク−結合タンパク質(LBP)はLPSに結合し、特異的CD14レセ プタに対するLPSの結合を媒介する。HL−60細胞上のCD14レセプタを介したLPSに よるシグナル形質導入の最近の研究では、LPSがその細胞応答、例えばセラミド 活性化タンパク質キナーゼの刺激によるサイトカインカスケードの開始を誘発す ることが示された。構造分析は、LPSの脂質Ａ半分の還元末端の一部分がセラミ ドの一部分に酷似していることを立証した。(C．K．Joseph et al.，J ．Biol．C hem. 269，1994，p17606〜17610参照)。従って、LPSが、細胞のセラミド経路の 中に入ることによってその活性を及ぼすことがわかるだろう。 発明の要約 驚くべきことに、LPSは、LBP以外のタンパク質に接合された時点で、セラミド 活性化タンパク質キナーゼを活性化させることによる以外の方法でセラミドの第 ２のメッセンジャ機能を模擬すること ができる、ということが発見された。 従って本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又 は治療のための医薬組成物において、 （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク 質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションをもたらすよ うな形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたもの 、及び （ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、 を含んで成る医薬組成物に関する。 もう１つの形態においては、本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する 疾病又は状態を予防又は治療する方法において、このような治療を必要としてい る患者に対して、 （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク 質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果として もたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、 と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法に関する。 さらにもう１つの形態では、本発明は、 （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活 性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーション を結果としてもたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、 と接合したものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又 は治療のための薬剤の製造を目的とした利用に関する。 発明の詳細な開示 好ましい一実施形態においては、本発明の組成物は、脂質含有物質が接合され るタンパク質として、グリコシル化された形で28kD（還元条件下でSDS-PAGEによ り決定されたもの）という見かけの分子量を有するヘパリン結合タンパク質(HBP )を含んでおり、このタンパク質は、多形核白血球のアズール顆粒の中で産生さ れる。 ヒト及びブタ由来の末梢好中性白血球から分離されたヘパリン結合タンパク質 の共有結合構造は、最近になって決定された(H．Flodgaard et al.，Eur ．J．Bi ochem. 197，1991，pp535-547: J．Phol et al., FEBS Lett. 272，1990，p20 0 ff.参照)。ヒト及びブタのタンパク質は両方共、好中性エラスターゼに対する 高い類似性を示すが、活性セリン195及びヒスチジン57の選択的突然変異のため( キモトリプシン番号付け(B．S．Hartley「セリンプロティナーゼにおける相同性 」Phil ．Trans．Roy．Soc．Serie 257，1970，p77 ff))、タンパク質にはタンパ ク質分解酵素活性が欠如している。タンパク質は、ヘパリンに対するそれらの高 い親和力のためそれぞれヒトヘパリン結合タンパク質（hHBP）及びブタヘパリン 結合タンパク質（pHBP）と名付けられた。Schafer et al.（W．M．Schafer et a l.，Infect ．Immun. 53，1986，p651 ff.）は、タンパク質を、その抗菌活性の ためカチオン性抗菌タンパク質(CAP37)と名 付けている。このタンパク質は同様に1.3×10-9Ｍ〜10-8Ｍの範囲全体にわたり 単球に対し走化性をもつことも示されており(H．A．Pereira et al.，J ．Chem． Invest ．85，1990，p1468 ff)，Flodgaard et al.,（前掲書中）から明らかな結 果と一貫している。 さらに、HBPは、単層培養の中で成長させられた細胞に添加された時点で内皮 細胞及び線維芽細胞の剥離及び収縮を媒介するものであることが示されてきた。 HBPは同様に単球の生存及びトロンボスポンジン分泌をも刺激する(E．φstergaa rd及びH．Flodgaard，J ．Leukocyte Biol. 51，1992，p316 ff)。 アズール顆粒から、アズロシジンと呼ばれるhHBP及び(AP37のものと同じ最初 の20のＮ末端アミノ酸残基を伴うタンパク質も分離され（J．E．Gabay et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86 ，1989，p.5610 ff; C．G．Wilde et al.，J ．B iol．Chem．265 ，1990，p2038 ff）、その抗菌特性が報告された(D．Campanelli et al.，J ．Chem．Invest．85，1990，p904 ff)。 好中性白血球内のhHBPの存在及び、白血球が食作用のあるStaph aureusである 場合に（hHBPと同一である）CAP37の89％が放出される（H．A．Pereira et al. ，前掲書中）という事実は、このタンパク質が明らかに活性化された好中球から 放出されることから、hHBPの１つの機能が炎症プロセスに対するその関与にある と考えられる、ということを表わしている。Pereira et al(前掲書中)は、CAP37 の機能が、それが特異的に単球をひきつけひいては第２の炎症波における単球の 内向き流を担う要因の１つであり得る炎症部位におけるものである、ということ を示唆した。φstergaard及びFlodgaard(前掲書中)は、単球の動員にとって重要 であることに加えて、HBPは、好中球のメカニズムならびに単球の溢出において 主要な役割を果たす可能性がある。 好中性球白血球は、それがHBPを分泌する炎症性又は感染性部位に侵入する最 初の細胞であることから、HBP媒介の細胞剥離及び同型凝集とそれに付隨する細 胞代謝のダウンレギュレーションは、炎症又は感染中の細胞損傷に対するもう１ つの防御メカニズムであり得る。ひとたび感染が一掃されると、HBPの作用によ り酸化ストレスを生きのびた基質細胞は、いつでも炎症性部位に再侵入できる状 態となり、HBPにより部位にひきつけられた単球及びマクロファージから分泌さ れたサイトカイン及び成長因子の精巧なアレイによって組織化された切合プロセ スに貢献する。 HBPの製造はWO89/08666及びH．Flodgaared et al.,(前掲書中)から明らかにな る。HBPは、他のところではCAP37(WO91/00907参照)及びアズロシジン（C．G．Wi lde et al.，J ．Biol．Chem. 265，1990，p2038参照）。 HBPは、LPS又はセラミドであり得る脂質含有物質と合わさって、細胞代謝をダ ウンレギュレートすることができると現在考えられている。HBPに接合されたLPS は、HBPの強いヘパラン硫酸−結合モチーフのため、LPSレセプタCD14には結合し ないが細胞表面には結合すると思われる。単球による好中球由来のHBPの急速な 摂取の測定からの新しいデータは又、CD14とは全く異なる単球上のHBP特異的リ ガンドについても立証している(Heinzelmann，M et．al.，Critical Care，1996 年印刷中)。LPSはその後細胞膜中に合体され、細胞のシグナリング器官と接触し 、究極的にセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化する。ホスファタ ーゼの活性化は、今度は細胞代謝のダウンレギュレーションを導くことができる 。この仮定を裏づけにして、Swiss 3T3細胞に対して分子に対するヘキサノイル 基の添加により膜透過性を付与され水溶性にされた外因性セラミドを添加するこ とによって、細胞の生活能力を保ちながら収 縮、剥離及び同型凝集といった形態的変化が導かれることになる、ということが 報告された。セラミドは、抗増殖性のアポプトシス経路の主要な調節因子そして タンパク質トラフィッキング及び分泌の阻害物質であると思われ、これらの事象 は、75kDのTNFαレセプタを介してのセラミド活性化タンパク質ホスファターゼ のTNFαにより誘発された活性化と結びつけられた。（Y．A．Hannun，J ．Biol． Chem.269 ，1994，pp3125-3128参照）。LPSは、セラミド類似体として、同様に、 HBPに接合された時点でセラミド活性化されたタンパク質ホスファターゼを刺激 するということが示唆されている。 かくしてHBP及びLPS（又は類似の脂質含有物質）の接合体を調製することによ り、炎症性部位での細胞増殖及び活性を阻害することによる（セラミド活性化タ ンパク質ホスファターゼの刺激によって媒介された）内皮細胞、平滑筋及び線維 芽細胞の保護と、（単球中のセラミド活性化タンパク質キナーゼの刺激によって 媒介される）細胞の必要なサイトカイン活性化防御の間のバランスを調整するた めに使用できる薬学組成物を提供することが可能である。このようなバランス調 整は、細胞防御機構に利がなく害しかない条件下で必要とされ得る。細胞中の「 休眠」表現型を結果としてもたらす炎症性フォーカスにおける内皮細胞、線維芽 細胞及び平滑筋に対するHBP／LPSの直接的作用は、これらの細胞をストレス損傷 から保護し、感染がひとたび一掃された時点で修復プロセスをいつでも受け継ぐ ことができる状態にこれらを保つことができる。 HBPは、適切には哺乳動物、特にヒト又はブタ由来のものであり得る。特にHBP は、配列番号１として配列リストの中に示されたアミノ酸配列をもつヒトHBPで あるか、又は、配列番号２として配列リスト内に示されたアミノ酸配列を伴うブ タHBP、又は、LPSの脂質Ａ部分を結合できるその機能的類似体又はペプチドフラ グメント である。このような機能的類似体の例としては、未変性タンパク質のＣ又はＣ末 端のいずれか又は両方に対する単数又は複数のアミノ酸残基の添加、未変性タン パク質のいずれか又は両方の末端における単数又は複数のアミノ酸残基の置換、 未変性タンパク質のいずれか又は両方の末端又はアミノ酸配列中の単数又は複数 の部位における単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、又は、未変性アミノ酸配列 内の単数又は複数の部位における単数又は複数のアミノ酸残基の挿入によって得 られる未変性タンパク質の誘導体が含まれる。 HBPは、適切には、DK特許出願第1452／94で記述された方法によって調製でき 、より特定的に言うと、HBPをコードするDNA配列は、立証済みの標準的方法、例 えばS．L．Beaucage及びM．H．Caruthers, Tetrahedron Letters 22，1981，pp 1859-1869により記述されたホスフォアミダイト方法又はMatthes et al.，EMBO Journal ら、1984，p801〜805により記述された方法によって合成的に調製可能で ある。ホスフォアミダイト方法に従うと、オリゴヌクレオチドが、例えば自動DN A合成装置内で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適当なベクター 内でクローニングされる。 DNA配列は同様に、ゲノミック又はcDNAライブラリを調製し、例えば、標準的 技術に従って（Sambrook et al.，分子クローニング；実験室マニュアル、第２ 版、Cold Spring Harbor，1989）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイ ブリダイゼーションによりHBPの全て又は一部についてコードするDNA配列につい てスクリーニングすることによって得られる。ゲノミック又はcDNA由来のもので あってもよい。DNA配列は又、例えばUS4683202又はR．K．Saiki et al.，Scienc e 239 ，1988，p487〜49）に記述されているように、特定のプライマを用いてポ リメラーゼ連鎖反応によっても調製可能である。 このときDNA配列は、適切には組換え型DNA手順に付され得るあらゆるベクター であってよい組換え型発現ベクター内に挿入される。ベクターの選択は、導入さ れるべき宿主細胞によって左右される。従って、ベクターは自律的に複製するベ クター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独 立している、例えばプラスミドといったベクターであってよい。代替的にはベク ターは、宿主細胞内に導入された時点で、宿主細胞ゲノム内に組込まれ、それが 組込まれた染色体と共に複製されるようなベクターであってもよい。 ベクター内では、HBPをコードするDNA配列は、適切なプロモータ配列に対し作 動的に連結されていなくてはならない。プロモータは、選択された宿主細胞の中 で転写活性を示すあらゆるDNA配列であってよく、宿主細胞と相同又は非相同の タンパク質をコードする遺伝子から誘導できる。哺乳動物の体内でHBPをコード するDNAの転写を導くのに適したプロモータの例としては、SV40プロモータ(Subr amani et al.，Mol ．Cell．Biol. １，1981，p854〜864)、MT−１（メタロチオ ネイン遺伝子）プロモータ(Palmiter et al.，Science 222，1983，p809〜814) 又はアデノウイルス２主要晩期プロモータがある。昆虫細胞内で使用するための 適切なプロモータはポリヘドリンプロモータである（Vasuvedan et al.，FEBS L ett ．311 ，1992，pp7-11）。酵母宿主細胞内で使用するための適切なプロモータ としては、酵母解糖遺伝子（Hitzeman et al.，J ．Biol．Chem. 255，1980，pp1 2073〜12080; Alber及びKawasaki，J ．Mol．Appl．Gen. １，1982，p419-434） 又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.，「化学薬品用の微生物 の遺伝工学」 (Hollaender et al．eds.)，Plenum Press，New York，1982)から のプロモータ、又はTPI1(US4599311)又はADH2-4C(Russell et al.，Na ture 304 ，1983，p652-654)プロモータが含まれる。糸状真菌宿主細胞において 使用するための適切なプロモータは、例えば、ADH3プロモータ（Mc Knight et a l.，The EMBO J．４，1985，pp2093〜2099）又はtpi Ａプロモータである。 HBPをコードするDNA配列は、同様に、ヒト成長ホルモンターミネータ(Palmite r et al.，前掲書中)又は（真菌宿主については）TP11（Alber and Kawasaki、 前掲書中）又はADH3(McKnight et al.，op ．cit)プロモータといった適切なター ミネータにも作動的に連結され得る。ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナ ル（例えばSV40又はアデノウイルス5E1b領域から）、転写エンハンサ配列（例え ばSV40エンハンサ）及び翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスVA RNAをコ ードするもの）といったような要素をさらに含んでいてよい。 組換え型発現ベクターはさらに、ベクターが問題の宿主細胞の中で複製できる ようにするDNA配列を含むことができる。このような配列（宿主細胞が哺乳動物 細胞である場合）の一例は、SV40複製起点である。ベクターは同様に、選択可能 なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）についてコードする遺 伝子といったような宿主細胞中の欠損をその産物が補足するような遺伝子、又は 、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートといった薬物に対する耐 性を付与する遺伝子を含む可能性がある。 HBPについてコードするDNA配列、プロモータ及びターミネータをそれぞれ連結 し、それらを複写に必要な情報を含む適当なベクター内に挿入するのに用いられ る手順は、当業者には周知のものである（例えば、Sambrook et al.,前掲書中参 照）。 発現ベクターが中に導入される宿主細胞は、HBPを産生することができるあら ゆる細胞であってよく、好ましくは、例えばXeno pus laevis 卵母細胞又は哺乳動物細胞の無脊椎動物（昆虫）細胞又は脊椎動物細胞、 特に昆虫及び哺乳動物の細胞といった真核性細胞である。適切な哺乳動物細胞系 統の例は、COS(ATCC CRL 1650)，BHK（ATCC CRL 1632，ATCC CCL 10）又はCHO（ ATCC CCL 61）細胞系統である。哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞 内に導入されたDNA配列を発現する方法は、例えばKaufman and Sharp，J ．Mol． Biol．159 ，1982，pp.601-621; Southern and Berg, J ．Mol．Appl．Genet. １ ，1982，pp.327-341; Loyter et al., Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 79，19 82，pp.422-426; Wigler et al., Cell 14，1978，p.725; Corsaro and Pears on，Somatic Cell Genetics ７，1981，p.603，Graham and van der Eb，Virol ogy 52，1973，p.456; and Neumann et al., EMBO J ． １，1982，PP.841-84 5の中で記述されている。 代替的には、宿主細胞として真菌細胞（酵母細胞を含む）を使用することもで きる。適切な酵母細胞の例としては、Saccharomyces spp又はSchizosaccharomyc es spp．の細胞、特にSaccharomyces cerevisiaeの菌株が含まれる。その他の真 菌細胞の例としては、Aspergillus spp又はNeurospara spp．などの糸状真菌の 細胞、特に、Aspergillus oryzae又はAspergillus niger，菌株がある。タン パク質の発現のためのAspergillus sppの使用は、例えばEP238023の中に記述さ れている。 細胞を培養するのに用いられる培地は、適切な補足物を含む血清含有又は無血 清培地といったような哺乳動物細胞を成長させるのに適した従来のあらゆる培地 、又は昆虫、酵母又は真菌細胞を成長させるための適切な培地であってよい。適 切な培地は、商業的供給業者から入手でき、又公表された処方箋（例えばAmeric an Type Culture Collectionのカタログ中のもの）に従って調製できる。 このとき細胞によって産生されたHBPは、遠心分離又はろ過により培地から宿 主細胞を分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いて上清又はろ液のタ ンパク様成分を沈殿させること、例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニ ティクロマトグラフィなどのさまざまなクロマトグラフィ手順により精製するこ とを含む従来の手順により、培地から回収され得る。 本発明の好ましい実施形態においては、脂質含有物質はLPSである。本発明の 組成の中に内含するのに適したLPSは、グラム陰性菌の細胞壁から得ることがで きる。代替的には、脂質含有物質は、LPSの脂質Ａ部分であり得る。脂質Ａは、 脂質Ａの前駆物質である脂質Ｘを合成することによって適切に調製できる。脂質 Ｋの合成については、I．Macher, Carbohydrate Res．162，1987，pp79〜84及 びK．Ikeda et al., Chem ．Pharm．Bull．35 1987, pp1383〜1387の中で記述 されている。脂質Ａは、P．L．Stuetz et al．「内毒素反応の細胞及び分子的側 面」、Eds，A．Nowotny，J．J．Spitzer及びE．J．Ziegler，1990，pp.129〜145 に記述されているように、E．coliからの脂質Ａシンセターゼの粗調製物の存在 下でUDP−脂質Ｘを反応させることによって合成される。さらに脂質含有物質は セラミドであり得る。セラミドは、リン酸セラミド及びガラクトシルセラミドと いったような化合物を含む化学的にさまざまなクラスの生体分子であるスフィン ゴ脂質のグループに属する。好ましいセラミドは以下のような構造をもつ。 なお式中、 Ｒ1はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ1 6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃ14-30アルキルであり、 Ｒ2′は、水素原子又はリン酸塩基であり； Ｒ3は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキ シ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ1-14アルキル基により置換 され得るＣ15-26アルキルであるか、或いは、Ｒ3は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを 含むヒドロキシル、ハロゲンによって置換され得るアリル基、好ましくはフェニ ル基であり； Ｒ4は、水素又はヒドロキシル基である。 より好ましいセラミドは、 という構造をもち、ここでＲ1はＣ14アルキル、Ｒ2は水素又はヒドロキシル又は リン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニルであり、Ｒ4は水素又はヒ ドロキシル基である。好ましいセラミドは、Ｎ−ヘクサノイルスフィンゴシン（ Ｃ6−セラミド）である。 望まれる無水物形態の脂肪酸を伴うＤ−エリスロースピンゴシンのアシル化を 用いる、P．Van Veldhoven et al., Anal ．Biochem. 183，1989，pp177-189の 中に記述されているとおり、さまざまな鎖長の脂肪酸での炭素２（Ｒ1）上での 置換により、さまざまなセラミドを合成することができる。炭素３（Ｒ3，Ｒ4） での置換 は、A．Bielawska et al., J ．Biol．Chem. 267，1992, pp18493〜18497及び A．Bielawska et al., J ．Biol．Chem. 268，1993，pp26226〜26232の中で記 述されてきた。 薬学組成物の中では、接合体は、例えばRemington's Pharmaceutical Science ，1985中に記述されているように薬学組成物の立証された方法のいずれかによっ て処方され得る。組成物は、標準的には、局所又は全射注射又は注入に適した形 をしていてよく、従って、無菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液と共に処方 され得る。組成物は、当該技術分野において周知のものである従来の滅菌技術に より滅菌できる。結果として得られた水溶液は、使用のため包装させるか又は無 菌状態でろ過させ、凍結乾燥させることができ、凍結乾燥された調製物は、投与 に先立ち無菌水溶液と組合わせる。組成物には、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナ トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの緩衝剤、浸透 圧調整剤などといった薬学的に受容可能な補助物質を含むことができる。HBPの 濃度は約0.5重量％未満、例えば１重量％から15〜20重量％に至るまで、大幅に 変動し得る。組成物の単位用量には、標準的に約10mg〜約１ｇのHBPが含まれて いる可能性がある。 本発明の薬学組成物は、炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、細菌性内 毒血症、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固の治療といった治療的利 用のため、又は単球の活性化により患者の免疫系を刺激するために、使用するの が有利であると考えられている。この目的で、治療すべき状態の重大さ及び患者 の状態に応じて、体重１kgにつき１〜100mgの接合体という一日の用量が適当で あると考えられている。 本発明については、さらに、以下の例の中で証明されているが、この例は請求 されているような発明の範囲をいかなる形であれ制限 するよう意図されたものではない。例１ ．２重突然変異を受けたHBP(Cvs26.42) HBP内のLPS結合部位は、２つのシステイン、Cys26及びCys42によりフランキン グされている。HBP誘導体がLPSを結合できないようにするため、２つのシステイ ンは、PCR突然変異誘発によってセリンに変えられた。Cys42が変えられた突然変 異誘発の第１ラウンドにおいて、トランスファ構成体pVL1392-HBPを鋳型として 用いた。Pfuポリメラーゼ及び２対のプライマPBRa247 での２つのPCR反応において、各々突然変異を含む２つの重複するフラグメント が生成された。プライマPBRa246及びPBRa247での新しいPCR反応に対し、各フラ グメントの10分の１を添加した。結果として得られた全長DNAフラグメントをBam HIで消化させ、正しい配位にてPVL1393内に連結した。配列決定によって突然変 異誘発を確認し、トランスファ構成体をpVL1393-HBP-Cys42と呼称した。同様にp VL1393-HBP-Cys42内でCys26を変えるため、２つの重複するプライマPBRa261（GG CAGGCACTTCTCCGGAGGTGCCCTGATC）及びPBRa262（GATCAGGGCACCTCCGGAGAAGTGCCTGC C）を、それぞれPBRa246及びPBRa247と共に、上述の通りのPCR突然変異誘発の新 しいラウンドにおいて使用した。ここでも又、生成された全長DNAフラグメント をpVL1393のBam HI部位の中へクローニングし、配列決定（pVL1393-HBP-Cys26.4 2 ）により突然変異を確認した。線形化されたAcRP23.lac ZバキュロウイルスDNA （Pharmingen，San Diego）及びpVL139 3-HBP-Cys26.42とSF９昆虫細胞を同時トランスフェクションすることにより、２ 重突然変異を受けたHBP誘導体をコードする組換え型にバキュロウイルスを分離 した。 この２重突然変異を受けた形のHBPを産生するため、10％のFCSを伴う補足され たグレース培地(Gibco)の中で成長する３×108のSF９細胞を遠心分離させ、１と いうMOI(感染多重度)を示すウイルス系統からの標本の中で再懸濁させた。ウイ ルスを伴う細胞を0.5ｌのBillcoスピナーフラスコ（＃1965-00500）に移し、２ ％のFCSを伴う補足された新鮮なグレースの培地を最終体積300mlとなるまで添加 した。最後に、25mlの無菌0.9％NaCl内で加圧蒸気滅菌した1.5ｇのヘパリンセフ ァロース（CL-6B，Pharmacia）を培養に添加した。培養を３日間27℃でインキュ ベートした。 昆虫細胞培養からヘパリンセファロースビーズと分離するため、３分間300rpm で、Sorvall Instruments TECHNOSPINR遠心分離機の中で50ml入り管に収容した4 00mlの量を遠心分離させた。細胞を伴う上清を吸引によりとり除き、各々の管に 添加された30mlの0.9％のNaClの中での再懸濁とそれに続く300rpmでの遠心分離 により、残りの汚染性細胞から、ペぺレット化されたヘパリンセファロースビー ズを分離した。最終的に、各管に添加された20mlの無菌0.5Ｍ NaClの中でビー ズを洗浄した。次に、１本の50ml入り管内で少量の0.5Ｍの無菌NaCl（20〜30ml ）中にビーズを収集し、無菌ガラスフィルタ漏斗に移送した。ビーズを排出させ 、HBP突然変異体を最終的に30mlの無菌の３ＭのNaClでビーズから流出させた。W O89/08666内に記述されている方法に従って、３Ｍの溶出物からHBP突然変異体を 精製した。 以下に記述される検定を用いてLPS結合能力についてHBP突然変異体材料をテス トし、いかなるLPS結合も観察されなかった。 LPS結合能力にいついての検定 ウシ血清アルブミン（Sigma St．Louis MO）１mg／ml, List Biological Lab oratories Inc．CA，USAの比活性1.45×106dpm／ミリグラムの大腸菌（Escheric hia coli）K12 LCD25 Lot #5012Aからの4.5ピコモルの［3Ｈ］リポ多糖体及び０ pmol（対照）、35pmol，18pmol及び3.6pmolという量のHBP突然変異体を含む無菌 0.9％NaCl155μｌの中で、結合実験を行なった。水浴を用いて、混合物を37℃で 20分間インキュベートした。10μｌの量で各標本に対して10μｌのウサギポリク ローナル抗HBP抗体を添加し、室温で60分間のインキュベーションを実施した。 最後に、50μｌの量で各標本に対し、８mgのプロテインＡセファロース（Pharma cia Sweden）を添加した。室温で10分間のインキュベーションの後、５分間2000 λｇでセファロース／抗HBP抗体の複合体を振り落とし、ベータシンチレーショ ンカウンタ(Packcard Instrument)の中で各標本からの100μｌの上清のアリコー トを計数することにより、上清中の放射能を決定した。上清中に残っている計数 値から、リポ多糖体の結合を、モル対モル反応を仮定して計算した。 φstergaard及びFlodgaard(前掲書中)により記述された通り、線維芽細胞及び 内皮細胞上の細胞剥離及び同型凝集を媒介するその能力について、HBP突然変異 体材料をテストした。 いかなる効果も観察できず、このことはこれらの効果を媒介するためにはHBP とLPSの間の接合体が必要であるという考えを裏付けていた。例２ ．組換え型の野生型及びキメラHBP 組換え型のヒト野生型HBPを、昆虫細胞(SF９／BRL)内のバキュロウイルス発現 系を用いて産生させた。前述の通りに（１）， HBPを精製した。 分子の全体的ひだ形成を変えることなくHBP内の推定上のLPS結合を妨害するこ とを目的として、キメラ形態のHBPを構築した。プロテアーゼといったようなキ モトリプシン族内でaa26〜42(HBP番号付け)を包含するループはきわめて可変的 である（２）。HBP内のエフェクタ部位は、同様にLPS結合部位（２）も含んでい るこのループの中にある、ということが示唆されてきた。Pereira et al（２） は、このループ内の保存されたシステインブリッジの重要性の他に、ループ内の 最初のＣのすぐ前の配列QGRHF内のRHモチーフもLPS結合にとって重要であるとい うことを示した。 分子の全体的構造を混乱させることなくLPS結合の無い分子を作り出すため、 同じ場所で極性の低いアミノ酸を含むループをもう１つのセリンプロテアーゼか ら導入させた。ブタのカリクレイン配列YSSPQからの必要条件を満たす。さらに 、分子の残りの部分にこのループを充てんすることも、Portage Quantaプログラ ムを用いた分子モデリングから演繹すると、充分に適合すると思われる。かくし て、キメラ形のHBPは、YSSPQで置換されたCys26に先行する５つのアミノ酸QGRHF を有していた。 内皮細胞培養 ヒト腑静脈内皮細胞(HUVEC)を前述のもの（３）に幾分かの修正（４）を加え た形で、分離し培養した。簡単に言うと、臍帯をCa2+及びMg2+を含まないPBS中 で収集し、細胞分離に至るまで４℃で貯蔵した。臍帯は24時間以内に使用された 。37℃で70Ｕ／mlの最終濃度でPBS中に希釈されたコラゲナーゼを用いてインキ ュベートする前に、Ca2+及びMg2+を含まないPBSで静脈を洗った。放出された細 胞を遠心分離し、ウシ胎児血清（８％）、子ウシ血清（８％）、ヘパリン（16Ｕ ／ml）、内皮細胞成長補足物（25μｇ／ml）及び抗生物質（ペニシリン83Ｕ／ml 、ストレプトマイシン83μｇ／ml及びフ ンギゾン83μｇ／ml）で補足された培地199中に懸濁させ、PBS中の２％のゼラチ ンで予めコーティングされた83cm2入りのフラスコの中に播種した。３〜７日間 の培養の後、トリプシン−EDTA(0.05％：0.5mM)を用いて細胞を剥離させ、48ウ ェル付き平板内に播種した。いくつかの実験では、細胞を48ウェルの平板に播種 する前に一回通過させる。丸石形態を表わした時点で、細胞を使用した。 無傷細胞中のタンパク質リン酸化反応 48ウェルの平板中で成長した集密的HUVECを、pH7.4でグルコース(5.56mM)，Na Cl(117.2mM)，CaCl2(1.8mM)，MgCl2(0.81mM)，KCl(5.36mM)，NaHCO3（17.9mM） 及びHEPES(10mM)から成る、リン酸塩を含まない緩衝液で２回洗浄し、その後37 ℃で30分間熱で不活性化された10％のヒト血清で補足されたリン酸塩を含まない 緩衝液中で25μのCi32PO4と共にインキュベートした。HUVECに試薬を添加し、さ らに30分間インキュベートさせた。10％のジメチルスルホキシドの中にオカダイ ン酸を希釈させ、0.16％のジメチルスルホキシド中に１μＭのオカダイン酸とい う最終濃度で使用した。エタノール：ドデカン（98.2ｖ／ｖ）の中でセラミドを 溶解させ、エタノールとドデカンの最終濃度はそれぞれ0.98％及び0.02％であっ た。不活性化された血清の最終濃度は、全てのインキュベーションにおいて10％ であった。実験の終りで、HUVECをリン酸塩を含まない氷冷緩衝液で２回、氷冷P BSで１回洗浄した。５％のSDSを含む電気泳動標本緩衝液(190μｌ)(14)を、ウェ ルに添加し、振とう装置上で室温で一晩HUVECを溶解させた。 32PO4 で標識づけされたタンパク質の分離及び分析 32PO4で標識づけされたタンパク質をｐ−メルカプトエタノール（５％）で還 元し、4〜16％のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離させた （５）。電気泳動ゲルをクーマシーブ ルーで染色し、Ｘ線フィルム又はFuji結像板に露呈させた。18−90のMr範囲をも つ支配的な放射性タンパク質の定量分析を、Biolmaging Analizer Bas2000（Fuj i Photo Film Co．Ltd.，Tokyo，Japan）上でFuji結像板に露呈されたゲル上で 行なった。対照の百分率として放射能を表わした。選択されたタンパク質バンド 内の放射能の平均的変化（３〜７つの異なるタンパク質の間）を計算した。 キメラHBPのLPS結合能力 LPSに対し結合する野生型HBPの親和力については、すでに示されてきた（６） 。マイクロタイタープレート上に固定されたLPSに対するキメラ及び野生型HBPの 結合は、Tokias et al（７）により以前に前述された手順を修正して行なわれた 。簡単に言うと、マイクロタイタープレートを一晩37℃で、50mMのホウ酸塩(pH9 .0)と20mMのEDTAの中の１ウェルにつき４μｇのLPSでコーティングした。非特異 的結合を決定するため、コーティングされていないウェルに対するHBPの結合を 含み入れた。プレートを大量の精製脱イオン水で洗い、37℃で乾燥させ、次に発 熱物質を含まないPBS中で調製された５mg／mlの非常に低い内毒素ウシ血清アル ブミンを用いて37℃で30分間遮断した。次に、発熱物質を含まない50mMのトリス (pH7.4)，500mMのNaCl，１mg／mlの非常に低い内毒素ウシ血清アルブミン及び0. 05％のTween-20から成る検定緩衝液内でプレートを４回洗浄した。それぞれ5322 及び5445cpm／ng HBPの比活性をもつ野生型組換え型〔125Ｉ〕HBP及びキメラ〔1 25 Ｉ〕HBPを、１ウェルにつき100μｌの合計量で指示された濃度で検定緩衝液中 で希釈し、ウェルに添加した。37℃で１時間のインキュベーションの後、プレー トを検定緩衝液中で３回洗浄し、各々に対し100μｌの20％SDSを添加し、次に室 温で10分間充分振とうした。γ−カウンタ(Pack and Instrument)内でSDS溶液の 放射能を検定した。野生型HBPと は対照的に、わずかな量のキメラHBPしか、固定化されたLPSに結合しなかった（ 図１）。 統計分析 実験グループ間の差異の意味を見極めた。Kruskal-Wallisの一方向分散分析と それに続くMann-Whitney U試験を用いた順位多重比較又はMann-Whitney U試験の みによってデータを検討した。結果は算術平均＋／−SDとして示されている。0. 05未満のＰ値が、統計的に有意なものとみなされた。 LPS結合が欠如したキメラHBP 我々は、以前に野生型HBPがLPS(６)を結合させることを示してきた。タンパク 質のリン酸化に対するHBPの効果にとってHBPに対するLPSの結合が重要であるか 否かを調査するため、キメラHBPを構築したがこれはLPSを結合させることができ なかった（図１）。野生型HBPとは対照的に、キメラHBPは、内皮細胞内タンパク 質リン酸化を減少させず（図２）、これは、HBP内の無傷のLPS結合ドメインが実 際、タンパク質リン酸化に対する効果にとって不可欠であったことを示している 。野生型HBP(50μｇ／ml）によって誘発されるタンパク質リン酸化の低下は、キ メラHBP(50μｇ／ml)及び対照（ｎ＝４，ｐ＝0.0209）の両方と著しく異なるも のであった。これらの実験は、オカダイン酸（１μＭ）の存在下で行なわれたが 、オカダイン酸の不在下でも類似の結果が観察された（データ示さず）。 図１、キメラHBPはリポ多糖体に結合しなかった。１時間マイクロタイタープ レート上で固定されたLPSに対する125Ｉで標識づけされた野生型及びキメラHBP の結合を、全く同一に調査した。野生型HBPは、用量依存式にLPSに結合したのに 対し、LPSに対するキメラHBPの結合は極くわずかしか見られなかった。図は、１ つの実 験からの全く同一のウェル内の平均結合を示す。 図２、リポ多糖体結合能力が欠如しているキメラHBPは、タンパク質リン酸化 を減少させることができなかった。内皮細胞を30分間32PO4で標識づけし、その 後さらに30分間、指示された濃度の野生型HBP又はキメラHBPと組合わせたオカダ イン酸又はオカダイン酸単独（１μＭ）でインキュベートした。4〜16％のSDS-P AGEにより放射性タンパク質を分離し、Phospho-Imagerにより分析した。４つの 個々の実験の平均±SDが示されている。結果は、キメラHBPが野生型HBPとは対照 的にタンパク質リン酸化を減少させることができなかったことを示している（図 ６Ｂ）。Kruskal-Wallis試験の後でMann-Whitney U試験が行なわれ、野生型HBP( 50μｇ／ml)は、キメラHBP(50μｇ／ml)と対照（ｎ＝４，Ｐ＝0.0209）の両方と 著しく異なっていた。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Pharmaceutical composition Field of the invention   Protein-lipids composed of heparin binding protein (HBP) and ceramide analogs Conjugates and their pharmacy in the treatment of conditions involving stress damage to cells Use. Background of the Invention   Local infection or inflammation site with concomitant activation of the cytokine cascade ( Systemic response to severe infections (eg abdominal cavity) The resulting septic shock has increased in frequency over the past 50 years. And is currently the most common cause of intensive care unit deaths in the United States I have. The reason for this increase and high incidence of septic shock is that intravascular catheters Increased use of invasive devices, such as increased use of cytotoxic and immunosuppressive drugs, Prolonged life of patients prone to sepsis and increased resistance to antibiotic-resistant organisms It is believed that the increased infections that are caused.   Disorders associated with sepsis are bacteremia (sepsis) characterized by positive blood cultures. Also known as tachypnea, tachycardia, hyperthermia, hypothermia Sepsis characterized by systemic response; clinical evidence of sepsis and lactate levels Signs of altered organ perfusion in the form of abnormally high levels of urine, insufficient urine volume, or sudden changes in mental status Presence of sepsis syndrome; clinical evidence of sepsis syndrome and duration of less than 1 hour Early septicemia with hypotension responsive to upcoming therapy And septic syndrome and hypotension lasting more than one hour despite conventional therapy There is clinical evidence of refractory septic shock, which is present.   Continued high mortality and morbidity due to gram-negative sepsis, To therapeutic agents that can prevent the potential lethal effect of circulating bacterial LPS Intensive inquiry has been inspired. Numerous articles have been published on high-dose intravenous The remarkable therapeutic effect of immunoglobulin is reported. However, in treatment Has been screened for high levels of naturally occurring antibodies to nuclear LPS From isolated donor plasma or from a very large pool of donors (> 1000) IgG is required. Monochrome for LPS that has also been proposed for the treatment of bacteremia Antibody inhibits cytokine cascade, probably induced by LPS There was little or no effect because it did not. Besides, comparison Only a few patients with sepsis show circulating endotoxemia and bacteremia, and Antibodies that neutralize LPS are not applied to the site where sepsis occurs.   In higher vertebrates as a result of the sustained oxidatine siaye stage Mild oxidative stress is a normal feature. Under normal conditions, elaborate antiacid An effective defense system consisting of the accumulation of an agent is between the oxygen-free radical and the antioxidant. To ensure that the body can cope with non-oxidative radicals I have. However, at the site of infection or injury, exogenous Phagocytic cells (activated neutrophils, leukocytes, Macrophages and monocytes) reveal numerous aggressive oxidizing species (anoxic radicals) It is excreted. At these sites, the production of anoxic radicals is dependent on the antioxidant capacity of surrounding cells. Far beyond the power, these cells are capable of necrosis or Apoptosis Can be damaged or killed due to programmed cell death .   At the site of infection or injury, a cytokine cascade is initiated, which The degree activates neutrophil leukocytes. Cytokine cascade (in Gram-negative bacteria) The endogenous endotoxin (abbreviated as LPS) is released at infectious or inflammatory sites (Also known as lipopolysaccharide), where the endotoxin Tumor necrosis factor alpha (TNFα), interleukin-1, Release of Tarleukin-6, Interleukin-8 and Platelet Activating Factor (PAF) Trigger. Arachidonic acid metabolized after release of TNFα, interleukin-1 and PAF Being leukotriene, thromboxane ATwoAnd form prostaglandins . Interleukin-1 and interleukin-6 activate T cells and -Feron-γ, interleukin-2, interleukin-4 and granulocyte-mono Produces spherical colony stimulating factor. Neutrophils are stimulated by most of these mediators. Can be activated directly. Thus, the damage induced by neutrophils is anoxic radioactive Aggregation during degranulation by the release of lysosomal and lysosomal enzymes and at sites of infection or inflammation Can occur during   The molecular mechanism responsible for LPS-mediated initiation of the cytokine cascade is Although not fully understood, the cytokines TNFα, vitDThreeAnd INF-γ signal Recent reports on transduction have provided some light on this phenomenon.   The cytokines vitD and INF-γ are membrane membranes for ceramide and phosphorylcholine. Stimulates membrane-bound neutral sphingomyelinase that hydrolyzes rufingomyelin Showed that it stimulated the production of ceramide in HL-60 cells. Was done. (T. Okazaki et al.,J . Biol. Chem.  265, 1990, p15823-15831 See), ceramic Is a ceramide activity that belongs to the family of X Ser / Thr Pro protein kinases. Is a second messenger that activates activated protein kinases (S . Mathias et al.,Proc . Natl. Acad. Sci. USA  881991, pp.1009-10013 reference). Ceramide also activates ceramide-activated Ser / Thr protein phosphatase. Have been shown to be active (RT Dobrowski and YA Hannun,J . Biol. C hem.   267, 1992, pp. 5048-5051). These initial reactions are based on the MAP kinase Activation of transcription factors, stimulation of transcription factors such as cMyc and c-Fos, NF-KB activation, Leads to the formation of arachidonic acid and arachidonic acid derivativesTwoComplex and now involve the stimulation of Guides further downstream signaling in a way that is not well understood It was shown that.   Circulating lipoprotein-binding protein (LBP) binds to LPS and binds to specific CD14 receptors. Mediates the binding of LPS to the septum. LPS via CD14 receptor on HL-60 cells Recent studies of signal transduction by LPS have shown that LPS responds to cellular responses such as ceramide. Triggering of cytokine cascade by stimulation of activated protein kinase Rukoto has been shown. Structural analysis revealed that a part of the reducing end of lipid A half of LPS Proved to be very similar to a part of the world. (CK Joseph et al.,J . Biol. C hem.   269, 1994, pp. 17606-17610). Thus, LPS plays a role in the cellular ceramide pathway. You will find that entering it exerts its activity. Summary of the Invention   Surprisingly, when LPS was conjugated to proteins other than LBP, ceramide Activation of ceramide in a manner other than by activating activated protein kinase Simulate the messenger function of 2 Can be found.   Accordingly, the present invention is directed to preventing or preventing diseases and conditions involving stress damage to cells. Is a pharmaceutical composition for treatment, (A) a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide,   When the zygote comes into contact with living cells, the lipid-containing substance is converted to a ceramide-activating protein. Activates cytoplasmic phosphatase and results in down-regulation of cellular metabolism In the shape of a sea, (B) conjugated with a protein capable of binding the lipid-containing substance ,as well as (C) a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, And a pharmaceutical composition comprising:   In another aspect, the invention involves stress damage to cells. A method for preventing or treating a disease or condition requires such treatment. Patient (A) a fat-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide,   When the zygote comes into contact with living cells, the lipid-containing substance is converted to a ceramide-activating protein. Activates cytoplasmic phosphatase resulting in down-regulation of cellular metabolism In a way that brings (B) a protein capable of binding the lipid-containing substance, Administering an effective amount of a conjugate with the compound.   In yet another aspect, the invention provides a method comprising: (A) a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide,   When the conjugate comes in contact with living cells, the lipid-containing substance activates ceramide. Activates sex phosphatase to down-regulate cellular metabolism In a way that results in (B) a protein capable of binding the lipid-containing substance, To prevent or prevent diseases or conditions associated with stress damage to cells Relates to its use for the manufacture of a medicament for treatment. Detailed Disclosure of the Invention   In one preferred embodiment, the composition of the present invention comprises a lipid-containing substance conjugated. 28 kD in glycosylated form (SDS-PAGE under reducing conditions) Heparin-binding protein (HBP) with an apparent molecular weight of This protein is produced in the azul granules of polymorphonuclear leukocytes. It is.   Heparin binding proteins isolated from peripheral neutrophil leukocytes from humans and pigs Has recently been determined (H. Flodgaard et al.,Eur . J. Bi ochem.  197, 1991, pp535-547: J. Phol et al.,FEBS Lett.  272, 1990, p20 0 ff.). Both human and porcine proteins respond to neutrophil elastase Shows high similarity but due to selective mutations of active serine 195 and histidine 57 ( Chymotrypsin numbering (BS Hartley "Homology in serine proteinases" "Phil . Trans. Roy. Soc. Serie257, 1970, p77 ff)) Lack of enzymatic activity. Proteins are their high relative to heparin Human heparin binding protein (hHBP) and porcine heparin for high affinity It was named binding protein (pHBP). Schafer et al. (WM Schafer et a l. ，Infect . Immun.  53, 1986, p651 ff.) Converts proteins to their antimicrobial activity. Named cationic antibacterial protein (CAP37) I have. This protein is also 1.3 × 10-9M ~ 10-8Over the entire range of M It has also been shown to be chemotactic for monocytes (HA Pereira et al.,J . Chem. Invest .85, 1990, p1468 ff), a clear conclusion from Flodgaard et al., (Supra). Consistent with the fruit.   In addition, HBP, when added to cells grown in monolayer culture, It has been shown to mediate cell and fibroblast detachment and contraction. HBP also stimulates monocyte survival and thrombospondin secretion (E. φstergaa rd and H.R. Flodgaard,J . Leukocyte Biol.  51, 1992, p316 ff).   From azur granules, hHBP called azulocidin and (first same as that of AP37 A protein with the 20 N-terminal amino acid residues of is also isolated (JE Gabay et al.,Proc . Natl. Acad. Sci. USA 86 1989, p.5610 ff; G. Wilde et al.,J . B iol. Chem. 265 , 1990, p2038 ff) and its antimicrobial properties have been reported (D. Campanelli).  et al.,J . Chem. Invest. 85, 1990, p904 ff).   Presence of hHBP in neutrophils and phagocytosis of leukocytesStaph aureusIs In that case 89% of CAP37 (identical to hHBP) is released (HA Pereira et al. , Supra) is due to the fact that neutrophils from which this protein is clearly activated As released, one function of hHBP lies in its involvement in inflammatory processes It is considered that it is considered. Pereira et al (supra) state that CAP37 Function of monocytes in a manner that specifically attracts monocytes and thus monocytes in the second inflammatory wave At the site of inflammation, which may be one of the factors responsible for inward flow Suggested. φstergaard and Flodgaard (supra) are important for monocyte recruitment In addition to that, HBP is involved in neutrophil mechanisms as well as in monocyte extravasation. May play a major role.   Neutrophil leukocytes may enter the inflammatory or infectious site where they secrete HBP. Since it is the first cell, HBP-mediated cell detachment and homotypic aggregation and the accompanying details Down-regulation of vesicle metabolism is another indication for cell injury during inflammation or infection. There can be two defense mechanisms. Once the infection is cleared, the effects of HBP Substrate cells that survive oxidative stress can re-enter the inflammatory site at any time Secreted by monocytes and macrophages attracted to the site by HBP. Cutting process organized by a sophisticated array of selected cytokines and growth factors Contribute to   The production of HBP is described in WO 89/08666 and H. Flodgaared et al., (Supra) You. HBP is otherwise known as CAP37 (see WO 91/00907) and azulocidine (CG Wi. lde et al.,J . Biol. Chem.  265, 1990, p2038).   HBP, combined with lipid-containing substances, which can be LPS or ceramide, reduces cellular metabolism. It is currently believed that it can be unregulated. LPS bonded to HBP Binds to LPS receptor CD14 due to the strong heparan sulfate-binding motif of HBP No, but appears to bind to the cell surface. Rapid release of neutrophil-derived HBP by monocytes New data from measurements of uptake also indicate that HBP-specific recruits on monocytes are quite different from CD14. Gand has also been demonstrated (Heinzelmann, M. et al., Critical Care, 1996). Year printing). LPS is then incorporated into the cell membrane and contacts the signaling organs of the cell. , Ultimately activating ceramide-activated protein phosphatase. Phosphata Activation can in turn lead to down-regulation of cellular metabolism . In support of this assumption, hexanoyl to molecule for Swiss 3T3 cells Addition of exogenous ceramide that has been made water-soluble by imparting membrane permeability by the addition of a group With this, cells can be collected while maintaining their ability to live. Morphological changes such as shrinkage, delamination and isomorphic aggregation Was reported. Ceramide is a key regulator of the antiproliferative apoptotic pathway and These events appear to be inhibitors of protein trafficking and secretion. Is a ceramide-activated protein phosphatase via a 75 kD TNFα receptor TNFα-induced activation. (YA Hannun,J . Biol. Chem.269 , 1994, pp3125-3128). LPS, similarly as a ceramide analog, Stimulates ceramide-activated protein phosphatase when conjugated to HBP It has been suggested that   Thus, by preparing a conjugate of HBP and LPS (or a similar lipid-containing substance) By inhibiting cell proliferation and activity at inflammatory sites (ceramide activation Endothelial cells, smooth muscle and fibers (mediated by stimulation of protein phosphatase) Blast cell protection (by stimulation of ceramide-activated protein kinase in monocytes) To regulate the balance between the necessary cytokine-activated defenses of cells It is possible to provide a pharmaceutical composition that can be used for Such a balance tone Arrangements may be required under conditions that would not harm the cell defense mechanism. In the cell Endothelial cells, fibroblasts in inflammatory foci resulting in a "dormant" phenotype Direct effects of HBP / LPS on cells and smooth muscle can damage these cells Protect from infection and take over the remediation process at any time once the infection has been cleared You can keep these in a state where you can.   The HBP may suitably be from a mammal, especially a human or a pig. Especially HBP Is a human HBP having the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1. Or with the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 HBP or a functional analog or peptide peptide thereof capable of binding the lipid A portion of LPS. Gment It is. Examples of such functional analogs include the C or C terminus of the native protein. Addition of one or more amino acid residues to either or both ends, Substitution of one or more amino acid residues at either or both ends of the protein; One or more in the terminal or amino acid sequence of either or both of the native proteins Deletion of one or more amino acid residues at the site, or native amino acid sequence By inserting one or more amino acid residues at one or more of the And derivatives of the native protein obtained.   HBP can suitably be prepared by the method described in DK Patent Application No. 1452/94. More specifically, the DNA sequence encoding HBP can be obtained using standard, proven methods, e.g., For example, S. L. Beaucage and M.S. H. Caruthers, ENG GBTetrahedron Letters 22, 1981, pp The phosphoramidite method described by 1859-1869 or Matthes et al.,EMBO Journal Et al., 1984, pages 801-805. is there. According to the phosphoramidite method, the oligonucleotide is, for example, an automated DN ASynthesized in a synthesizer, purified, annealed, ligated, and Cloned in   DNA sequences can also be used to prepare genomic or cDNA libraries, e.g., standard According to the technology (Sambrook et al.,Molecular cloning; laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989) The DNA sequence coding for all or part of HBP Obtained by screening. Genomic or cDNA derived There may be. DNA sequences can also be found in, for example, US Pat. K. Saiki et al.,Scienc e 239 , 1988, pp. 487-49). It can also be prepared by the remerase chain reaction.   The DNA sequence is then suitably converted to any vector that can be subjected to recombinant DNA procedures. Inserted into a recombinant expression vector which may be Vector selection introduced Depends on the host cell to be used. Therefore, vectors must replicate autonomously. Or extrachromosomal entities whose replication is independent of chromosomal replication. It may be a standing vector, for example a plasmid. Alternatively When introduced into the host cell, the promoter is integrated into the host cell genome, It may be a vector that is replicated together with the integrated chromosome.   In the vector, the HBP-encoding DNA sequence is made to the appropriate promoter sequence. Must be dynamically linked. The promoter is located in the selected host cell. May be any DNA sequence that exhibits transcription activity, and may be homologous or heterologous to the host cell. It can be derived from the gene encoding the protein. Code HBP in mammals Examples of promoters suitable for directing the transcription of a DNA sequence include the SV40 promoter (Subr amani et al.,Mol . Cell. Biol.  11981, pp. 854-864), MT-1 (metallothio Nein gene) promoter (Palmiter et al.,Science 222, 1983, p809-814) Or there is an adenovirus 2 major late promoter. For use in insect cells A suitable promoter is the polyhedrin promoter (Vasuvedan et al.,FEBS L ett . 311 , 1992, pp7-11). Suitable promoters for use in yeast host cells The yeast glycolysis gene (Hitzeman et al.,J . Biol. Chem. 255, 1980, pp1 2073-12080; Alber and Kawasaki,J . Mol. Appl. Gen.  1, 1982, p419-434) Or the alcohol dehydrogenase gene (Young et al.,"Microorganisms for chemicals Genetic Engineering " (Hollaender et al. Eds.), Plenum Press, New York, 1982) The promoter, orTPI1(US4599311) orADH2-4C(Russell et al.,Na ture 304 1983, p652-654). In filamentous fungal host cells Suitable promoters for use include, for example, the ADH3 promoter (Mc Knight et a l. 、 TheEMBO J.4, 1985, pp 2093-2099) ortpiA promoter.   The HBP-encoding DNA sequence is likewise a human growth hormone terminator (Palmite r et al., supra) or (for fungal hosts) TP11 (Alber and Kawasaki, Above mentioned) orADH3(McKnight et al.,op . cit) A suitable target such as a promoter It may also be operatively connected to a minator. The vector can also be a polyadenylation signal. (Eg, from the SV40 or adenovirus 5E1b region), transcription enhancer sequences (eg, For example, the SV40 enhancer) and translation enhancer sequences (eg, adenovirus VA RNA And the like may be further included.   The recombinant expression vector further allows the vector to replicate in the host cell in question. DNA sequence to be included. Such a sequence (where the host cell is a mammal An example is the SV40 origin of replication. Vectors are selectable as well Markers coding for various markers, such as dihydrofolate reductase (DHFR) A gene whose product complements a defect in the host cell, such as a gene, or Resistance to drugs such as, neomycin, hygromycin or methotrexate May contain genes that confer sex.   Ligation of DNA sequence, promoter and terminator coding for HBP Used to insert them into a suitable vector containing the information necessary for copying. Procedures are well known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook et al., Supra. See).   The host cell into which the expression vector is introduced is capable of producing HBP. It can be a loose cell, preferablyFor example, Xeno pus laevis Oocyte or mammalian cell invertebrate (insect) cell or vertebrate cell, In particular, eukaryotic cells such as insect and mammalian cells. Appropriate mammalian cell lines Examples of COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) or CHO ( ATCC CCL 61) Cell line. Transfect mammalian cells Methods for expressing a DNA sequence introduced into E. coli are described, for example, in Kaufman and Sharp,J . Mol. Biol. 159 , 1982, pp. 601-621; Southern and Berg,J . Mol. Appl. Genet.  1 , 1982, pp. 327-341; Loyter et al.,Proc . Natl. Acad. Sci. USA  79, 19 82, pp. 422-426; Wigler et al.,Cell  14, 1978, p. 725; Corsaro and Pears on,Somatic Cell Genetics  7, 1981, p. 603, Graham and van der Eb,Virol ogy   52, 1973, p. 456; and Neumann et al.,EMBO J .  1, 1982, PP.841-84 It is described in 5.   Alternatively, fungal cells (including yeast cells) can be used as host cells. Wear. Examples of suitable yeast cells include:Saccharomyces spp orSchizosaccharomyc es  spp. Cells, especiallySaccharomyces cerevisiaeStrains are included. Other true Examples of bacterial cells include:Aspergillus spp orNeurospara spp. Such as filamentous fungi Cells, especiallyAspergillus  oryzaeOrAspergillus  niger, Strains. Tan For the expression of proteinAspergillus The use of spp is described, for example, in EP238023. Have been.   The medium used to culture the cells may be serum-containing or blood-free with appropriate supplements. Any conventional medium suitable for growing mammalian cells, such as clear medium Or any suitable medium for growing insect, yeast or fungal cells. Suitable Uncut media is available from commercial suppliers and can be obtained from published prescriptions (eg, American an Type Culture Collection catalog).   At this time, HBP produced by the cells is collected from the medium by centrifugation or filtration. Separating the main cells, removing the supernatant or filtrate using a salt such as ammonium sulfate. Precipitation of protein-like components, such as ion exchange chromatography, affinity Purification by various chromatographic procedures, such as And can be recovered from the culture medium by conventional procedures including:   In a preferred embodiment of the present invention, the lipid-containing substance is LPS. Of the present invention LPS suitable for inclusion in the composition can be obtained from the cell wall of Gram-negative bacteria. Wear. Alternatively, the lipid-containing material can be the lipid A portion of LPS. Lipid A is It can be appropriately prepared by synthesizing lipid X, which is a precursor of lipid A. Lipid For the synthesis of K, see I.K. Macher, MN USCarbohydrate Res.162, 1987, pp79-84 and And K. Ikeda et al.,Chem . Pharm. Bull.35 1987, described in pp1383-1387 Have been. Lipid A is P.I. L. Stuetz et al. "Cellular and molecular aspects of the endotoxin response Planes, "Eds, A. Nowotny, J .; J. Spitzer and E.S. J. Ziegler, 1990, pp. 129-145 As described in of crude preparation of lipid A synthetase from E. coli It is synthesized by reacting UDP-lipid X below. In addition, lipid-containing substances It can be ceramide. Ceramide is combined with ceramide phosphate and galactosylceramide. Sphine, a chemically diverse class of biomolecules, including such compounds Belongs to the group of golipids. Preferred ceramides have the following structure.   In the formula,   R1Is substituted with a hydroxyl group at the α position or saturated or unsaturated C at the ω position.1 6-30 Linear or branched C which can be esterified by fatty acids14-30Alkyl,   RTwo'Is a hydrogen atom or a phosphate group;   RThreeIs saturated or unsaturated at the α-position, or hydroxy at the α-position. Optionally substituted by one or more C1-14Substituted by alkyl group C that can be15-26Alkyl or RThreeRepresents F, Cl and Br or methyl Allyl groups which can be replaced by halogens, including hydroxyl, halogen, preferably phenyl A group;   RFourIs hydrogen or a hydroxyl group. More preferred ceramides are Where R is1Is C14Alkyl, RTwoIs hydrogen or hydroxyl or A phosphate group, RThreeIs CFifteen-Alkyl or phenyl;FourIs hydrogen or arsenic It is a droxyl group. Preferred ceramides are N-hexanoyl sphingosine ( C6-Ceramide).   Acylation of D-erythro spingocin with the desired anhydride form of fatty acid Used, Van Veldhoven et al.,Anal . Biochem.  183, 1989, pp177-189 As described therein, carbon 2 (R) in fatty acids of various chain lengths1On) By substitution, various ceramides can be synthesized. Carbon 3 (RThree, RFour) Replace with Is A. Bielawska et al.,J . Biol. Chem.  267, 1992, pp 18493-18497 and A. Bielawska et al.,J . Biol. Chem.  268, 1993, pp26226-26232 Has been described.   In a pharmaceutical composition, the conjugate can be, for example,Remington's Pharmaceutical Science , 1985, by any of the proven methods of pharmaceutical compositions. Can be prescribed. The composition will typically be in a form suitable for topical or bulk injection or infusion. And therefore formulated with sterile water or isotonic saline or glucose solution. Can be done. The composition is prepared using conventional sterilization techniques well known in the art. More sterilizable. The resulting aqueous solution can be packaged for use or The bacteria can be filtered and lyophilized, and the lyophilized preparation is administered Combine with sterile aqueous solution prior to use. Compositions include, for example, sodium acetate, sodium lactate. Buffering agents such as thorium, sodium chloride, potassium chloride and calcium chloride, osmosis Pharmaceutically acceptable auxiliary substances such as pressure regulators can be included. HBP The concentration can be significantly less than about 0.5% by weight, for example from 1% to 15-20% by weight. Can fluctuate. A unit dose of the composition typically contains from about 10 mg to about 1 g of HBP. Could be.   The pharmaceutical composition of the present invention may be used for inflammation, viral infection, ischemic reperfusion syndrome, Therapeutic benefits such as treatment of toxemia, sepsis, septic shock, and disseminated intravascular coagulation Use to stimulate the patient's immune system through activation or by activating monocytes Are considered to be advantageous. For this purpose, the severity of the condition to be treated and the patient A daily dose of 1 to 100 mg of conjugate per kg of body weight is appropriate, depending on the condition of It is believed that there is.   The invention is further demonstrated in the following examples, which are not claimed. In any way limits the scope of the invention as claimed It is not intended to be.Example 1 .HBP with double mutation (Cvs 26.42 )   The LPS binding site in HBP consists of two cysteines, Cys26And Cys42By Frankin Has been To prevent HBP derivatives from binding LPS, two cysteines Was converted to serine by PCR mutagenesis. Cys42Suddenly changed In the first round of mutagenesis, the transfer construct pVL1392-HBP was used as a template. Using. Pfu polymerase and two pairs of primers PBRa247 Two overlapping fragments each containing a mutation in two PCR reactions at Was generated. For each new PCR reaction with primers PBRa246 and PBRa247, One-tenth of the pigment was added. The resulting full-length DNA fragment is  Digested with HI and ligated into PVL1393 in correct orientation. Sudden change due to sequencing After confirming the induction of metabolism, the transfer construct was replaced with pVL1393-HBP-Cys42It was called. Similarly p VL1393-HBP-Cys42Cys within26The two overlapping primers PBRa261 (GG CAGGCACTTCTCCGGAGGTGCCCTGATC) and PBRa262 (GATCAGGGCACCTCCGGAGAAGTGCCTGC C) together with PBRa246 and PBRa247, respectively, for the new PCR mutagenesis as described above. Used in a new round. Again, the generated full-length DNA fragment Was cloned into the BamHI site of pVL1393 and sequenced (pVL1393-HBP-Cys26.4 Two ) Confirmed the mutation. AcRP23.lac Z baculovirus DNA linearized (Pharmingen, San Diego) and pVL139 3-HBP-Cys26.42And SF9 insect cells were co-transfected to Isolate Baculovirus into Recombinant Encoding HBP Derivative with Mutation did.   To produce this double mutated form of HBP, it was supplemented with 10% FCS. 3 × 10 3 grown in grace media (Gibco)8Centrifuge SF9 cells from Resuspended in specimens from virus strains showing the MOI (multiplicity of infection) referred to. Wooly Transfer the cells with the ruth to a 0.5 l Billco spinner flask (# 1965-00500) Add fresh Grace's medium supplemented with 100% FCS to a final volume of 300 ml did. Finally, 1.5 g of heparin sef autoclaved in 25 ml of sterile 0.9% NaCl. Agarose (CL-6B, Pharmacia) was added to the culture. Incubate the culture at 27 ° C for 3 days. I was vate.   300 rpm for 3 minutes to separate heparin sepharose beads from insect cell culture And placed in a 50 ml tube in a Sorvall Instruments TECHNOSPINR centrifuge4 A volume of 00 ml was centrifuged. Remove the supernatant with cells by aspiration and place in each tube Resuspension in added 30 ml of 0.9% NaCl followed by centrifugation at 300 rpm Pelleted heparin sepharose beads from remaining contaminating cells Was separated. Finally, bead in 20 ml of sterile 0.5 M NaCl added to each tube. Was washed. Next, a small amount of 0.5 M sterile NaCl (20-30 ml) is placed in a single 50 ml tube. The beads were collected during and transferred to a sterile glass filter funnel. Let the beads drain The HBP mutant was finally eluted from the beads with 30 ml of sterile 3M NaCl. W HBP mutants were isolated from 3M eluate according to the method described in O89 / 08666. Purified.   Test the HBP mutant material for LPS binding ability using the assay described below. And no LPS binding was observed.   Test for LPS binding capacity   Bovine serum albumin (Sigma St. Louis MO) 1mg / ml, List Biological Lab oratories Inc. Specific activity of CA, USA 1.45 × 106dpm / milligram of Escherichia coli (Escheric hia coli) 4.5 picomoles of [K12 LCD25 Lot # 5012A]ThreeH] lipopolysaccharide and 0 Sterile containing HBP mutants in amounts of pmol (control), 35 pmol, 18 pmol and 3.6 pmol Binding experiments were performed in 155 μl of 0.9% NaCl. Mix the mixture at 37 ° C using a water bath Incubated for 20 minutes. 10 μl of rabbit polish for each specimen in a volume of 10 μl Lonal anti-HBP antibody was added and incubation was performed for 60 minutes at room temperature. Finally, for each specimen in a volume of 50 μl, 8 mg of Protein A Sepharose (Pharma cia Sweden) was added. After 10 minutes incubation at room temperature, 5 minutes 2000 Shake down the Sepharose / anti-HBP antibody complex at λg and apply beta scintillation Aliquot 100 μl of supernatant from each sample in a counter (Packcard Instrument) The radioactivity in the supernatant was determined by counting the cells. Count remaining in supernatant From the values, the binding of the lipopolysaccharide was calculated assuming a molar to molar reaction.   As described by φstergaard and Flodgaard (supra), fibroblasts and HBP mutation for its ability to mediate cell detachment and homotypic aggregation on endothelial cells Body material was tested.   No effects could be observed, which means that HBP This supported the notion that a conjugate was required between LPS and LPS.Example 2 .Recombinant wild-type and chimeric HBP   Expression of recombinant human wild-type HBP in baculovirus expression in insect cells (SF9 / BRL) Produced using the system. HBP was purified as described above (1).   Preventing putative LPS binding within HBP without altering the overall plication of the molecule For this purpose, a chimeric form of HBP was constructed. Keys like protease The loop encompassing aa26-42 (HBP numbering) within the motrypsin family is highly variable (2). The effector site in HBP also contains the LPS binding site (2) It has been suggested that they are in this loop. Pereira et al (2) , Besides the importance of the conserved cysteine bridge in this loop, The RH motif in the sequence QGRHF just before the first C is also important for LPS binding I showed you.   To create molecules without LPS binding without disrupting the overall structure of the molecule, A loop containing a less polar amino acid at the same location as another serine protease Introduced. Meets the requirements from the porcine kallikrein sequence YSSPQ. further Filling the rest of the molecule with this loop can also be done using the Portage Quanta program. If deduced from molecular modeling using a system, it seems to be well suited. Hide The chimeric form of HBP is Cys substituted with YSSPQ.26Amino acids QGRHF preceding the Had.   Endothelial cell culture   Human umbilical endothelial cells (HUVEC) were added to the above (3) with some modifications (4) The cells were separated and cultured. Simply put, umbilical cord2+And Mg2+In PBS without And stored at 4 ° C. until cell separation. Umbilical cord used within 24 hours . Ink using collagenase diluted in PBS at a final concentration of 70 U / ml at 37 ° C Calibration before Ca2+And Mg2+The vein was washed with PBS without vein. Released fine The cells were centrifuged, and fetal calf serum (8%), calf serum (8%), heparin (16 U / Ml), endothelial cell growth supplement (25 μg / ml) and antibiotics (83 U / ml penicillin). , 83 μg / ml of streptomycin and Ngizone (83 μg / ml) suspended in medium 199 supplemented with 2% gelatin in PBS. 83cm pre-coated withTwoThe seeds were seeded in the containing flasks. 3-7 days After culturing, cells were detached using trypsin-EDTA (0.05%: 0.5 mM), and Seeds were placed in a plate with a well. In some experiments, seed cells in 48-well plates One pass before you do. Cells were used once they exhibited cobblestone morphology.   Protein phosphorylation in intact cells   Confluent HUVECs grown in 48 well plates were grown at pH 7.4 with glucose (5.56 mM), Na Cl (117.2 mM), CaClTwo(1.8mM), MgClTwo(0.81 mM), KCl (5.36 mM), NaHCOThree(17.9mM) And HEPES (10 mM), twice with a phosphate-free buffer, Contains no phosphate supplemented with 10% human serum that has been heat inactivated at 30 ° C for 30 minutes 25 μCi in buffer32POFourIncubated with Add reagents to HUVEC, Were allowed to incubate for 30 minutes. Okadai in 10% dimethyl sulfoxide Acid diluted in 0.16% dimethyl sulfoxide with 1 μM okadinate. The final concentration was used. Ethanol: ceramide in dodecane (98.2 v / v) Dissolve to give final ethanol and dodecane concentrations of 0.98% and 0.02%, respectively. Was. Final concentration of inactivated serum is 10% for all incubations Met. At the end of the experiment, HUVECs were washed twice with phosphate-free ice-cold buffer, ice-cold P Washed once with BS. The electrophoresis sample buffer containing 5% SDS (190 μl) (14) was HUVECs were dissolved on a shaker at room temperature overnight.    32 PO 4 And analysis of proteins labeled with   32POFourThe protein labeled with is returned with p-mercaptoethanol (5%) And separated by 4-16% SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (5). Coomassie gel electrophoresis gel Stained with a roux, and exposed to an X-ray film or Fuji imaging plate. 18-90 Mr range Quantitative analysis of the two dominant radioactive proteins was performed using the Biolmaging Analizer Bas2000 (Fuj i Photo Film Co. Ltd., Tokyo, Japan) on the gel exposed on the Fuji imaging plate Done. Radioactivity was expressed as a percentage of the control. Selected protein bands The average change in radioactivity within (between 3 and 7 different proteins) was calculated.   LPS binding ability of chimeric HBP   The affinity of wild-type HBP for binding to LPS has already been shown (6). . Chimeric and wild-type HBP against LPS immobilized on microtiter plates The coupling was performed by modifying the procedure previously described by Tokias et al (7). . Briefly, microtiter plates were incubated overnight at 37 ° C with 50 mM borate (pH 9). .0) and 4 μg of LPS per well in 20 mM EDTA. Non-specific HBP binding to uncoated wells to determine specific binding Included. Wash the plate with copious amounts of purified deionized water, dry at 37 ° C, Very low 5 mg / ml endotoxin bovine serum serum prepared in pyrogen-free PBS Blocked for 30 minutes at 37 ° C. with Bumin. Next, 50 mM Tris without pyrogen (pH 7.4), 500 mM NaCl, 1 mg / ml very low endotoxin bovine serum albumin and 0.1 mg / ml. Plates were washed four times in assay buffer consisting of 05% Tween-20. 5322 each And a wild type recombinant having a specific activity of 5445 cpm / ng HBP [125I] HBP and chimera [1 twenty five I] HBP in assay buffer at indicated concentrations in a total volume of 100 μl per well And added to the wells. After 1 hour incubation at 37 ° C, play Wash the plate three times in assay buffer, add 100 μl of 20% SDS to each, then add Shake well at room temperature for 10 minutes. SDS solution in γ-counter (Pack and Instrument) Radioactivity was assayed. With wild-type HBP In contrast, only a small amount of chimeric HBP bound to the immobilized LPS ( (Fig. 1).   Statistical analysis   The significance of the differences between the experimental groups was determined. Kruskal-Wallis one-way analysis of variance and Subsequent rank multiple comparison using Mann-Whitney U test or Mann-Whitney U test The data were examined by the individual. Results are shown as arithmetic mean +/- SD. 0. P values less than 05 were considered statistically significant.   Chimeric HBP lacking LPS binding   We have previously shown that wild-type HBP binds LPS (6). Protein The binding of LPS to HBP important for the effect of HBP on phosphorylation of proteins? To investigate whether or not the chimeric HBP was constructed, it was able to bind LPS. None (FIG. 1). In contrast to wild-type HBP, chimeric HBP is a protein in endothelial cells. Did not reduce cytoplasmic phosphorylation (FIG. 2), indicating that the intact LPS-binding domain The protein was essential for its effect on protein phosphorylation . The reduction in protein phosphorylation induced by wild-type HBP (50 μg / ml) was Significantly different from both Mera HBP (50 μg / ml) and control (n = 4, p = 0.0209) It was. These experiments were performed in the presence of ocadic acid (1 μM). Similar results were observed in the absence of ocadic acid (data not shown).   FIG. 1, chimeric HBP did not bind to lipopolysaccharide. 1 hour microtiter For fixed LPS on rate125Wild-type and chimeric HBP labeled with I Was examined exactly the same. Although wild-type HBP bound LPS in a dose-dependent manner In contrast, very little binding of chimeric HBP to LPS was seen. The figure shows 1 One fruit The average binding in identical wells from the experiment is shown.   FIG. 2. Chimeric HBP lacking lipopolysaccharide binding ability has protein phosphorylation Could not be reduced. Endothelial cells for 30 minutes32POFourLabeled with Okada in combination with the indicated concentrations of wild-type HBP or chimeric HBP for an additional 30 minutes Incubation was performed with either inic acid or okadaic acid alone (1 μM). 4-16% SDS-P Radioactive proteins were separated by AGE and analyzed by Phospho-Imager. Four The average of individual experiments ± SD is shown. Results show that chimeric HBP is in contrast to wild-type HBP Indicates that the protein phosphorylation could not be reduced 6B). After the Kruskal-Wallis test, the Mann-Whitney U test was performed and wild-type HBP ( 50 μg / ml) was compatible with both chimeric HBP (50 μg / ml) and control (n = 4, P = 0.0209). It was significantly different.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月２９日 【補正内容】 請求の範囲 １．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又は治療のため の医薬組成物において、 （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるヘパリン結合タンパク質(HBP) と接合させたもの及び （ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体を含んで成り、この接合体が、生きた 細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼ を活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもらたらす、医薬 組成物。 ２．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項１に記載の組成物。 ３．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項２に記載の組成物。 ４．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項３に記載の組 成物。 ５．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項２に記載の組成物。 ６．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を 結合できるその類似体をHBPが有している請求項５に記載の組成物。 ７．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項１に記載の組成物。 ８．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項１に記載の組成物。 ９．脂肪含有物質がセラミドである請求項１に記載の組成物。 ここでＲ1が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は水 素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニル であり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 ここで、 Ｒ1はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ1 6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃ14ー30アルキルであり、 Ｒ2′は、水素原子又はリン酸塩基であり； Ｒ3は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキ シ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ1-14アルキル基により置換 され得るＣ15-26アルキルであるか、或いは、Ｒ3は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを 含むヒドロキシル、ハロ ゲンによって置換され得るアリル基、好ましくはフェニル基であり； Ｒ4は、水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 12．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態を予防又は治療する方 法において、このような治療を必要としている患者に対して （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク 質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果として もたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、 と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法。 13．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項12に記載の方法。 14．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項13に記載の方法。 15．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項14に記載の方 法。 16．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項13に記載の方法。 17．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂 質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項16に記載の方法。 18．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項12に記載の方法。 19．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項12に記載の方法。 20．脂肪含有物質がセラミドである請求項12に記載の方法。 ここでＲ1が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は水 素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニル であり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項20に記載の方法。 22．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、 播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するた めの請求項12〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．タンパク質と脂質含有物質の接合体の有効量が、体重１kgにつき約１mg〜 約100mgの範囲内にある請求項12〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似している脂質部分をもつ脂質含 有物質を （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるヘパリン結合タンパク質(HBP) 、 と結合させたものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防 又は治療のための薬剤の製造を目的とした利用であって、この接合体が、生きた 細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼ を活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらす、利用。 25．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつへパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項24に記載の利用。 26．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項25に記載の利用。 27．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項26に記載の利 用。 28．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項25に記載の利用。 29．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を 結合できるその類似体をHBPが有している請求項28に記載の利用。 30．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項24に記載の利用。 31．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項24に記載の利用。 32．脂肪含有物質がセラミドである請求項24に記載の利用。 ここでＲ1が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は水 素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニル であり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項32に記載の利用。 34．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、 播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するた めの請求項24〜33のいずれか１項に記載の利用。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] April 29, 1997 [Content of Amendment] Claims 1. A pharmaceutical composition for preventing or treating diseases and conditions involving stress damage to cells, comprising: (a) a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide; A conjugate with a heparin binding protein (HBP) capable of binding a substance and (c) a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, wherein the conjugate is contacted with live cells. A pharmaceutical composition wherein the lipid-containing substance activates ceramide-activated protein phosphatase, resulting in down-regulation of cellular metabolism. 2. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin-binding protein (HBP) in glycosylated form with an apparent molecular weight of 28 kD (determined by SDS-PAGE under reducing conditions), 2. The composition of claim 1, wherein the composition is produced in azure granules of polymorphonuclear leukocytes. 3. The composition according to claim 2, wherein the heparin binding protein is human HBP. 4. The composition according to claim 3, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence list as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 5. 3. The composition of claim 2, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 6. The composition according to claim 5, wherein the HBP has an amino acid shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analogue thereof capable of binding a lipid-containing substance. 7. The composition according to claim 1, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 8. The composition of claim 1, wherein the lipid-containing substance is the lipid A portion of LPS. 9. The composition according to claim 1, wherein the fat-containing substance is ceramide. Where R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or a hydroxyl or phosphate group, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, and R 4 is The composition according to claim 9, which is a hydrogen or a hydroxyl group. Wherein, R 1 is a linear or branched C 14 -30 alkyl may be esterified by a saturated or unsaturated C 1 6-30 fatty acids or ω position is substituted with a hydroxyl group at the α position, R 2 'Is a hydrogen atom or a phosphate group; R 3 is saturated or unsaturated at the α-position, or substituted at the α-position by a hydroxy group and optionally one or more C 1-14 either a C 15-26 alkyl which may be substituted by an alkyl group, or, R 3 is, F, Cl and Br or hydroxyl containing methyl, allyl group which may be substituted by halogen, preferably a phenyl group; R 4 is The composition according to claim 9, which is a hydrogen, hydroxyl or hydroxyl group. 12． A method for preventing or treating a disease or condition involving stress damage to cells, comprising: (a) a fat-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide for a patient in need of such treatment; (B) binding the lipid-containing substance in such a way that the lipid-containing substance activates ceramide-activated protein phosphatase at the time the conjugate comes into contact with living cells, resulting in down-regulation of cell metabolism Administering an effective amount of a protein conjugated with the protein. 13. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin-binding protein (HBP) in glycosylated form with an apparent molecular weight of 28 kD (determined by SDS-PAGE under reducing conditions), 13. The method of claim 12, wherein the method is produced in azur granules of polymorphonuclear leukocytes. 14. 14. The method according to claim 13, wherein the heparin binding protein is human HBP. 15． 15. The method according to claim 14, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 16． 14. The method of claim 13, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 17． 17. The method of claim 16, wherein the HBP has an amino acid set forth in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 18． 13. The method according to claim 12, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 19. 13. The method according to claim 12, wherein the lipid-containing substance is a lipid A portion of LPS. 20. 13. The method according to claim 12, wherein the fat-containing substance is ceramide. Where R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or a hydroxyl or phosphate group, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, and R 4 is 21. The method according to claim 20, which is a hydrogen or a hydroxyl group. twenty two. 22. Any one of claims 12 to 21 for preventing or treating inflammation, viral infection, ischemic reperfusion syndrome, sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation, or for stimulating a patient's immune system. The method described in. twenty three. 23. The method of any one of claims 12 to 22, wherein the effective amount of the conjugate of the protein and the lipid-containing substance is in the range of about 1 mg / kg to about 100 mg / kg body weight. twenty four. (A) a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide, and (b) a heparin-binding protein (HBP) capable of binding the lipid-containing substance; For use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease or condition involving stress damage to a ceramide-activated protein phosphatase when the conjugate contacts live cells. Utilization to activate and result in down-regulation of cell metabolism. twenty five. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin binding protein (HBP) having an apparent molecular weight of 28 kD (as determined by SDS-PAGE under reducing conditions) in glycosylated form. 25. The use according to claim 24, wherein is produced in azure granules of polymorphonuclear leukocytes. 26. 26. The use according to claim 25, wherein the heparin binding protein is human HBP. 27. 27. The use according to claim 26, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 28. Use according to claim 25, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 29. 29. The use according to claim 28, wherein the HBP has an amino acid shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analogue thereof capable of binding a lipid-containing substance. 30. The use according to claim 24, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 31. The use according to claim 24, wherein the lipid-containing substance is the lipid A portion of LPS. 32. The use according to claim 24, wherein the fat-containing substance is ceramide. Where R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or a hydroxyl or phosphate group, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, and R 4 is 33. The use according to claim 32, which is a hydrogen or a hydroxyl group. 34. 34. Any one of claims 24 to 33 for preventing or treating inflammation, viral infection, ischemic reperfusion syndrome, sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation, or for stimulating the patient's immune system. Use described in.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＺ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＢＮ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 47/48 A61K 37/02 ADY C07K 14/47 C12N 15/00 ZNAA C12N 15/09 ZNA A61K 37/54 ADZ C12P 21/02 ABN (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, D , DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又は治療のため の薬学組成物において、 （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク 質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果として もたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたもの 、及び （ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、 を含んで成る薬学組成物。 ２．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項１に記載の組成物。 ３．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項２に記載の組成物。 ４．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項３に記載の組 成物。 ５．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項２に記載の組成物。 ６．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を 結合できるその類似体をHBPが有している請求項５に 記載の組成物。 ７．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項１に記載の組成物。 ８．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項１に記載の組成物。 ９．脂肪含有物質がセラミドである請求項１に記載の組成物。 ここでＲ1が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は水 素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニル であり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 ここで、 Ｒ1はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ1 6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃl4-30アルキルであり、 Ｒ2′は、水素原子又はリン酸塩基であり； Ｒ3は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキ シ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ1-14アルキル基により置換 され得るＣ15ー26アルキルであるか、或 いは、Ｒ3は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを含むヒドロキシル、ハロゲンによって 置換され得るアリル基、好ましくはフェニル基であり； Ｒ4は、水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 12．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態を予防又は治療する方 法において、このような治療を必要としている患者に対して （ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、 接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク 質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果として もたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、 と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法。 13．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項12に記載の方法。 14．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項13に記載の方法。 15．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項14に記載の方 法。 16．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項13に記載の方法。 17．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を 結合できるその類似体をHBPが有している請求項16に記載の方法。 18．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項12に記載の方法。 19．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項12に記載の方法。 20．脂肪含有物質がセラミドである請求項12に記載の方法。 ここで、Ｒ1が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は 水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニ ルであり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項20に記載の方法。 22．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、 播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するた めの請求項12〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．タンパク質と脂質含有物質の接合体の有効量が、体重１kgにつき約１mg〜 約100mgの範囲内にある請求項12〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物 質を接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパ ク質ホスファターゼを活性化して細胞代 謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、 （ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、 と接合したものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又 は治療のための薬剤の製造を目的とした利用。 25．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（ 還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリ ン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒 の中で産生される、請求項24に記載の利用。 26．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項25に記載の利用。 27．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有 物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項26に記載の利 用。 28．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項25に記載の利用。 29．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を 結合できるその類似体をHBPが有している請求項28に記載の利用。 30．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項24に記載の利用。 31．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項24に記載の利用。 32．脂肪含有物質がセラミドである請求項24に記載の利用。 ここで、Ｒ1が炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ2は水 素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ3はＣ15−アルキル又はフェニル であり、Ｒ4は水素又はヒドロキシル基である、請求項32に記載の利用。 34．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、 播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するた めの請求項24〜33のいずれか１項に記載の利用。[Claims] 1. A pharmaceutical composition for preventing or treating diseases and conditions involving stress damage to cells, comprising: (a) a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide; (B) conjugated with a protein capable of binding said lipid-containing substance in such a way that said lipid-containing substance activates ceramide-activated protein phosphatase upon contact with and results in down-regulation of cellular metabolism. And (c) a pharmaceutically acceptable diluent or carrier. 2. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin-binding protein (HBP) in glycosylated form with an apparent molecular weight of 28 kD (determined by SDS-PAGE under reducing conditions), 2. The composition of claim 1, wherein the composition is produced in azure granules of polymorphonuclear leukocytes. 3. The composition according to claim 2, wherein the heparin binding protein is human HBP. 4. The composition according to claim 3, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence list as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 5. 3. The composition of claim 2, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 6. The composition according to claim 5, wherein the HBP has an amino acid shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analogue thereof capable of binding a lipid-containing substance. 7. The composition according to claim 1, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 8. The composition of claim 1, wherein the lipid-containing substance is the lipid A portion of LPS. 9. The composition according to claim 1, wherein the fat-containing substance is ceramide. Where R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or a hydroxyl or phosphate group, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, and R 4 is The composition according to claim 9, which is a hydrogen or a hydroxyl group. Wherein, R 1 is a linear or branched C L4-30 alkyl may be esterified by a saturated or unsaturated C 1 6-30 fatty acids or ω position is substituted with a hydroxyl group at the α position, R 2 'Is a hydrogen atom or a phosphate group; R 3 is saturated or unsaturated at the α-position, or substituted at the α-position by a hydroxy group and optionally one or more C 1-14 or is a C 15 over 26 alkyl may be substituted by an alkyl group, or, R 3 is, F, Cl and Br or hydroxyl containing methyl, allyl group which may be substituted by halogen, preferably a phenyl group; R 4 is The composition according to claim 9, which is a hydrogen, hydroxyl or hydroxyl group. 12． A method for preventing or treating a disease or condition involving stress damage to cells, comprising: (a) a fat-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide for a patient in need of such treatment; (B) binding the lipid-containing substance in such a way that the lipid-containing substance activates ceramide-activated protein phosphatase at the time the conjugate comes into contact with living cells, resulting in down-regulation of cell metabolism Administering an effective amount of a protein conjugated with the protein. 13. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin-binding protein (HBP) in glycosylated form with an apparent molecular weight of 28 kD (determined by SDS-PAGE under reducing conditions), 13. The method of claim 12, wherein the method is produced in azur granules of polymorphonuclear leukocytes. 14. 14. The method according to claim 13, wherein the heparin binding protein is human HBP. 15． 15. The method according to claim 14, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 16． 14. The method of claim 13, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 17． 17. The method of claim 16, wherein the HBP has an amino acid set forth in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 18． 13. The method according to claim 12, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 19. 13. The method according to claim 12, wherein the lipid-containing substance is a lipid A portion of LPS. 20. 13. The method according to claim 12, wherein the fat-containing substance is ceramide. Wherein R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or hydroxyl or phosphate, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, R 4 is 21. The method of claim 20, wherein is a hydrogen or a hydroxyl group. twenty two. 22. Any one of claims 12 to 21 for preventing or treating inflammation, viral infection, ischemic reperfusion syndrome, sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation, or for stimulating a patient's immune system. The method described in. twenty three. 23. The method of any one of claims 12 to 22, wherein the effective amount of the conjugate of the protein and the lipid-containing substance is in the range of about 1 mg / kg to about 100 mg / kg body weight. twenty four. (A) When a conjugate contacts a living cell with a lipid-containing substance having a lipid moiety structurally identical or similar to ceramide, the lipid-containing substance activates ceramide-activated protein phosphatase to down-regulate cell metabolism Producing a medicament for preventing or treating a disease or condition conjugated to (b) a protein capable of binding the lipid-containing substance, but which involves stress damage to cells. The intended use. twenty five. The protein to which the lipid-containing substance is conjugated is a heparin-binding protein (HBP) in glycosylated form with an apparent molecular weight of 28 kD (determined by SDS-PAGE under reducing conditions), 25. The use according to claim 24 wherein the polymorphonuclear leukocytes are produced in azure granules. 26. 26. The use according to claim 25, wherein the heparin binding protein is human HBP. 27. 27. The use according to claim 26, wherein the HBP has the amino acid sequence shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 or an analog thereof capable of binding a lipid-containing substance. 28. Use according to claim 25, wherein the heparin binding protein is porcine HBP. 29. 29. The use according to claim 28, wherein the HBP has an amino acid shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 2 or an analogue thereof capable of binding a lipid-containing substance. 30. The use according to claim 24, wherein the lipid-containing substance is lipopolysaccharide (LPS). 31. The use according to claim 24, wherein the lipid-containing substance is the lipid A portion of LPS. 32. The use according to claim 24, wherein the fat-containing substance is ceramide. Where R 1 is an amide-bonded fatty acid with a chain length of 14 carbon atoms, R 2 is hydrogen or a hydroxyl or phosphate base, R 3 is C 15 -alkyl or phenyl, and R 4 is 33. The use according to claim 32, which is a hydrogen or a hydroxyl group. 34. 34. Any one of claims 24 to 33 for preventing or treating inflammation, viral infection, ischemic reperfusion syndrome, sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation, or for stimulating the patient's immune system. Use described in.
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