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JPH11509723A - Preparation of antigen-specific glycosylation inhibitor - Google Patents

Preparation of antigen-specific glycosylation inhibitor

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Publication number
JPH11509723A
JPH11509723A JP8530267A JP53026796A JPH11509723A JP H11509723 A JPH11509723 A JP H11509723A JP 8530267 A JP8530267 A JP 8530267A JP 53026796 A JP53026796 A JP 53026796A JP H11509723 A JPH11509723 A JP H11509723A
Authority
JP
Japan
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cells
aggif
antigen
gif
specific
Prior art date
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Pending
Application number
JP8530267A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
公成 石坂
保之 石井
Original Assignee
ラホヤ インスティチュート フォー アラージー アンド イムノロジー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ラホヤ インスティチュート フォー アラージー アンド イムノロジー filed Critical ラホヤ インスティチュート フォー アラージー アンド イムノロジー
Publication of JPH11509723A publication Critical patent/JPH11509723A/en
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Abstract

(57)【要約】 抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＡｇＧＩＦ）の組換え生産および単離の方法が提供される。また、抗原に結合し、かつ抗原特異的に免疫応答を抑制する可溶性の非特異的ＧＩＦ−ＴＣＲα鎖からなる。ＡｇＧＩＦを利用して抗原特異的に免疫応答を調節する方法も開示される。   (57) [Summary] Methods for recombinant production and isolation of an antigen-specific glycosylation inhibitor (AgGIF) are provided. It also comprises a soluble non-specific GIF-TCRa chain that binds to the antigen and suppresses the immune response in an antigen-specific manner. A method for regulating an immune response in an antigen-specific manner using AgGIF is also disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 抗原特異的グリコシル化阻害因子の製法 本発明は米国立衛生研究所によって授与された認可第ＡＩ１１２０２号の政府 援助の下になされたものであり、米国政府は本発明につきいくらかの権利を有す る。発明の背景 １．発明の利用分野 本発明は広い意味で免疫応答に係り、特に特定の抗原に対する免疫応答の抑制 に有用な抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＡｇＧＩＦ）に係る。 ２．関連技術の説明 以前から免疫学者らにより、免疫応答を調節するメカニズムを見出す目的で、 免疫系が研究されている。このために、免疫応答を非特異的に低下または増大さ せるさまざまな薬やプロトコルが利用されている。しかしこの種の調節は満足の いくものではない。というのは、この種の調節は免疫系全体に影響を及ぼすもの であり、また免疫応答の抗原特異的調節を可能にするような免疫系の個々の要素 を理解した上でのものではないからである。たとえば、アレルギーの治療におい ては個体の免疫系全体を低下させることなく特定のアレルゲンに対する免疫応答 を選択的に抑制するのが有利であろう。 個体に外来抗原を導入すると、２つの主要な要素、すなわちリンパ球の機能的 に異なる集団（それぞれＴ細胞およびＢ細胞といわれる）によって媒介される細 胞性免疫および体液性免疫から成る免疫応答が生ずる。Ｔ細胞は、免疫系におい てさまざまな他の細胞型を「補助」または活性化するリンホカインを産生するこ とによって抗原刺激に応答する。加えて、ある種のＴ細胞は細胞傷害性のエフェ クター細胞となることができる。一方、Ｂ細胞の応答は、主として、抗原と直接 結合する分泌性産物である抗体から成る。 Ｂ細胞応答とＴ細胞応答の両者の際立った特徴は免疫用の抗原に対する鋭敏な 特異性であるが、抗原認識のメカニズムは異なっている。抗体は固体表面上また は溶液中の抗原に直接結合するのに対して、Ｔ細胞は抗原提示細胞の表面のよう な固相上に存在する抗原とのみ反応する。また、これらの抗原は、主要組織適合 遺伝子複合体（ＭＨＣ）にコードされたクラスＩ分子またはクラスII分子との関 係でＴ細胞に提示されなければならない。このＭＨＣとは、多様な免疫学的機能 を有するタンパク質をコードする一連の遺伝子群を指している。クラスＩ遺伝子 産物はあらゆる細胞上に見られ、主要な移植拒絶反応の標的となる。クラスII遺 伝子産物はほとんどが各種造血系統の細胞で発現され、免疫応答における細胞‐ 細胞相互作用に関与している。クラスＩとクラスIIのタンパク質はいずれも、抗 原提示細胞の表面上で抗原に対する受容体としても機能することが示されている 。 １９７０年、GershonとKondo(Immunology 18:723，1970)により、Ｔ細胞は免 疫応答の経過に負の影響も及ぼすことができるという提案がなされた。この免疫 調節の考え方は最初懐疑的に迎えられたが、その後広範囲の実験系で抗原に特異 的なサプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）が報告されている(Green，et al.，Ann．Rev． Immunol．1:439-463，1983; Dorf and Benacerraf，Ann．Rev．Immunol．2:127- 158，1984)。 Ｔｓ作用のメカニズムの概要をつかむための試みの結果、Ｔ細胞の培養上清中 にいくつかの可溶性メディエーターが発見されるに至った。そこで、Ｔｓの機能 は、他のＴ細胞やＢ細胞に作用することになるＴサプレッサー因子（ＴｓＦ）の 放出によって果たされるという仮説が立てられた。実験データに基づいて、さま ざまなＴｓサブセットとそれらのＴｓＦとの複雑な相互作用を説明する精巧なモ デルが提案された(Asherson，et al.，Ann．Rev．Immunol．4:37-68，1986)。 Ｔ細胞の異なる機能性サブセットに対する特定の細胞表面マーカーが同定され たためＴｓとそれらのＴｓＦに対する特有なマーカーの探索が行なわれた。まず 最初に、Ｔｓ細胞表現型の研究により、これらは細胞傷害性になり得る(cytotox ic potential)Ｔ細胞に共通なマーカーであるＣＤ８（Ｌｙｔ−２）を発現する ことが示された。１９７６年、マウスのＴｓによって特異的に発現される構造物 と反応すると思われる抗血清が報告された(Murphy，et al.，J．Exp．Med．144: 699，1976; Tada，et al.，J．Exp．Med.，144:713，1976)。この抗原をコード している遺伝子はそのマッピング研究によりマウスＭＨＣ内でＩ−ＥαとＩ−Ｅ βの間のＩ領域に存在することが判明した。この遺伝子座はＩ−Ｊと名付けられ た。 １９８０年代初期、細胞免疫学の分野は現象学から分子特性決定に移行し始め た。この移行の結果、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の特性決定、各種リンホカインの 同定およびＭＨＣタンパク質の三次元構造といった数多くの発見がなされた。し かし、Ｔ細胞に媒介される抑制の研究に分子クローニング技術を応用しても実り ある結果は得られなかった。たとえば、ＴｓＦを均一になるまで生化学的に精製 しようとした試みはほとんど成功しなかった。マウスＭＨＣのＩ領域の遺伝子を 単離して配列決定したところ、Ｉ−Ｊ遺伝子を担うのに充分なＤＮＡはＩ−Ｅα とＩ−Ｅβの間にないようであった。さらに、たくさんのＴ細胞クローンとＴ細 胞ハイブリドーマについてＴＣＲβ遺伝子再編成を検査したところ、ヘルパーＴ 細胞と細胞障害性Ｔ細胞のみがそのような再編成を含有しているのに対して、試 験したＴｓはいずれも陰性であり、Ｔｓが機能性の受容体を発現していない可能 性を示していた(Hedrick，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:531-535，1 985)。 Ｔ細胞およびＢ細胞の抗原に対する応答の特異性はこれらの細胞が発現する特 有の受容体の働きである。Ｂ細胞がこの受容体を抗体の形態で分泌することが発 見されたときＢ細胞受容体の研究は急速に進展した。形質細胞腫は、モノクロー ナルな起源(monoclonal in origin)を有する、抗体産生細胞で天然に生じる腫瘍 である。これらの腫瘍は、最初に抗体分子の単離とその構造の特性決定において 用いられた均一なタンパク質の連続供給源となった(Potter，Physiol．Res．52: 631-710，1972)。今では、抗体の細胞表面型が膜貫通アンカードメインを含有し ていることを除いて、抗体はその膜結合対応物と同じであることが証明されてい る(Tonegawa，Nature 302:575-581，1983)。 一方、ＴＣＲに関する初期の研究ではＴＣＲの分泌型が検出できなかったので 、可溶性の抗体を用いたアプローチは有効に利用できなかった。加えて、Ｔ細胞 の抗原認識におけるＭＨＣ拘束の発見によって、ＴＣＲの解析はさらに困難の度 を増した(Zinkernagel and Doherty，Nature 248:701-702，1974)。その時点で は、抗原とＭＨＣの両者に対する結合を担うのが単一のＴＣＲであるのか、また は２ つの別個の受容体が関与するのかどうかについては論議があった。しかし、明ら かであると思われていたことは、ＴＣＲがＢ細胞受容体と同じではないらしいと いうことであった。 １９８０年代、モノクローナル抗体、組換えＤＮＡ技術および抗原特異的Ｔ細 胞の長期培養法の開発によって、ＴＣＲの同定が大きく促進された。Ｔ細胞のク ローン集団に対して生成したモノクローナル抗体は免疫性Ｔ細胞のみと特異的に 反応することが発見された(Allison，et al.，J．Immunol．129:2293，1982; Ha skin，et al.，J．Exp．Med．157:1149，1983; Samelson，et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 80:6972，1983)。これらのクローン特異的抗体を使用してＴ 細胞膜を免疫沈降させたところＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量４６，０００ダルトン のバンドが発見された。また非還元性の条件下で９０，０００ダルトンのバンド が検出され、ＴＣＲの二量体構造が示唆された。その後の実験により、機能性の ＴＣＲはαおよびβといわれるジスルフィド結合した２つの糖タンパク質で構成 されるヘテロダイマーであることが確認された(Marrack and Kappler，Science 238:1073-1079，1987)。ほぼ同じ頃、このα鎖とβ鎖をコードする相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）クローンがヒトおよびマウスで単離された(Hedrick，et al.，Natu re 308:149-153，1984; Hedrick，et al.，Nature 308:153-158，1984; Yanagi ，et al.，Nature 308:145-149，1984)。このｃＤＮＡの配列解析によって、こ のコード配列は抗体の遺伝子と同様に再編成された遺伝子セグメントで形成され ていることが立証された。このα遺伝子とβ遺伝子を受容細胞に移入すると抗原 特異性とＭＨＣ拘束を付与するのに必要かつ充分であることが示された(Dembic ，et al.，Nature 320:232-238，1986)。すなわち、ヘテロダイマーのＴＣＲは 抗原とＭＨＣの組合せを認識することに関与していると思われる。α可変領域お よびβ可変領域がそれぞれ抗原およびＭＨＣを認識する傾向があるように示唆す る研究もある(Kappler，et al.，Cell 49:263-271，1987; Winoto，et al.，Nat ure 324:679-682，1986; Tan，et al.，Cell 54:247-261，1988)が、認識は受容 体全体から現れる性質であるとする他の研究もある(Kuo and Hood，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 84:7614-7618，1987; Danska，et al.，J．Exp．Med．172:27 -33，1990)。 ＣＤ３は、ＴＣＲに非共有的に結合しており、かつＴＣＲ占有(o ccup ancy)によって誘発されるＴ細胞活性化に至る膜貫通シグナリング事象に関与し 得るポリペプチドの複合体である(Clevers，et al.，Ann．Rev．Immunol．6:629 ，1988)。抗体によるＣＤ３の直接刺激はＴ細胞活性化の通常の経路に似ている ことが示されている(Meuer，et al.，J．Exp．Med．158:988，1983)。ＣＤ３の Ｔ細胞表面への輸送にはこれと完全なヘテロダイマーＴＣＲ複合体との細胞内に おける会合(association)が必要とされる。また、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖とＣ Ｄ３ポリペプチドとの複合体は小胞体内で組立てられることも立証されている(M inami，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:2688-2692，1987; Alarcon，e t al.，J．Biol．Chem．236:2953-2961，1988)。正確に形成された完全な受容体 ＴＣＲ／ＣＤ３はその後機能性ユニットとして細胞表面に輸送される。不完全に 組立てられた受容体複合体は小胞体で分解されるか、またはゴルジ体を介してリ ソソームへ輸送され、そこで分解されるようになる。したがって、結合してない α鎖とβ鎖は通常Ｔ細胞の外部に近付くことはできないと思われる。完全なＴＣ Ｒのα受容体とβ受容体でさえ細胞外で分泌された形態で容易には検出できない 。従来、これらの抗原認識における機能はＴ細胞表面に、かつヘテロダイマーの 形態に限られていると考えられていた。 今では、αβＴＣＲが大部分の機能性Ｔ細胞によって発現されることは明らか である。γδヘテロダイマーから成る第二のタイプのＴＣＲが同定されているが 、これらの受容体は少数の末梢Ｔ細胞で発現され、その抗原特異的認識における 関与はまだ立証されていない。構造上、Ｔ細胞のαβ受容体とγδ受容体は一次 配列、遺伝子構成およびＤＮＡ再編成モードにおいて抗体分子と相同性が高い(D avis and Bjorkman，Nature 334:395-402，1988)。しかし、Ｔ細胞抗原受容体は ２つの重要な点で抗体とは異なる。すなわち、ＴＣＲは細胞表面にのみ見られ、 ＭＨＣにコードされる分子の関係でのみ抗原を認識する。 最近の研究によって、ＴＣＲは場合により細胞から排出または放出されること があることが示唆されている(Guy，et al.，Science 244:1477-1480，1989; Fai rchild，et al.，J．Immunol．145:2001-2009，1990)。しかし、そのように分泌 された分子が完全なＴＣＲであるか、部分的な断片であるか、またはＴＣＲと交 差反応性のエピトープを有する他の分子であるか立証されていない。本明細書に 記載する実施例で立証される発見の前には、機能的に活性なＴＣＲα鎖が残りの ＴＣＲ成分とは独立してＴ細胞から放出され得るという見解は異論があり、疑い がもたれていた。Klausnerらは、ＴＣＲαはＣＤ３δと複合体化されない限り小 胞体に保持され、そこで分解されることを示し(Bonifacino，et al.，Science 2 47:79-82，1990)、さらにＣＤ３−ＴＣＲ複合体の一部として細胞表面に輸送・ 送出されないＴＣＲαはリソソームで分解されることを示した(Minami，et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:2688-2692，1987)。これらの観察結果は、Ｔ ＣＲαが細胞から放出され得る経路に反するものである。同様に小胞体に保持さ れてそこで分解されるＴＣＲβに関する研究によって、ＴＣＲの組立てと輸送は もっと複雑であることが示唆されている(Wileman，et al.，Cell Regulation 1: 907-919，1990)。たとえば、ＴＣＲβトランスジーンを発現するＳＣＩＤマウス において、ＴＣＲβはＴＣＲα成分やＣＤ３成分の存在しない状態で未成熟胸腺 細胞の表面で発現される(Kishi，et al.，EMBO J．10:93-100，1991)。また、Ｖ ＤＪおよびＣβ1 ドメインのみを含む末端切断型のＴＣＲβ鎖遺伝子が構築され 、そのような分子は分解されるという予想にもかかわらず分泌された(Gascoigne ，J．Biol．Chem．265:9266-9301，1990)。すなわち、細胞によってはＴＣＲが 、恐らくは他の未同定分子との複合体としておよび／または翻訳後に末端を切取 られた形態で少量放出され得るという可能性があった。 いくつかの実験で、ＴＣＲαに対する抗体と反応する未同定の可溶性調節因子 の１つ以上の存在が報告されている。たとえば、合成ポリペプチド抗原であるポ リ１８，プラスＩ−Ａdに対して特異的なＣＤ４+ヘルパーＴ細胞ハイブリドーマ Ａ１．１のin vitroアッセイで細胞フリーの免疫調節活性が検出された。この因 子の良好な抗原特異性はＴ細胞ハイブリドーマの特異性に相当していた(Zheng， et al.，J．Immunol．140:1351-1358 1988)。ＴＣＲのＶαおよびＶβに対応す るアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞表面ＴＣＲ−ＣＤ３発現を特異的に阻 害することが見出されたが、Ａ１．１の可溶性調節活性の産生を阻害したのはＶ αのアンチセンスのみであってＶβ（またはコントロールのオリゴヌクレオチド ）は阻害しなかった(Zheng，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:3758-376 2，1989)。ごく最近の研究において、Ａ１．１の抗原特異的調節活性がＴＣＲ αに特異的なモノクローナル抗体のカラムに結合・溶出され、代謝的に標識され た上清から分子量が４６，０００ダルトンのタンパク質として分離された。この 活性は抗‐ＴＣＲβ抗体、抗‐ＴＣＲ Ｖβ抗体または抗‐ＣＤ３ε抗体には結 合しなかった(Bissonnette，et al.，J．Immunol．146:2898-2907，1991)。ＴＣ Ｒα鎖決定基を共有しているが表面ＴＣＲに由来しないＴｓ活性が報告されてい るが特性決定されていない(Collins，et al.，J．Immunol．145:2809-2812，199 0)。Takedaら(J．Immunol．145:2846-2853，1990)もＴＣＲα鎖決定基を共有し ているがＭＨＣ拘束されているＴｓ活性を報告している。これらの結果とは対照 的に、Fairchild(J．Immunol．145:2001-2009，1990)は抗‐ＴＣＲ Ｃαと反応 するが抗‐Ｖβ抗体および抗‐ＴＣＲ−β抗体とも反応するＤＮＰ特異的Ｔｓ因 子を報告している。本明細書に記載する発見の前には、観察された抗原特異的調 節活性に関与する可溶性の免疫調節メディエーターとしてのＴＣＲαの役割を同 定または解明したものはいない。 可溶性ＴＣＲ分子の産生のために、ＴＣＲ膜貫通領域を置換または欠失する３ つの主要な戦略を試みた。最も直接的なアプローチでは翻訳終止コドンをＴＣＲ αまたはＴＣＲα／βダイマーの上流に導入した。ｃＤＮＡでトランスフェクト したＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＨｅｌａ細胞ではＴＣＲαがゴルジ 装置に入る前に非リソソーム区画で急速に分解されることが報告されている(Wil eman，et al.，J．Cell．Biol.，110:973-986，1990; Lippincott-Schwartz，et al.，Cell，54:209-220，1988; Baniyash，et al.，J．Biol．Chem.，263:9874 -9878，1988; Bonifacino，et al.，Science，247:79-82，1990; Bonifacino，e t al.，Cell，63:503-513，1990; Manolios，et al.，Science，249:274-277，1 990; Shin，et al.，Science，259:1901-1904，1993)。二番目の戦略では、ＴＣ Ｒのα鎖とβ鎖の細胞外ＶドメインとＣドメインを胎盤アルカリ性ホスファター ゼまたはＴｈｙ−１分子のグリコシル‐ホスファチジルイノシトール膜アンカー に混入した(shuffle)(Lin，et al.，Science，249:677-679，1990; Slanetz，et al.，Eur．J．Immunol.，21:179-183，1991)。対応する脂質結合ＴＣＲポリペ プチドは細胞をホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで処理する ことにより可溶性の形態で膜から放出され、この可溶化されたＴＣＲαβヘテロ ダイマーは抗‐クローン型clonotypicモノクローナル抗体と特異的に反応するこ とが示された。しかし、放出されたＴＣＲポリペプチドの収率はあまりにも低く 、この分子を臨床用途に応用することはできなかった。第三のアプローチはＴＣ Ｒと免疫グロブリンの定常領域(Gregoire，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．US A，88:8077-8081，1991; Weber，et al.，Nature，356:793-796，1992)またはＣ Ｄ３ゼータ鎖(Engel，et al.，Science，256:1318-1321，1992)とのハイブリッ ドタンパク質を遺伝子工学的に作製することであった。これらの融合タンパク質 は骨髄腫細胞または白血病細胞のトランスフェクションによって培地中に分泌さ れ、これらの可溶性ＴＣＲはいずれも対応する細胞表面結合ＴＣＲの血清学的に 検出されるエピトープを保持していることが示された。しかし、これらの融合タ ンパク質は低親和性の抗原認識を示し、免疫原性である可能性がある。しかしな がら、ＴＣＲαの役割に関して行なわれて来たあらゆる研究にもかかわらず、本 発明以前には、ＴＣＲαは膜結合ＴＣＲの一部のように他のＴＣＲサブユニット と会合して存在しているものとして知られていた。 免疫応答が抑制される場合の一例はアレルギーの治療の場合である。アレルゲ ンに対するＩｇＥ抗体は花粉症を引き起こし、外因性喘息のような他のアレルギ ー性疾患に関与していることが確立されている。アレルギー性疾患におけるＩｇ Ｅ抗体の決定的な役割のため、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の生成の調節と抑 制がアレルギー性疾患の根本的な治療のひとつであるという可能性が生じた。た とえば、ブタクサのアレルゲンに対して感受性の花粉症患者の血清中には常にそ のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体が検出される。このＩｇＥ抗体力価は花粉の季 節の後に上昇した後、年の残りの間に少しだけ低下する。血清中におけるＩｇＥ の半減期はたった２〜３日であるので、ＩｇＥ抗体力価が持続するということは 、これらの抗体がアレルゲンに対する暴露がなくても患者のリンパ系細胞によっ て連続的に合成されているということを示している。 過去２０年間にわたって実験動物においてＩｇＥ抗体応答をコントロールする ためにいくつかの異なる試みがなされた。ひとつのアプローチは、アレルギー患 者に微量のアレルゲンを繰り返し注射する古典的な免疫療法すなわち脱感作処置 の改善である。この脱感作処置により患者によっては臨床症状が改善され得るこ とが示されているが、花粉症患者の血清中のＩｇＧ抗体力価はこの処置後低下し なかった。この処置の主たる免疫学的効果は、ＩｇＥ抗体の形成を増大させるこ とと、花粉の時期の後にＩｇＥ抗体力価の上昇を抑制することであると考えられ る。 脱感作すなわち免疫抑制治療における制限は、副作用のため患者が大量のアレ ルゲンを寛容できないことである。この困難さを克服するために、治療用に尿素 変性抗原や抗原のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合体のような化学修飾し たアレルゲンを使用する試みがなされた。この修飾した抗原は天然の抗原に対す る抗体と結合しないので、アレルギー症状を起こすことなく比較的大量の修飾抗 原を注射することができる。しかし、修飾抗原は抗原特異的Ｔ細胞を刺激するこ とができる。修飾抗原をマウスに静脈注射したところ天然の抗原に対する一次Ｉ ｇＥ抗体応答を抑制する抗原特異的サプレッサーＴ細胞が生成したという証拠が 得られた。しかし、抗体力価が最大に達した後にこの治療を始めたところ、この 治療による進行中のＩｇＥ抗体形成に対する影響が最小になった(Takatsu and I shizaka，J．Immunol.，117:1211，1976)。マウスにおける観察と一致して、花 粉症患者におけるポリエチレングリコールと結合したアレルゲンの臨床試験によ って、この治療ではＩｇＥ抗体力価を低下できないことが示された。修飾した抗 原の反復注射によって進行中のＩｇＥ抗体形成を抑制できなかったのは、多分、 アレルギー患者に抗原特異的ヘルパーＴ細胞が比較的大量に存在するためであろ う。修飾した抗原は抗原特異的サプレッサーＴ細胞の生成を誘発するだけではな く、ヘルパーＴ細胞の集団を拡大もするので、この治療による後者の効果がサプ レッサーＴ細胞の影響を上回っているのかもしれない。この解釈は、抗原特異的 サプレッサーＴ細胞を免疫したマウスに導入したところ進行中のＩｇＥ抗体形成 が抑制されたという事実によって支持されている(Takatsu and Ishizaka，J．Im munol.，117:1211，1976)。これらの結果が総合して示唆したことは、ヘルパー Ｔ細胞集団を拡大することなく抗原特異的サプレッサーＴ細胞を生じさせること が可能であれば、花粉症患者において持続するＩｇＥ抗体形成を抑制することが できるであろうということである。 ＩｇＥに対する親和性をもちＩｇＥ合成を選択的に調節する２つのタイプのＴ 細胞因子がすでに発見されている。一方のＩｇＥ結合性因子（ＩｇＥ−ＢＦ）は ＩｇＥ応答を選択的に増大させるが、他のタイプのＩｇＥ−ＢＦはその応答を選 択的に抑制する。このＩｇＥ強化因子とＩｇＥ抑制因子の主たる相違はこれらの 分子の炭水化物部分であるように思われる。ＩｇＥ強化因子はレンチルレクチン およびコンカナバリンＡに結合するがＩｇＥ抑制因子はこれらのレクチンに結合 できない(Yodoi，et al.，J．Immunol.，128:289，1982)。ＩｇＥ強化因子また はＩｇＥ抑制因子の選択的生成に対する細胞メカニズムの解析およびこれら因子 の遺伝子クローニングにより、ＩｇＥ強化因子とＩｇＥ抑制因子が共通の構造遺 伝子をもっていること、ならびにこれらの因子の炭水化物部分および生物学的活 性の性質が翻訳後のグリコシル化過程中に確立されることが示された(Martens， et al.，Proc．Nat'l Acad．Sci.，U.S.A.，84: 809，1987)。生理学的条件下で このグリコシル化過程はこの過程を増進または阻害する２つのＴ細胞因子によっ てコントロールされる。これらの因子はグリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）および グリコシル化増強因子（ＧＥＦ）とよばれる。 ＧＩＦに特有の性質はその生化学的活性である。このリンホカインはリポモデ ュリン(lipomodulin)（ホスホリパーゼ阻害性タンパク質）に対するモノクロー ナル抗体に結合する(Uede，et al.，J．Immunol.，130:878，1983)。また、ＧＩ Ｆの主要な供給源は抗原特異的サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）であることもマウス で発見されている(Jadieu，et al.，J．Immunol.，133:3266，1984)。オボアル ブミン（ＯＶＡ）特異的サプレッサーＴ細胞ハイブリドーマに関するその後の実 験により、これらハイブリドーマ細胞を抗原（ＯＶＡ）でパルスした同系マクロ ファージによって刺激すると、ＯＶＡに対して親和性を有するＧＩＦ（抗原結合 性ＧＩＦ）が生成することが示された。しかし、同じハイブリドーマでＯＶＡに 対する親和性をもたないＧＩＦ（非特異的ＧＩＦ）が構成的に分泌された。非特 異的ＧＩＦとＯＶＡ結合性ＧＩＦの関連性の研究により、この抗原結合性ＧＩＦ は抗原結合性ポリペプチド鎖と非特異的ＧＩＦとで構成されていることが示され た(Jardieu and Ishizaka，in Immune Regulation By Characterized Polypepti des，Goldstein，et al.，eds.，Alan R．Liss，Inc.，N.Y.，p595，1987)。ま た、この抗原結合性ＧＩＦは他の研究者によって記載されている抗原特異的サプ レッサーＴ細胞因子（ＴｓＦ）と共通の抗原決定基をもっており、抗原（担体） 特異的に抗体応答を抑制することも判明している。さらに、抗原結合性ＧＩＦば かりでなく他の研究者によって記載された抗原特異的ＴｓＦもモノクローナル抗 ‐リポモデュリン（141-B9）とカップルした免疫吸着剤に結合し、酸性ｐＨでこ の免疫吸着剤から溶出させることによって回収された(Steele，et al.，J．Immu nol.，142:2213，1989)。 アレルギーの治療における脱感作の重大な制限にもかかわらずこの技術は依然 としてよく選択される方法である。したがって、抗原特異的ではあるが現存する 脱感作療法で見られる副作用を伴なわない技術が特に必要とされている。 宿主対移植片拒絶（ＨＶＧ）および移植片対宿主拒絶（ＧＶＨ）を防止するに は免疫応答の抑制が肝要である。残念ながら、自己免疫疾患においても、ＨＶＧ およびＧＶＨにおいても、免疫応答の抑制には、効力が限られており、しかも特 異的ではなくて全身的に作用する毒性の極めて高い薬を使用する。このような療 法の厳しい制限のため、毒性がより低く、しかし特異性はより高い免疫抑制剤が 必要とされている。本発明はこれを達成するための手段を提供する。発明の要約 本発明の基礎となった発見は、抗原に直接結合し、その抗原に対して生じる免 疫応答を抑制する抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）の形成においてＴＣＲαがあ る役割を果たすということと、実際ＡｇＧＩＦがＴＣＲα鎖遺伝子の発現産物で あるということである。以前には、特定のＴＣＲαが単一のポリペプチドとして 発現された後非特異的ＧＩＦに特異性を付与するということは知られていなかっ た。したがって本発明は、抗原特異的ＧＩＦポリペプチドをコードするポリヌク レオチドを単離する方法および実質的に純粋な抗原特異的ＧＩＦポリペプチドを 単離する方法を初めて提供する。図面の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、Ｔｓハイブリドーマに由来する抗原特異的ＧＩＦ の免疫ブロット分析を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定され たアミノ酸配列を示し、図２Ｃは、マウスＧＩＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列 および推定されたアミノ酸配列を示し、図２Ｄは、ヒトＧＩＦのｃＤＮＡのヌク レオチド配列および推定されたアミノ酸配列を示す。 図３は、安定なＴＣＲα鎖ｃＤＮＡトランスフェクタント(transfectant)に由 来するＴＣＲα鎖の免疫ブロット分析を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ＴＣＲα鎖トランスフェクタントに由来する培養上清の 免疫ブロット分析を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ＴＣＲα鎖トランスフェクタントに由来するＨｉｓ−ｔ ａｇを用いた５５ｋＤ抗原特異的ＧＩＦの免疫ブロット分析を示す。 図６は、ＴＣＲα−ｔａｇ遺伝子トランスフェクタントの免疫ブロットを示す 。 図７は、抗ＣＤ３で刺激された２１１α細胞の免疫ブロットを示す。レーン１ は抗ＴＣＲβ後の溶出画分を示し、レーン２は抗ＴＣＲαの溶出物を示す。発明の詳細な説明 本発明は抗原特異的免疫応答の調節のための抗原特異的ＧＩＦの生産、単離お よび使用を含む。たとえば、対応する抗原に対して特異的であり抗原特異的抑制 を誘発する抗原特異的ＧＩＦを使用して過敏反応、自己免疫反応および移植片拒 絶反応を抑制することができる。 本発明は、非特異的ＧＩＦと、抗原結合活性および免疫調節活性の両方を有す るＴＣＲα鎖（αとβから成る完全なＴ細胞表面抗原受容体ではない）とを含む ポリペプチドに係る。抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）とよばれる、抗原特異的 調節活性をもつ抗原結合性ＧＩＦ‐ＴＣＲαタンパク質はいろいろな方法で製造 することができる。たとえば、公知のアミノ酸配列に基づいて組換えＤＮＡ技術 および／または化学合成法によってＡｇＧＩＦタンパク質を発現させることがで きる。あるいはまた、この活性因子を放出する連続なＴ細胞系の培養上清からＡ ｇＧＩＦを直接精製することができる。特定の理論に縛られるつもりはないが、 ＧＩＦ鎖およびＴＣＲα鎖は単一のポリヌクレオチドから、または同時に転写・ 翻訳される２つ以上のポリヌクレオチドから転写・翻訳されるようである。後者 の場合には２つのポリペプチドを組合せてＡｇＧＩＦを形成することができる。 ひとつの態様において、本発明は、サプレッサーＴ細胞を活性化し（この活性 化によりＴ細胞におけるＡｇＧＩＦ遺伝子の発現が誘発される）、サプレッサー Ｔ細胞ポリヌクレオチドを、非特異的ＧＩＦポリヌクレオチドとハイブリダイズ するオリゴヌクレオチドおよびＴＣＲαポリヌクレオチドとハイブリダイズする オリゴヌクレオチドと接触させ、非特異的ＧＩＦオリゴヌクレオチドおよびＴＣ Ｒαオリゴヌクレオチドの両者とハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離す ることからなる、ＡｇＧＩＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（１つ または複数）を単離する方法を提供する。 「活性化」という用語は、Ｔ細胞を刺激してＡｇＧＩＦの産生を誘発すること を指す。サプレッサーＴ細胞の活性化はＣＤ３またはＴ細胞表面受容体を架橋す るかまたは細胞を抗原でパルスした同系マクロファージにさらすのが好ましい。 この場合の抗原はＡｇＧＩＦが結合する抗原である。 ＡｇＧＩＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する本方法は、 Ｔサプレッサー細胞のＤＮＡまたはＲＮＡを、非特異的ＧＩＦと特異的にハイブ リダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびＴＣＲα鎖とハイブリダイズす るオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。特に、ＡｇＧＩＦをコ ードするポリヌクレオチドはＴＣＲα鎖の定常領域に由来するオリゴヌクレオチ ドプローブとハイブリダイズする。本明細書に記載するＡｇＧＩＦをコードする ポリヌクレオチドの単離により（ここで、「接触」では核酸ハイブリダイゼーシ ョンを利用する）、適当なプローブが入手できれば、任意の生物に由来する任意 のＡｇＧＩＦ遺伝子配列を単離することが可能になる。たとえば、ＧＩＦまたは ＴＣＲα鎖の定常領域をコードする配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプ ローブは化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオ リゴペプチド連鎖が知られていなければならない。そのようなスクリーニングの 場合、ハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは変性した二本鎖 ＤＮＡで行なうのが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的とするポリペプ チドに関連するｍＲＮＡ配列が極めて少量で存在する原料に由来するｃＤＮＡク ローンの検出の場合特に有用である。言い換えると、非特異的結合を回避するた めにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用すると、たとえば、 混合物中の完全な相補体である単一のプローブと標的ＤＮＡとをハイブリダイゼ ーションさせることによって特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィー で可視化することが可能である(Wallace，et al.，Nucl．Acid Res.，9:879，19 81)。 ＧＩＦプローブは配列番号１または３として示す配列（それぞれ図２Ｃまたは ２Ｄに示したマウスまたはヒトのＧＩＦポリヌクレオチド。これらはそれぞれマ ウスまたはヒトのＧＩＦのヌクレオチド配列に相当する）から誘導するのが好ま しい。当業者は、推定されるＡｇＧＩＦポリヌクレオチドに対するハイブリダイ ゼーション用プローブとして利用できる適当なオリゴヌクレオチドを決定するこ とができるであろう。ＴＣＲα鎖の定常領域に対するハイブリダイゼーションに 使用するオリゴヌクレオチドプローブは配列番号５（ＴＣＲα鎖の定常領域に相 当する）から誘導するのが好ましい。プローブの長さは約１５〜２５個のヌクレ オチドであるのが好ましいが、ストリンジェントな条件下で特異的なハイブリダ イゼーションが可能であればそれより長いかまたは短いプローブを設計すること ができる。 本発明の方法によって単離するＡｇＧＩＦをコードするポリヌクレオチドはＤ ＮＡでもＲＮＡでもよい。たとえば、このポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡでも ｃＤＮＡでもメッセンジャーＲＮＡでもよい。ｃＤＮＡ調製用のメッセンジャー ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＡｇＧＩＦのゲノム配列は両方とも所望のＡｇＧＩＦを産 生する細胞原料から得ることができる。本発明の発見の一部として、ＡｇＧＩＦ のゲノム配列は活性化されていない細胞原料から得ることができないということ は今や明らかである。特定の理論に縛られるつもりはないが、抗原刺激により、 ＧＩＦ遺伝子またはＴＣＲα鎖遺伝子の再編成または転座があり、２つの遺伝子 が近接して配置され単一の分子として転写されるようになり、その結果ＴＣＲα によりＡｇＧＩＦポリペプチドに抗原特異性が与えられるように思われる。 融合ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチドはいずれも 、その開裂産物がＡｇＧＩＦの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする 限り、本発明に包含されるものと理解されたい。そのようなポリヌクレオチドと しては、天然、合成または意図的に操作したポリヌクレオチドがある。たとえば 、ＡｇＧＩＦポリヌクレオチドは位置指定突然変異誘発にかけることができる。 このポリヌクレオチド配列にはまた、アンチセンス配列および遺伝暗号の結果縮 重 している配列も包含される。２０種類の天然アミノ酸があり、そのほとんどが２ つ以上のコドンによって規定される。したがって、縮重ヌクレオチド配列はいず れも、そのヌクレオチド配列によってコードされている融合ポリペプチドのアミ ノ酸配列が機能的に変化しない限り本発明に包含される。 また本発明は、本発明のヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチドも提供 する。「相補的な」ヌクレオチド配列は、その相補的な配列がハイブリダイズで きる条件下で特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。これらの条件には 温度、ｐＨ、緩衝液およびヌクレオチド組成が包含される。たとえば、二本鎖Ｄ ＮＡ分子のプラス鎖とマイナス鎖は相補的なヌクレオチド配列である。本発明の ポリヌクレオチドには、目的とするＡｇＧＩＦポリペプチドをコードするゲノム ＤＮＡと選択的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基の長さ、典型的には１ ８塩基以上の長さの断片が包含される。選択的ハイブリダイゼーションとは、ヌ クレオチド配列とその相補体である標的ＤＮＡとの非特異的結合を回避する条件 （たとえば、ｐＨ、温度、緩衝液）を意味している。 ハイブリダイゼーション法は、標識された混合合成オリゴヌクレオチドプロー ブを使用する組換えクローンのスクリーニングに有用である。この場合、各々の プローブは、変性した二本鎖ＤＮＡの不均質な混合物を含むハイブリダイゼーシ ョンサンプル中の特定のＤＮＡ配列の完全な相補体であってもよい。このような スクリーニングの場合、ハイブリダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡまたは変性し た二本鎖ＤＮＡに対して行なうのが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的 とするポリペプチドと関連するｍＲＮＡ配列が極めて少量で存在する原料に由来 するｃＤＮＡクローンの検出の場合特に有用である。言い換えると、非特異的結 合を回避するためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する と、たとえば、標的ＤＮＡを混合物中のその完全な相補体である単一のプローブ とハイブリダイゼーションさせることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオー トラジオグラフィーで可視化することが可能である(Wallace，et al.，Nucleic Acid Research，9:879，1981)。 ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が公知 である場合しばしば選択される方法である。所望のポリペプチド産物のアミノ酸 残基の全配列が知られていない場合ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、選択 される方法はｃＤＮＡ配列の合成である。目的とするｃＤＮＡ配列を単離する標 準的な方法の中には、高レベルの遺伝子発現を有する供与細胞に豊富に存在する ｍＲＮＡの逆転写によって誘導される、プラスミドまたはファージに担持された ｃＤＮＡのライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使 用すると、めったにない発現産物でさえクローニングすることができる。ポリペ プチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合、一本鎖に変性されて いるｃＤＮＡのクローン化されたコピーに対して行なわれるＤＮＡ／ＤＮＡハイ ブリダイゼーション法において、標的ｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列を 複製する標識した一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の作製 を使用することができる(Jay et al.，Nucl．Acid Res．11:2325，1983)。 ラムダgt11のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを、少なくとも１つのエピトー プを有するポリペプチドに特異的な抗体を用いて、そのポリペプチドの発現につ いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナ ルまたはモノクローナル的に誘導されたもののいずれであることもでき、そのｃ ＤＮＡによってコードされているタンパク質の存在を示す発現産物を検出するの に使用することができる。 本発明のＡｇＧＩＦポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は適切な宿主細胞に ＤＮＡを移入することによってin vitroで発現させることができる。「宿主細胞 」とは、ベクターが増殖し、そのＤＮＡを発現することができる細胞である。ま たこの用語はその宿主細胞の子孫も包含する。複製の間に突然変異が起こること があるので全ての子孫が親の細胞と同じであるとは限らないものと考えられる。 しかし、この「宿主細胞」という用語を使用するときにはそのような子孫も包含 される。安定な移入、すなわち宿主中で外来ＤＮＡが連続的に維持される方法は 業界で公知である。 抗原特異的ＧＩＦをコードする配列の供給源として、および／またはｃＤＮＡ ライブラリーもしくはゲノムライブラリーを調製するのにＴ細胞を利用すること ができる。また、リンパ系臓器の一部（たとえば、脾臓、リンパ節、胸腺、およ び末梢血リンパ球）はすりつぶしてＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するための供給源 として使用することができる。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡの手軽な供給源と してＴ細胞系を使用することができる。ＡｇＧＩＦコード配列を含有する遺伝子 操作された微生物や細胞系をこの目的でＤＮＡの便利な供給源として使用するこ とができる。 本発明の方法で使用するＡｇＧＩＦの供給源として、および／またはＡｇＧＩ Ｆを製造するのに使用する遺伝子材料源として利用することができる抗原特異的 Ｔ細胞は、当業界で周知であるいくつかのin vitro技術によって生成・選択する ことができる。Ｔ細胞の供給源は末梢血、リンパ節、脾臓、その他のリンパ系臓 器、または腫瘍結節のようにＴ細胞が浸潤する組織部位とすることができる。Ｔ 細胞画分は、密度勾配遠心分離またはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などのよ うなＴ細胞表面マーカーに対する抗体を使用する細胞選別法によって他の細胞型 から分離することができる。これらの方法には、パンニング法、アフィニティー クロマトグラフィー、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離などがあるがこれ らに限定されるわけではない。Ｔ細胞が発現しないマーカーに対する抗体を使用 するかまたは各種基体に対する接着のような非Ｔ細胞の膜特性を利用して非Ｔ細 胞集団を除去することによってＴ細胞を富化するネガティブな選択法も使用でき る。上記技術に加えて、ヘルパーＴ細胞や細胞障害性／サプレッサーＴ細胞を選 択する際にそれぞれ抗ＣＤ４や抗ＣＤ８のようなさらに特異的なマーカーまたは 記憶細胞のようなＴ細胞サブセット（亜群）上に発現するマーカーに対する抗体 を使用して、目的とするＴ細胞サブセットをさらに選択することができる。 抗原特異的Ｔ細胞系をin vitroで生成するには、照射された適当な抗原提示細 胞およびサイトカインの存在下で最適な濃度の特定の抗原で繰り返し刺激すれば よい。抗原提示細胞は自己由来またはＭＨＣに適合した供給源から得るべきであ り、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ＥＢＶで形質転換したＢ 細胞または分離してない末梢血単核細胞でよい。サイトカインとしては、天然型 または組換え型のインターロイキン１、２、４および６のような各種インターロ イキンが包含され得る。そのようなひとつの技術として、たとえば、Takata，et al.，J．Immunol．145:2846-2853，1990を参照されたい。 抗原特異的細胞のクローン集団は、照射された支持細胞、抗原およびサイトカ インの存在下で限界希釈クローニング法を使用するＴ細胞クローニングによって 誘導することができる。あるいは、Ｔ細胞ハイブリドーマは、抗原特異的Ｔ細胞 とBW5147やBW1100のような融合相手の腫瘍系と融合させた後ＨＡＴ選択および再 クローニングすることによって生成させることができる。抗原特異的Ｔ細胞はま たＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用してクローニングおよび増殖されて きた。Ｔ細胞クローンおよびＴ細胞ハイブリドーマはin vivo供給源から直接得 られる細胞を用いて生成させ、その後クローニングおよび融合操作に先立って確 保される抗原特異的Ｔ細胞系に対する試験および選択を行なうことができる。Ｔ 細胞クローンは７〜１４日毎に抗原または抗ＣＤ３で繰り返し刺激することによ って長期にわたり培養維持することができ、その後サイトカインで増やすするこ とができる。一方、Ｔ細胞ハイブリドーマは適当な培地で周期的な抗原刺激を行 なうことなく増殖させることができる。Ｔ細胞クローンの抗原特異的反応性（Ａ ｇＧＩＦ）は、ＥＬＩＳＡを始めとする業界で公知の方法によってスクリーニン グする。 ＡｇＧＩＦを産生するＴｓハイブリドーマはこの因子をコードするｃＤＮＡの 供給源とするのが好ましい。抗原特異的Ｔ細胞因子が一定のエピトープ特異性を 有するＴ細胞クローンから誘導されることは公知である(Iwata，et al.，J．Imm unol.，143:3909，1989; Yamaguchi，et al.，Intl．Immunol.，1:337，1992; M ori，et al.，Intl．Immunol.，5:833，1993)。抗原で刺激したマウス脾臓細胞( Iwata and Ishizaka，J．Immunol.，141:3270，1988; Ohno，et al.，Intl．Imm unol.，2:275，1990)またはアレルギー患者の末梢血リンパ球(Thomas，et al.， J．Immunol.，148:729，1992)からＧＩＦを産生するＴｓ集団を発生させる方法 と、ＧＩＦを産生するＴｓハイブリドーマの構築は当業者に公知である。このＧ ＩＦを産生するハイブリドーマ／クローンから、抗原特異的ＧＩＦを産生するＴ ｓハイブリドーマまたはＴｓクローンを選択する。このハイブリドーマ／Ｔｓク ローンを抗原でパルスした同系マクロファージで刺激するか、またはＣＤ３の架 橋によって刺激し、培養上清を抗原とカップルさせたセファローズその他の適切 なマトリックス上で分画する。カラムに保持されたタンパク質を酸性ｐＨで溶出 し、当業者に公知の方法、たとえばイワタとイシザカが記載した方法(Iwata and Ishizaka，J．Immunol.，141:3270，1988。参考として本明細書に組み入れる ）によって溶出画分にＧＩＦ生物活性が存在するかどうか決定する。刺激される と抗原特異的ＧＩＦを産生するＴｓハイブリドーマまたはＴｓクローンを用いて ＴＣＲα鎖またはＡｇＧＩＦをコードする遺伝子をクローニングする。 ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーは業界でよく知られている技 術を使用して生成したＤＮＡ断片から作製できる。ＡｇＧＩＦをコードする断片 は、上記した非特異的ＧＩＦおよびＴＣＲα配列の一部と相同なヌクレオチドプ ローブを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって同定 できる。ここで、ヒトとマウスのＴＣＲα（Ｃα）に対しては単一の定常領域遺 伝子が存在することに注目すべきである。どちらの種でもＣαをコードするヌク レオチド配列が公知であるので、業界の標準的な方法によって定常領域と相同な ＤＮＡプローブを合成することができ、これを用いて、ＡｇＧＩＦのｃＤＮＡを 合成したりＴ細胞またはゲノムクローンから作製したｃＤＮＡライブラリー中で 適当なＡｇＧＩＦ配列を同定したりするのに使用することができるＡｇＧＩＦ遺 伝子またはｍＲＮＡ転写体をＴ細胞から単離することができる。あるいは、所望 のＴＣＲα鎖の可変領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドを構築することが できるであろうが、これらは可変領域の配列に応じてケースバイケースで設計し なければならないであろう。定常領域に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド プローブはこの点で有利である。すなわち、これらはどのようなＡｇＧＩＦ遺伝 子またはコード配列を「捜し出す」のにも使用することができるからである（た とえば、Maniatis，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor Laboratory，N.Y.，1989に記載されている技術を参照されたい） 。たとえば、特定の態様では、Ｔ細胞ハイブリドーマ231F1細胞（ＯＶＡ特異的 ）からＴＣＲα鎖遺伝子に対する完全なヌクレオチドコード配列を単離した（図 ２Ａおよび２Ｂ、配列番号５）。 あるいはまた、非特異的なＧＩＦ配列および特異的なＴＣＲα配列に由来する オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術でプライマ ーとして用いて、直接クローニングすることができるＡｇＧＩＦ配列のｃＤＮＡ またはゲノムコピーを生成することができるであろう。そのようなＰＣＲ法を概 観するには、たとえば、Gelfand，D.H.，“PCR Technology，Principles and Ap plications for DNA Amplification,”Ed.，H.A．Erlich，Stockton Press，N.Y .，1989および“Current-Protocols in Molecular Biology,”Vol．2，Ch．15， Eds．Ausubel，et al.，John Wiley & Sons，1988を参照されたい。 ＡｇＧＩＦコード配列を同定しクローニングするのに選択した方法には関係な く、発現クローニング法を利用してスクリーニングの労力をかなり減らすことが できる。近年、抗体遺伝子をクローニングし発現させる一段階法が報告されてい る(McCaferty et al.，Nature 348:552-554，1990; Winter and Milstein，Natu re 349:293-299，1991)。この技術に基づいて、ＡｇＧＩＦ遺伝子は同様に、λ やｆｄのようなバクテリオファージのコートタンパク質遺伝子に隣接する部位で ベクター中に直接クローニングすることができる。ＡｇＧＩＦ遺伝子を担持する ファージはその表面に融合タンパク質を発現し、抗原またはＡｇＧＩＦ特異的抗 体（非特異的ＧＩＦとＴＣＲα鎖の定常領域に対して二重特異的な抗体、または ２つの異なる抗体）を含有するカラムを使用して結合活性をもつファージ粒子を 選択・単離することができる。一過性の遺伝子発現系も正確なＡｇＧＩＦ遺伝子 を同定するのに利用することができる。たとえば、ＣＯＳ細胞系（たとえば、Ge rard & Gluzman，Mol．Cell．Biol．6(12):4570-4577，1986）を使用してもよい 。ポジティブなクローンが選択されたら、遺伝子産物（ＡｇＧＩＦ）の生物活性 を本明細書に記載する公知の方法によって抗原特異性に関してアッセイすること ができる。 ヌクレオチドコード配列の縮重のため、公知のＡｇＧＩＦ遺伝子と類似のアミ ノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の実施の際にＡｇＧＩＦのクロー ニングと発現に使用することができる。そのような変更としていろいろなヌクレ オチド残基の欠失、付加または置換があり、その結果同一または機能的に等価な 遺伝子産物をコードする配列が得られる。この遺伝子産物は配列中に、サイレン トな変化（したがって生物活性のある産物をもたらす）となるアミノ酸の欠失、 付加または置換を含んでいてもよい。そのようなアミノ酸の置換は関与する残基 の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、両親媒性およびＳＨ基に基づいて行な うことができる。たとえば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およ びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸としてはリシンおよびアルギニン があり、類似の親水性を有する非帯電極性頭部基をもつアミノ酸としてはロイシ ン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、 セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンがある。また、適当なシステ イン残基をアラニン／セリンで置換して、タンパク質の立体配座、したがって生 物活性に影響を及ぼし得るスルフヒドリル（ＳＨ）基を除去することもできる。 そのようなＡｇＧＩＦを産生するのに使用した方法が何であっても、その分子 の抗原結合能と免疫調節活性を評価しなければならない。たとえば、ＡｇＧＩＦ が対象抗原と直接結合する能力は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）、免疫 沈降、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイを始めとする改変したイムノ アッセイ技術（これらのアッセイ系で通常使われる抗体の代わりにＡｇＧＩＦを 使用する）によって評価することができる。これらのアッセイの例を後記実施例 に例示する。 抗原結合性ＡｇＧＩＦの免疫調節能は、免疫応答を抗原特異的に検出できるア ッセイ系を使用して評価することができる。たとえば、本明細書に記載・例示し たプラーク形成細胞（ＰＦＣ）アッセイを利用して、特定の抗原に対する免疫応 答を抑制するＡｇＧＩＦを同定することができる。ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ ）のような高度に免疫原性の担体の存在下で脾臓細胞を培養すると、免疫応答が 起こり、プラーク形成細胞が生成することになる。培養当たり生成するＰＦＣの 数を評価するには、培養した脾臓細胞をＳＲＢＣ（または適当な溶解可能な担体 ）および補体と混合し、混合物を単層として培養する。透明なプラーク（たとえ ば溶解した赤血球の）によって囲まれた細胞はＰＦＣとして数えられる。脾臓細 胞培養におけるＰＦＣ生成の阻害、すなわちＰＦＣ／培養物の数の低下は、免疫 の応答の抑制を示唆している。ＡｇＧＩＦの抑制活性を試験するために、またそ の抑制が抗原特異的であることを確認するために、以下のようにしてＰＦＣアッ セイを実施することができる。すなわち、目的とする抗原をＳＲＢＣ（Ａｇ−Ｓ ＲＢＣ）とカップルさせて免疫してないマウスに由来する脾臓細胞に加える。抗 原に対して特異的なＡｇＧＩＦの免疫調節効果を評価するには、試験すべきＡｇ ＧＩＦを以下に述べる補助成分の存在下で培養物に加える（すなわち、補助成 分は試験すべきＡｇＧＩＦの前にまたは同時に培養物に加えなければならない） 。コントロールの培養物にはＡｇＧＩＦを加えるか、または関連のない抗原を使 用してもよい。培養後、ＰＦＣ／培養物の数を各々の条件に対して評価する。コ ントロールで観察されたＰＦＣ生成と比較した試験培養物におけるＰＦＣ生成の 阻害は、試験したＡｇＧＩＦがその培養系で通常生成する免疫応答を抗原特異的 に抑制することを示している。 モノクローナルＴ細胞集団の抗原特異性は抗原に応答したこれらの細胞の増殖 および／またはリンホカイン産生を測定するin vitroアッセイで評価することが できる。Ｔ細胞の表現型はさまざまなＴ細胞マーカーに対する抗体で染色するこ とによって確認することができる。さらに、Ｔ細胞の抗原特異性を試験するため にＥＬＩＳＡを使用することができる。 そのような抗原特異的Ｔ細胞はＡｇＧＩＦを構成的に分泌することができるか 、またはＡｇＧＩＦの放出のための活性化シグナルを必要とすることがある。好 ましくは、この抗原特異的Ｔ細胞は、組換えＤＮＡ技術および／または化学合成 技術によってＡｇＧＩＦポリペプチドを産生するのに必要な遺伝子材料の供給源 として使用できる。このアプローチにより、天然のＡｇＧＩＦを分泌し得ないあ る種の抗原特異的Ｔ細胞を、本発明に従って使用すべきＡｇＧＩＦの遺伝子材料 源として使用することができる。 別の態様において、本発明は、式Ｒ1−Ｒ2（ここで、Ｒ1は非特異的ＧＩＦで あり、Ｒ2はＴＣＲα鎖である）を有する配列をもつ融合ポリペプチドをコード するポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、このポリヌクレオチド 配列の発現を可能にする条件下で培養し、実質的に純粋なＡｇＧＩＦを単離する ことからなる、実質的に純粋で生物学的に活性なＡｇＧＩＦを組換え産生する方 法を提供する。このＡｇＧＩＦはマウスかヒトのものであるのが好ましい。 本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、天然において付随する他 のタンパク質、脂質、炭水化物、その他の物質を実質的に含まないポリペプチド を指す。当業者は、すでに本明細書に記載したように非特異的ＧＩＦのエピトー プおよびＴＣＲα定常領域のエピトープと結合するモノクローナル抗体を用いた アフィニティークロマトグラフィーのようなタンパク質精製の標準的な技術を用 いてこのポリペプチドを精製することができる。この実質的に純粋なポリペプチ ドは還元性ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル上で約５５ｋＤの単一で主要なバン ドを示す。このポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列解析によって決定 することもできる。このポリペプチドには、ポリペプチドの活性が保たれる限り においてこのポリペプチドの機能性の断片が包含される。ポリペプチドの生物学 的活性を含有するより小さいペプチドが本発明に包含される。 生物学的に活性なＡｇＧＩＦを発現するためには、ＡｇＧＩＦをコードするヌ クレオチド配列を適当な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写と 翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入する。ＡｇＧＩＦコード配列の改変 版を作製して発現産物の安定性、産生、精製または収率を高めることができるで あろう。たとえば、融合タンパク質、すなわちＡｇＧＩＦと異種タンパク質から なる開裂可能な融合タンパク質の発現を遺伝子工学的に作製できる。このような 融合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより、たとえば異種タン パク質に対して特異的なカラムに固定化することにより、容易に単離できる。Ａ ｇＧＩＦ部分と異種タンパク質との間に開裂部位を挿入すると、この開裂部位を 分裂させる適当な酵素または試薬で処理することによってクロマトグラフィーカ ラムからＡｇＧＩＦを遊離させることができる（たとえば、Booth，et al.，Imm unol Lett.，19:65-70，1988およびGardella，et al.，J．Biol．Chem.，265:15 854-15859，1990を参照されたい）。 生物学的に活性なＡｇＧＩＦを産生するために、ＧＩＦを発現するＴｓ細胞に 、ＴＣＲαをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトすることができる（実施例 ４参照）。あるいはまた、ＧＩＦポリヌクレオチドとＴＣＲαポリヌクレオチド の両方を同時にひとつの細胞にトランスフェクトしてＡｇＧＩＦを産生すること ができる。さらに、同じ宿主細胞にＴＣＲβ鎖ｃＤＮＡもトランスフェクトする ことが望ましいことがある。 当業者にはよく知られている方法を使用して、ＡｇＧＩＦコード配列と適当な 転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これ らの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およびin vivo組換え／遺 伝子組換えが包含される（たとえば、Maniatis，et al.，Molecular Cloning A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989 に記載され ている技術を参照されたい）。 組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者にはよく知られている慣用 技術によって行なうことができる。宿主が大腸菌(E．coli)のような原核生物で ある場合、ＤＮＡの取込みが可能なコンピテント細胞は、対数増殖期の後に収穫 し、次いで業界で周知の手順によってＣａＣｌ2法で処理した細胞から調製する ことができる。あるいはＭｇＣｌ2またはＲｂＣｌを使用することができる。ま た形質転換は、宿主細胞のプロトプラストの形成後、またはエレクトロポレーシ ョンによって、実施することもできる。 宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈、微量注入のような通常の機械 的方法、エレクトロポレーション、リポソームに封入したプラスミドの挿入、ま たはウイルスベクターといったＤＮＡトランスフェクション法が使用できる。ま た真核生物細胞は、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、単純 ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択可能な表現型をコードする第二の 外来ＤＮＡ分子とで同時にトランスフェクトすることもできる。別の方法は、シ ミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシパピローマウイルスのような真核生物ウ イルスベクターを使用して真核生物細胞を一過的に感染させるかまたは形質転換 しタンパク質を発現させることである(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。本明細書に記載するように宿主細胞 として真核生物宿主を利用するのが好ましい。 微生物または真核生物で発現した本発明のポリペプチドを単離・精製する技術 は、たとえば、分取用クロマトグラフィー分離およびモノクローナル抗体やポリ クローナル抗体または抗原を使用するもののような免疫学的分離といった慣用手 段のいずれでもよい。 ＡｇＧＩＦコード配列を発現させるには、各種の宿主‐発現ベクター系が利用 できる。これらには、ＡｇＧＩＦコード配列を含有する組換えバクテリオファー ジＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換し た細菌のような微生物、ＡｇＧＩＦコード配列を含有する組換え酵母発現ベクタ ーで形質転換した酵母、ＡｇＧＩＦコード配列を含有する組換えウイルス発現ベ クター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウ イルスＴＭＶ）で感染させたかもしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえ ばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、ＡｇＧＩＦコード配列を含有す る組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫 細胞系、またはＡｇＧＩＦコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（ たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染させた 動物細胞系、または安定な発現のために遺伝子工学的に操作した形質転換動物細 胞系があるがこれらに限定されることはない。 発現ベクター中には、利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的または誘導 的プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを始めとする たくさんの適切な転写・翻訳要素のいずれも使用できる（たとえば、Bitter，et al.，Methods in Enzymology 153:516-544，1987を参照されたい）。たとえば 、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、plac、ptrp、 ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）のような誘導性プロモーターを使用 できる。哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞に由来するプロ モーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに 由来するプロモーター（たとえば、レトロウイルスの長い末端反復配列、アデノ ウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）が使 用できる。挿入されたＡｇＧＩＦコード配列を転写するには組換えＤＮＡまたは 合成技術で製造したプロモーターも使用できる。 細菌系の場合、発現したＡｇＧＩＦに対して意図する用途に応じて、たくさん の発現ベクターを有利に選択することができる。たとえば、ＡｇＧＩＦを大量に 産生したい場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令 するベクターが望ましいであろう。ＡｇＧＩＦの回収の際に役立つ開裂部位を含 むように工学的に操作したものが好ましい。そのようなベクターとしては、ハイ ブリッドＡｇＧＩＦ‐ｌａｃＺタンパク質が産生するようにＡｇＧＩＦコード配 列をｌａｃＺコード領域と同じ読み枠でベクター中に連結することができるE．c oli発現ベクターpUR278(Ruther et al.，EMBO J．2:1791，1983)、pINベクター( Inouye & Inouye，Nucleic acids Res．13:3101-3109，1985; Van Heeke & S chuster，J．Biol．Chem．264:5503-5509，1989)などがあるがこれらに限られる わけではない。 酵母の場合、構成的または誘導的プロモーターを含有するいくつかのベクター を使用できる。概論としては、Current Protocols in Molecular Biology，Vol ．2，Ed．Ausubel，et al.，Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience，C h．13，1988; Grant，et al.，Expression and Secretion Vectors for Yeast， in Methods in Enzymology，Eds．Wu & Grossman，31987，Acad．Press，N.Y.， Vol．153，pp.516-544，1987; Glover，DNA Cloning，Vol．II，IRL Press，Was h.，D．C.，Ch．3，1986; Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，M ethods in Enzymology，Eds．Berger & Kimmel，Acad．Press，N.Y.，Vol．152 ，pp．673-684，1987およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyce s，Eds．Strathern et al.，Cold Spring Harbor Press，Vols．I and II，1982 を参照されたい。ADHやLEU2のような構成的酵母プロモーターまたはGALのような 誘導的プロモーターを使用できる(Cloning in Yeast，Ch．3，R．Rothstein In: DNA Cloning Vol．11，A Practical Approach，Ed．DM Glover，IRL Press，Wa sh.，D.C.，1986)。あるいはまた、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組込みを促 進するベクターを使用することができる。 植物発現ベクターを使用する場合、ＡｇＧＩＦコード配列の発現はたくさんの プロモーターのいずれによっても行なうことができる。たとえば、ＣａＭＶの３ ５Ｓ ＲＮＡプロモーターや１９Ｓ ＲＮＡプロモーターのようなウイルスプロ モーター(Brisson，et al.，Nature 310:511-514，1984)またはＴＭＶに対する コートタンパク質プロモーター(Takamatsu，et al.，EMBO J．6:307-311，1987) を使用できる。あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーター( Coruzzi，et al.，1984，EMBO J．3:1671-1680; Broglie et al.，Science 22 4 :838-843，1984)または熱ショックプロモーター、たとえば大豆のhsp 17.5-Eも しくはhsp 17.3-B(Gurley，et al.，Mol．Cell．Biol．6:559-565，1986)を使用 できる。これらの構築物はＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベク ター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、エレクトロポレーションなどを用いて植 物細胞に導入することができる。このような技術の概論としては、たとえば、 Weissbach & Weissback，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Pre ss，NY，Section VIII，pp.421-463，1988およびGrierson & Corey，Plant Mole cular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch．7-9，1988を参照されたい。 ＡｇＧＩＦを発現するのに使用することができる他の発現系は昆虫系である。 ひとつのそのような系の場合、外来遺伝子を発現させるベクターとしてAutograp ha californica核多角体病ウイルス(AcNPV)を使用する。このウイルスはSpodopt era frugiperda細胞で増殖する。ＡｇＧＩＦコード配列はこのウイルスの非必須 領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、AcNPVプロモーター（ たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置できる。ＡｇＧＩＦコード 配列がうまく挿入されると、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、封入されてない 組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされているタン パク質コートをもたないウイルス）が産生する。次にこれらの組換えウイルスを 使用し、挿入された遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞を感染させ る。Smith，et al.，J．Viol．46:584，1983; Smith の米国特許第4,215,051号 を参照されたい。 真核生物系、好ましくは哺乳動物発現系を使用すると発現した哺乳動物タンパ ク質の的確な翻訳後修飾が行なわれる。一次転写体の的確なプロセッシング、グ リコシル化、リン酸化、および有利には遺伝子産物の分泌のための細胞機構を有 する真核生物細胞をＡｇＧＩＦの発現用の宿主細胞として使用すべきである。哺 乳動物細胞系が好ましい。そのような宿主細胞系としては、CHO，VERO，BHK，He La，COS，MDCK，-293ならびにWI38およびＴｓハイブリドーマ（ＧＩＦを発現す る）が包含され得るがこれらに限定されるものではない。たとえば、ヒトＴＣＲ αポリヌクレオチドをＧＩＦを発現するマウスまたはヒトのＴｓ細胞にトランス フェクトすることができ、生物活性のヒトＡｇＧＩＦが発現する（実施例４）。 組換えウイルスまたは発現を指令するウイルス成分を利用して哺乳動物細胞系 を工学的に作製できる。たとえば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合 、ＡｇＧＩＦコード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期 プロモーターおよび３分節系リーダー配列に連結することができる。このキメラ 遺伝子は次いでin vitroまたはin vivoの組換えによってアデノウイルスゲノム に 挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１または Ｅ３）に挿入すると、感染した宿主中で生存できＡｇＧＩＦを発現することがで きる組換えウイルスが得られる（たとえば、Logan & Shenk，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，81:3655-3659，1984を参照されたい）。あるいはまた、ワクシニア ウイルスの７．５Ｋプロモーターを使用できる（たとえば、Mackett，et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，79:7415-7419，1982; Mackett，et al.，J．Virol ．49:857-864，1984; Panicali，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:4927 -4931，1982を参照されたい）。特に興味があるのは、染色体外要素として複製 する能力を有するウシパピローマウイルスに基づくベクターである(Sarver，et al.，Mol．Cell．Biol．1:486，1981)。このＤＮＡがマウスの細胞に入ったらす ぐ後にプラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピーに複製する。挿入された ｃＤＮＡの転写にはプラスミドが宿主の染色体に組込まれている必要はないので 高いレベルの発現が得られる。これらのベクターはプラスミド中にneo遺伝子の ような選択マーカーを含ませることによって安定な発現に使用することができる 。あるいはまた、レトロウイルスゲノムを、ＡｇＧＩＦ遺伝子を宿主細胞に導入 してその発現を指令することができるベクターとして使用するように改変するこ とができる(Cone & Mulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6349-6353，19 84)。また高レベルの発現は、限定されることはないがメタロチオネインIIＡプ ロモーターや熱ショックプロモーターを始めとする誘導性プロモーターを使用し て達成することもできる。 組換えタンパク質の長期にわたる高収率産生には安定な発現が好ましい。ウイ ルス性の複製起点を含有する発現ベクターを使うのではなく、適当な発現制御要 素（たとえば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポ リアデニル化部位など）によってコントロールされるＡｇＧＩＦのｃＤＮＡおよ び選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。この組換えプラスミド 中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、そのため細胞はそのプラスミド を自身の染色体中に安定に組込み、増殖してフォーカスを形成することができる 。その後このフォーカスをクローニングし、増殖させて細胞系とすることができ る。たとえば、外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作した細胞を富化培地で１〜２日 増殖 させた後選択培地にスイッチするとよい。たくさんの選択系が使用でき、たとえ ば、限定するわけではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(W igler，et al.，Cell，11:223，1977)、ヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalska & Szybalski，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，48:2026，1962)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺 伝子(Lowy，et al.，Cell，22:817，1980)はそれぞれｔｋ-、hgprtまたはaprt細 胞で使用することができる。また、抗代謝物耐性を以下のものに対する選択のベ ースとして使用することができる。dhfrはメトトレキセートに対する耐性を付与 し(Wigler，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:3567，1980; O´Hare，e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8:1527，1981)、gptはミコフェノール酸 に対する耐性を付与し(Mulligan & Berg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:207 2，1981)、neoはアミノグリコシドG-418に対する耐性を付与し(Colberre-Grapin ，et al.，J．Mol．Biol.，150:1，1981)、hygroはハイグロマイシンに対する耐 性を付与する(Santerre，et al.，Gene，30:147，1984)。最近になって、別の選 択可能な遺伝子が記載されている。すなわち、trpBは細胞がトリプトファンの代 わりにインドールを利用することを可能にし、hisDは細胞がヒスチジンの代わり にヒスチノールを利用することを可能にし(Hartman & Mulligan，Proc．Natl．A cad．Sci．USA，85:8047，1988)、ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）はオル ニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン ＤＦＭＯに対する耐性を付与する(McConlogue L.，In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，ed.，1987)。 遺伝子工学的に作製した細胞によるＡｇＧＩＦタンパク質産物の発現は、たと えばウェスタンブロット法、放射免疫沈降(radioimmuno-precipitation)、酵素 結合免疫検定などのような免疫検定法によって免疫学的に評価することができる 。しかし、発現系の成功の最終的な試験には、生物学的に活性なＡｇＧＩＦ遺伝 子産物の産生が含まれる。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場合、培養したトラ ンスフェクタント宿主細胞から得た無細胞培地をＡｇＧＩＦまたはその免疫調節 活性について検定すればよい。遺伝子産物が分泌されない場合には細胞溶解物に つ いてそのような活性を検定するとよい。いずれの場合も、限定されることはない が、発現したＡｇＧＩＦが抗原と結合する能力、またはＴ細胞ハイブリドーマを グリコシル化ＩｇＥ結合因子の形成から非グリコシル化ＩｇＥ結合因子の形成に スイッチする能力を測定するアッセイ（実施例１）、およびその免疫学的機能を 評価するアッセイ（たとえばＰＦＣアッセイ）を始めとするいくつかのアッセイ を使用してＡｇＧＩＦ活性を評価することができる。 あるいはまた、抗原特異的ＧＩＦ（ＧＩＦ活性を有する５５ｋＤａのペプチド ）は、生物活性のＧＩＦとＴＣＲα鎖の融合タンパク質として製造することがで きる。１３ｋＤａのＧＩＦポリペプチド配列はさまざまな細胞系の細胞で産生さ れるが、Ｔｓ細胞によって産生されたポリペプチドのみが生物学的に活性である (Liu，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:11227，1994)。ヒトＧＩＦの ｃＤＮＡをマウスＴｓ細胞に入れた安定なトランスフェクタントは、上掲のLiu ，et al.に記載されているように生物活性なヒトＧＩＦを産生する。プロカルシ トニン前駆体のＮ末端領域とヒトＧＩＦとから成る融合タンパク質をコードする キメラｃＤＮＡをＢＭＴ１０細胞またはＣＯＳ細胞にトランスフェクトすると、 １３ｋＤａの生物活性なＧＩＦが分泌される。このヒトＧＩＦポリペプチドは、 たとえばAffigelに結合した抗ＧＩＦを使用してアフィニティー精製することが できる。 可溶性形態のＴＣＲα鎖の産生のための融合相手としてカルモジュリンその他 の担体を用いた細菌の融合発現系も利用することができる。この系によると、カ ルモジュリン‐ＴＣＲα融合タンパク質が細胞溶解物の可溶性画分中に高レベル で発現し、このタンパク質のカルモジュリン部分のフェニルセファロースに対す る高い親和性に基づいて融合タンパク質の迅速な精製が容易になる。カルモジュ リン部分とＴＣＲα鎖との間のリンカー配列を認識するトロンビンで融合タンパ ク質を消化することによって、組換えＴＣＲα鎖を回収することができる。この 方法により、Ｖα、Ｊα、Ｃα細胞外領域から成るＴＣＲα鎖が得られる。同じ 方法が、可溶性形態のＴＣＲβ鎖を産生するのにも有用である。生物活性なＧＩ Ｆ分子内のＳＨ基はブロックされているが、組換えＧＩＦペプチドとＴＣＲα鎖 の混合物を穏やかに還元した後タンパク質ジスルフィドイソメラーゼで混合物を 処理すると、ＴＣＲα鎖とＧＩＦの間で鎖間ジスルフィド結合が生成する。たと えばトランスグルタミナーゼの存在下で２つの独立したペプチドと結合すること ができる５サイクルのＶＫＧＬＤＰを含有する、セメントイン(cementoin)を用 いてＧＩＦペプチドをＴＣＲα鎖と結合することができる。融合相手を産生する のに有用な開裂部位を有する他の担体と融合相手は当業者には公知である。 さらに別の態様において、本発明は、サプレッサーＴ細胞を活性化し（活性化 によりＴ細胞における遺伝子の発現が誘発される）、サプレッサーＴ細胞発現産 物を非特異的ＧＩＦポリペプチドに結合する抗体およびＴＣＲαポリペプチドに 結合する抗体と独立に接触させ、ＧＩＦ抗体とＴＣＲα抗体の両者に結合するポ リペプチドを単離することからなる、実質的に純粋なＡｇＧＩＦポリペプチドを 単離する方法を提供する。 本発明で使用する「抗体」という用語は、完全な分子と、その断片であってエ ピトープ決定基と結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2およびＦｖのよ うなものを包含する。これらの抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合 する能力をいくらか保持しており、以下のように定義される。 （１）抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有するＦａｂ断片は、無傷の軽鎖と １つの重鎖の一部とが生成するように酵素パパインで完全な抗体を消化すること によって生成することができる。 （２）抗体分子のＦａｂ′断片は、抗体全体をペプシンで処理した後還元して無 傷の軽鎖と重鎖の一部とを生成させることによって得ることができる。抗体１分 子当たり２つのＦａｂ′断片が得られる。 （３）（Ｆａｂ′）2は、完全な抗体を酵素のペプシンで処理した後還元処理を しないで得ることができる抗体断片であり、Ｆ（ａｂ′）2は２つのジスルフィ ド結合で互いに保持された２つのＦａｂ′断片のダイマーである。 （４）Ｆｖは、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域と を含有する遺伝子工学的に作製された断片と定義される。 （５）単一鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適切なポリペプチドリンカーによって遺伝 子的に融合された単一鎖分子として連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域 を含有する遺伝子工学的に作製された分子と定義される。 これらの断片の作製法は業界で公知である（たとえば、Harlow and Lane，Ant ibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(19 88)を参照されたい。これを参考として本明細書に組み入れる）。 本発明で使用する「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する 、抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は通常アミノ酸や糖側鎖の ような分子の化学的に活性な表面原子団で構成されており、通常は特定の三次元 構造特性と特定の電荷特性をもっている。 本発明で記載するＡｇＧＩＦポリペプチドまたはＴＣＲα定常領域に結合する 抗体は、完全なポリペプチド（ＧＩＦ）または目的とする小さいペプチドを含有 する断片を免疫用の抗原として用いて調製することができる。動物を免疫するの に使用する、配列番号２のようなポリペプチドまたは配列番号２に由来するエピ トープを含有するペプチドまたはＴＣＲαに由来する定常領域は、翻訳されたｃ ＤＮＡからまたは化学合成によって誘導することができ、所望であれば担体タン パク質と結合することができる。ペプチドと化学結合させるのに通常用いられる そのような担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チロ グロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドがある。次 いで、結合したペプチドを用いて動物（たとえばマウス、ラット、ヤギ、ウサギ ）を免疫する。 生物学的に活性なＡｇＧＩＦを高レベルに産生するクローンが同定されたら、 そのクローンを増殖させ、大量のタンパク質を産生するのに使用することができ る。そのタンパク質は、たとえば、限定するわけではないが、免疫アフィニティ ー精製、高速液体クロマトグラフィーを始めとするクロマトグラフィー法、など 、業界でよく知られている技術を用いて精製することができる。このタンパク質 が培養した細胞から分泌される場合ＡｇＧＩＦはその培地から容易に回収するこ とができる。 Ｔ細胞の粗製培地からＡｇＧＩＦを精製する方法はクローニングし発現した産 物の精製に適応し得る。たとえば、後記実施例で使用する231F1細胞から得たＡ ｇＧＩＦは、Ｔ細胞の粗製培地から、硫酸アンモニウム沈殿後のアフィニティー クロマトグラフィーによって精製することができる(Zheng，et al.，J．Immunol ． ，140:1351-1358，1988; Bissonnette，et al.，J．Immunol.，146:2898-2907， 1991)。全てのＡｇＧＩＦ（たとえば、ＧＩＦおよびＴＣＲα定常領域）に共通 に存在する決定基または抗原またはその特定の抗原性エピトープを含有する断片 に対して特異的な精製されたモノクローナル抗体は、臭化シアン活性化Sepharos e４Ｂ(Pharmacia)またはAffigel 10（BioRad）に結合させてアフィニティークロ マトグラフィーに使用することができる。あるいは、問題とするα鎖タンパク質 をコードしているのがどの特定Ｖα遺伝子セグメントであるかが知られていれば 、いろいろなＶα遺伝子ファミリーの産物に対して作成した抗体も使用できる。 加えて、抗体は特定のＡｇＧＩＦの可変領域に対して作成し、関連のない他のＡ ｇＧＩＦの混合物からα鎖を精製するのに使用することができる。この場合特定 のＡｇＧＩＦは、充分な量のタンパク質が存在していれば、バルク培養Ｔ細胞の 粗製培地からでも単離することができる。 ＡｇＧＩＦコード配列を遺伝子工学的に処理して開裂可能な融合タンパク質を コードするようにした場合、ＡｇＧＩＦの精製はアフィニティー精製技術を用い て容易に行なうことができる。たとえば、プロテアーゼ因子Ｘａ開裂認識配列を ＡｇＧＩＦのカルボキシ末端とマルトース結合性タンパク質との間に工学的に作 成することができる。得られる融合タンパク質は、マルトース結合性タンパク質 が結合するアミロースを結合したカラムを用いて容易に精製することができる。 次に、ＡｇＧＩＦ融合タンパク質をマルトース含有バッファーでカラムから溶出 した後因子Ｘａで処理する。この開裂したＡｇＧＩＦは、第二のアミロースカラ ムに通してマルトース結合性タンパク質を除去することによってさらに精製され る(New England Biolabs，Beverly，MA)。本発明のこの態様を使用して、ＡｇＧ ＩＦ配列と、精製に使用することができる結合相手を有する第二のペプチドまた はタンパク質（たとえば免疫アフィニティーカラムを調製することができるよう な任意の抗原）との間に、任意の開裂部位または酵素開裂基質を遺伝子工学的に 作成することができる。 特定のＡｇＧＩＦ遺伝子が分子クローニングされそのＤＮＡ配列が決定された ら、上記方法およびその他たくさんの方法によってそのタンパク質産物を生産す ることができる。たとえば、ＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列に基づいて 、 固相化学合成技術を使用して、ＡｇＧＩＦの全体または一部を製造することがで きる(Creighton，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H．Freem an and Co.，N.Y．pp．50-60，1983)。このアプローチは、分子の活性部位に相 当するタンパク質の小さい部分を生成するのに特に有用である。抗原と結合する ＡｇＧＩＦの場合、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントによってコードさ れているタンパク質のアミノ末端の可変領域が抗原結合性には重要である可能性 が極めて高い。したがって、α鎖の可変領域に相当する合成ペプチドを製造する ことができる。さらに、たとえばα鎖の定常領域が充分な免疫調節応答を達成す る際に補助因子との相互作用にとって重大であることが知られていれば、前記し たα鎖定常領域の特定の部分を含有するより大きいペプチドも合成することがで きる。 ＡｇＧＩＦのクローン化されたＤＮＡ配列に基づいてＡｇＧＩＦを製造する別 の方法は、in vitroの無細胞系でその遺伝子を転写・翻訳するものである。本明 細書で例示する特定の具体例においては、231F1のＡｇＧＩＦ遺伝子をin vitro で転写・翻訳するが、その産物は還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約５５，００ ０ダルトンの分子量のタンパク質であることが示される。このタンパク質はグリ コシル化されてないＡｇＧＩＦポリペプチド鎖に相当する。そのような無細胞in vitro系は大規模なタンパク質生産のために設計されたものではないが、このア プローチの利点は他のタンパク質の合成のない状態で特定の免疫学的反応におけ る特定のＡｇＧＩＦの寄与を決定的に立証する方法を提供することである。Ａｇ ＧＩＦの抗原特異的免疫調節活性により、ヒトまたは動物の対象においてin viv oとin vivoの広範囲の用途が提供される。抗原に結合することができ、かつin v itroで検定して免疫調節活性を示すＡｇＧＩＦまたはその断片もしくは誘導体は いずれも本発明方法の実施に使用できる。抗原に結合することができ、かつ通常 はその抗原に対して引き出される免疫応答を抑制するＡｇＧＩＦは、過敏反応、 移植拒絶および自己免疫疾患のような抗原特異的免疫応答のダウンレギュレーシ ョン(down-regulation)に有用であろう。 したがって、本発明は、ヒトに免疫抑制量の抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ） を投与し、免疫応答を抑制することからなる、抗原に対するヒトの免疫応答を抑 制する方法も提供する。「抑制する」または「抑制性」という用語は、ヒトの受 容療法において望ましくない免疫応答の有害な影響を低減することを意味する。 「免疫抑制量」という用語は、ヒトＡｇＧＩＦの使用量が望ましくない免疫応答 に起因する疾病または症状の原因を抑制するのに充分な量であることを意味する 。さらに本方法は、５５ｋＤａのペプチドとＴＣＲβ鎖の複合体の投与を含むこ とがある。ＴＣＲβは、当業者には公知の方法、たとえば化学結合またはジスル フィド結合の形成による複合体化によってＡｇＧＩＦと複合体化することができ る。 本発明のＡｇＧＩＦを投与する投与量範囲は、免疫応答の症状がある程度抑制 されるという所望の効果を生ずるのに充分大きなものである。投与量は、所望で ない交差反応、アナフィラキシー（過敏性）反応などのような有害な副作用を起 こす程大きくしてはならない。一般に、この投与量は患者の年齢、容態、性別お よび病気の程度に応じて変化し得、当業者が決定することができる。投与量は、 なんらかの反対の指標(counterindication)があった場合には個々の医者が調節 することができる。投与量は１回につき約０．００１mg／kg〜約２mg／kg、好ま しくは約０．００１mg／kg〜約０．２mg／kgの範囲で変えことができ、１日に１ 回または複数回、１日または数日間である。 本発明のＡｇＧＩＦは注射によってまたは時間をかけて少しずつ注入すること によって非経口投与することができる。本発明のＡｇＧＩＦは静脈内に、腹膜組 織内に、筋肉内に、皮下に、洞内に、または経皮的に投与することができる。 非経口投与用の製剤としては無菌の水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁 液がある。非水性溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、 植物油（たとえば、オリーブ油）、および注射可能な有機のエステル（たとえば 、オレイン酸エチル）である。水性の担体としては、水、アルコール性／水性溶 液、乳濁液または懸濁液、たとえば生理食塩水および緩衝化媒質がある。非経口 用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルぶどう糖液、デキストロー スおよび塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液または脂肪油がある。静脈内用の ビヒクルとしては流体および栄養補充物、電解質補充物（たとえば、リンゲルぶ どう糖液を主材とするもの）などがある。保存剤その他の添加物、たとえば抗菌 剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスなどが存在していてもよい。 さらに本発明は、本発明のＡｇＧＩＦが結合することができる抗原に対する望 ましくない免疫応答の治療に使用する、本発明のＡｇＧＩＦを含む医薬または薬 剤組成物を調製する方法にも係る。ＡｇＧＩＦはヒトＡｇＧＩＦが好ましい。 抗原特異的免疫抑制を示す抗原結合性ＡｇＧＩＦは、免疫反応が有害でありそ のような応答を抗原特異的に抑制するのが望ましいような状態を処置するのに使 用しうる。本発明に従って処置できるこれらの疾患としては、過敏症（Ｉ〜VI型 ）、自己免疫疾患および臓器または組織の移植後の移植片拒絶反応があるが、こ れらに限られることはない。 過敏症反応は一般に４つのグループに分類される。Ｉ型の反応は、抗原特異的 ＩｇＥによって生起するマスト細胞顆粒消失の結果起こる即時型過敏症である。 Ｉ型の疾病の例としては、植物の花粉、かびの胞子、昆虫の部分、動物の鱗屑、 ハチやヘビの毒、産業塵埃、家庭の塵埃、食品、薬品および薬物のような物質に よって生じる最も普通のアレルギーがある。II型の反応は特定の抗体、通常はＩ ｇＧやＩｇＭの標的細胞に対する作用によって引き起こされ、細胞の破壊に至る 。II型の疾病の例としては、輸血反応、胎児赤芽球症、自己免疫溶血性貧血、重 症筋無力症およびグレイヴス病がある。III型の反応は抗原‐抗体複合体の形成 およびその後の抗体エフェクターメカニズムの活性化によって引き起こされる。 III型の疾病の例としては、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群お よびある種の形態の関節炎がある。IV型の反応はＴ細胞、マクロファージ、線維 芽細胞その他の細胞型の関与する細胞媒介反応である。これらは遅延型過敏症と もいわれる。アレルギー性接触皮膚炎はこのカテゴリーの典型的な例である。 自己免疫疾患とは、自己抗原に対する免疫系の反応によって引き起こされて組 織の破壊に至る一群の疾患をいう。これらの応答は抗体、自己反応性Ｔ細胞また は両者によって媒介され得る。これらの症状の多くは過敏症に関して上記したも のと重複している。いくつかの重要な自己免疫疾患には糖尿病、自己免疫性甲状 腺炎、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび重症筋 無力症が包含される。 ＭＨＣの根本的な理解により組織の類別の技術が進歩し、その結果臓器または 組織移植における成功率が大きく向上した。今日一般に行なわれる移植手術のい くつかには腎臓、心臓、肝臓、皮膚、膵臓ランゲルハンス島および骨髄のような 臓器や組織がある。しかし、ドナーとレシピエントが遺伝的に同一でない場合に はやはり移植片拒絶が起こり得る。 限定するわけではないが上述した特定の疾病を始めとする上記症状の全てで有 害な免疫応答のダウンレギュレーションは宿主にとって有益である。この点、Ｔ 細胞、抗体または両者によって媒介される免疫応答を特異的に抑制しつつ他の通 常の免疫機能は全て維持するのにＡｇＧＩＦを使用できる。たとえば、実験的ア レルギー脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、精製したミエリン塩基性タンパク質の投与によ ってマウスで誘発され得るヒトの多発性硬化症の動物モデルである。ＴHはこの 疾病の発病に重大な役割を果たすことが示されている(Wraith，et al.，Cell，5 7:709-715，1989)。所与のマウス株で自己反応性Ｔ細胞によって認識される抗原 決定基の数は限られている。さらに、自己免疫性ＴＣＲの構築に使用するＶαお よびＶβ遺伝子セグメントは、少数の脳炎発生エピトープに対するＴ細胞応答の 大部分が同じＴＣＲをもつように等しく制限されている。ＴＣＲ決定基に対する 抗体はin vivoでＡｇＴ細胞を枯渇させて病気から保護するのに有効に用いられ た(Owhashi and Heber-Katz，J．Exp．Med．168:2153-2164，1988)。本発明の実 施の際は、ＡｇＧＩＦ遺伝子をそのような自己反応性Ｔ細胞から単離し、適当な 宿主細胞で発現させ、in vitroとin vivoで抗原特異的免疫応答を抑制する能力 を試験すればよい。この目的でＡｇＧＩＦを使用するのは、多発性硬化症や重症 筋無力症のようなある種のヒトの疾病において自己免疫性Ｔ細胞が検出され、あ る種のＶαおよびＶβ対立遺伝子の制限された有用性を同様に有しているように みえるという最近の知見に鑑みて特に重要である(Oksenberg，et al.，Proc．Na tl.，Acad．Sci．USA，86:988-992，1989)。 本発明によると、以上の症状は、前記抗原に対して生じる免疫応答を抑制する 関連の抗原に対して特異的なＡｇＧＩＦを有効量患者に投与することによって処 置できる。使用するのに選択するＡｇＧＩＦは、本明細書に記載したＰＦＣアッ セイのようなin vitroの免疫調節検定によって評価できる。ＡｇＧＩＦは、限定 するわけではないが注射、注入、非経口および経口といった各種方法で投与でき る。ＡｇＧＩＦおよび関連する誘導体、類似体、たとえば可変領域から誘導され たペプチドは、唯一の活性剤として、または他の成分と共に、使用することがで きる。そのような組成物はリン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水および滅菌水を始 めとする生理学的に許容できる担体と共に投与することができる。あるいは、Ａ ｇＧＩＦを送出するのにリポソームを使用することができる。これに関連して、 細胞特異的抗原を認識して細胞特異的抗原に結合する抗体とリポソームとを複合 体化させることによって、ＡｇＧＩＦ組成物を「ターゲッティング」するための 手段を提供することができる。 有効投与量は、関係する抗原に対してin vivoで生じるであろう免疫応答を抑 制するのに必要な量である。ＡｇＧＩＦの使用量は投与法、他の活性化合物の使 用、などによって変わる。通常、０．１μｇ〜１００μｇ／mlの程度の循環血清 レベルを生じる投与量を使用できる。抗原特異的応答を抑制するのに最も効果的 な濃度は、本明細書に記載し当業者には公知であるＰＦＣアッセイのようなin v itroアッセイにさまざまな濃度のＡｇＧＩＦを添加して、達成された阻害のレベ ルをモニターすることによってin vitroで決定できる。 以下の実施例は本発明を例示するものであり、限定するものではない。これら は使用できるものの代表例ではあるが、当業者には公知の他の方法もこれに代え て使用できる。 実施例１ 材料と方法 細胞系 ：ＯＶＡ特異的サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）ハイブリドーマ231F1細胞(Ja rdieu，et al.，J．Immunol.，138:1494，1987)、ハチ毒ホスホリパーゼＡ2（Ｐ ＬＡ2）に特異的なＴｓハイブリドーマ3B3細胞(Mori，et al.，Int．Immunol.， 5:833，1993)、ＴＣＲβ鎖のｍＲＮＡとＣＤ３−ｍＲＮＡを含有するがＴＣＲα 鎖のｃＤＮＡを含有しないＴ細胞系175.2(Glaichenhans，et al.，J．Immunol. ，146:2095，1991)を使用した。231F1細胞と3B3細胞はいずれもその細胞表面に ＴＣＲを発現した（モノクローナル抗ＴＣＲβ鎖と抗ＣＤ３を用いた免疫螢光法 により決定）が、175.2細胞はいずれの抗体でも染色されなかった。抗原と抗体 ：結晶性オボアルブミンはNutritional Biochemから購入し、ハチ毒 ホスホリパーゼＡ2はSigma Chemical Co.(St.Louis，MO)から購入した。抗原は 、 ゲル１ml当たりタンパク質１〜３mgでCL Sepharose 4Bにカップルさせた。ＰＬ Ａ2はすでに記載されている(Mori，et al.,上掲)ようにしてＣＮＢｒで処理した 。抗マウスＣＤ３(145-2C11)(Lee，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，8 4:1374，1987)、抗ＴＣＲα鎖(H28-710)(Beker，et al.，Cell，87:911，1989) および抗ＴＣＲβ鎖(H57-597)(Kubo，et al.，J．Immunol.，142:2736，1989)ｍ ＡＢおよびポリクローナルウサギ抗ＧＩＦ抗体(Mikayama，et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，90:10056，1993)はすでに記載されている。モノクローナル 抗体（ｍＡｂ）は全て培養上清または抗血清をプロテインＡ Sepharoseに吸着さ せて精製した。カラムに保持されたＩｇＧは0.1ＭグリシンＨＣｌバッファー（ ｐＨ3.0）で溶出して回収した。ｍＡｂのH28-710、H57-597またはウサギ抗ＧＩ Ｆ抗血清のＩｇＧ画分をAffigel 10にカップルさせた。２〜４mgのｍＡｂまたは ５mgの抗ＧＩＦは１mlのゲルにカップルさせた。正常なウサギＩｇＧ（ＲＧＧ） はゲル１ml当たりタンパク質５mgとしてAffigel 10にカップルさせた。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定 ：Fast Trackm ＲＮＡ単離キット(Invitrogen)を用 いて231F1細胞からポリ（Ａ）+ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮ Ａ合成システム(Gibco BRL)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを生成させ、Ｔ４リガーゼ( Inaba，et al.，Internat．Immunol.，3:1053，1991)で環化させた。ＴＣＲαの ｃＤＮＡクローニング用ＰＣＲプライマーを合成した。これらのプライマーのヌ クレオチド配列は、それぞれ、５′−ＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴ ＡＣＡＣＡ−３′（Ｃαのヌクレオチド４７〜２４）（配列番号７）、５′−Ｇ ＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧ−３′（Ｃαの３６６〜３８ ９）（配列番号８）、５′−ＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡ Ｃ−３′（図２Ａの１４６〜１６９）（配列番号９）、５′−ＡＧＧＡＡＣＡＡ ＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧ−３′（図２Ａの２１３〜２３４）（配列番号１ ０）、５′−ＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣ−３′（図２Ａ の８０４〜７８４）（配列番号１１）であった。ＰＣＲ反応は変性には95℃で１ 分、アニーリングには55℃で２分、伸長には72℃で２分行なった。増幅したＤＮ Ａを単離し、ＴＡクローニングベクターＰＣＲＩＩ(Invitrogen)に挿入した。Ｄ ＮＡ配列決定はシーケンスキット(United States Biochemical)を用いて標準 的なジデオキシ法によって行なった。発現ベクターの構築と安定なトランスフェクション ：哺乳動物の発現ベクターpE Fneoはすでに記載されている(Liu，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，91: 11227，1994)。XbaI部位を有するＴＣＲαのｃＤＮＡの５′端とNotI部位を有す る同ｃＤＮＡの３′端に相当する２つのプライマーを用いたＰＣＲでＴＣＲα鎖 をコードする全長ｃＤＮＡを増幅し、ｃＤＮＡをpEFneoに挿入した。上記５′プ ライマーとＴＣＲαの３′端をコードする３′プライマー、エンテロキナーゼの リンカー配列、６つのヒスチジン残基のタグドメインおよびNotI部位を用いてＰ ＣＲによりＴＣＲα−タグ遺伝子を作製し、同じベクターに挿入した。200Ｖ、9 60μＦのエレクトロポレーション(Bio-Rad)によってトランスフェクションした 。安定なトランスフェクタントはＧ４１８（0.5mg／ml）耐性によって選択した 。ＴＣＲαのｍＲＮＡの発現は［32Ｐ］で標識したＶα11.3特異的プローブを用 いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。ハイブリドーマ細胞と安定なトランスフェクタントのの刺激 ：231F1細胞と3B3細 胞の抗原刺激のために、１０％Ｎｕ血清を含むＤＭＥＭに懸濁したＴ細胞ハイブ リドーマ（１×106細胞／ml）を、100μｇ／mlのＯＶＡ(Jardieu，et al.，上掲 ）または30μｇ／mlのＣＮＢｒで処理したＰＬＡ2（Mori，et al.,上掲）でパル ス処理したA20.3細胞（２×105細胞／ml）と共に培養した。24時間の培養後上清 を回収した。ＣＤ３の架橋によってハイブリドーマ細胞または安定なトランスフ ェクタントを刺激するために、細胞を氷上で30分５μｇ／mlの抗ＣＤ３で処理し た。細胞を洗浄し、無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、106／mlの細胞を含有する細胞 懸濁液を、プロテインＡでコートした組織培養フラスコで培養した(Iwata，et a l.，J．Immunol.，143:3909，1989)。24時間のインキュベーション後培養上清を 回収した。培養上清の分画 ：細胞系の細胞の培養上清または細胞質画分を適当な免疫吸着剤 上で分画した。特に記載しない限り培養上清は限外ろ過により10〜50倍に濃縮し 、サンプルを1/3〜1/5倍容量のＲＧＧとカップルさせたAffigel 10と共に一晩混 合した。懸濁液をカラムに装填し、洗浄液と共に通り抜け画分を２〜３mlの免疫 吸着剤カラムにかけた。この調製物を一晩カラムに循環させた後、カラムの40〜 50倍容量のＰＢＳで洗浄した。免疫吸着カラムに残ったタンパク質をカラムの３ 倍容量の0.1ＭグリシンＨＣｌバッファー（ｐＨ3.0）で溶出させて回収した。Ｈ ｉｓタグを有する組換えペプチドは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース(Qiagen)を用いて 精製した。濃縮した培養上清を４℃で50ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐ Ｈ８）に対して透析し、ＮａＣｌを最終濃度300mMで加えた。サンプルを４℃で3 0分間1/10容量のＮｉ−ＮＴＡアガロースと穏やかに混合し、懸濁液をカラムに 詰めた。カラムの40倍容量の１mMのイミダゾールを含有するリン酸バッファーで 洗浄した後カラムに保持されたタンパク質を、100mMのイミダゾールを含有する リン酸バッファーで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット ：アフィニティーで精製した調製物を還元 性条件下15％のポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。い くつかの実験ではサンプルをE．coliから誘導された組換えヒトＧＩＦ（T．Mika yamaから供給された）と共に分析した(Kirin Brewery Co.，Maebashi，Japan)。 ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、高化学発光ウェスタンブロット検出系 (Amersham)で免疫ブロットを実施した。ポリクローナルウサギ抗ＧＩＦのＩｇＧ 画分とｍＡｂのH28-710をそれぞれＧＩＦエピトープを有するペプチドとＴＣＲ α鎖決定基を有するペプチドの検出に用いた。ＧＩＦ生物活性の検出 ：マウスＴ細胞ハイブリドーマ12H5細胞が、グリコシル化 されたＩｇＥ結合性因子（ＩｇＥ−ＢＦ）の生成から、グリコシル化されてない ＩｇＥ−ＢＦの生成にスイッチする能力によって活性を検出した。アッセイ手順 の詳細についてはすでに記載されている(Iwata，M．and Ishizaka，K.，J．Immu nol.，141:3270，1988)。簡単にいうと、連続２倍希釈の試験すべきサンプルの 存在下で12H5細胞をマウスＩｇＥと共に培養し、培養ろ液中のＩｇＥ−ＢＦをレ ンチルレクチンSepharoseで分画した。12H5細胞をＩｇＥのみと共に培養した場 合細胞が形成したほとんど全てのＩｇＥ−ＢＦがレンチルレクチンSepharoseに 結合し、αメチルマンノシドによる溶出によって回収された。しかし、12H5培養 物に十分量のＧＩＦを加えると、ＩｇＥ−ＢＦのほとんどはレンチルレクチンSe pharoseに保持されず、通り抜け画分中に回収された。サンプルのＧＩＦ力価は1 2H5細胞により形成されるＩｇＥ−ＢＦの性質であるサンプルの最大希釈を示し ている。 実施例２ 抗原特異的ＧＩＦ中の５５ｋＤペプチドの同定 以下の実験では抗原特異的ＧＩＦの同定を記載する。ＯＶＡに特異的なＴｓハ イブリドーマ231F1細胞をＯＶＡでパルスしたA20.3細胞と共に24時間培養した。 限外ろ過により培養上清を濃縮した後濃縮培養上清をＯＶＡとカップルさせたSe pharoseで分画した。通り抜け画分と酸で溶出した画分とのＧＩＦ生物活性の分 布により、最初の培養上清のＧＩＦ生物活性の80〜90％が免疫吸着カラムに保持 され、酸溶出物に回収されたことが示された。すなわち、この酸溶出物をＳＤＳ −ＰＡＧＥで分析した後ポリクローナル抗ＧＩＦで免疫ブロットした。抗ＧＩＦ に結合する主要なバンドは５５ｋＤａペプチドであった。抗原で刺激したＰＬＡ2 特異的Ｔｓハイブリドーマ3B3細胞の培養上清で同様な実験を行なった。 図１はＴｓハイブリドーマからの抗原特異的ＧＩＦの分析結果を示す。図１Ａ は、抗原でパルスしたＡＰＣで3B3細胞を刺激して得られＰＬＡ2とカップルした Sepharoseを用いてアフィニティー精製したＰＬＡ2特異的ＧＩＦの結果を示す（ レーン２）。E．coli由来の組換えヒトＧＩＦはレーン１にアプライした。これ らは還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後抗ＧＩＦで免疫ブロットした。 図１Ｂでは、H28-710とカップルさせたAffigelを用いて、抗ＣＤ３で刺激した23 1F1細胞からＯＶＡに特異的なＧＩＦをアフィニティー精製した。ＧＩＦ力価が １：80の溶出画分（レーン１）をＯＶＡ‐Sepharoseでさらに分画した。酸溶出 物（レーン２）と通り抜け物（Ｅｆｆ、レーン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗 ＧＩＦによる免疫ブロットによって分析した。図１ＣはH28-710による免疫ブロ ットで分析した同じ画分を示す。 図１Ａに示されているように、抗原とカップルしたSepharoseからの溶出物を 還元性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＧＩＦを用いたウェスタンブロットで 分析したところ、５５ｋＤａの単一のバンドが得られた。ＯＶＡ特異的Ｔｓハイ ブリドーマ231F1細胞をＯＶＡでパルスしたＡＰＣで刺激し、ＯＶＡ−Sepharose を用いてＯＶＡ特異的ＧＩＦを精製したとき同様な結果が得られた。ＯＶＡ特異 的ＧＩＦ調製物およびＰＬＡ2特異的ＧＩＦ調製物の両方で５５ｋＤａのペプ チドが同定されたことにより、ＧＩＦ活性がこのペプチドに関連していることが 示された。 抗原特異的ＧＩＦ調製物のペプチドの特性を決定するために、231F1細胞を抗 ＣＤ３で処理し、無血清培地に懸濁させ、プロテインＡでコートした組織培養皿 で24時間培養した。抗原特異的ＧＩＦはAffigelにカップルさせたモノクローナ ル抗ＴＣＲα鎖H28-710に結合する(Iwata，et al.，J．Immunol.，143:3917，19 89)ので、培養上清をＲＧＧとカップルさせたAffigelに予め吸着させ、通り抜け 画分をH28にカップルさせたAffigelで分画した。予期した通り、培養上清中のＧ ＩＦ生物活性の大部分（80〜90％）が免疫吸着剤に結合し、酸溶出で回収された 。この吸着に使用したＲＧＧAffigelの酸溶出物ではＧＩＦ生物活性が検出され なかった。H28とカップルさせたAffigelからの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分 析したところ、抗ＧＩＦに結合する５５ｋＤａペプチドと１３ｋＤａペプチドが 再び立証された（図１Ｂ、レーン１）。そこで、ＧＩＦ力価が１：80の溶出画分 をＯＶＡとカップルさせたSepharoseでさらに分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ る免疫吸着および免疫ブロットで得た画分の分析により、５５ｋＤａのペプチド とＧＩＦ生物活性が酸溶出物中に回収されるが、通り抜け画分中には検出されな いことが示された。重要な知見は、この５５ｋＤａペプチドがウェスタンブロッ トにおいて抗ＧＩＦおよび抗ＴＣＲα鎖の両方に結合したということである（図 １Ｂ、１Ｃ）。 コントロールとして刺激してない231F1細胞の培養上清を用いて同様な実験を 行なった。処理してない231F1細胞を無血清培地に懸濁させ、プロテインＡでコ ートした組織培養フラスコで培養した。その上清をＲＧＧAffigelに予め吸着さ せ、H28とカップルさせたAffigelで分画した。刺激してない細胞の最初の培養上 清の生物活性は抗ＣＤ３で刺激した細胞の培養上清と同等であった。しかし、Ｒ ＧＧAffigelでもH28-710-Affigelでもその酸溶出画分中には生物活性は検出され なかった。後者の画分はウェスタンブロットでH28-710 に結合する５５ｋＤａの ペプチドを含んでいなかった。すなわち、H28-710Affigelからの通り抜け画分は 抗ＧＩＦAffigelに吸着され、カラムに保持されたタンパク質は酸溶出により回 収された。抗ＧＩＦ‐Affigelからの溶出物はＧＩＦ生物活性をもっており、 ウェスタンブロットで抗ＧＩＦに結合する１３ｋＤａペプチドを含有していた。 以前の観察(Jardieu，et al.上掲）から予期されたように、刺激してない231F1 細胞の培養上清のＧＩＦ生物活性はＯＶＡ‐Sepharoseに結合せず、ＯＶＡ‐Sep haroseから得た酸溶出画分はウェスタンブロットで抗ＧＩＦに結合する５５ｋＤ ａペプチドを含有していなかった。これらの結果が示していることは、231F1細 胞がＯＶＡでパルスされたＡＰＣによって刺激されたかまたは細胞表面のＣＤ３ の架橋により刺激されたときにのみ231F1細胞から５５ｋＤａペプチドが放出さ れるということである。 実施例３ Ｔｓ細胞由来のＴＣＲα鎖の分子クローニング 231F1細胞に由来するＴＣＲα鎖をコードする遺伝子をInaba，et al.が記載し た方法によってクローニングした(Inaba，et al.，上掲)。231F1細胞のｍＲＮＡ から二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｔ４リガーゼを用いて連結することによって環化 した。Ｃα領域遺伝子中のヌクレオチド４７〜２４に相当するアンチセンスオリ ゴヌクレオチドとこの領域中のヌクレオチド３６６〜３８９に相当するセンスオ リゴヌクレオチドとを使用してＰＣＲを実行した（実施例１参照）。ＰＣＲで増 幅したＤＮＡをサブクローニングし、Ｃα遺伝子プローブを用いてスクリーニン グした。陽性クローン中のＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列により、融合相手BW 5147に由来するものとは異なるユニークなＶαＪα遺伝子の存在が明らかになっ た。分析した５個のＤＮＡ挿入物のうち２つのクローンが同じ配列をもっていた 。Ｖα領域の推定されたアミノ酸配列は３個のアミノ酸を除いてＶα11.3のもの と同一であった(Jameson，et al.，J．Immunol.，147:3185，1991)（図２）。23 1F1細胞由来のＶαＪα遺伝子中のＪα領域はユニークであったが、KapplerとPa lomerが記載したＪα−３ＤＴ(Yague，et al.，Nucl．Acids Res.，16:11355，1 988)と８６％相同であった。図２Ａに、231F1細胞由来の全長ＴＣＲα鎖ｃＤＮ Ａのヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列を示す。Ｌ、Ｖ、Ｊ、Ｃはリー ダー配列、Ｖα領域、Ｊα領域、Ｃα領域を示す。図２Ｂはタグ−ＴＣＲαのｃ ＤＮＡの３′端のヌクレオチド配列を示す。 231F1細胞中のユニークなＴＣＲα鎖が完全なＣα領域をもっているかどうか 決定するために、ＴＣＲα鎖のＣα遺伝子をクローニングした。231F1のｍＲＮ Ａから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｖα11.3に特異的なプライマー（図２のヌクレ オチド１４６〜１６９）とオリゴｄＴを用いてＰＣＲを実行した。反応混合物を 100倍に希釈し、Ｃα遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、Ｖα11.3中のヌクレオチ ド２１３〜２３４とＣα３′端特異的プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。二 回目のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をサブクローニングし、挿入物のヌクレオチ ド配列を決定した。その結果によって、この実験で得られた９つのクローンのう ち８つがＣα遺伝子の完全なヌクレオチド配列をもっており、231F1細胞がユニ ークなＴＣＲα鎖（完全な配列を図２Ａに示す）をもっていることが示された。 プライマーを含まないＰＣＲ反応バッファー中でヌクレオチド１〜４３７およ び２１３〜８０４に相当するＴＣＲαのｃＤＮＡをクローニングし末端を切断し た２つの断片を等量混合することによって、全長ＴＣＲα−ｃＤＮＡのクローニ ングを完成させた。こうして得られた全長のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、pEFneo に挿入したｃＤＮＡを、ＴＣＲβとＣＤ３を発現するが機能性のＴＣＲα遺伝子 を欠くＴ細胞系175.2(Glaichenhans，et al.,上掲)にトランスフェクトした。ｍ ＲＮＡのノーザンブロットによってＶα11.3ｃＤＮＡをもつ各クローンから安定 なトランスフェクタントを選別し、最高量のα鎖ｍＲＮＡを発現するＴ細胞クロ ーンを樹立した。免疫蛍光法で測定したところ代表的なクローンであるE106はそ の細胞表面にＴＣＲαβとＣＤ３を発現したが、元の175.2細胞系の細胞は抗Ｃ Ｄ３でも抗ＴＣＲβ鎖でも染色できなかった。E106細胞がＴＣＲα鎖を合成する ことを確認するために、安定なトランスフェクタントをＤＭＥＭで培養し、約１ ０9個の細胞から得た細胞溶解物をH28-710とカップルしたAffigelに吸着させた 。免疫吸着剤からの酸溶出物画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析しその後ｍＡ ｂのH28-710で免疫ブロットしたところ、このｍＡｂに結合した３５ｋＤａのペ プチドの存在が明らかになった。 予期した通り、175.2クローンの細胞溶解物を同じ手法で分画し、H28-710-Aff igelからの酸溶出物を免疫ブロットにより分析したところ、ペプチドは検出され なかった。図３に、安定なトランスフェクタントE106から得たＴＣＲα鎖の免疫 ブロット分析結果を示す。E106細胞とトランスフェクトしてない175.2細胞系 細胞の細胞溶解物をH28-710とカップルしたAffigelに吸着させ、カラムに保持さ れたタンパク質を酸溶出によって回収した（溶解物）。E106細胞を抗ＣＤ３で刺 激し、培養上清を同じ免疫吸着剤で分画した（上清）。溶出画分はH28-710によ る免疫ブロットで分析した。 E106クローンが可溶性のＴＣＲα鎖またはその誘導体を放出する可能性を試験 するために、細胞を抗ＣＤ３で刺激した。培養上清（300ml）を濃縮し、ＲＧＧ とカップルしたAffigelに吸着させ、通り抜け画分をH28-710とカップルしたAffi gelで分画した。酸溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロットで分析したとこ ろモノクローナル抗ＴＣＲα鎖に結合するペプチドは検出できなかった（図３） 。E106細胞はＴＣＲα鎖またはその誘導体を分泌できなかったようである。 実施例４ Ｔｓ細胞によるＴＣＲα鎖遺伝子産物の生成 Ｔｓハイブリドーマ231F1は抗原刺激により抗原特異的ＧＩＦを生成し、この 因子はH28-710とカップルしたAffigelに結合するので、Ｔｓハイブリドーマにお けるＴＣＲα鎖の過剰発現(over-expression)がこの抗原特異的因子の産生を高 めるかどうか決定する試験を行なった。すなわち、ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡをＴｓハ イブリドーマにトランスフェクトして安定なトランスフェクタントを樹立した。 トランスフェクトした細胞クローンを、Ｖα11.3ｃＤＮＡ断片をプローブとして 用いたｍＲＮＡのノーザンブロット分析によって選択した。最高量のＶα11.3+ ｍＲＮＡを発現する代表的なクローン211αの試料を抗ＣＤ３で刺激するかまた は刺激しないで培養した。無血清培地で24時間培養後、培養上清を20倍に濃縮し 、ｍＡｂH28-710を用いた免疫ブロットによって分析した。 図４に、231F1細胞にＴＣＲα鎖ｃＤＮＡを入れた安定なトランスフェクタン トによる５５ｋＤａペプチドの生成を示す。図４Ａは、トランスフェクトしてな い231F1細胞と抗ＣＤ３で刺激した安定なトランスフェクタント211α細胞を示す 。刺激してない細胞（−）またはＣＤ３で刺激した細胞（＋）の培養上清を濃縮 し、H28-710を用いた免疫ブロットによって分析した。図４Ｂは、抗ＣＤ３で刺 激しH28-710 Affigel で分画した211α細胞の培養上清とH28-710またはポリクロ ーナル抗ＧＩＦを用いた免疫ブロットによって分析した酸溶出画分を示す。 図４Ａに示されているように、抗ＣＤ３で刺激した211α細胞の培養上清はｍ ＡｂのH28に結合する５５ｋＤａペプチドを含有していたが、刺激してない細胞 の培養上清ではこのペプチドは検出されなかった。免疫ブロットの特異性を確認 するために、抗ＣＤ３で刺激した細胞の培養上清をH28-710とカップルしたAffig elに吸着させ、酸溶出画分を免疫ブロットで分析した。図３Ｂに示されているよ うに、５５ｋＤａのペプチドは酸溶出物中に回収された。抗ＣＤ３で刺激した23 1F1細胞の培養上清における前記の観察結果（図１）から予期されたように、免 疫ブロットで測定したとき、アフィニティー精製した調製物中の５５ｋＤａペプ チドはH-28ばかりでなく抗ＧＩＦとも結合した（図４Ｂ）。この知見と一致して 、ＧＩＦ生物活性は酸溶出画分の１：40希釈物中に検出されたが、この活性はH- 28 Affigelからの通り抜け画分の１：２希釈物中には検出できなかった。元の培 養上清中のＧＩＦ生物活性の滴定の結果、この培養上清中の50％より多くの活性 がH-28 Affigelの酸溶出画分中に回収されたことが示された。５５ｋＤａのペプ チドは調製物中でＧＩＦ決定基を有する唯一のペプチドである（図４Ｂ）から、 このＧＩＦ生物活性はこのペプチドに関連しているものと思われる。 ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡの安定なトランスフェクタントはトランスフェクトしてな い231F1細胞より多くの５５ｋＤａペプチドを産生した。この観察結果を確認す るために、231F1細胞を同じ手法で抗ＣＤ３で刺激し、その培養上清をH28-710-A ffigelで分画した。元の培養上清のＧＩＦ生物活性の大部分は免疫吸着剤からの 酸溶出画分中に回収されたが、この画分は免疫ブロットでｍＡｂのH28-710と抗 ＧＩＦの両者に結合する５５ｋＤａペプチドを含有していた。211α細胞と231F1 細胞から得られたアフィニティー精製した物質の連続２倍希釈物をウェスタンブ ロットで分析したところ、211α細胞で形成された５５ｋＤａペプチドは同数の2 31F1細胞が産生したものより約１０倍多いことが示された。ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡ のトランスフェクションがこのペプチドの生成を著しく高めたことは明らかであ る。 この５５ｋＤａペプチドがＴＣＲαｃＤＮＡの産物であることを確認するため に、６つのヒスチジン残基のペプチドをコードするヌクレオチド配列をＴＣＲα 鎖ｃＤＮＡの３′端に結合し（図２Ｂ参照。タグ−ＴＣＲαｃＤＮＡの３′端の ｎｔ配列）、このＴＣＲα−タグ遺伝子を231F1細胞にトランスフェクトした。 代表的な安定なトランスフェクタントとトランスフェクトしてない231F1細胞の 試料を抗ＣＤ３で刺激し、または刺激しないで培養した。濃縮した培養上清の一 部をNi-NTA Agaroseに吸着させ、カラムに保持されたタンパク質を100mMのイミ ダゾールで溶出して回収した。 図５に、231F1細胞中のＴＣＲα−タグ遺伝子の安定なトランスフェクタント によるＨｉｓ−タグを有する５５ｋＤａペプチドの産生の結果を示す。図５Ａに 示されているように、安定なトランスフェクタントＦ５、Ｆ１２およびＦ１５な らびにトランスフェクトしてない231F1細胞の試料を刺激なしに（−）または抗 ＣＤ３ｍＡｂで処理した後に（＋）培養した。培養上清を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥおよびH28-710による免疫ブロットによって分析した。抗ＣＤ３で刺激した 細胞の培養上清はＴＣＲα決定基を有する５５ｋＤａペプチドを含有していた。 図５Ｂでは、Ｈｉｓを含有するペプチドをNi-NTA agaroseを用いてアフィニティ ー精製し、溶出物をH28-710による免疫ブロットで分析した。安定なトランスフ ェクタント由来の５５ｋＤａをアフィニティー精製したが、231F1 細胞由来のペ プチドはNi-NTA agaroseに結合しなかった。 図５Ａに示されているように、抗ＣＤ３で刺激した細胞の培養上清はいずれも H28-710に結合する５５ｋＤａペプチドを含有していたが、刺激してない細胞の 培養上清にはこのペプチドは検出されなかった。この結果もまた、安定なトラン スフェクタント由来の５５ｋＤａペプチドがNi-NTA Agaroseに結合するが231F1 細胞由来の同じペプチドは結合しない（図５Ｂ）ことを立証していた。 Ni-NTA Agaroseの溶出物中の５５ｋＤａペプチドがH-28 Affigelから得られた ものと同じであることを確認するために、代表的な安定なトランスフェクタント Ｆ１２を抗ＣＤ３で刺激し、培養上清をNi-NTA AgaroseまたはH28-710とカップ ルしたAffigelで分画した。吸着剤に保持されたタンパク質をイミダゾールまた はグリシンＨＣｌバッファー（ｐＨ3.0）で溶出して回収し、免疫ブロットで分 析した。 図６は、231F1細胞中にＴＣＲα−タグ遺伝子を含む安定なトランスフェクタ ントがＨｉｓタグを有する５５ｋＤａペプチドを産生することを示す。Ｆ１２ク ローンを抗ＣＤ３で刺激し、培養上清をNi-NTA agaroseまたはH28-710 Affigel で分画した。カラムからの溶出物をモノクローナルH28-710またはポリクローナ ル抗ＧＩＦで免疫ブロットすることによって分析した。Ｃα決定基およびＧＩＦ 決定基を有する５５ｋＤａペプチドはNi-NTA agaroseとH28-710 Affigelの両者 の溶出画分で検出された。 図６に示されているように、どちらの調製物もH28-710およびポリクローナル 抗ＧＩＦに結合する５５ｋＤａペプチドを含有していた。予期された通り、培養 上清中のＧＩＦ生物活性の大部分がH-28 Affigelに結合し、酸溶出によって回収 された。また、Ni-NTA Agaroseからの溶出画分は元の培養上清中に存在していた ＧＩＦ生物活性の約1/2を含有していることも見出された。元の培養上清中に存 在していたＧＩＦ生物活性の残りの1/2はNi-NTA Agaroseに保持されず、通り抜 け画分に回収されるが、その溶出画分中の活性は夾雑物のためとは思われない。 というのは、100mMのイミダゾールで溶出する前に１mMのイミダゾールを含有す るＰＢＳでカラムをよく洗浄したからである。さらに、刺激してないＦ１２細胞 の培養上清中のＧＩＦ生物活性はNi-NTA Agarose中に保持されなかった。これら の結果は総じて、５５ｋＤａペプチドがＴＣＲα鎖ｃＤＮＡの産物であること、 およびＧＩＦ生物活性がこのペプチドに関連していることを示している。 実施例５ ５５ｋＤａペプチドは抗原特異的ＧＩＦのサブユニットである ５５ｋＤａペプチドが実際に抗原特異的ＧＩＦであるか否かを決定するために 実験を行なった。安定なトランスフェクタント211α細胞を抗ＣＤ３で刺激し、 培養上清をH28-710とカップルしたAffigelカラムで分画した。予期した通り、Ｔ ＣＲα決定基を保有する５５ｋＤａのペプチドは免疫吸着剤に結合し、酸性ｐＨ の溶出によって回収された。次にこの酸溶出物をＯＶＡとカップルしたSepharos eで分画した。H-28 Affigelから溶出した画分中のＧＩＦ生物活性の約2/3〜3/4 がＯＶＡ-Sepharoseに結合し、酸溶出によって回収された。ＯＶＡ-Sepharoseか らの酸溶出物と通り抜け画分の免疫ブロット分析によって、５５ｋＤａペプチド が溶出画分中で検出可能であるが、通り抜け画分は酸溶出画分より実質的に多く の５５ｋＤａペプチドを含有していた。この結果が示しているのは、５５ｋ Ｄａペプチドは抗原特異的ＧＩＦのサブユニットであるが、安定なトランスフェ クタントから放出されたペプチドの一部はＯＶＡ-Sepharoseと結合できなかった ということである。 231F1細胞に由来する抗原特異的ＧＩＦは抗ＴＣＲα鎖ばかりでなくAffigelと カップルしたｍＡｂ抗ＴＣＲβ鎖、すなわちH-57-597(Iwata，et al.，J．Immun ol.，143:3917，1989)とも結合するので、抗ＣＤ３で刺激した211α細胞の培養 上清をH57-597とカップルしたAffigelカラムで分画した。免疫吸着剤に保持され たタンパク質を酸溶出によって回収した。通り抜け画分をH28-710-Affiに吸着さ せ、抗ＴＣＲα免疫吸着剤に結合したタンパク質を回収した。抗ＴＣＲβ（レー ン１）および抗ＴＣＲα（レーン２）の溶出画分をH28-710を用いた免疫ブロッ トによって分析した。予期した通り、元の培養上清中のＧＩＦ生物活性の大部分 （70〜80％）がH-57-597カラムからの酸溶出画分中に回収され、この画分はウェ スタンブロット分析においてｍＡｂのH-28に結合する５５ｋＤａバンドを含んで いた（図７）。しかし、ｍＡｂのH-57-597はこの画分の免疫ブロット分析におい ていかなるペプチドも検出できなかった。そこで、H57-597-Affigelからの通り 抜け画分をH28-Affigelに吸着させ、カラムに保持されたタンパク質をＧＩＦ生 物活性および免疫ブロットに関して評価した。結果は、明らかに、かなりの量の H-28+５５ｋＤａペプチドがH-57-597に結合するがH28-710とカップルしたAffige lには結合しなかったことを示している。しかし、この画分のＧＩＦ生物活性はH -57-597-Affigelからの溶出物に存在するもののほぼ1/4〜1/3であった。この結 果が示唆しているのは、５５ｋＤａペプチドのマイナーな部分がH57-597と反応 する別のペプチドと複合体を形成しているが、211α細胞から分泌された５５ｋ Ｄａペプチドのかなりの部分はこのペプチドと関連していないということである 。特定の理論に縛られるつもりはないが、抗ＴＣＲβ抗体と結合するこのペプチ ドは５５ｋＤａのＧＩＦが抗原に結合するのに必要であるらしいと推定される。 以上、本発明を現時点で好ましい具体例に関して記載して来たが、本発明の範 囲を逸脱することなくさまざまな修正をすることが可能であるものと理解された い。したがって、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである 。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                    Preparation of antigen-specific glycosylation inhibitor   This invention is a government of Approval No. AI11202 awarded by the National Institutes of Health. With assistance, the U.S. Government has certain rights in the invention. You.Background of the Invention 1. Field of application of the invention   The present invention relates to the immune response in a broad sense, and particularly the suppression of the immune response to a specific antigen. The present invention relates to an antigen-specific glycosylation inhibitor (AgGIF) which is useful for the present invention. 2. Description of related technology   For some time, immunologists have been trying to find mechanisms that regulate the immune response. The immune system is being studied. Because of this, the immune response is reduced or increased non-specifically. Various drugs and protocols are used. But this kind of adjustment is satisfactory It doesn't work. Because this kind of regulation affects the whole immune system And individual elements of the immune system that allow antigen-specific modulation of the immune response It is not a matter of understanding. For example, in the treatment of allergies Immune response to specific allergens without compromising the individual's overall immune system May be advantageously suppressed.   Introduction of a foreign antigen into an individual leads to two major components: the functional function of lymphocytes. Cells mediated by different populations (referred to as T cells and B cells, respectively) An immune response is generated consisting of vesicular and humoral immunity. T cells are in the immune system Produce lymphokines that "help" or activate a variety of other cell types. And respond to antigenic stimulation. In addition, certain T cells may have cytotoxic effectors. Can be a human cell. On the other hand, the response of B cells is mainly Consists of an antibody that is a secreted product that binds.   The salient features of both B-cell and T-cell responses are sensitive to antigens for immunization. Although specific, the mechanism of antigen recognition is different. Antibodies are also available on solid surfaces Binds directly to antigens in solution, whereas T cells look like the surface of antigen presenting cells. Reacts only with antigens present on a solid phase. These antigens also have major histocompatibility Association with class I or class II molecules encoded by the gene complex (MHC) Must be presented to the T cells in the process. This MHC is a variety of immunological functions Refers to a series of genes encoding proteins having Class I gene The product is found on every cell and is a major transplant rejection target. Class II remains Most of the gene products are expressed in cells of various hematopoietic lineages, Involved in cell interactions. Both class I and class II proteins are anti- It has also been shown to function as a receptor for antigens on the surface of primitive presenting cells .   In 1970, Gershon and Kondo (Immunology 18: 723, 1970) ruled out T cells. It was proposed that the course of the epidemic response could also have a negative effect. This immunity The idea of regulation was initially skeptical, but then became antigen-specific in a wide range of experimental systems Suppressor T cells (Ts) have been reported (Green, et al., Ann. Rev. Immunol. 1: 439-463, 1983; Dorf and Benacerraf, Ann. Rev. Immunol. 2: 127- 158, 1984).   Attempts to get an overview of the mechanism of Ts action resulted in T cell culture supernatants. Several soluble mediators have been discovered. So, the function of Ts Is a T suppressor factor (TsF) that acts on other T cells and B cells. It was hypothesized that it would be fulfilled by the release. Based on the experimental data, An elaborate model that explains the complex interactions of various Ts subsets with their TsF Dell has been proposed (Asherson, et al., Ann. Rev. Immunol. 4: 37-68, 1986).   Specific cell surface markers for different functional subsets of T cells have been identified Therefore, a search for Ts and their unique markers for TsF was performed. First First, studies of the Ts cell phenotype can make them cytotoxic (cytotox ic potential) expresses CD8 (Lyt-2), a marker common to T cells It was shown that. 1976, structures specifically expressed by mouse Ts (Murphy, et al., J. Exp. Med. 144: 699, 1976; Tada, et al., J. Am. Exp. Med., 144: 713, 1976). Code this antigen Genes that have been identified in the mouse MHC as IEα and IE It was found to be in the I region during β. This locus is named IJ Was.   In the early 1980s, the field of cytoimmunology began to shift from phenomenology to molecular characterization Was. As a result of this transition, T cell receptor (TCR) characterization and various lymphokine Numerous discoveries have been made, such as identification and the three-dimensional structure of MHC proteins. I However, the application of molecular cloning techniques to the study of T cell-mediated suppression is also fruitful Some results were not obtained. For example, biochemically purify TsF until it is homogeneous Attempts have been made with little success. The mouse MHC I region gene When isolated and sequenced, enough DNA to carry the IJ gene was found to be IEα And appeared not to be between I-Eβ. In addition, many T cell clones and T cells Inspection of TCRβ gene rearrangement in vesicular hybridoma revealed that helper T Only cells and cytotoxic T cells contain such rearrangements, whereas All tested Ts are negative and Ts may not express a functional receptor (Hedrick, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 531-535, 1 985).   The specificity of the response of T and B cells to antigens depends on the characteristics expressed by these cells. This is the function of a receptor. It has been discovered that B cells secrete this receptor in the form of antibodies. When viewed, B cell receptor research evolved rapidly. Plasmacytoma, monochrome Tumors naturally occurring in antibody-producing cells with a monoclonal in origin It is. These tumors were first identified in the isolation of antibody molecules and characterization of their structure. It became a continuous source of the homogeneous protein used (Potter, Physiol. Res. 52: 631-710, 1972). Now, the cell surface form of an antibody contains a transmembrane anchor domain. Except that they are identical to their membrane-bound counterparts. (Tonegawa, Nature 302: 575-581, 1983).   On the other hand, early studies on TCR did not detect the secreted form of TCR. However, approaches using soluble antibodies have not been available effectively. In addition, T cells Analysis of TCR becomes more difficult with the discovery of MHC restriction in antigen recognition (Zinkernagel and Doherty, Nature 248: 701-702, 1974). at the time Asks whether a single TCR is responsible for binding to both antigen and MHC, Is 2 There was debate as to whether two separate receptors were involved. But obviously What was thought was that the TCR was not likely to be the same as the B cell receptor. It was that.   In the 1980's, monoclonal antibodies, recombinant DNA technology and antigen-specific T cells The development of long-term vesicle culture methods has greatly facilitated the identification of TCRs. T cell Monoclonal antibodies raised against the loan population are specific for immune T cells only (Allison, et al., J. Immunol. 129: 2293, 1982; Ha). skin, et al., J. Exp. Med. 157: 1149, 1983; Samelson, et al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA 80: 6972, 1983). Using these clone-specific antibodies, T When the cell membrane was immunoprecipitated, the molecular weight was 46,000 daltons by SDS-PAGE. Band was discovered. 90,000 dalton band under non-reducing conditions Was detected, suggesting a dimeric structure of the TCR. Subsequent experiments show that the functionality TCR consists of two disulfide-linked glycoproteins called α and β (Marrack and Kappler, Science 238: 1073-1079, 1987). At about the same time, the complementary DNA encoding the α and β chains (CDNA) clones have been isolated in humans and mice (Hedrick, et al., Natu re 308: 149-153, 1984; Hedrick, et al., Nature 308: 153-158, 1984; Yanagi , Et al., Nature 308: 145-149, 1984). By analyzing the sequence of this cDNA, Coding sequence is formed by rearranged gene segments similar to antibody genes It was proved that. When these α and β genes are transferred to recipient cells, It has been shown to be necessary and sufficient to confer specificity and MHC restriction (Dembic , Et al., Nature 320: 232-238, 1986). That is, the TCR of the heterodimer is It appears to be involved in recognizing the combination of antigen and MHC. α variable area And β variable regions suggest that they are prone to recognize antigen and MHC, respectively (Kappler, et al., Cell 49: 263-271, 1987; Winoto, et al., Nat. ure 324: 679-682, 1986; Tan, et al., Cell 54: 247-261, 1988), but recognition is acceptable Other studies have suggested that it is a property that emerges from the whole body (Kuo and Hood, Proc. Natl. . Acad. Sci. USA 84: 7614-7618, 1987; Danska, et al., J. Am. Exp. Med. 172: 27 -33, 1990). CD3 is non-covalently bound to the TCR and is occupied by the TCR (o ccup ancy) induced transmembrane signaling events leading to T cell activation Complex of the resulting polypeptide (Clevers, et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 629). , 1988). Direct stimulation of CD3 by antibodies mimics the normal pathway of T cell activation (Meuer, et al., J. Exp. Med. 158: 988, 1983). CD3 For transport to the surface of T cells, this is combined with the complete heterodimeric TCR complex intracellularly. An association is required. In addition, α and β chains of TCR and C Complexes with D3 polypeptides have also been demonstrated to be assembled in the endoplasmic reticulum (M inami, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2688-2692, 1987; Alarcon, e t al., J.S. Biol. Chem. 236: 2953-2961, 1988). Precisely formed complete receptor TCR / CD3 is then transported to the cell surface as a functional unit. Imperfectly The assembled receptor complex is degraded in the endoplasmic reticulum or released via the Golgi apparatus. It is transported to the sosome, where it is degraded. Therefore, not combined The α and β chains usually do not appear to be accessible outside the T cell. Complete TC Even α and β receptors for R cannot be easily detected in extracellular secreted form . Conventionally, these functions in antigen recognition are located on the surface of T cells and of heterodimers. It was thought to be limited to form.   It is now clear that the αβ TCR is expressed by most functional T cells It is. A second type of TCR consisting of a γδ heterodimer has been identified, , These receptors are expressed on a small number of peripheral T cells and have a role in their antigen-specific recognition. Involvement has not yet been proven. Structurally, T cells αβ and γδ receptors are primary High homology with antibody molecules in sequence, gene organization and DNA rearrangement mode (D avis and Bjorkman, Nature 334: 395-402, 1988). However, T cell antigen receptors Antibodies differ from antibodies in two important respects. That is, the TCR is found only on the cell surface, Recognizes antigen only in the context of MHC encoded molecules.   Recent studies show that TCRs may be excreted or released from cells (Guy, et al., Science 244: 1477-1480, 1989; Fai rchild, et al., J. Immunol. 145: 2001-2009, 1990). But secreted that way The resulting molecule is a complete TCR, a partial fragment, or Other molecules with differentially reactive epitopes have not been proven. In this specification Prior to the findings demonstrated in the described examples, a functionally active TCRa chain was The view that it can be released from T cells independently of the TCR component is controversial and suspicious. Was leaning. Klausner et al. Reported that TCRα was small unless complexed with CD3δ. Is retained in the endoplasmic reticulum and decomposed there (Bonifacino, et al., Science 2 47: 79-82, 1990) and transported to the cell surface as part of the CD3-TCR complex. Untransferred TCRa was shown to be degraded in the lysosome (Minami, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2688-2692, 1987). These observations indicate that T It is against the pathway by which CRα can be released from cells. Also retained in the ER Research on the TCRβ that is degraded there, It has been suggested to be more complex (Wileman, et al., Cell Regulation 1: 907-919, 1990). For example, SCID mice expressing the TCRβ transgene In the immature thymus in the absence of the TCRα and CD3 components It is expressed on the surface of cells (Kishi, et al., EMBO J. 10: 93-100, 1991). Also, V A truncated TCRβ chain gene containing only the DJ and Cβ1 domains was constructed. , Such molecules were secreted despite the expectation that they would be degraded (Gascoigne , J. et al. Biol. Chem. 265: 9266-9301, 1990). That is, some cells have a TCR Truncation, possibly as a complex with other unidentified molecules and / or after translation It was possible that a small amount could be released in a given form.   In some experiments, unidentified soluble regulators that react with antibodies to TCRa The presence of one or more has been reported. For example, a synthetic polypeptide antigen, Li 18, Plus IAdCD4 specific for+Helper T cell hybridoma Cell-free immunomodulatory activity was detected in the in vitro assay of A1.1. This cause Good antigen specificity of the offspring corresponded to that of the T cell hybridoma (Zheng, et al., J. Amer. Immunol. 140: 1351-1358 1988). Corresponding to Vα and Vβ of TCR Antisense oligonucleotides specifically inhibit cell surface TCR-CD3 expression Although it was found to be harmful, it was V that inhibited the production of the soluble regulatory activity of A1.1. Vβ (or control oligonucleotide) ) Did not inhibit (Zheng, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3758-376). 2, 1989). In a very recent study, the antigen-specific regulatory activity of A1.1 It is bound and eluted to a monoclonal antibody column specific for α, and metabolically labeled. The supernatant was separated as a protein having a molecular weight of 46,000 daltons. this The activity is not linked to anti-TCRβ antibody, anti-TCR Vβ antibody or anti-CD3ε antibody. (Bissonnette, et al., J. Immunol. 146: 2898-2907, 1991). TC Ts activity sharing the Rα chain determinant but not derived from the surface TCR has been reported. But not characterized (Collins, et al., J. Immunol. 145: 2809-2812, 199). 0). Takeda et al. (J. Immunol. 145: 2846-2853, 1990) also share the TCR α chain determinant. But report THC activity restricted to MHC. In contrast to these results Fairchild (J. Immunol. 145: 2001-2009, 1990) reacts with anti-TCR Cα DNP-specific Ts factor that reacts with anti-Vβ antibody and anti-TCR-β antibody Report a child. Prior to the findings described herein, the observed antigen-specific Identify the role of TCRa as a soluble immunomodulatory mediator involved in nodal activity There is nothing fixed or elucidated.   3 to replace or delete the TCR transmembrane region for the production of a soluble TCR molecule Tried three major strategies. The most direct approach is to add a translation stop codon to the TCR introduced upstream of the α or TCRa / β dimer. Transfected with cDNA In COS-1 cells, COS-7 cells or Hela cells, TCRa is Golgi. It is reported to be rapidly degraded in non-lysosomal compartments before entering the device (Wil eman, et al. Cell. Biol., 110: 973-986, 1990; Lippincott-Schwartz, et.  al., Cell, 54: 209-220, 1988; Baniyash, et al., J. Am. Biol. Chem., 263: 9874 -9878, 1988; Bonifacino, et al., Science, 247: 79-82, 1990; Bonifacino, e t al., Cell, 63: 503-513, 1990; Manolios, et al., Science, 249: 274-277, 1 990; Shin, et al., Science, 259: 1901-1904, 1993). In the second strategy, TC Placental alkaline phosphatase for extracellular V and C domains of R α and β chains Glycosyl-phosphatidylinositol membrane anchor of ze or Thy-1 molecule (Shuffle) (Lin, et al., Science, 249: 677-679, 1990; Slanetz, et.  al., Eur. J. Immunol., 21: 179-183, 1991). Corresponding lipid-bound TCR polypeptide Peptides treat cells with phosphatidylinositol-specific phospholipase C Is released from the membrane in a soluble form and the solubilized TCRαβ heterologous Dimers react specifically with anti-clonal clonotypic monoclonal antibodies Was shown. However, the yield of released TCR polypeptide is too low However, this molecule could not be applied for clinical use. The third approach is TC R and the constant region of immunoglobulin (Gregoire, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 88: 8077-8081, 1991; Weber, et al., Nature, 356: 793-796, 1992) or C Hybridization with D3 zeta chain (Engel, et al., Science, 256: 1318-1321, 1992) To produce the protein by genetic engineering. These fusion proteins Is secreted into the medium by transfection of myeloma or leukemia cells. All of these soluble TCRs are serologically equivalent to the corresponding cell surface-bound TCRs. It was shown to carry the epitope to be detected. However, these fusion tags The proteins show low affinity antigen recognition and may be immunogenic. But Despite all the work that has been done on the role of TCRa, Prior to the invention, TCRα was a member of other TCR subunits, such as part of the membrane-bound TCR. And was known to exist.   One example where the immune response is suppressed is in the treatment of allergies. Allerge IgE antibodies to arginine cause hay fever and other allergies such as exogenous asthma. -Has been established to be involved in sexually transmitted diseases. Ig in allergic diseases Due to the critical role of E antibodies, regulation and suppression of IgE antibody production against allergens The possibility has emerged that control is one of the fundamental treatments for allergic diseases. Was For example, the serum of hay fever patients who are sensitive to ragweed allergens IgE antibodies to allergens are detected. This IgE antibody titer is in the pollen season After rising after the knot, it drops slightly during the rest of the year. IgE in serum Has a half-life of only a few days, so a sustained IgE antibody titer If these antibodies are not exposed to the allergen, Indicates that they are continuously synthesized.   Control IgE antibody response in laboratory animals over the past 20 years Several different attempts were made to do so. One approach is allergy Classical immunotherapy, or desensitization treatment, in which a small amount of allergen is repeatedly injected into the elderly It is an improvement. This desensitization procedure may improve clinical symptoms in some patients. IgG antibody titers in serum of hay fever patients decreased after this treatment. Did not. The main immunological effect of this treatment is to increase the formation of IgE antibodies. To suppress the rise in IgE antibody titers after the pollen season. You.   The limitation in desensitization or immunosuppressive treatment is that patients have large Rugen cannot be tolerated. To overcome this difficulty, therapeutic urea Chemical modification of denatured antigens or antigens such as polyethylene glycol (PEG) conjugates Attempts have been made to use allergens. This modified antigen is Relatively large amounts of modified antibodies without allergic symptoms The original can be injected. However, modified antigens can stimulate antigen-specific T cells. Can be. Injection of modified antigen into mice intravenously resulted in primary I against natural antigen There is evidence that antigen-specific suppressor T cells have been generated that suppress the gE antibody response. Obtained. However, when he started this treatment after the antibody titer reached its maximum, Treatment had minimal effect on ongoing IgE antibody formation (Takatsu and I shizaka, J.S. Immunol., 117: 1211, 1976). Consistent with observations in mice, flowers Clinical trial of allergen conjugated to polyethylene glycol in hay fever patients Thus, it was shown that this treatment did not reduce IgE antibody titers. Modified anti Probably, the failure to suppress ongoing IgE antibody formation by repeated injections of the original This may be due to the relatively large amount of antigen-specific helper T cells present in allergic patients. U. Modified antigens not only trigger the generation of antigen-specific suppressor T cells And expand the population of helper T cells, so the latter effect of this treatment is suboptimal. It may have exceeded the effect of Lesser T cells. This interpretation is antigen-specific Ongoing IgE antibody formation upon introduction of suppressor T cells into immunized mice (Takatsu and Ishizaka, J. Im munol., 117: 1211, 1976). The collective suggestion of these results is that helpers Generating antigen-specific suppressor T cells without expanding the T cell population If possible, suppress persistent IgE antibody formation in hay fever patients That is possible.   Two types of T that have affinity for IgE and selectively regulate IgE synthesis Cellular factors have already been discovered. One IgE binding factor (IgE-BF) While selectively increasing the IgE response, other types of IgE-BF select that response. Selectively suppress. The main difference between this IgE enhancer and the IgE suppressor is that It appears to be the carbohydrate portion of the molecule. IgE enhancer is lentil lectin And IgE inhibitors bind to these lectins No (Yodoi, et al., J. Immunol., 128: 289, 1982). IgE enhancer or Analysis of cellular mechanisms for the selective production of IgE repressors Cloning of IgE enhances IgE enhancer and IgE repressor Carrying the gene and the carbohydrate portion and biological activity of these factors Sex properties have been shown to be established during the post-translational glycosylation process (Martens, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., U.S.A., 84: 809, 1987). Under physiological conditions This glycosylation process is triggered by two T cell factors that enhance or inhibit this process. Controlled. These factors include glycosylation inhibitor (GIF) and It is called glycosylation enhancing factor (GEF).   A unique property of GIF is its biochemical activity. This lymphokine is a lipomode Monochrome against lipomodulin (phospholipase inhibitory protein) Binds to a null antibody (Uede, et al., J. Immunol., 130: 878, 1983). Also, GI The major source of F is antigen-specific suppressor T cells (Ts) (Jadieu, et al., J. Immunol., 133: 3266, 1984). Oval Subsequent Fruit for Bumin (OVA) -Specific Suppressor T Cell Hybridoma Experiments showed that these hybridoma cells were pulsed with antigen (OVA) to obtain syngeneic macro cells. When stimulated by phage, GIF (antigen binding Sex GIF). However, OVA with the same hybridoma GIF with no affinity for it (non-specific GIF) was constitutively secreted. Non-special Studies of the association of the heterologous GIF with the OVA binding GIF indicate that this antigen binding GIF Is shown to be composed of an antigen-binding polypeptide chain and a non-specific GIF. (Jardieu and Ishizaka, in Immune Regulation By Characterized Polypepti des, Goldstein, et al., eds., Alan R. Liss, Inc., NY, p595, 1987). Ma In addition, this antigen-binding GIF has been described as an antigen-specific sub-supplement by other researchers. It has an antigenic determinant common to Lesser T cell factor (TsF), and It has also been found that it specifically suppresses the antibody response. In addition, antigen binding GIF In addition, antigen-specific TsF described by other researchers was also -Binds to immunosorbents coupled with lipomodulin (141-B9) and Was recovered by elution from an immunosorbent (Steele, et al., J. Immu). nol., 142: 2213, 1989).   Despite the serious limitations of desensitization in the treatment of allergies, this technique remains This is the method that is often selected. Therefore, it is antigen-specific but extant There is a particular need for techniques that do not have the side effects seen with desensitization therapy.   Preventing host versus graft rejection (HVG) and graft versus host rejection (GVH) It is essential to suppress the immune response. Unfortunately, even in autoimmune diseases, HVG And GVH also have limited efficacy in suppressing the immune response, and Use highly toxic drugs that work systemically, not unusually. Such treatment Due to the strict restrictions of the law, immunosuppressants with lower toxicity but higher specificity is necessary. The present invention provides a means for accomplishing this.Summary of the Invention   The discovery underlying the present invention is that the binding directly to an antigen and the TCRa in the formation of antigen-specific GIF (AgGIF) AgGIF is an expression product of the TCRa chain gene. That is. Previously, certain TCRas were identified as a single polypeptide. It is not known to confer specificity to non-specific GIF after expression Was. Accordingly, the present invention relates to polynucleic acids encoding antigen-specific GIF polypeptides. Methods for isolating leotide and substantially pure antigen-specific GIF polypeptides A method for isolation is provided for the first time.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   1A, 1B and 1C show antigen-specific GIFs derived from Ts hybridomas. 2 shows an immunoblot analysis of.   2A and 2B show the nucleotide sequence of the TCRa chain cDNA and the deduced FIG. 2C shows the nucleotide sequence of the mouse GIF cDNA. FIG. 2D shows the nucleotide sequence of human GIF cDNA. 1 shows the reotide sequence and the deduced amino acid sequence.   FIG. 3 shows the results from stable TCRa chain cDNA transfectants. Figure 5 shows an immunoblot analysis of the incoming TCRa chain.   4A and 4B show culture supernatants from TCRa chain transfectants. 3 shows an immunoblot analysis.   5A and 5B show His-t derived from TCRa chain transfectants. Figure 5 shows immunoblot analysis of 55kD antigen-specific GIF using ag.   FIG. 6 shows an immunoblot of TCRa-tag gene transfectants. .   FIG. 7 shows an immunoblot of 211α cells stimulated with anti-CD3. Lane 1 Indicates the eluted fraction after anti-TCRβ, and lane 2 indicates the eluted anti-TCRa.Detailed description of the invention   The present invention provides for the production, isolation and production of antigen-specific GIF for the modulation of antigen-specific immune responses. And use. For example, specific for the corresponding antigen and antigen-specific suppression Hypersensitivity reaction, autoimmune reaction and graft rejection using antigen-specific GIF that induces Abnormal reaction can be suppressed.   The present invention has non-specific GIF and both antigen-binding and immunomodulatory activities TCR α chain (not a complete T cell surface antigen receptor consisting of α and β) Pertains to polypeptides. Antigen-specific GIF (AgGIF) Antigen-binding GIF-TCRa protein with regulatory activity is produced by various methods can do. For example, based on a known amino acid sequence, And / or expression of AgGIF protein by chemical synthesis. Wear. Alternatively, A from the culture supernatant of a continuous T cell line releasing this active agent gGIF can be purified directly. While not intending to be bound by any particular theory, The GIF and TCRa chains can be transcribed from a single polynucleotide or simultaneously. It appears to be transcribed and translated from two or more polynucleotides to be translated. the latter In this case, the two polypeptides can be combined to form AgGIF.   In one embodiment, the present invention provides for the activation of suppressor T cells (this activity Induces expression of the AgGIF gene in T cells), a suppressor Hybridizing a T cell polynucleotide with a non-specific GIF polynucleotide Hybridizes with the oligonucleotides and TCRα polynucleotides Contacting the oligonucleotide with a non-specific GIF oligonucleotide and TC Isolate a polynucleotide that hybridizes to both Rα oligonucleotides A polynucleotide encoding an AgGIF polypeptide (one Or more than one).   The term "activation" refers to stimulating T cells to induce the production of AgGIF Point to. Activation of suppressor T cells crosslinks CD3 or T cell surface receptors Preferably, or the cells are exposed to syngeneic macrophages pulsed with antigen. The antigen in this case is an antigen to which AgGIF binds.   The method of isolating a polynucleotide encoding an AgGIF polypeptide comprises: DNA or RNA of T suppressor cells is specifically hybridized with non-specific GIF. Hybridizes with oligonucleotide probe and TCRa chain to be hybridized Contacting with an oligonucleotide probe. In particular, AgGIF The polynucleotide to be loaded is an oligonucleotide derived from the constant region of the TCRa chain. Hybridizes with the probe. Encodes the AgGIF described herein By isolating the polynucleotide (where "contacting" means nucleic acid hybridization) If a suitable probe is available, any probe derived from any organism can be used. AgGIF gene sequence can be isolated. For example, GIF or Oligonucleotide sequences corresponding to part of the sequence encoding the constant region of the TCRa chain Lobes can be chemically synthesized. This requires a short amino acid sequence. The rigopeptide linkage must be known. Of such screening If the hybridization is mRNA, single-stranded DNA or denatured double-stranded It is preferred to work with DNA. Hybridization is performed using the desired polypep CDNA cDNA derived from a source in which mRNA sequences related to This is particularly useful for loan detection. In other words, to avoid non-specific binding The use of stringent hybridization conditions for Hybridize a single probe, the perfect complement in a mixture, with target DNA Autoradiography of specific cDNA clones (Wallace, et al., Nucl. Acid Res., 9: 879, 19). 81).   The GIF probe has the sequence shown as SEQ ID NO: 1 or 3 (FIG. 2C or Mouse or human GIF polynucleotide shown in 2D. These are each Mouse or human GIF nucleotide sequence). New One of skill in the art will be able to hybridize to the putative AgGIF polynucleotide. To determine suitable oligonucleotides that can be used as probes for And will be able to. For hybridization to the constant region of TCRa chain The oligonucleotide probe used is SEQ ID NO: 5 (corresponding to the constant region of the TCRa chain). Preferably). Probe length is about 15-25 nuclei Otides are preferred, but are specific under stringent conditions. Design longer or shorter probes if possible Can be.   The polynucleotide encoding AgGIF isolated by the method of the invention is D NA or RNA may be used. For example, this polynucleotide may be genomic DNA It may be cDNA or messenger RNA. Messenger for cDNA preparation Both the RNA (mRNA) and AgGIF genomic sequences produce the desired AgGIF. It can be obtained from living cell sources. As part of the discovery of the present invention, AgGIF That the genomic sequence cannot be obtained from unactivated cell sources Is now clear. Without intending to be bound by any particular theory, antigen stimulation The rearrangement or translocation of the GIF gene or the TCRa chain gene Are placed in close proximity and transcribed as a single molecule, resulting in TCRa Seem to confer antigen specificity on the AgGIF polypeptide.   Any polynucleotide encoding all or part of the fusion polypeptide , The cleavage product of which encodes a polypeptide having the biological activity of AgGIF Insofar, it should be understood that they are encompassed by the present invention. With such a polynucleotide These include naturally, synthetically or intentionally manipulated polynucleotides. For example , AgGIF polynucleotides can be subjected to site-directed mutagenesis. This polynucleotide sequence also contains the antisense sequence and the resulting consequent genetic code. Heavy Are included. There are 20 natural amino acids, most of which are 2 Defined by one or more codons. Therefore, no degenerate nucleotide sequence Again, the amino acid of the fusion polypeptide encoded by the nucleotide sequence. As long as the amino acid sequence does not change functionally, it is included in the present invention.   The present invention also provides a polynucleotide complementary to the nucleotide sequence of the present invention. I do. A "complementary" nucleotide sequence is one in which the complementary sequence is hybridized. Hybridizes under specific conditions with a particular nucleotide sequence. These conditions include Temperature, pH, buffer and nucleotide composition are included. For example, double-stranded D The plus and minus strands of the NA molecule are complementary nucleotide sequences. Of the present invention The polynucleotide includes a genome encoding the desired AgGIF polypeptide. At least 15 bases in length that selectively hybridizes to DNA, typically 1 Fragments longer than 8 bases are included. Selective hybridization is Conditions that avoid non-specific binding of the nucleotide sequence to its complement, the target DNA (Eg, pH, temperature, buffer).   The hybridization method uses a labeled mixed synthetic oligonucleotide probe. This is useful for screening of recombinant clones using the same. In this case, each The probe is a hybridization probe containing a heterogeneous mixture of denatured double-stranded DNA. It may be a perfect complement of a specific DNA sequence in the solution sample. like this In the case of screening, hybridization may be single-stranded DNA or denatured. It is preferably performed on double-stranded DNA. Hybridization is the purpose MRNA sequence related to the target polypeptide is derived from a very small amount of raw material This method is particularly useful in the detection of cDNA clones. In other words, non-specific conclusions Use stringent hybridization conditions to avoid hybridization And, for example, a single probe whose target DNA is its perfect complement in a mixture Specific cDNA clones by hybridization with It can be visualized by triradiography (Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9: 879, 1981).   For DNA sequence synthesis, the entire sequence of amino acid residues of the desired polypeptide product is known. Is often the method of choice. Amino acids of the desired polypeptide product If the entire sequence of residues is not known, direct synthesis of the DNA sequence is not possible and The method performed is the synthesis of a cDNA sequence. A target for isolating the cDNA sequence of interest Some of the standard methods are abundant in donor cells with high levels of gene expression Plasmid or phage carried, induced by reverse transcription of mRNA There is the formation of a library of cDNAs. Used in combination with polymerase chain reaction technology In use, even rare expression products can be cloned. Polype If a significant portion of the amino acid sequence of the peptide is known, DNA / DNA hybridization performed on cloned copies of existing cDNAs In the hybridization method, a sequence presumed to be present in the target cDNA is Preparation of labeled single- or double-stranded DNA or RNA probe sequences to replicate Can be used (Jay et al., Nucl. Acid Res. 11: 2325, 1983).   A cDNA expression library such as lambda gt11 is Expression of the polypeptide using an antibody specific for that polypeptide. And can be screened indirectly. Such antibodies are polyclonal Or monoclonally derived, and its c Detecting expression products indicative of the presence of the protein encoded by the DNA Can be used for   The DNA sequence encoding the AgGIF polypeptide of the present invention can be transferred to a suitable host cell. It can be expressed in vitro by transferring DNA. "Host cells "Is a cell in which the vector can grow and express its DNA. Ma The term also includes the progeny of the host cell. Mutations occur during replication Therefore, not all progeny may be the same as the parent cells. However, the use of the term "host cell" also includes such progeny Is done. The method of stable transfer, ie, the continuous maintenance of foreign DNA in the host, is Known in the art.   As a source of sequences encoding antigen-specific GIF and / or cDNA Using T cells to prepare libraries or genomic libraries Can be. In addition, some lymphoid organs (eg, spleen, lymph nodes, thymus, And peripheral blood lymphocytes) for grinding and extracting DNA or RNA Can be used as Alternatively, with a convenient source of DNA or RNA Alternatively, a T cell line can be used. Gene containing AgGIF coding sequence Use of engineered microorganisms and cell lines as a convenient source of DNA for this purpose Can be.   As a source of AgGIF for use in the method of the invention and / or Antigen specific that can be used as a source of genetic material used to produce F T cells are generated and selected by several in vitro techniques well known in the art. be able to. Sources of T cells are peripheral blood, lymph nodes, spleen, and other lymphoid organs Organs, or tissue sites where T cells infiltrate, such as tumor nodules. T The cell fraction is subjected to density gradient centrifugation or a method such as CD2, CD3, CD4, Cell types using antibodies to T cell surface markers such as Can be separated from These methods include panning, affinity There are chromatography, flow cytometry, magnetic bead separation, etc. It is not limited to them. Use antibodies against markers not expressed by T cells Or utilizing non-T cell membrane properties such as adhesion to various substrates. A negative selection method that enriches T cells by removing cell populations can also be used. You. In addition to the above techniques, we select helper T cells and cytotoxic / suppressor T cells. More specific markers such as anti-CD4 and anti-CD8 respectively Antibodies to markers expressed on T cell subsets (subgroups) such as memory cells Can be used to further select T cell subsets of interest.   To generate antigen-specific T cell lines in vitro, appropriate irradiated antigen-presenting cells must be used. Repeated stimulation with optimal concentrations of specific antigens in the presence of cells and cytokines Good. Antigen presenting cells should be obtained from autologous or MHC compatible sources. B, transformed with macrophages, dendritic cells, Langerhans cells, EBV It can be a cell or unseparated peripheral blood mononuclear cell. Natural cytokines Or various interrogations such as recombinant interleukins 1, 2, 4 and 6 Ichin can be included. One such technology, for example, Takata, et  al., J. et al. Immunol. 145: 2846-2853, 1990.   A clonal population of antigen-specific cells consists of irradiated feeder cells, antigens and cytokines. By T cell cloning using the limiting dilution cloning method in the presence of Can be guided. Alternatively, the T cell hybridoma is an antigen-specific T cell HAT selection and re-fusion after fusion with a fusion partner tumor line such as BW5147 or BW1100 It can be produced by cloning. Antigen-specific T cells Cloned and propagated using a monoclonal antibody against CD3 Came. T cell clones and T cell hybridomas are obtained directly from in vivo sources Cells, and then confirm them prior to the cloning and fusion procedures. Testing and selection against the retained antigen-specific T cell line can be performed. T Cell clones were obtained by repeated stimulation with antigen or anti-CD3 every 7-14 days. Can be maintained for a long time, and then can be increased by cytokines. Can be. On the other hand, T cell hybridomas undergo periodic antigen stimulation in a suitable medium. It can be grown without litter. Antigen-specific reactivity of T cell clones (A gGIF) was screened by methods known in the art, including ELISA. To   AgGIF-producing Ts hybridomas are based on the cDNA encoding this factor. Preferably, it is a source. Antigen-specific T cell factor has a certain epitope specificity It is known that it is derived from a T cell clone having the same (Iwata, et al., J. Imm. unol., 143: 3909, 1989; Yamaguchi, et al., Intl. Immunol., 1: 337, 1992; M ori, et al., Intl. Immunol., 5: 833, 1993). Mouse spleen cells stimulated with antigen ( Iwata and Ishizaka, J.M. Immunol., 141: 3270, 1988; Ohno, et al., Intl. Imm unol., 2: 275, 1990) or peripheral blood lymphocytes of allergic patients (Thomas, et al., J. Immunol., 148: 729, 1992) for generating a GIF-producing Ts population The construction of Ts hybridomas producing GIF is known to those skilled in the art. This G From hybridomas / clones producing IF, antigen-specific GIF producing T Select s hybridoma or Ts clone. This hybridoma / Ts Stimulate the loan with syngeneic macrophages pulsed with antigen or mount CD3 Sepharoses or other suitable, stimulated by pons and coupled culture supernatant with antigen Fractionation on a simple matrix. Elute proteins retained on the column at acidic pH However, methods known to those skilled in the art, such as those described by Iwata and Ishizaka (Iwata and   Ishizaka, J .; Immunol., 141: 3270, 1988. Incorporated herein by reference ) To determine if GIF bioactivity is present in the eluted fraction. Stimulated And Ts hybridoma or Ts clone producing antigen-specific GIF The gene encoding the TCRa chain or AgGIF is cloned.   cDNA or genomic libraries are well-known in the art. It can be made from DNA fragments generated using techniques. Fragment encoding AgGIF Is a nucleotide sequence homologous to a portion of the non-specific GIF and TCRa sequences described above. Identification by screening such libraries with lobes it can. Here, a single constant region remains for human and mouse TCRa (Cα). It should be noted that there is a gene. Nuq that encodes Cα in both species Because the leotide sequence is known, homology to the constant region can be determined by standard methods in the art. A DNA probe can be synthesized, and using this, cDNA of AgGIF can be synthesized. In cDNA libraries synthesized or made from T cells or genomic clones AgGIF fragments that can be used to identify suitable AgGIF sequences Genes or mRNA transcripts can be isolated from T cells. Or desired Can construct oligonucleotides specific to the variable region of the TCRa chain of These may be designed, but on a case-by-case basis depending on the sequence of the variable region. Would have to. Oligonucleotides designed based on constant regions Probes are advantageous in this regard. That is, what are the AgGIF genes Because it can also be used to "find" children or code sequences. For example, Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold S (See the technology described in Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989) . For example, in certain embodiments, T cell hybridoma 231F1 cells (OVA-specific ) Was isolated from the complete nucleotide coding sequence for the TCRa chain gene (Figure 2A and 2B, SEQ ID NO: 5).   Alternatively, it is derived from a non-specific GIF sequence and a specific TCRa sequence Oligonucleotide probes are primed using PCR (polymerase chain reaction) technology. AgGIF sequence cDNA that can be used for direct cloning Or a genome copy could be generated. An overview of such PCR methods See, for example, Gelfand, D.H., “PCR Technology, Principles and Ap. replications for DNA Amplification, "Ed., H.A. Erlich, Stockton Press, N.Y. ., 1989 and "Current-Protocols in Molecular Biology," Vol. 2, Ch. 15, Eds. See Ausubel, et al., John Wiley & Sons, 1988.   The method chosen to identify and clone the AgGIF coding sequence is not relevant. The use of expression cloning techniques can significantly reduce screening effort. it can. Recently, one-step methods for cloning and expressing antibody genes have been reported. (McCaferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Winter and Milstein, Natu re 349: 293-299, 1991). Based on this technology, the AgGIF gene also has a λ At the site adjacent to the bacteriophage coat protein gene, such as or fd It can be cloned directly into a vector. Carrying AgGIF gene The phage expresses the fusion protein on its surface and expresses the antigen or AgGIF-specific antibody. Body (a bispecific antibody to the non-specific GIF and the constant region of the TCRa chain, or Phage particles with binding activity using a column containing two different antibodies) It can be selected and isolated. AgGIF gene is also accurate in transient gene expression system Can be used to identify For example, a COS cell line (eg, Ge rard & Gluzman, Mol. Cell. Biol. 6 (12): 4570-4577, 1986) . Once a positive clone is selected, the biological activity of the gene product (AgGIF) Is assayed for antigen specificity by known methods described herein. Can be.   Due to the degeneracy of the nucleotide coding sequence, amino acids similar to the known AgGIF gene are used. Other DNA sequences encoding the amino acid sequence may be used in the practice of the present invention. For expression and expression. Various changes such as changes Otide residue deletions, additions or substitutions, resulting in identical or functionally equivalent A sequence encoding the gene product is obtained. This gene product is contained in the sequence Deletion of amino acids resulting in an unusual change (thus resulting in a biologically active product), It may include additions or substitutions. Such amino acid substitutions may involve residues Based on polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, amphipathicity and SH groups I can. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and And glutamic acid, and the positively charged amino acids are lysine and arginine And an amino acid with an uncharged polar head group of similar hydrophilicity , Isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, There are serine, threonine, phenylalanine and tyrosine. Also, an appropriate system The in residue is replaced with alanine / serine to give the protein conformation, It is also possible to remove sulfhydryl (SH) groups which may affect the activity of the substance.   Regardless of the method used to produce such AgGIF, the molecule Must be evaluated for its antigen-binding ability and immunomodulatory activity. For example, AgGIF Is capable of binding directly to the target antigen by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Modified immunology, including sedimentation, western blot, radioimmunoassay Assay technology (AgGIF is used instead of the antibody commonly used in these assay systems) Use). Examples of these assays are described in the Examples below. An example is shown below.   The immunomodulating ability of antigen-binding AgGIF is an antigen-specific detection of immune response. It can be evaluated using the seysey system. For example, as described and illustrated in this specification Plaque forming cell (PFC) assay to assess the immune response to specific antigens AgGIF that suppresses the answer can be identified. Sheep red blood cells (SRBC Culture of spleen cells in the presence of highly immunogenic carriers such as This will result in the production of plaque forming cells. Of PFC generated per culture To assess the number, cultured spleen cells were cultured with SRBC (or a suitable lysable carrier). ) And complement and incubating the mixture as a monolayer. Transparent plaque (even if Cells surrounded by (of lysed erythrocytes) are counted as PFCs. Spleen Inhibition of PFC production in cell culture, ie, a reduction in the number of PFCs / culture, Suggests suppression of the response. To test the inhibitory activity of AgGIF, To confirm that suppression of antigens is antigen-specific, Say can be implemented. That is, the target antigen is converted to SRBC (Ag-S RBC) and spleen cells from non-immunized mice. Anti To evaluate the immunomodulatory effect of AgGIF specific to the progenitor, GIF is added to the culture in the presence of the auxiliary components described below (ie, The minute must be added to the culture before or simultaneously with the AgGIF to be tested) . Control cultures can be supplemented with AgGIF or use unrelated antigens. May be used. After incubation, the number of PFC / cultures is evaluated for each condition. Ko Control of PFC production in the test culture compared to the PFC production observed with Inhibition is an antigen-specific response to the immune response that the tested AgGIF normally produces in its culture system. It shows that it suppresses.   The antigen specificity of the monoclonal T cell population is indicative of the proliferation of these cells in response to the antigen And / or in vitro assays to measure lymphokine production it can. T cell phenotype can be stained with antibodies to various T cell markers. And can be confirmed by: Furthermore, to test the antigen specificity of T cells ELISA can be used.   Can such antigen-specific T cells constitutively secrete AgGIF Or an activation signal for AgGIF release may be required. Good Preferably, the antigen-specific T cells are obtained by recombinant DNA technology and / or chemical synthesis. Sources of genetic material required to produce AgGIF polypeptides by technology Can be used as With this approach, natural AgGIF cannot be secreted. Genetic material of AgGIF to use certain antigen-specific T cells according to the invention Can be used as a source.   In another embodiment, the present invention provides a compound of formula R1-RTwo(Where R1Is a non-specific GIF Yes, RTwoIs a TCRa chain). A host cell transformed with the polynucleotide sequence Culture under conditions that allow expression of the sequence and isolate substantially pure AgGIF Recombining substantially pure and biologically active AgGIF comprising: Provide the law. The AgGIF is preferably mouse or human.   As used herein, the term "substantially pure" refers to other, naturally associated, terms. Polypeptides substantially free of proteins, lipids, carbohydrates and other substances Point to. One of skill in the art will recognize the epitope of a non-specific GIF as described herein. And monoclonal antibodies that bind epitopes of the TCRa constant region Uses standard techniques for protein purification, such as affinity chromatography This polypeptide can then be purified. This substantially pure polypeptide A single major band of approximately 55 kD on a reducing SDS-polyacrylamide gel. Indicates Purity of this polypeptide is determined by amino-terminal amino acid sequence analysis You can also. As long as the activity of the polypeptide is maintained, And functional fragments of this polypeptide. Polypeptide biology Smaller peptides containing specific activity are encompassed by the present invention.   In order to express biologically active AgGIF, a nucleic acid encoding AgGIF is required. The nucleotide sequence is transferred to a suitable expression vector, i.e., the transcription of the inserted coding sequence. Insert into a vector containing elements required for translation. Modification of AgGIF coding sequence Plates can be made to increase the stability, production, purification or yield of the expression product. There will be. For example, from a fusion protein, AgGIF and a heterologous protein The expression of the cleavable fusion protein can be engineered. like this The fusion protein can be purified by affinity chromatography, It can be easily isolated by immobilizing it on a column specific for protein. A When a cleavage site is inserted between the gGIF portion and the heterologous protein, this cleavage site is Chromatographic chromatography by treatment with the appropriate enzymes or reagents to disrupt AgGIF can be released from the ram (see, eg, Booth, et al., Imm unol Lett., 19: 65-70, 1988 and Gardella, et al. Biol. Chem., 265: 15 854-15859, 1990).   In order to produce biologically active AgGIF, GIF expressing Ts cells And cDNA encoding TCRa can be transfected (see Examples 4). Alternatively, a GIF polynucleotide and a TCRa polynucleotide Transfecting both into one cell at the same time to produce AgGIF Can be. Furthermore, the same host cell is also transfected with TCR β chain cDNA. It may be desirable.   Using methods well known to those skilled in the art, the AgGIF coding sequence Expression vectors containing transcription / translation control signals can be constructed. this These methods include in vitro recombinant DNA technology, synthetic technology and in vivo recombination / Gene recombination is included (eg, Maniatis, et al., Molecular Cloning A). Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989. Please refer to the technologies that are available).   Transformation of host cells with recombinant DNA is accomplished by conventional techniques well known to those skilled in the art. It can be done by technology. The host is a prokaryote such as E. coli In some cases, competent cells capable of uptake of DNA are harvested after the logarithmic growth phase Followed by CaCl 2 by procedures well known in the art.TwoFrom cells treated by the method be able to. Or MgClTwoOr RbCl can be used. Ma Transformation can be performed after protoplast formation in the host cells or by electroporation. Depending on the option, it can be implemented.   If the host is a eukaryote, ordinary machines such as calcium phosphate coprecipitation and microinjection Methods, electroporation, insertion of plasmids encapsulated in liposomes, or Alternatively, a DNA transfection method such as a viral vector can be used. Ma Eukaryotic cells contain a DNA sequence encoding the fusion polypeptide of the invention and a simple A second encoding a selectable phenotype such as the herpes thymidine kinase gene It can be co-transfected with a foreign DNA molecule. Another method is Eukaryotic organisms such as mian virus 40 (SV40) and bovine papilloma virus Transiently infecting or transforming eukaryotic cells using an ils vector (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring  Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Host cell as described herein Preferably, a eukaryotic host is used.   Technology for isolating and purifying the polypeptide of the present invention expressed in a microorganism or eukaryote For example, preparative chromatographic separations and monoclonal antibodies or poly Conventional techniques such as immunological separation, such as those using clonal antibodies or antigens Any of the steps may be used.   Various host-expression vector systems are used to express the AgGIF coding sequence it can. These include recombinant bacteriophages containing the AgGIF coding sequence. Transform with diDNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vector Microorganisms such as bacteria, recombinant yeast expression vectors containing the AgGIF coding sequence Yeast, transformed with a recombinant viral expression vector containing the AgGIF coding sequence. (For example, cauliflower mosaic virus CaMV, tobacco mosaic virus) Infected with a recombinant plasmid expression vector (e.g. Plant cell line transformed with AgGIF coding sequence Insects infected with a recombinant viral expression vector (eg, baculovirus) Cell lines or recombinant viral expression vectors containing the AgGIF coding sequence ( (For example, retrovirus, adenovirus, vaccinia virus) Animal cell lines or transgenic animal cells engineered for stable expression Vesicle system, but is not limited to these.   Expression vectors may be constitutive or inducible, depending on the host / vector system utilized. Such as a functional promoter, transcription enhancer element, transcription terminator, etc. Any of a number of suitable transcription and translation elements can be used (eg, Bitter, et  al., Methods in Enzymology 153: 516-544, 1987). For example When cloning in a bacterial system, the pL, plac, ptrp, Uses an inducible promoter such as ptac (ptrp-lac hybrid promoter) it can. When cloning in a mammalian cell line, the Motor (eg metallothionein promoter) or mammalian virus Derived promoters (eg, retroviral long terminal repeats, adeno Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter) Can be used. To transcribe the inserted AgGIF coding sequence, recombinant DNA or Promoters produced by synthetic techniques can also be used.   For bacterial systems, depending on the intended use for the expressed AgGIF, Can be advantageously selected. For example, a large amount of AgGIF Direct high-level expression of easily purified fusion protein products if you want to produce A vector that does this would be desirable. Includes cleavage site useful for AgGIF recovery Those that have been engineered as described above are preferred. Such vectors include high AgGIF coding sequence such that brid AgGIF-lacZ protein is produced. The sequence can be ligated into the vector in the same reading frame as the lacZ coding region. c oli expression vector pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983), pIN vector ( Inouye & Inouye, Nucleic acids Res. 13: 3101-3109, 1985; Van Heeke & S chuster, J .; Biol. Chem. 264: 5503-5509, 1989) Do not mean.   In yeast, some vectors containing constitutive or inducible promoters Can be used. For an overview, see Current Protocols in Molecular Biology, Vol. . 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, C h. 13, 1988; Grant, et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Was h., D. C., Ch. 3, 1986; Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, M ethods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152 , Pp. 673-684, 1987 and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyce s, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982 Please refer to. Constitutive yeast promoters such as ADH or LEU2 or GAL Inducible promoters can be used (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In:  DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wa sh., D.C., 1986). Alternatively, it facilitates the integration of the foreign DNA sequence into the yeast chromosome. Vectors that proceed can be used.   When using plant expression vectors, the expression of the AgGIF coding sequence can be This can be done with any of the promoters. For example, CaMV 3 Viral pros such as 5S RNA promoter and 19S RNA promoter Motor (Brisson, et al., Nature 310: 511-514, 1984) or TMV Coat protein promoter (Takamatsu, et al., EMBO J. 6: 307-311, 1987) Can be used. Alternatively, plant promoters such as the small subunit of RUBISCO ( Coruzzi, et al., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., Science 22 4 Or 838-843, 1984) or heat shock promoters, such as soy hsp 17.5-E Or hsp 17.3-B (Gurley, et al., Mol. Cell. Biol. 6: 559-565, 1986). it can. These constructs include Ti plasmid, Ri plasmid, plant virus vector Plant using direct DNA transformation, microinjection, electroporation, etc. Can be introduced into cells. For an overview of such technologies, for example, Weissbach & Weissback, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Pre ss, NY, Section VIII, pp. 421-463, 1988 and Grierson & Corey, Plant Mole cular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. See 7-9, 1988.   Another expression system that can be used to express AgGIF is an insect system. In one such system, Autograp is used as a vector to express foreign genes. ha californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used. This virus is Spodopt Proliferate in era frugiperda cells. AgGIF coding sequence is non-essential for this virus Region (eg, the polyhedrin gene) and cloned into the AcNPV promoter ( (For example, a polyhedrin promoter). AgGIF code Successful insertion of sequence inactivates polyhedrin gene and is not encapsulated The recombinant virus (ie, the protein encoded by the polyhedrin gene) Virus without a proteinaceous coat). Next, these recombinant viruses Use to infect Spodoptera frugiperda cells in which the inserted gene is expressed You. Smith, et al., J.M. Viol. 46: 584,1983; U.S. Patent No. 4,215,051 to Smith. Please refer to.   Mammalian tamper expressed using a eukaryotic system, preferably a mammalian expression system Precise post-translational modifications of the protein are made. Precise processing of primary transfer Has a cellular mechanism for lycosylation, phosphorylation and, advantageously, secretion of gene products Eukaryotic cells should be used as host cells for the expression of AgGIF. Nursing Milk cell lines are preferred. Such host cell systems include CHO, VERO, BHK, He La, COS, MDCK, -293 and WI38 and Ts hybridomas (expressing GIF ) Can be included, but is not limited thereto. For example, human TCR transfecting α-polynucleotide into mouse or human Ts cells expressing GIF And the bioactive human AgGIF is expressed (Example 4).   Mammalian cell lines utilizing recombinant viruses or viral components that direct expression Can be engineered. For example, when using an adenovirus expression vector , The AgGIF coding sequence is an adenovirus transcription / translation control complex, e.g. It can be linked to a promoter and a tripartite leader sequence. This chimera The gene is then transformed into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. To Can be inserted. Non-essential regions of the viral genome (eg, region E1 or When inserted into E3), it can survive in the infected host and express AgGIF. A recombinant virus is obtained (for example, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. . Sci. USA, 81: 3655-3659, 1984). Or vaccinia The viral 7.5K promoter can be used (see, eg, Mackett, et al., roc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419, 1982; Mackett, et al., J. Am. Virol . 49: 857-864, 1984; Panicali, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927 -4931, 1982). Of particular interest are replicating as extrachromosomal elements Is a vector based on bovine papillomavirus that has the ability to al., Mol. Cell. Biol. 1: 486, 1981). This DNA enters mouse cells After replication, the plasmid replicates to about 100-200 copies per cell. Inserted The plasmid does not need to be integrated into the host chromosome for transcription of the cDNA, High levels of expression are obtained. These vectors contain the neo gene in a plasmid. By including such a selectable marker, it can be used for stable expression . Alternatively, the retroviral genome is introduced into the host cell with the AgGIF gene. To be used as a vector that can direct its expression. (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353, 19 84). Also, high levels of expression can be, but are not limited to, metallothionein IIA Use inducible promoters, such as Can also be achieved.   For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. Wooly Rather than using an expression vector containing a lupus origin of replication, appropriate expression control Element (eg, promoter sequence, enhancer sequence, transcription terminator, AgGIF cDNAs controlled by the And a selectable marker to transform the host cell. This recombinant plasmid The selectable marker in it confers resistance to selection, so that cells Can be stably integrated into its own chromosome and proliferate to form a focus . This focus can then be cloned and expanded into a cell line. You. For example, after the introduction of foreign DNA, the genetically engineered cells may be Proliferation It is advisable to switch to a selection medium after the reaction. Many selections are available, even if For example, but not limited to, herpes simplex virus thymidine kinase gene (W igler, et al., Cell, 11: 223, 1977), hypoxanthine-guanine phosphoribosi Transferase gene (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. . USA, 48: 2026, 1962), and adenine phosphoribosyltransferase The genes (Lowy, et al., Cell, 22: 817, 1980) are each tk-, Hgprt or aprt fine Can be used on vesicles. In addition, anti-metabolite resistance should be a base for selection for: Can be used as a source. dhfr confers resistance to methotrexate (Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567, 1980; O'Hare, e. t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527, 1981), gpt is mycophenolic acid (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 207). Neo confers resistance to the aminoglycoside G-418 (Colberre-Grapin , Et al. Mol. Biol., 150: 1, 1981), hygro is resistant to hygromycin. (Santerre, et al., Gene, 30: 147, 1984). Recently, another election Selectable genes are described. That is, trpB replaces tryptophan with cells. HisD allows cells to replace histidine instead of using indole (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. A.) cad. Sci. USA, 85: 8047, 1988), ODC (ornithine decarboxylase) 2- (difluoromethyl) -DL-ornithine, a nitin decarboxylase inhibitor Provides resistance to DFMO (McConlogue L., In: Current Communications  in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987).   Expression of AgGIF protein products by genetically engineered cells For example, Western blot, radioimmuno-precipitation, enzyme Can be assessed immunologically by immunoassays such as binding immunoassays . However, the final test of the success of the expression system involves the biologically active AgGIF gene. Includes production of offspring products. If the host cell secretes the gene product, the cultured tiger AgGIF or immunomodulation thereof using a cell-free medium obtained from a non-effectant host cell The activity may be assayed. If the gene product is not secreted, One And assay for such activity. In any case, there is no limit Determine the ability of the expressed AgGIF to bind to the antigen, or the T cell hybridoma From formation of glycosylated IgE binding factor to formation of non-glycosylated IgE binding factor Assay to Measure Switching Ability (Example 1) and Its Immunological Function Several assays, including assays to evaluate (eg, PFC assays) Can be used to assess AgGIF activity.   Alternatively, an antigen-specific GIF (a 55 kDa peptide having GIF activity) ) Can be produced as a fusion protein of biologically active GIF and TCRa chain. Wear. The 13 kDa GIF polypeptide sequence has been produced in cells of various cell lines. However, only polypeptides produced by Ts cells are biologically active (Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11227, 1994). Human GIF Stable transfectants containing cDNA in mouse Ts cells are described in Liu, supra. Produce biologically active human GIF as described in U.S. Pat. Procalci Encodes a fusion protein consisting of the N-terminal region of the tonin precursor and human GIF When the chimeric cDNA is transfected into BMT10 cells or COS cells, A 13 kDa bioactive GIF is secreted. This human GIF polypeptide is For example, affinity purification using anti-GIF coupled to Affigel it can.   Calmodulin and others as fusion partners for production of soluble forms of TCRa chains Bacterial fusion expression systems using the above carriers can also be used. According to this system, High levels of rumodulin-TCRa fusion protein in the soluble fraction of cell lysates And expressed in the calmodulin portion of the protein against phenyl sepharose. The high affinity facilitates rapid purification of the fusion protein. Calmod Fusion protein with thrombin recognizing a linker sequence between the phosphorus moiety and the TCRa chain By digesting the protein, the recombinant TCRa chain can be recovered. this The method yields a TCRa chain consisting of the Vα, Jα, and Cα extracellular regions. the same The method is also useful for producing a soluble form of the TCR β chain. Bioactive GI SH group in F molecule is blocked, but recombinant GIF peptide and TCRa chain After gentle reduction of the mixture, the mixture is digested with protein disulfide isomerase. Upon processing, an interchain disulfide bond is formed between the TCRa chain and the GIF. And For example, binding to two independent peptides in the presence of transglutaminase Using cementoin containing 5 cycles of VKGLDP The GIF peptide can bind to the TCRa chain. Produce a fusion partner Other carriers and fusion partners that have cleavage sites useful for such are known to those skilled in the art.   In yet another aspect, the invention relates to the method of activating suppressor T cells (activating Induces gene expression in T cells), suppressor T cell expression To antibodies and TCRa polypeptides that bind nonspecific GIF polypeptides Contact independently with the antibody to bind, and bind to both the GIF and TCRa antibodies. A substantially pure AgGIF polypeptide comprising isolating the polypeptide. A method for isolation is provided.   The term "antibody" as used in the present invention refers to an entire molecule and its fragments Fab, F (ab ') capable of binding to a pitope determinantTwoAnd Fv yo Stuff. These antibody fragments selectively bind to their antigen or receptor It has some ability to do so, defined as: (1) The Fab fragment containing the monovalent antigen-binding fragment of the antibody molecule is intact with the intact light chain. Digestion of a complete antibody with the enzyme papain so that it forms part of one heavy chain Can be generated by (2) The Fab 'fragment of the antibody molecule is reduced by treating the whole antibody with pepsin and reducing it. It can be obtained by generating the light chain of the wound and part of the heavy chain. Antibody 1 minute Two Fab 'fragments are obtained per offspring. (3) (Fab ')TwoTreats the complete antibody with the enzyme pepsin followed by reduction. F (ab ') is an antibody fragment that can be obtained withoutTwoIs two disulfi A dimer of two Fab 'fragments held together by a bond. (4) Fv is expressed as a light chain variable region and a heavy chain variable region expressed as two chains. Is defined as a genetically engineered fragment containing (5) Single chain antibodies ("SCAs") are inherited by an appropriate polypeptide linker. Light chain variable region and heavy chain variable region joined as a covalently fused single-chain molecule Is defined as a genetically engineered molecule containing   Methods for making these fragments are well known in the art (eg, Harlow and Lane, Ant. ibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (19 See (88). This is incorporated herein by reference).   As used herein, the term "epitope" refers to the paratope of an antibody to which it binds , An antigenic determinant on an antigen. Epitopic determinants are usually found on amino acids or sugar side chains. Are composed of chemically active surface groups of such molecules, usually in a particular three-dimensional It has structural characteristics and specific charge characteristics.   Binds to the AgGIF polypeptide or TCRa constant region described in the present invention Antibodies contain whole polypeptide (GIF) or small peptides of interest Can be prepared using the fragment to be used as an antigen for immunization. Immunize animals A polypeptide such as SEQ ID NO: 2 or an epitope derived from SEQ ID NO: 2 The constant region derived from the peptide containing the tope or TCRa contains the translated c It can be derived from DNA or by chemical synthesis and, if desired, a carrier tandem. Can bind to protein. Usually used for chemical coupling to peptides Such carriers include keyhole limpet hemocyanin (KLH), tyro There are globulin, bovine serum albumin (BSA) and tetanus toxoid. Next In addition, animals (eg, mice, rats, goats, rabbits) Immunize).   Once a clone producing high levels of biologically active AgGIF has been identified, The clone can be expanded and used to produce large amounts of protein. You. The protein may be, for example, but not limited to, immunoaffinity -Purification, chromatography methods including high-performance liquid chromatography, etc. Can be purified using techniques well known in the art. This protein AgGIF can be easily recovered from the culture medium when secreted from cultured cells. Can be.   Methods for purifying AgGIF from crude T cell cultures are described in Can be adapted for product purification. For example, A obtained from 231F1 cells used in Examples described later gGIF was obtained from the crude medium of T cells by affinity after ammonium sulfate precipitation. It can be purified by chromatography (Zheng, et al., J. Immunol . , 140: 1351-1358, 1988; Bissonnette, et al., J. Am. Immunol., 146: 2898-2907, 1991). Common to all AgGIFs (eg, GIF and TCRa constant region) Or a fragment containing a determinant or antigen present in or a particular antigenic epitope thereof A purified monoclonal antibody specific for is a cyanogen bromide-activated Sepharos e4B (Pharmacia) or Affigel 10 (BioRad) Can be used for matography. Alternatively, the α-chain protein in question If it is known which specific Vα gene segment encodes Antibodies raised against products of various Vα gene families can also be used. In addition, antibodies may be raised against the variable region of a particular AgGIF, and other unrelated A It can be used to purify the α chain from a mixture of gGIF. In this case specific AgGIF can be used for bulk culture of T cells if sufficient amounts of protein are present. It can also be isolated from crude media.   Genetic engineering of the AgGIF coding sequence to produce a cleavable fusion protein When encoded, AgGIF purification uses affinity purification techniques. And can be easily performed. For example, the protease factor Xa cleavage recognition sequence is Engineering between the carboxy terminus of AgGIF and maltose binding protein Can be achieved. The resulting fusion protein is a maltose binding protein Can be easily purified using a column to which amylose is bound. Next, the AgGIF fusion protein was eluted from the column with a maltose-containing buffer. And then treated with factor Xa. The cleaved AgGIF is converted to a second amylose scalar. Further purified by removing the maltose binding protein (New England Biolabs, Beverly, MA). Using this aspect of the invention, the IgG A second peptide having an IF sequence and a binding partner that can be used for purification, or Can be used to prepare proteins (eg, immunoaffinity columns) Between any cleavage site or enzyme cleavage substrate by genetic engineering Can be created.   A specific AgGIF gene was molecularly cloned and its DNA sequence determined. Produce the protein product by the methods described above and many others. Can be For example, based on an amino acid sequence deduced from a DNA sequence, , It is possible to produce all or part of AgGIF using solid-phase chemical synthesis techniques. (Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H. Freem an and Co., N.Y. pp. 50-60, 1983). This approach adds to the active site of the molecule. It is particularly useful for producing small portions of the protein of interest. Binds to antigen In the case of AgGIF, it is encoded by the V gene segment and the J gene segment. Variable region at the amino terminus of a known protein may be important for antigen binding Is extremely high. Therefore, a synthetic peptide corresponding to the variable region of the α chain is produced. be able to. Further, for example, the constant region of the alpha chain achieves a sufficient immunomodulatory response If known to be important for interaction with cofactors during Larger peptides containing specific portions of the α-chain constant region can also be synthesized. Wear.   Another method for producing AgGIF based on the cloned DNA sequence of AgGIF Is a method in which the gene is transcribed and translated in a cell-free system in vitro. Honcho In a specific embodiment illustrated in the text, the 231F1 AgGIF gene is transformed in vitro. The product is transcribed and translated at about 550,000 by reducing SDS-PAGE. It is shown to be a protein with a molecular weight of 0 Dalton. This protein is Corresponds to the uncosylated AgGIF polypeptide chain. Such cell-free in  Although in vitro systems were not designed for large-scale protein production, The advantage of the approach is that it can be used in certain immunological reactions without the synthesis of other proteins. The purpose of the present invention is to provide a method for definitively demonstrating the contribution of a specific AgGIF. Ag Due to the antigen-specific immunomodulatory activity of GIF, in vivo or in vivo in human or animal subjects A wide range of o and in vivo applications are provided. Capable of binding antigen and in v AgGIF or a fragment or derivative thereof that exhibits immunomodulatory activity when assayed in itro Either can be used to carry out the method of the present invention. Able to bind antigen and usually AgGIF suppresses the immune response elicited against its antigen, Down-regulation of antigen-specific immune responses such as transplant rejection and autoimmune diseases Useful for down-regulation.   Thus, the present invention provides humans with an immunosuppressive amount of antigen-specific GIF (AgGIF). A human immune response to an antigen by administering It also provides a way to control. The terms “suppress” or “suppressive” refer to human Means reducing the deleterious effects of unwanted immune responses in tolerability. The term "immunosuppressive amount" refers to an immune response in which the use of human AgGIF is undesirable. Means sufficient to control the cause of the disease or condition caused by . In addition, the method may include administration of a complex of a 55 kDa peptide and a TCR β chain. There is. TCRβ can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, by chemical bonding or disulfation. Can be complexed with AgGIF by complexation through the formation of You.   The dosage range in which the AgGIF of the present invention is administered will reduce some of the symptoms of the immune response. Large enough to produce the desired effect. Dosage is desired May cause adverse side effects such as no cross-reactivity, anaphylactic reactions, etc. Do not rub too large. Generally, this dose will depend on the patient's age, condition, gender, And the degree of the disease, and can be determined by one skilled in the art. The dose is Individual physician adjusts if there is any counterindication can do. The dosage is about 0.001 mg / kg to about 2 mg / kg per dose, preferably Or in the range of about 0.001 mg / kg to about 0.2 mg / kg. One or more times, one or several days.   AgGIF of the invention may be injected by injection or in small portions over time Can be administered parenterally. AgGIF of the present invention can be administered intravenously into peritoneal tissue. It can be administered intrawoven, intramuscularly, subcutaneously, intrasinusally, or transdermally.   Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions There is liquid. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, Vegetable oils (eg, olive oil), and injectable organic esters (eg, , Ethyl oleate). Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solvents. There are solutions, emulsions or suspensions, for example, saline and buffered media. Parenteral Vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose Water and sodium chloride, lactated Ringer's solution or fatty oils. For intravenous use Vehicles include fluid and nutrient supplements, electrolyte supplements (eg, Ringer's tablets). Glucose-based liquid). Preservatives and other additives, such as antibacterial Agents, antioxidants, chelating agents and inert gases and the like may be present.   Further, the present invention relates to a novel antigen to which the AgGIF of the present invention can bind. Pharmaceutical or medicament comprising the AgGIF of the present invention for use in treating an unwanted immune response The present invention also relates to a method for preparing an agent composition. AgGIF is preferably human AgGIF.   Antigen-binding AgGIF that exhibits antigen-specific immunosuppression may have a deleterious immune response. Used to treat conditions where it would be desirable to antigen-specifically suppress a response such as Can be used. These diseases that can be treated according to the invention include hypersensitivity (types I-VI) ), Autoimmune disease and graft rejection after organ or tissue transplantation. It is not limited to these.   Hypersensitivity reactions generally fall into four groups. Type I reactions are antigen-specific Immediate type hypersensitivity resulting from mast cell granule loss caused by IgE. Examples of type I diseases include plant pollen, mold spores, insect parts, animal dander, For substances such as bee and snake poisons, industrial dust, household dust, food, medicines and drugs There are the most common allergies that result. Type II reactions are specific antibodies, usually I Caused by the action of gG and IgM on target cells, leading to cell destruction . Examples of type II disease include transfusion reactions, fetal erythroblastosis, autoimmune hemolytic anemia, and severe There are myasthenia gravis and Graves' disease. Type III reactions form antigen-antibody complexes And subsequent activation of the antibody effector mechanism. Examples of type III diseases include immune complex glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome and And there are some forms of arthritis. Type IV reactions include T cells, macrophages, fibers Cell-mediated reactions involving blasts and other cell types. These are delayed hypersensitivity It is also said. Allergic contact dermatitis is a typical example of this category.   Autoimmune diseases are caused by the immune system's response to self-antigens. A group of diseases that lead to the destruction of a tissue. These responses can be antibodies, autoreactive T cells or Can be mediated by both. Many of these symptoms have been described above for hypersensitivity. Overlaps with Some important autoimmune diseases include diabetes, autoimmune thyroid Adenitis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and myasthenia muscle Asthenia is included.   A fundamental understanding of MHC has advanced the art of tissue categorization, resulting in The success rate in tissue transplantation has greatly improved. Transplant surgery commonly performed today Some include kidney, heart, liver, skin, pancreatic islets of Langerhans and bone marrow There are organs and tissues. However, if the donor and recipient are not genetically identical, Again, graft rejection can occur.   All of the above symptoms, including but not limited to the specific diseases mentioned above, Down regulation of an adverse immune response is beneficial to the host. In this regard, T While specifically suppressing the immune response mediated by cells, antibodies, or both, AgGIF can be used to maintain all normal immune functions. For example, experimental Allergy encephalomyelitis (EAE) is caused by administration of purified myelin basic protein. Is an animal model of human multiple sclerosis that can be induced in mice. THBox's It has been shown to play a significant role in the pathogenesis of disease (Wraith, et al., Cell, 5 7: 709-715, 1989). Antigen recognized by autoreactive T cells in a given mouse strain The number of determinants is limited. In addition, Vα and the like used to construct autoimmune TCRs And Vβ gene segments are responsible for the T cell response to a small number of encephalitogenic epitopes. Most are equally restricted to have the same TCR. For the TCR determinant Antibodies are used effectively in vivo to deplete AgT cells and protect against disease (Owhashi and Heber-Katz, J. Exp. Med. 168: 2153-2164, 1988). The present invention In application, the AgGIF gene is isolated from such autoreactive T cells and Ability to express in host cells and suppress antigen-specific immune responses in vitro and in vivo Should be tested. The use of AgGIF for this purpose is important for multiple sclerosis and severe Autoimmune T cells have been detected in certain human diseases, such as myasthenia, As well as having the limited utility of certain Vα and Vβ alleles This is particularly important in view of the recent findings that are visible (Oksenberg, et al., Proc. tl., Acad. Sci. USA, 86: 988-992, 1989).   According to the present invention, the above symptoms suppress the immune response generated against the antigen By administering to the patient an effective amount of AgGIF specific for the relevant antigen. Can be placed. The AgGIF selected for use is the PFC update described herein. It can be assessed by an in vitro immunomodulation assay such as Say. AgGIF is limited Can be administered by various means, including injection, infusion, parenteral and oral You. AgGIF and related derivatives, analogs, such as those derived from variable regions Peptide can be used as the sole active agent or with other ingredients. Wear. Such compositions include phosphate buffered saline, saline and sterile water. It can be administered together with other physiologically acceptable carriers. Or A Liposomes can be used to deliver gGIF. In this connection, Combination of liposome with antibody that recognizes cell-specific antigen and binds to cell-specific antigen For "targeting" the AgGIF composition by Means can be provided.   Effective doses will suppress the immune response that would occur in vivo against the antigen of interest. It is the amount necessary to control. The amount of AgGIF used depends on the method of administration and the use of other active compounds. It depends on the use, etc. Circulating serum, usually on the order of 0.1 μg-100 μg / ml Dose producing levels can be used. Most effective at suppressing antigen-specific responses Suitable concentrations are determined by in v, such as the PFC assay described herein and known to those skilled in the art. Various concentrations of AgGIF were added to the itro assay to determine the level of inhibition achieved. Can be determined in vitro by monitoring the   The following examples illustrate, but do not limit, the invention. these Are representative of those that can be used, but other methods known to those of ordinary skill Can be used.                                 Example 1                                Materials and methods Cell line : OVA-specific suppressor T cells (Ts) hybridoma 231F1 cells (Ja rdieu, et al. Immunol., 138: 1494, 1987), bee venom phospholipase ATwo(P LATwo) -Specific Ts hybridoma 3B3 cells (Mori, et al., Int. Immunol., 5: 833, 1993), containing TCR β chain mRNA and CD3-mRNA but containing TCR α T cell line 175.2 containing no strand cDNA (Glaichenhans, et al., J. Immunol. 146: 2095, 1991). Both 231F1 and 3B3 cells are on the cell surface Expression of TCR (immunofluorescence using monoclonal anti-TCR β chain and anti-CD3 175.2 cells were not stained with any of the antibodies.Antigens and antibodies : Crystalline ovalbumin was purchased from Nutritional Biochem and wasp venom Phospholipase ATwoWas purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Antigen , Coupled to CL Sepharose 4B at 1-3 mg protein / ml gel. PL ATwoWas treated with CNBr as previously described (Mori, et al., Supra). . Anti-mouse CD3 (145-2C11) (Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8 4: 1374, 1987), anti-TCRa chain (H28-710) (Beker, et al., Cell, 87: 911, 1989). And anti-TCR β chain (H57-597) (Kubo, et al., J. Immunol., 142: 2736, 1989) m AB and polyclonal rabbit anti-GIF antibody (Mikayama, et al., Proc. Natl. . Acad. Sci. USA, 90: 10056, 1993) has already been described. monoclonal All antibodies (mAbs) adsorb culture supernatant or antiserum to Protein A Sepharose. And purified. The IgG retained on the column was 0.1 M glycine HCl buffer ( (pH 3.0). mAb H28-710, H57-597 or rabbit anti-GI The IgG fraction of the F antiserum was coupled to Affigel 10. 2-4 mg of mAb or 5 mg of anti-GIF was coupled to 1 ml of gel. Normal rabbit IgG (RGG) Was coupled to Affigel 10 as 5 mg protein per ml gel.PCR and DNA sequencing : Use Fast Trackm RNA isolation kit (Invitrogen) Poly (A) from 231F1 cells+RNA was isolated and reverse transcribed into cDNA. cDN A double-stranded cDNA was generated using an A synthesis system (Gibco BRL), and T4 ligase ( Inaba, et al., Internat. Immunol., 3: 1053, 1991). TCRa PCR primers for cDNA cloning were synthesized. These primers The nucleotide sequence was 5'-CGAGGATCTTTTTAACTGGT, respectively. ACACA-3 '(nucleotides 47-24 of Ca) (SEQ ID NO: 7), 5'-G TAGCGGGATTTAACCTGCTCATG-3 '(366 to 38 of Cα) 9) (SEQ ID NO: 8), 5'-CGACACTGTGCAGTGGTCTCTA C-3 ′ (146 to 169 in FIG. 2A) (SEQ ID NO: 9), 5′-AGGAACAA AGGAGAATGGGAGG-3 '(213 to 234 in FIG. 2A) (SEQ ID NO: 1) 0), 5'-TCAACTGGACCACAGGCCTCAGC-3 '(FIG. 2A 804-784) (SEQ ID NO: 11). The PCR reaction is performed at 95 ° C for 1 And annealing at 55 ° C. for 2 minutes and extension at 72 ° C. for 2 minutes. Amplified DN A was isolated and inserted into the TA cloning vector PCRII (Invitrogen). D NA sequencing is standardized using a sequencing kit (United States Biochemical) Was performed by a typical dideoxy method.Construction of expression vector and stable transfection ： Mammalian expression vector pE Fneo has already been described (Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 11227, 1994). Has 5 'end of TCRα cDNA with XbaI site and NotI site PCR using two primers corresponding to the 3 'end of the same cDNA Was amplified and the cDNA was inserted into pEFneo. 5 'above Primer and 3 'primer encoding the 3' end of TCRa, enterokinase Using a linker sequence, a tag domain of six histidine residues and a NotI site, A TCRa-tag gene was prepared by CR and inserted into the same vector. 200V, 9 Transfected by 60 μF electroporation (Bio-Rad) . Stable transfectants were selected for G418 (0.5 mg / ml) resistance . The expression of TCRα mRNA is [32P] -labeled Vα11.3 specific probe Were evaluated by Northern blot hybridization.Stimulation of hybridoma cells and stable transfectants : 231F1 cells and 3B3 cells T cell hive suspended in DMEM containing 10% Nu serum for antigen stimulation of cells Lidoma (1 × 106Cells / ml) with 100 μg / ml OVA (Jardieu, et al., Supra). ) Or PLA treated with 30 μg / ml CNBrTwo(Mori, et al., Supra) A20.3 cells (2 × 10FiveCells / ml). Supernatant after 24 hours of culture Was recovered. Hybridoma cells or stable transfection by cross-linking of CD3 Cells were treated with 5 μg / ml anti-CD3 for 30 minutes on ice to stimulate Was. Wash cells, resuspend in serum-free DMEM, add 106/ Ml of cells containing cells The suspension was cultured in a tissue culture flask coated with protein A (Iwata, et a). l., J. Immunol., 143: 3909, 1989). After 24 hours incubation, remove the culture supernatant Collected.Fractionation of culture supernatant ： Appropriate immunoadsorbent for cell line cell culture supernatant or cytoplasmic fraction Fractionated above. Unless otherwise noted, culture supernatants were concentrated 10- to 50-fold by ultrafiltration. Mix samples overnight with Affigel 10 coupled with 1/3 to 1/5 volume of RGG I combined. The suspension was loaded onto the column, and the fraction passed through together with the washing solution was immunized with 2-3 ml of immunity. Loaded on an adsorbent column. After circulating this preparation through the column overnight, Washed with 50 volumes of PBS. Remove the protein remaining on the immunosorbent column It was eluted with twice the volume of 0.1 M glycine HCl buffer (pH 3.0) and collected. H Recombinant peptide having an is tag was prepared using Ni-NTA agarose (Qiagen). Purified. The concentrated culture supernatant was added to a 50 mM sodium phosphate buffer (p H8) was dialyzed and NaCl was added to a final concentration of 300 mM. Sample at 4 ° C for 3 Mix gently with 1/10 volume of Ni-NTA agarose for 0 minutes, and place the suspension on the column. Stuffed. 40 times the volume of the column with phosphate buffer containing 1 mM imidazole The protein retained on the column after washing contains 100 mM imidazole Elution was carried out with a phosphate buffer.SDS-PAGE and immunoblot : Reduction of affinity purified preparation Analyzed by SDS-PAGE on a 15% polyacrylamide gel under neutral conditions. I In some experiments, samples were recombinant GIF derived from E. coli (T. Mika (supplied from yama) (Kirin Brewery Co., Maebashi, Japan). Transfer proteins in gel to PVDF membrane and use high chemiluminescence western blot detection system Immunoblots were performed on (Amersham). Polyclonal rabbit anti-GIF IgG The fraction and the mAb H28-710 were compared with a peptide having a GIF epitope and TCR, respectively. It was used for detection of a peptide having an α-chain determinant.Detection of GIF biological activity : Mouse T cell hybridoma 12H5 cells are glycosylated Non-glycosylated from the production of modified IgE binding factor (IgE-BF) Activity was detected by its ability to switch to the production of IgE-BF. Assay procedure Has already been described (Iwata, M. and Ishizaka, K., J. Immu nol., 141: 3270, 1988). Briefly, serial two-fold dilutions of the sample to be tested 12H5 cells were cultured with mouse IgE in the presence of IgE-BF in the culture filtrate. Fractionation was performed using the lectin lectin Sepharose. When 12H5 cells were cultured with IgE alone Almost all IgE-BF formed by the combined cells was converted to lentil lectin Sepharose. Bound and recovered by elution with α-methyl mannoside. However, 12H5 culture When a sufficient amount of GIF was added to the product, most of the IgE-BF became lentil lectin Se. It was not retained in the pharose and was recovered in the through fraction. GIF titer of sample is 1 2 shows the maximum dilution of the sample that is characteristic of IgE-BF formed by 2H5 cells. ing.                                   Example 2                 Identification of 55 kD peptide in antigen-specific GIF   The following experiment describes the identification of antigen-specific GIF. OVA-specific Ts Hybridoma 231F1 cells were cultured for 24 hours with A20.3 cells pulsed with OVA. After the culture supernatant was concentrated by ultrafiltration, the concentrated culture supernatant was coupled with OVA. Fractionated with pharose. The amount of GIF bioactivity between the pass-through fraction and the fraction eluted with acid Cloth retains 80-90% of GIF bioactivity of initial culture supernatant on immunosorbent column And it was shown to be recovered in the acid eluate. That is, this acid eluate was subjected to SDS -Analyzed by PAGE and immunoblotted with polyclonal anti-GIF. Anti-GIF The major band binding to was the 55 kDa peptide. PLA stimulated with antigenTwo A similar experiment was performed with the culture supernatant of specific Ts hybridoma 3B3 cells.   FIG. 1 shows the results of analysis of antigen-specific GIF from Ts hybridoma. FIG. 1A Is PLA obtained by stimulating 3B3 cells with APC pulsed with antigen.TwoCouple with PLA affinity purified using SepharoseTwoThe results of specific GIF are shown ( Lane 2). E. E. coli-derived recombinant human GIF was applied to lane 1. this Performed SDS-PAGE under reducing conditions and then immunoblotted with anti-GIF. In FIG. 1B, anti-CD3 stimulated Affigel coupled with H28-710 was used. GIF specific to OVA was affinity purified from 1F1 cells. GIF titer The 1:80 elution fraction (lane 1) was further fractionated on OVA-Sepharose. Acid elution Product (lane 2) and pass-through (Eff, lane 3) were analyzed by SDS-PAGE and anti- Analyzed by immunoblotting with GIF. FIG. 1C shows the immunoblotting with H28-710. Shows the same fractions analyzed in the kit.   As shown in FIG. 1A, eluate from Sepharose coupled with antigen SDS-PAGE under reducing conditions and Western blot with anti-GIF Analysis yielded a single band at 55 kDa. OVA-specific Ts high Bridoma 231F1 cells were stimulated with APC pulsed with OVA and OVA-Sepharose Similar results were obtained when OVA-specific GIF was purified using. OVA specific GIF preparation and PLATwo55 kDa pep with both specific GIF preparations The identification of the tide indicates that GIF activity is related to this peptide. Indicated.   To characterize the peptides of the antigen-specific GIF preparation, 231F1 cells were Tissue culture dish treated with CD3, suspended in serum-free medium and coated with protein A For 24 hours. Antigen-specific GIF monochromator coupled to Affigel Binds to anti-TCRa α-chain H28-710 (Iwata, et al., J. Immunol., 143: 3917, 19). 89) Therefore, the culture supernatant was pre-adsorbed to Affigel coupled with RGG and passed through. Fractions were fractionated on Affigel coupled to H28. As expected, G in the culture supernatant Most of the IF bioactivity (80-90%) bound to the immunosorbent and was recovered by acid elution . GIF biological activity was detected in the acid eluate of RGG Affigel used for this adsorption. Did not. The fraction eluted from Affigel coupled with H28 was analyzed by SDS-PAGE. The analysis revealed that 55 kDa peptide and 13 kDa peptide that bind to anti-GIF were Again proven (FIG. 1B, lane 1). Therefore, the eluted fraction having a GIF titer of 1:80 Was further fractionated on Sepharose coupled with OVA. By SDS-PAGE Analysis of the fractions obtained by immunoadsorption and immunoblotting revealed a 55 kDa peptide. And GIF bioactivity are recovered in the acid eluate, but not detected in the flow-through fraction. Was shown. An important finding is that this 55 kDa peptide is In this case, it bound to both the anti-GIF and the anti-TCRa chain (Fig. 1B, 1C).   A similar experiment was performed using the culture supernatant of unstimulated 231F1 cells as a control. Done. Untreated 231F1 cells are suspended in serum-free medium and coagulated with protein A. And cultured in a tissue culture flask. The supernatant was previously adsorbed to RGG Affigel. And fractionated on Affigel coupled with H28. On the first culture of unstimulated cells The biological activity of Qing was comparable to the culture supernatant of cells stimulated with anti-CD3. But R No biological activity was detected in the acid-eluted fraction of either GGAffigel or H28-710-Affigel. Did not. The latter fraction was 55 kDa bound to H28-710 by Western blot. It did not contain any peptides. That is, the fraction passing through from H28-710Affigel is The protein adsorbed on the anti-GIF Affigel and retained on the column is recovered by acid elution. Was taken. The eluate from anti-GIF-Affigel has GIF bioactivity, Western blot contained a 13 kDa peptide that bound to anti-GIF. Unexpected 231F1 as expected from previous observations (Jardieu, et al. Supra). The GIF biological activity of the cell culture supernatant does not bind to OVA-Sepharose, The acid-eluted fraction from harose is a 55 kD that binds to anti-GIF by Western blot. It did not contain the a peptide. These results show that the 231F1 cell Cells were stimulated by OVA-pulsed APC or cell surface CD3 55kDa peptide released from 231F1 cells only when stimulated by cross-linking That is to say.                                   Example 3                 Molecular cloning of TCR α chain from Ts cells   Inaba, et al. Described a gene encoding a TCRa chain derived from 231F1 cells. (Inaba, et al., Supra). MRNA of 231F1 cells And ligated using T4 ligase to cyclize did. An antisense oligonucleotide corresponding to nucleotides 47 to 24 in the Cα region gene; And nucleotides corresponding to nucleotides 366 to 389 in this region. PCR was carried out using lignonucleotides (see Example 1). Increased by PCR The cloned DNA was subcloned and screened using the Cα gene probe. I did it. Depending on the nucleotide sequence of the DNA insert in the positive clone, the fusion partner BW Existence of unique VαJα gene different from that derived from 5147 Was. Two clones of the five DNA inserts analyzed had the same sequence . The deduced amino acid sequence of the Vα region is that of Vα11.3 except for 3 amino acids. (Jameson, et al., J. Immunol., 147: 3185, 1991) (FIG. 2). twenty three Although the Jα region in the VαJα gene from 1F1 cells was unique, Kappler and Pa Jα-3DT described by Lomer (Yague, et al., Nucl. Acids Res., 16: 11355, 1). 988) and 86% homology. FIG. 2A shows the full-length TCRa chain cDN derived from 231F1 cells. 1 shows the nucleotide sequence of A and the deduced amino acid sequence. L, V, J, C are Lee , The Vα region, the Jα region and the Cα region. FIG. 2B shows c of tag-TCRa. Shows the nucleotide sequence of the 3 'end of the DNA.   Whether the unique TCRα chain in 231F1 cells has a complete Cα region To determine, the Cα gene of the TCRa chain was cloned. MRN of 231F1 A, a single-stranded cDNA was synthesized, and a primer specific to Vα11.3 (nuclease in FIG. 2) PCR was carried out using otides 146-169) and oligo dT. The reaction mixture The DNA fragment containing the Cα gene was diluted 100-fold and the nucleotide fragment in Vα11.3 was PCR was performed using primers 213 to 234 and primers specific to the Cα 3 ′ end. two The DNA fragment amplified by the second PCR was subcloned, and the nucleotide Sequence was determined. The results show that the nine clones obtained in this experiment Eight have the complete nucleotide sequence of the Cα gene and 231F1 cells It was shown to have a good TCRa chain (the complete sequence is shown in Figure 2A).   Nucleotides 1-437 and PCR reaction buffer without primers And cDNAs of TCRa corresponding to 213 and 804 were cut and the ends were truncated. By mixing equal amounts of the two fragments, cloning of the full-length TCRa-cDNA Was completed. The full-length cDNA thus obtained was amplified by PCR, and pEFneo The TCRα gene that expresses TCRβ and CD3 but is functional The transfected T cell line 175.2, which lacks E. coli (Glaichenhans, et al., Supra). m Stable from each clone with Vα11.3 cDNA by Northern blot of RNA T cell clones that select the highest transfectants and express the highest amount of α-chain mRNA Was established. E106, a representative clone, was measured by immunofluorescence. Expressed TCRαβ and CD3 on the cell surface, but cells of the original 175.2 cell line Neither D3 nor anti-TCR β chain could be stained. E106 cells synthesize TCRa chains To confirm this, stable transfectants were cultured in DMEM and 09Cell lysate from individual cells was adsorbed to Affigel coupled with H28-710 . The acid eluate fraction from the immunosorbent was analyzed by SDS-PAGE and then analyzed for mA Immunoblot with H28-710 in b, the 35 kDa plasmid bound to this mAb The presence of the peptide was revealed.   As expected, the cell lysate of the 175.2 clone was fractionated in the same manner and H28-710-Aff Analysis of the acid eluate from the igel by immunoblot revealed that the peptide was detected. Did not. FIG. 3 shows the immunity of the TCRa chain obtained from the stable transfectant E106. 4 shows the results of blot analysis. 175.2 cell line not transfected with E106 cells Cell lysate of cells is adsorbed to Affigel coupled with H28-710 and retained on the column. The recovered protein was recovered by acid elution (lysate). Stab E106 cells with anti-CD3 Vigorously, the culture supernatant was fractionated with the same immunosorbent (supernatant). The eluted fraction is based on H28-710 Were analyzed by immunoblotting.   Testing the possibility that E106 clones release soluble TCRa chains or their derivatives To do so, cells were stimulated with anti-CD3. The culture supernatant (300 ml) is concentrated, and RGG Adsorbed to Affigel coupled with Affigel Fractionated by gel. The acid-eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting. No peptide binding to the monoclonal anti-TCRa chain was detected (Fig. 3). . It appears that E106 cells failed to secrete the TCRa chain or a derivative thereof.                                   Example 4                  Production of TCRa chain gene product by Ts cells   Ts hybridoma 231F1 generates antigen-specific GIF upon antigen stimulation, The factor binds to Affigel coupled to H28-710, so that Ts hybridomas Over-expression of the TCRα chain increases the production of this antigen-specific factor. A test was performed to determine whether That is, the TCR α chain cDNA is Transfected into hybridomas to establish stable transfectants. Using the transfected cell clone as a probe with the Vα11.3 cDNA fragment The mRNA used was selected by Northern blot analysis. The highest Vα11.3+ A sample of a representative clone 211α expressing mRNA was stimulated with anti-CD3 or Was cultured without stimulation. After culturing in serum-free medium for 24 hours, the culture supernatant is concentrated 20 times. Were analyzed by immunoblot using mAb H28-710.   FIG. 4 shows a stable transfectant obtained by adding TCR α chain cDNA to 231F1 cells. 2 shows the production of a 55 kDa peptide by G. FIG. 4A shows the transfected Shows stable transfectant 211α cells stimulated with 231F1 cells and anti-CD3 . Concentrate culture supernatant of unstimulated cells (-) or cells stimulated with CD3 (+) And analyzed by immunoblot using H28-710. FIG. 4B shows an anti-CD3 sting. Culture supernatant of 211α cells fractionated with H28-710 Affigel and H28-710 or polyclonal Figure 3 shows the acid-eluted fractions analyzed by immunoblot with internal anti-GIF.   As shown in FIG. 4A, the culture supernatant of 211α cells stimulated with anti-CD3 was m Non-stimulated cells containing a 55 kDa peptide that binds to Ab H28 This peptide was not detected in the culture supernatant of. Confirm immunoblotting specificity Cultures of cells stimulated with anti-CD3 were analyzed by Affig coupled with H28-710. El was adsorbed and the acid-eluted fraction was analyzed by immunoblot. It is shown in FIG. 3B Thus, the 55 kDa peptide was recovered in the acid eluate. 23 stimulated with anti-CD3 As expected from the above observation results (FIG. 1) in the culture supernatant of 1F1 cells, 55 kDa peptide in the affinity-purified preparation as determined by immunoblot. Tide bound not only H-28 but also anti-GIF (FIG. 4B). Consistent with this finding GIF bioactivity was detected in a 1:40 dilution of the acid eluted fraction, but this activity was No detectable was found in a 1: 2 dilution of the run-through fraction from 28 Affigel. Original culture Titration of GIF bioactivity in the culture supernatant resulted in more than 50% activity in this culture supernatant Was recovered in the acid-eluting fraction of H-28 Affigel. 55kDa pep Since tide is the only peptide with a GIF determinant in the preparation (FIG. 4B), This GIF biological activity appears to be related to this peptide.   Stable transfectants of TCR α chain cDNA should not be transfected. Produced more 55 kDa peptide than 231F1 cells. Confirm this observation For this, 231F1 cells were stimulated with anti-CD3 in the same manner, and the culture supernatant was used for H28-710-A Fractionated by ffigel. Most of the GIF biological activity of the original culture supernatant was from immunosorbents. This fraction was collected in the acid-eluted fraction, and this fraction was immunoblotted against mAb H28-710. It contained a 55 kDa peptide that bound to both GIFs. 211α cells and 231F1 Serial two-fold dilutions of affinity purified material obtained from cells were When analyzed by lot, the 55 kDa peptide formed in 211α cells It was shown to be about 10 times more than that produced by 31F1 cells. TCR α chain cDNA It was clear that transfection of You.   To confirm that this 55 kDa peptide is a product of TCRa cDNA The nucleotide sequence encoding a peptide of six histidine residues is Ligated to the 3 'end of the strand cDNA (see FIG. 2B. nt sequence) and this TCRa-tag gene was transfected into 231F1 cells. Representative stable transfectants and untransfected 231F1 cells Samples were cultured with or without anti-CD3 stimulation. One of the concentrated culture supernatant Part was adsorbed to Ni-NTA Agarose, and the protein retained on the column was It was eluted with dazole and collected.   FIG. 5 shows stable transfectants of TCRa-tag gene in 231F1 cells. 1 shows the results of the production of a 55 kDa peptide having a His-tag according to the invention. In FIG. 5A As shown, stable transfectants F5, F12 and F15 Samples of 231F1 cells that were not transfected with rabies were stimulated (-) or After treatment with CD3 mAb, (+) culture was performed. The culture supernatant is concentrated, and SDS-PA Analyzed by immunoblotting with GE and H28-710. Stimulated with anti-CD3 The cell culture supernatant contained the 55 kDa peptide with the TCRa determinant. In FIG. 5B, the peptide containing His was affinity-purified using Ni-NTA agarose. -Purified and eluate analyzed by immunoblot with H28-710. Stable transfer Affinity-purified 55 kDa derived from the 231F1 cells The peptide did not bind to Ni-NTA agarose.   As shown in FIG. 5A, all culture supernatants of cells stimulated with anti-CD3 were Of unstimulated cells that contained the 55 kDa peptide that binds to H28-710 This peptide was not detected in the culture supernatant. This result also shows a stable 55 kDa peptide derived from Spectactant binds to Ni-NTA Agarose but 231F1 The same peptide from cells did not bind (FIG. 5B).   55 kDa peptide in the eluate of Ni-NTA Agarose was obtained from H-28 Affigel A representative stable transfectant to make sure it is the same as the one Stimulate F12 with anti-CD3 and cup culture supernatant with Ni-NTA Agarose or H28-710 And fractionated on a reduced Affigel. Immobilized proteins immobilized on the adsorbent Was recovered by elution with glycine HCl buffer (pH 3.0) and analyzed by immunoblotting. Was analyzed.   FIG. 6 shows a stable transfector containing a TCRa-tag gene in 231F1 cells. Shows that the H.sup.t produces a 55 kDa peptide with a His tag. F12 Stimulate the lawn with anti-CD3 and wash the culture supernatant with Ni-NTA agarose or H28-710 Affigel Fractionated. Elute from the column with monoclonal H28-710 or polyclonal Were analyzed by immunoblot with anti-GIF. Cα determinant and GIF The 55 kDa peptide having a determinant was obtained from both Ni-NTA agarose and H28-710 Affigel. Was detected in the eluted fraction.   As shown in FIG. 6, both preparations were H28-710 and polyclonal. It contained a 55 kDa peptide that binds to anti-GIF. Culture as expected Most of the GIF biological activity in the supernatant binds to H-28 Affigel and is recovered by acid elution Was done. The eluted fraction from Ni-NTA Agarose was present in the original culture supernatant It was also found to contain about 1/2 of GIF biological activity. In the original culture supernatant The remaining half of the existing GIF bioactivity was not retained by Ni-NTA Agarose and passed The activity in the eluted fraction does not seem to be due to impurities. It contains 1 mM imidazole before eluting with 100 mM imidazole. This is because the column was thoroughly washed with PBS. In addition, unstimulated F12 cells GIF bioactivity in the culture supernatant was not retained in Ni-NTA Agarose. these Overall, the results show that the 55 kDa peptide is the product of the TCR α chain cDNA, And that GIF biological activity is associated with this peptide.                                 Example 5         55 kDa peptide is a subunit of antigen-specific GIF   To determine whether the 55 kDa peptide is indeed an antigen-specific GIF An experiment was performed. Stimulate stable transfectant 211α cells with anti-CD3, The culture supernatant was fractionated on an Affigel column coupled with H28-710. As expected, T The 55 kDa peptide carrying the CRα determinant binds to the immunosorbent and has an acidic pH Was recovered by elution. Next, this acid eluate was coupled with OVA by Sepharos Fractionated by e. About 2/3 to 3/4 of GIF biological activity in fraction eluted from H-28 Affigel Bound to OVA-Sepharose and recovered by acid elution. OVA-Sepharose? Immunoblot analysis of the acid eluate and pass-through fractions revealed a 55 kDa peptide. Is detectable in the eluted fraction, but the through fraction is substantially higher than the acid eluted fraction 55 kDa peptide. This result shows that 55k Da peptide is a subunit of antigen-specific GIF, Some of the peptides released from the octant failed to bind to OVA-Sepharose That's what it means.   Antigen-specific GIF derived from 231F1 cells is not only anti-TCRa chain but also Affigel. Coupled mAb anti-TCR β-chain, ie, H-57-597 (Iwata, et al., J. Immun ol., 143: 3917, 1989), and culture of 211α cells stimulated with anti-CD3. The supernatant was fractionated on an Affigel column coupled with H57-597. Retained by immunosorbent The recovered protein was recovered by acid elution. Pass-through fraction is adsorbed on H28-710-Affi Then, the protein bound to the anti-TCRa immunoadsorbent was recovered. Anti-TCRβ (Lae 1) and anti-TCRa (lane 2) eluted fractions were used for immunoblotting using H28-710. Analyzed by As expected, most of the GIF bioactivity in the original culture supernatant (70-80%) was recovered in the acid-eluted fraction from the H-57-597 column, Including 55 kDa band binding to mAb H-28 in stunt blot analysis (FIG. 7). However, the mAb H-57-597 was found in immunoblot analysis of this fraction. Did not detect any peptides. So, from H57-597-Affigel Absorbed fraction was adsorbed to H28-Affigel, and the protein retained on the column was converted to GIF Product activity and immunoblot. The result is, obviously, a considerable amount H-28+Affige that 55kDa peptide binds to H-57-597 but couples with H28-710 l indicates that it did not bind. However, the GIF biological activity of this fraction is H Approximately 1/4 to 1/3 of those present in the eluate from -57-597-Affigel. This result The results suggest that a minor portion of the 55 kDa peptide reacts with H57-597. 55k secreted from 211α cells A significant portion of the Da peptide is not associated with this peptide . Without intending to be bound by any particular theory, this peptidic binding to anti-TCRβ antibody Is presumed to be necessary for the 55 kDa GIF to bind to the antigen.   While the invention has been described with reference to the presently preferred embodiment, the scope of the invention is not to be construed as limiting the invention. It was understood that various modifications could be made without departing from the scope No. Accordingly, the invention is limited only by the following claims. .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // C12P 21/08 A61K 37/02 (C12P 21/00 C12R 1:91)

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）ポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドを単離する方法であって、 ａ）サプレッサーＴ細胞を活性化することによりＴ細胞におけるＡｇＧＩＦ遺伝 子の発現を誘発させ、 ｂ）サプレッサーＴ細胞ポリヌクレオチドを、非特異的ＧＩＦポリヌクレオチド にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびＴＣＲαポリヌクレオチドにハ イブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させ、 ｃ）非特異的ＧＩＦオリゴヌクレオチドおよびＴＣＲαオリゴヌクレオチドの両 者にハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する、ことを含んでなる方法。 ２． サプレッサーＴ細胞の活性化がＣＤ３またはＴ細胞表面受容体を架橋す ることである、請求項１記載の方法。 ３． サプレッサーＴ細胞の活性化が抗原でパルスされた同系マクロファージ で刺激することである、請求項１記載の方法。 ４． 非特異的ＧＩＦポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドが配列 番号１に由来する、請求項１記載の方法。 ５． ＴＣＲαポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドがＴＣＲαヌ クレオチド配列の定常領域に由来する、請求項１記載の方法。 ６． ＡｇＧＩＦをコードするポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記 載の方法。 ７． ＡｇＧＩＦをコードするポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記 載の方法。 ８． 実質的に純粋で生物学的に活性な抗原特異的グリコシル化阻害因子（Ａ ｇＧＩＦ）を組換え生産する方法であって、 ａ）式Ｒ1−Ｒ2（式中、Ｒ1は非特異的ＧＩＦであり、Ｒ2はＴＣＲα鎖である） をもつ配列を有する融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質 転換された宿主細胞を、前記ポリヌクレオチド配列の発現が可能となる条件下で 培養し、 ｂ）実質的に純粋なＡｇＧＩＦを単離する、ことを含んでなる方法。 ９． Ｒ1がマウス由来である、請求項８記載の方法。 １０． Ｒ1がヒト由来である、請求項８記載の方法。 １１． 宿主細胞が真核細胞である、請求項８記載の方法。 １２． 宿主細胞がＣＯＳ細胞である、請求項１１記載の方法。 １３． 実質的に純粋な抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）ポリペプチドを単離 する方法であって、 ａ）サプレッサーＴ細胞を活性化することによりＴ細胞における遺伝子の発現を 誘発させ、 ｂ）サプレッサーＴ細胞発現産物を、非特異的ＧＩＦポリペプチドに結合する抗 体および／またはＴＣＲαポリペプチドに結合する抗体と接触させ、 ｃ）非特異的ＧＩＦに結合する抗体およびＴＣＲαに結合する抗体の両者に結合 するポリペプチドを単離する、ことを含んでなる方法。 １４． サプレッサーＴ細胞の活性化がＣＤ３またはＴ細胞表面受容体を架橋 することにより行われる、請求項１３記載の方法。 １５． サプレッサーＴ細胞の活性化が抗原でパルスされた同系マクロファー ジで刺激することにより行われる、請求項１３記載の方法。 １６． ＧＩＦポリペプチドに結合する抗体が配列番号２に由来するエピトー プに結合する、請求項１３記載の方法。 １７． ＴＣＲαポリペプチドに結合する抗体がＴＣＲαポリペプチドの定常 領域に由来するエピトープに結合する、請求項１３記載の方法。 １８． 免疫抑制量の組換え抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）をヒトに投与し 、免疫応答を抑制することからなる、抗原に対するヒトの免疫応答を抑制する方 法。 １９． 投与が非経口である、請求項１８記載の方法。 ２０． 非経口投与が皮下、筋肉内、腹膜内、洞内、経皮および静脈内より成 る群の中から選択されるルートである、請求項１９記載の方法。 ２１． 投与量が一回当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇである 、請求項２０記載の方法。 ２２． 投与量が一回当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇで ある、請求項２１記載の方法。 ２３． 免疫抑制量の実質的に精製された組換え抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩ Ｆ）と医薬品として不活性な担体とを含む医薬組成物。 ２４． ＡｇＧＩＦがヒト由来である、請求項２３記載の医薬組成物。 ２５． 抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）をコードする、単離されたポリヌク レオチド配列。 ２６． 抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）をコードするポリヌクレオチドがＤ ＮＡである、請求項２５記載のポリヌクレオチド。 ２７． 抗原特異的ＧＩＦ（ＡｇＧＩＦ）をコードするポリヌクレオチドがＲ ＮＡである、請求項２５記載のポリヌクレオチド。 ２８． 実質的に純粋で生物学的に活性な抗原特異的グリコシル化阻害因子（ ＡｇＧＩＦ）を組換え生産する方法であって、 ａ）非特異的ＧＩＦを発現する宿主細胞であって、ＴＣＲα鎖をコードするポリ ヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、前記ポリヌクレオチド配列の発 現が可能となる条件下で培養し、 ｂ）実質的に純粋なＡｇＧＩＦを単離する ことを含んでなる方法。 ２９． 宿主細胞がＴｓ細胞である、請求項２８記載の方法。 ３０． 宿主細胞がマウスである、請求項２８記載の方法。 ３１． 宿主細胞がヒトである、請求項２８記載の方法。 ３２． さらに、ＴＣＲβを含む、請求項１８または２８に記載の方法。 ３３． 請求項１記載の方法によって単離されたＡｇＧＩＦポリヌクレオチド 。 ３４． 請求項８または１３記載の方法によって生産されたＡｇＧＩＦポリペ プチド。[Claims] 1. A method for isolating a polynucleotide encoding an antigen-specific GIF (AgGIF) polypeptide, comprising: a) activating suppressor T cells to induce expression of the AgGIF gene in T cells; b) suppressing suppressor T cells Contacting the polynucleotide with an oligonucleotide that hybridizes to a non-specific GIF polynucleotide and an oligonucleotide that hybridizes to a TCRα polynucleotide; c) a polynucleotide that hybridizes to both a non-specific GIF oligonucleotide and a TCRα oligonucleotide Is isolated. 2. 2. The method of claim 1, wherein activating suppressor T cells is cross-linking CD3 or a T cell surface receptor. 3. 2. The method of claim 1, wherein the activation of the suppressor T cells is stimulating with syngeneic macrophages pulsed with the antigen. 4. 2. The method of claim 1, wherein the oligonucleotide that binds to a non-specific GIF polynucleotide is derived from SEQ ID NO: 1. 5. 2. The method of claim 1, wherein the oligonucleotide that binds to the TCRa polynucleotide is derived from a constant region of a TCRa nucleotide sequence. 6. The method according to claim 1, wherein the polynucleotide encoding AgGIF is DNA. 7. 2. The method according to claim 1, wherein the polynucleotide encoding AgGIF is RNA. 8. A method for recombinantly producing a substantially pure, biologically active, antigen-specific glycosylation inhibitor (AgGIF) comprising: a) a compound of the formula R 1 -R 2 , wherein R 1 is a non-specific a GIF, R 2 is a host cell transformed with a polynucleotide sequence encoding a fusion polypeptide having a sequence having at which) TCR a chain, are cultured under conditions in which expression of the polynucleotide sequences can be achieved B) isolating substantially pure AgGIF. 9. R 1 is derived from a mouse, The method of claim 8. 10. R 1 is human The method of claim 8. 11. 9. The method according to claim 8, wherein the host cell is a eukaryotic cell. 12. The method according to claim 11, wherein the host cell is a COS cell. 13. A method of isolating a substantially pure antigen-specific GIF (AgGIF) polypeptide, comprising: a) activating suppressor T cells to induce expression of a gene in the T cells; b) expressing suppressor T cells. Contacting the product with an antibody that binds a non-specific GIF polypeptide and / or an antibody that binds a TCRa polypeptide; c) a polypeptide that binds both an antibody that binds a non-specific GIF and an antibody that binds TCRa Is isolated. 14． 14. The method of claim 13, wherein the activation of suppressor T cells is performed by crosslinking CD3 or a T cell surface receptor. 15. 14. The method of claim 13, wherein activation of suppressor T cells is performed by stimulating with syngeneic macrophages pulsed with an antigen. 16. 14. The method of claim 13, wherein the antibody that binds to a GIF polypeptide binds to an epitope derived from SEQ ID NO: 2. 17． 14. The method of claim 13, wherein the antibody that binds to the TCRa polypeptide binds to an epitope derived from the constant region of the TCRa polypeptide. 18. A method for suppressing a human immune response to an antigen, comprising administering an immunosuppressive amount of a recombinant antigen-specific GIF (AgGIF) to a human and suppressing the immune response. 19. 19. The method of claim 18, wherein the administration is parenteral. 20. 20. The method of claim 19, wherein parenteral administration is a route selected from the group consisting of subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intrasinusal, transdermal, and intravenous. 21. 21. The method of claim 20, wherein the dose is about 0.001 mg / kg to about 2 mg / kg per dose. 22. 22. The method of claim 21, wherein the dose is about 0.001 mg / kg to about 0.2 mg / kg per dose. 23. A pharmaceutical composition comprising an immunosuppressive amount of a substantially purified recombinant antigen-specific GIF (AgGIF) and a pharmaceutically inert carrier. 24. 24. The pharmaceutical composition according to claim 23, wherein the AgGIF is of human origin. 25. An isolated polynucleotide sequence encoding an antigen-specific GIF (AgGIF). 26. The polynucleotide according to claim 25, wherein the polynucleotide encoding antigen-specific GIF (AgGIF) is DNA. 27. The polynucleotide according to claim 25, wherein the polynucleotide encoding antigen-specific GIF (AgGIF) is RNA. 28. A method for recombinantly producing a substantially pure, biologically active antigen-specific glycosylation inhibitor (AgGIF) comprising: a) a host cell expressing non-specific GIF, wherein the host cell encodes a TCRα chain; Culturing a host cell transformed with said polynucleotide sequence under conditions that allow expression of said polynucleotide sequence; and b) isolating substantially pure AgGIF. 29. 29. The method according to claim 28, wherein the host cell is a Ts cell. 30. 29. The method according to claim 28, wherein the host cell is a mouse. 31. 29. The method according to claim 28, wherein the host cell is human. 32. 29. The method of claim 18 or 28, further comprising TCRβ. 33. An AgGIF polynucleotide isolated by the method of claim 1. 34. An AgGIF polypeptide produced by the method of claim 8 or 13.
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