JPH11505126A - プライマーシリーズ集団を使用する広い動的範囲の核酸検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、検査試料中に存在し得るターゲット配列の量を検出する方法を提供する。この方法は、検査試料中に存在し得るターゲット配列の相対濃度を検出するために、増幅反応で少なくとも二つのプライマーセットからなるプライマーシリーズ集団を使用する。プライマーセットは互いに異なる感度を有し、ターゲット配列の異なる部分からなるサブターゲット配列とハイブリダイズする。この方法は一般的には、ターゲット配列を含んでいる疑いのある検査試料とプライマーシリーズ集団と増幅反応の実施に必要な手段とをサイクルにかけ、増幅サブターゲット配列を検出することからなる。個々のプライマーセットによって生成された増幅サブターゲット配列の定量的検出に基づいて、ターゲット配列の相対量を決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 プライマーシリーズ集団を使用する広い動的範囲の核酸検出 発明の分野 本発明は、検査試料中に存在し得る核酸配列を増幅し検出するための方法、特 に、検査試料中に存在し得る核酸配列を定量的に検出する方法に関する。発明の背景 検査試料中に存在し得るターゲット核酸配列を増幅する方法は、現在では当業 者に良く知られている。この種の方法には、米国特許明細書第４，６８３，１９ ５号及び第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、欧 州特許出願公開明細書第３２０,３０８号に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ） 、欧州特許出願公開明細書第４３９，１８２号に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣ Ｒ）、国際特許出願公開明細書第９３／２０２２７号に記載のマルチプレックス ＬＣＲ等がある。これらの方法は、医療診断分野、並びに遺伝学、分子生物学及 び生化学の分野で広く使用されるようになった。不都合なことに、核酸増幅反応 の短所の一つは、主に定性的であるという点にある。 増幅反応のこのような性質は、検査試料中に存在し得るターゲット配列の存在 を定量的に検出するための増幅反応の使用を困難にする。従って従来の増幅反応 は、検査試料中の微量のターゲット配列の存在を検出する場合には有用であるが 、検査試料中のターゲット配列の量を決定する場合には通常使用できない。しか しながら、定量的増幅反応分析が可能なように従来の増幅反応を改変した方法が 開発された。 或る定量的増幅反応は「競合増幅」と称する。この方法は通常ＰＣＲに適用さ れる。競合増幅反応では、増幅反応中に標準核酸配列がターゲット配列と競合す る。通常は、標準配列と、ターゲット配列を含んでいる疑いのある試料とを、標 準配列の量が総ての希釈物中で一定であるような一連の希釈物中で一緒にする。 あるいは、標準配列と試料配列を、標準配列の量が希釈物毎に異なるような一連 の希釈物中で一緒にする。いずれの場合も、一連の希釈物の各希釈物中の標準配 列濃度は既知である。次いで、一連の希釈物の総ての希釈物についてＰＣＲを実 施すると、２種類の核酸配列の混合物が形成される。標準配列に由来する核酸配 列と、試料配列に由来する核酸配列である。特定希釈物中の核酸配列の濃度は、 増幅前の希釈物中の標準配 列及び試料配列のコピー数に依存する。典型的には、どちらの種類の配列にも、 増幅反応中に検出可能基を導入する。増幅後は前記２種類の核酸を分離し、それ ぞれの核酸配列中に導入された検出可能基の量を測定する。この検出操作を、一 連の希釈物の各希釈物毎に実施する。次いで競合曲線を作成し、既知の標準配列 量に基づいて試料配列の量を推算すればよい。 競合増幅方法は、米国特許明細書第５，２１９，７２７号、Ｋｉｎｏｓｈｉｔ ａ Ｔ．ら，Ａｎａｌａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０６： ２３１−２３５(１９９２)、及びＪａｌａｖａ Ｔ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ １５：（１），１３４−２０５（１９９３）に記述されている。これらの 競合増幅方法は有用性を示したが、たくさんの量の試料準備及び技術者介入を必 要とし、それに付随して試料汚染の危険を伴う。また、標準配列を使用するため 、従来の増幅反応では必要とされない試薬も必要である。更に、一連の希釈物の 各希釈物について増幅を実施するため、単一試料について増幅を実施する場合よ り多くの試薬が必要とされる。これらは総て、競合増幅反応の実施コストを増加 させる要因である。 別の競合増幅反応は「反応動力学増幅分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）」である。この方法は、染料 が二本鎖核酸配列に結合する能力を利用する。例えば、ＰＣＲは通常、二本鎖核 酸配列を生成する。臭化エチジウムのような二本鎖核酸配列に結合する染料の存 在下では、連続的ＰＣＲ増幅ラウンドに伴って蛍光の増加が観察される。検査試 料中のターゲット核酸配列の量が多ければ多いほど、蛍光の増加はより早く観察 される。 反応動力学増幅分析は、Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ １１：１０２６−１０３０(１９９３)に記述されている。不都合なことに 、増幅反応の効率は試料毎に変化し得る。そのため、二つの試料がターゲット配 列を同等の濃度で含んでいても、反応動力学増幅分析では二つの試料について互 いに異なる蛍光量が示され得る。従って、この方法は臨床的用途では必ずしも有 用ではない。なぜなら、このような用途では、アッセイすべき試料の種類が多岐 にわたるからである。 そのため、技術者による操作又は試薬を過剰に必要とせず、臨床的実験用途で 使用できるような、定量的増幅反応実施方法が必要とされている。発明の概要 本発明は、一連の希釈物の調製を必要とせず、従って多量の試薬及び技術者介 入を必要とせずに、検査試料中のターゲット配列の相対量又は概算量を検出する 方法を提供する。一般的には、本発明の方法は、ターゲット核酸配列を含んでい る疑いのある検査試料を、ターゲット核酸配列の第一のサブターゲット部分とハ イブリダイズできる第一のプライマーセットと、ターゲット核酸配列の第二のサ ブターゲット部分とハイブリダイズできる第二のプライマーセットとを含む核酸 増幅反応混合物に接触させることからなる。ターゲット配列の第一及び第二のサ ブターゲット部分は互いに異なり、第一及び第二のプライマーセットは、第一の プライマーセットは必ずターゲット配列の第一の閾値濃度かそれ以上の濃度の時 にのみ検出可能増幅物を生成することができ、第二のプライマーセットは必ずタ ーゲット核酸配列の第二の閾値濃度かそれ以上の濃度の時にのみ検出可能増幅物 を生成することができるように、選択される。プライマーセットが検出可能増幅 物を生成できる閾値濃度も互いに異なる。 ターゲット配列と反応混合物とを接触させた後、得られた混 合物を、検査試料がターゲット核酸配列をプライマーセットによる検出可能増幅 物の生成が可能な閾値濃度又はそれ以上の濃度で含んでいる場合に、少なくとも 一方のプライマーセットから検出可能増幅物を生成させるのに十分な増幅条件下 におく。少なくとも一方のプライマーセットから生成された増幅物があればそれ を反応混合物中で検出して、検査試料がターゲット核酸配列を本質的に前記プラ イマーセットに対応する閾値濃度又はそれ以上の濃度で含んでいたかどうかを決 定する。 プライマーセットは種々の増幅反応プロトコルで使用し得るが、好ましくはＬ ＣＲ又はＰＣＲプロトコルに従って使用する。また、個々のプライマーセットの プライマーは、生成され得るサブターゲット配列コピーの検出を容易にするため に標識を有し得る。図面の簡単な説明 第１図は、増幅した核酸配列の検出に使用できるイムノクロマトグラフィース トリップを示す説明図である。 第２図ａ及び第２図ｂは、増幅反応混合物と増幅した核酸配列の検出に必要な 試薬とに接触させる前又は接触させた後のイムノクロマトグラフィーストリップ の推測説明図である。 第３図及び第４図は、単一反応容器内に入れた二つの異なるターゲット配列を 一対のＰＣＲプライマーセットを使用して増幅する増幅反応の生成物を検出する ために使用したゲルの写真である。プライマーセット及びターゲット配列の濃度 については後述の実施例２でより詳細に説明する。発明の詳細な説明 本発明は、試料の実質的な操作又は準備を必要としない。例えば、本発明の方 法は一連の希釈物の形成を必要としない。あるいは、本発明の方法では、検査試 料中に存在し得るターゲット配列の相対量を決定するために複数の増幅反応を実 施する必要がない。従って、本発明の方法は単一反応器で実施することができ、 そのため過剰な試料操作に伴う汚染の問題が軽減される。また、本発明の方法の 実施に必要な試薬の量もより少ない。これらの理由及び後で明らかにされる他の 理由によって、本発明の方法は容易に自動化できる。 本発明の方法は、プライマーセット（「プローブセット」とも称する）を使用 してターゲット核酸配列を増幅する核酸増幅反応（以後「増幅反応」と称する） に適用できる。要約すれば、本発明の方法は、検査試料中に存在し得るターゲッ ト配列の相 対濃度を検出するために、増幅反応で、少なくとも二つのプライマーセットから なる「プライマーシリーズ集団（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｒｉ ｅｓ）」を使用する。本発明の方法は一般的には、ターゲット配列を含んでいる 疑いのある検査試料を、プライマーシリーズ集団と増幅反応の実施に適した別の 試薬とを含む核酸増幅反応混合物に接触させることからなる。前記反応混合物は 次いで、プライマーシリーズ集団を構成するプライマーセットがターゲット配列 の一部である任意の「サブターゲット配列」とハイブリダイズしこれを増幅させ ることができるような増幅条件にかけ得る。次いで、増幅したサブターゲット配 列の存在を検出すればよい。個々のプライマーセットによって生成された増幅サ ブターゲット配列を総称して「増幅物」と呼ぶ。プライマーシリーズ集団を構成 する個々のプライマーセットによって生成された増幅物の定量的検出に基づいて 、ターゲット配列の概算量を決定することができる。特定的には、本発明で使用 する個々のプライマーセットが、「閾値濃度」のターゲット配列の存在下で検出可 能増幅物を生成するため、個々のプライマーセットからの検出可能なシグナルに より、検査試料中に当該プライマーセットの閾値濃度と少なく とも同じ濃度のターゲット配列が存在することが示される。一方、個々のプライ マーセットによって検出可能増幅物が生成されなければ、ターゲット配列は本質 的に、当該プライマーセットの閾値濃度又はそれ以上の濃度で存在しないと決定 し得る。 ここで本発明の方法をより詳細に説明する。検査試料は、典型的には、ターゲ ット配列を含んでいる疑いのある任意の物質である。検査試料は、当業者に公知 の方法、例えば患者から試験片を採取し、必要であればその中に含まれている細 胞を破壊して核酸を放出させる方法により調製し得る。プライマーシリーズ集団 を構成する個々のプライマーセットを、複数の個別容器内に入れた検査試料と接 触させることができることは理解されよう。しかしながら好ましくは、プライマ ーシリーズ集団を単一容器内に入れた検査試料と接触させる。 ターゲット配列は通常、プライマーシリーズ集団を構成するプライマーセット がハイブリダイズする少なくとも二つのサブターゲット配列を含む核酸配列（例 えばＲＮＡ又はＤＮＡ）である。サブターゲット配列は、相対量を本発明の方法 で決定できる遺伝子又は生体中に特徴的に存在しているという意味で、ターゲッ ト配列に特有のサブセットである。典型的には、サブ ターゲット配列は一定のコピー数でターゲット配列内に存在し、好ましくは、サ ブターゲット配列はターゲット配列内に１対１の比率で存在する。従ってターゲ ット配列は、特徴的なサブターゲット配列又は部分を含んでいると推測される任 意の配列からなり得る。 ターゲット配列は、一本鎖配列、二本鎖配列、連続配列であり得、又は、個々 のプライマーセットが例えば遺伝子、遺伝子フラグメントもしくは余分な染色体 核酸配列であり得る任意のサブターゲット配列とハイブリダイズして増幅を行う のに十分な連続性を配列の部分を有する限り、フラグメント化配列であってもよ い。ターゲット配列全体の配列が不明であっても、サブターゲット配列の少なく とも一部分は既知であるのが普通である。例えば、ＰＣＲを使用する場合にはサ ブターゲット配列の両端は既知であり、ＬＣＲを使用する場合にはサブターゲッ ト配列全体が既知である。 本発明の方法は、例えば細菌又はウイルスのゲノムのように少なくとも１Ｋｂ を有するのが典型的なターゲット配列の概算量を決定する場合に特に有用である 。例えば、ターゲット配列は、サブターゲット配列がＭＯＭＰ遺伝子、ＬＰＳ遺 伝子及び ／又はクリプチック（ｃｒｙｐｔｉｃ）プラスミドの部分からなり得るＣｈｌａ ｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ のような微生物のゲノムを含み得る。ある いは、前記三つの部分のいずれか一つに、総てのサブターゲット配列が存在し得 る。また、ウイルスゲノムがターゲット配列を含み、サブターゲット配列がウイ ルスゲノム内に特徴的に存在する配列を含み得る。例えば、ＨＩＶゲノムのサブ ターゲット配列は、Ｐ２４抗原をコードする遺伝子及びｐｏｌ遺伝子の部分を含 み得る。あるいは前述と同様に、総てのサブターゲット配列が、Ｐ２４抗原をコ ードする遺伝子又はｐｏｌ遺伝子のいずれかに存在し得る。 プライマーシリーズ集団は、別個のサブターゲットに特異的な少なくとも二つ のプライマーセットからなる。また、個々のプライマーセットの感度は典型的に は既知であり、個々のプライマーセットのうち少なくとも二つのプライマーセッ トの感度は互いに異なるか又は識別できる。プライマーシリーズ集団を含む溶液 とターゲット配列と増幅反応の実施に適した別の試薬とを増幅反応条件下におく と、プライマーセットがそれぞれのサブターゲット配列を増幅させる。それぞれ のサブターゲット配列はターゲット配列に特徴的なサブセットであるため、個々 のプライマーセットの感度は最終的に、ターゲット配列の濃度に依存する。個々 のプライマーセットが検出可能増幅物を生成し始める時のターゲット配列濃度を 、当該プライマーセットの閾値濃度と称する。閾値濃度の存在下では、プライマ ーセットは増幅物を検出可能な量で生成する。一方、閾値濃度の不在下では、個 々のプライマーセットによって生成された増幅物の量を検出することはできない 。このように、プライマーセットが検出可能増幅物を生成するか又は生成しない かは、検査試料中のターゲット配列の量に相関させることができ、閾値の異なる 二つ以上のプライマーセットを使用すれば、半定量的検出方法を実現することが できる。 少なくとも二つのプライマーセットの感度又は閾値濃度は、所与の濃度のター ゲット配列の存在下でプライマーセットを用いて増幅反応を実施することにより 容易に決定できる。増幅物が存在すれば、その検出によって、ターゲット配列濃 度が検出可能増幅物を生成させるのに十分な大きさであるかどうかを決定するこ とができる。例えば、「プライマーセットＡ」及び「プライマーセットＢ」を、 プライマーセットＡ及びプライマーセットＢが特異性を示すサブターゲット配列 からなるターゲット 配列を１０，０００分子含む検査試料と接触させ得る。次いで、得られた混合物 を増幅条件下におき、増幅物を検出すればよい。プライマーＡが検出されるほど 十分な増幅物を生成し、プライマーＢが増幅物を生成しなかった場合には、プラ イマーセットの感度が異なり、プライマーセットＡの閾値濃度が１０，０００個 のターゲット分子に一致するかそれ以上であると決定できる。従って、使用する プライマー濃度で、これらのプライマーセットの感度は「自然に」識別できる。 プライマーセットＡのより正確な閾値濃度は、ターゲット濃度を減少させながら 増幅反応を繰り返すことによって決定し得る。プライマーセットＢの閾値濃度は 、ターゲット配列の濃度を増加させながら増幅反応を更に実施することによって 決定し得る。プライマーセットＢが最初に検出可能増幅物を生成する時のターゲ ット配列濃度が、プライマーセットＢの閾値濃度となる。多数のプライマーセッ トの感度は、これらのプライマーセットを同一増幅反応で使用することによって 決定するのが好ましいが、多数のプライマーセットを別個の増幅反応で使用する ことによってこれらのプライマーセットの感度を個別に決定することもできる。 前述の方法で決定した感度はプライマーセットの「固有感 度」と称し、このような感度は通常、感度を測定した条件に固有のものである。 従って、あるプライマーセットを異なる増幅サイクル数で増幅反応に使用すると 、そのプライマーセットの感度は変化し得る。例えば、増幅サイクル数を増やす と、プライマーセットの閾値濃度が減少し得る。逆に、増幅サイクル数を減らす と、プライマーセットの閾値濃度が増加し得る。当業者には明らかなように、プ ライマーセットの感度又は閾値濃度は絶対的ではなく、本発明の思想及び範囲を 逸脱せずに、正確な閾値濃度に対する僅かな偏差が増幅反応毎に示され得る。従 って、プライマーセットが本質的に自己の閾値濃度又はそれ以上の濃度でのみ検 出可能増幅物を生成することが当業者に理解されよう。 場合によっては、即ち例えば、プライマーシリーズ集団を構成する二つ以上の プライマーセットの感度が自然には識別できないような場合には、プライマーセ ットの固有感度を変えることが望まれ得る。そのような場合には、一つ以上のプ ライマーセットの感度を調整し得る。プライマーセットの調整は通常、あるプラ イマーセットの感度を、該プライマーセットが別のプライマーセットの閾値濃度 と識別できる閾値濃度の存在下で検 出可能増幅物を生成するように変えることからなる。その結果、プライマーセッ トの間に「不均衡」が生じ、そのため増幅反応に使用されている個々のプライマ ーセットが互いに異なる閾値濃度で検出可能増幅物を生成する。このようにして 、プライマーシリーズ集団を構成する二つ以上のプライマーセットの感度が自然 には識別できない場合には、個々のプライマーセットのうちの少なくとも一つを 、該プライマーセットが別のプライマーセットと異なる閾値濃度の存在下で検出 可能増幅物を生成するように調整する。 個々のプライマーセットを調整するために使用する方法は選択の問題である。 プライマーセットの感度を調整するための好ましい方法の一つは、増幅反応で使 用するプライマーセットの濃度を変えることからなる。選択した閾値濃度の存在 下で、プライマーセットが検出可能増幅物を生成するであろうプライマーセット 濃度を正確に予測することは不可能である。しかしながら、この決定は簡単な実 験を通して経験的に行うことが容易である。通常は、所与数の増幅サイクルにわ たって増幅反応に使用するプライマーセットの濃度を増加させると、プライマー セットの感度が増加する。例えば、２５サイクルの増幅後に、 あるプライマーセットの１０ｎＭ濃度が１０，０００コピーのターゲット配列で 検出可能増幅物を生成していなければ、そのプライマーセットの感度は通常、増 幅反応におけるそのプライマーセットの濃度を増加させることによって増加させ ることができる。例えば、前記プライマーセットを１００ｎＭ濃度で使用すると 、２５サイクルの増幅後に１０，０００のターゲット配列の存在下で検出可能増 幅物が生成され得る。逆に、２５サイクルの増幅後に、あるプライマーセットの １０ｎＭ濃度が１０，０００コピーのターゲット配列で検出可能増幅物を生成し ていれば、そのプライマーセットの感度は通常、増幅反応におけるそのプライマ ーセットの濃度を低下させることによって減少させることができる。例えば、前 記プライマーセットを１ｎＭ濃度で使用して２５サイクルの増幅後に検出可能増 幅物を生成させるためには、１００，０００個のターゲット配列が必要とされ得 る。 プライマーセットの感度調整には、不完全に相補的なプライマー（「不適正プ ライマー」とも称する）も使用し得る。例えば、所与の増幅サイクル数の後に、 あるプライマーセットが１００コピーのターゲット配列の存在下で検出可能増幅 物を生 成すれば、そのプライマーセットが特異性を示すサブターゲット配列に適合しな いヌクレオチドをそのプライマーセット内に導入することによってその感度を低 下させることができる。即ち、調整したプライマーセットはターゲットに対して 完全には相補的ではない。このような調整プライマーセットはターゲットに対す る結合効率が低下しているため、所与数の増幅サイクル後に検出可能増幅物を生 成するためには、より多くのターゲット配列が必要とされ得る。従って、前記調 整プライマーセットは１，０００ターゲット配列の閾値濃度を有し得る。 ターゲット配列は、サブターゲット配列のコピーを多数含み得る。そのような 場合には、前記多重コピー配列に特異的な個々のプライマーセットの閾値濃度を 、ターゲット配列中に単一コピーを有するサブターゲット配列に特異的なプライ マーセットが有すると予測される閾値濃度より低くし得る。勿論、多重コピーサ ブターゲット配列は、この種の配列に特異的なプライマーセットの調整方法を通 して考慮し得る。例えば、多重コピーサブターゲット配列に特異的なプライマー セットは、所望の閾値濃度を維持するために、より低い濃度で使用し得る。 また、あるプライマーセットの閾値濃度の決定に使用する増 幅サイクルの数は、そのプライマーセットを使用する増幅反応で使用する増幅サ イクルの数とほぼ同じでなければならない。更に、検出システムの感度はしばし ば変化し得る。従って、本発明の方法の実施には、プライマーの調整又はプライ マーの感度の決定に使用したものと同じ検出システムを使用しなければならない 。 プライマーシリーズ集団を構成するプライマーセットの数は、ターゲット配列 を類別することができる意味ある範囲に基づいて当業者が適宜選択する問題であ る。例えば、試料中のウイルス粒子数を使用して疾患の種々の段階を示すことが できる場合には、２個以上のプライマーセットが望まれ得る。例えば、ターゲッ ト配列を類別することができる意味ある範囲の数がｎ＋１であれば、このような 範囲をカバーするためにｎ個のプライマーセットを使用し得る。本発明では、例 えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のプライマーセットを使用し得 る。このようにして、この場合はウイルスゲノムであるターゲット配列の相対数 を決定し、検査試料中のウイルスの種々のレベルと相関させることができる。当 業者には理解されるであろうが、本発明の方法は検査試料中のターゲット配列数 の概算値を与え る。特定的には、プライマーシリーズ集団の使用によって、ターゲット配列の数 が含まれる得る値の範囲を与える。 しかしながら、プライマーセットの感度の調整がより精度高く調節できればで きるほど、検査試料中のターゲット配列の相対濃度の値の範囲は狭くなる。例え ば、２個のプライマーセットの感度を、一方の調整プライマーセットがターゲッ ト配列１，０００以上の閾値濃度を有し、他方の調整プライマーセットがターゲ ット配列１０，０００以上の閾値濃度を有するように調整した場合には、検査試 料中に１，０００未満のターゲット配列、１，０００〜１０，０００のターゲッ ト配列、又は１０，０００を超えるターゲット配列が存在するかどうかを決定し 得るであろう。しかしながら、同じ対のプライマーセットを１０〜１００ターゲ ット配列の閾値濃度に調整すれば、１０未満、１０〜１００、又は１００を越え るターゲット配列が検査試料中に存在していたかどうかを決定することができる 。従って、本明細書で使用する「概算」という用語は、検査試料中のターゲット 配列数が或る値範囲内に含まれることを意味するが、このような範囲を形成する 値はターゲット配列の正確な数を与えるのに十分に近いものであり得る。 プライマーシリーズ集団は、単一増幅反応で検査試料中のターゲット配列の相 対量を決定するために使用できる。ＬＣＲ、ＧＬＣＲ及びＰＣＲといったような 増幅反応は当業者に良く知られている。これらの反応は典型的には、プライマー を使用して、通常は遥かに大きい核酸配列の小部分であるターゲット核酸配列の コピーを繰り返し生成する。プライマー及びプローブはそれ自体、ターゲット配 列の一部分に相補的な核酸配列であり、増幅条件下でターゲット配列の相補的部 分とハイブリダイズ又は結合する。ターゲット配列のコピーは典型的には、ハイ ブリダイズしたプライマーにヌクレオチドを付加し及び／又は隣接プライマー対 を連結するために、ポリメラーゼもしくはリガーゼ活性を有する酵素を別個にも しくは組合わせて使用するプライマーの伸長及び／又は連結反応プロセスによっ て生成される。酵素的重合及び連結方法が主流であるが、別の方法、例えば化学 的重合及び連結も本発明で使用するのに適している。モノマー又は予備生成オリ ゴマーのようなプライマー又はプローブに付加されるヌクレオチドも、ターゲッ ト配列に対して相補的である。プライマー又はプローブが十分に伸長及び／又は 連結されたら、例えば反応混合物を「融解温度」、即ち相補的 核酸鎖が解離する温度に加熱することにより、ターゲット配列から分離する。こ のようにして、ターゲット配列に相補的な配列が形成される。 その後、二本鎖配列を分離し、プライマーをそれぞれのターゲットにハイブリ ダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを伸長／及び又は連結し、再度分離 することによって、ターゲット配列数を更に増幅するために新しい増幅サイクル を実施し得る。増幅サイクルによって生成される相補的配列は、ターゲット配列 数を更に増幅するためのプライマー又はプローブ伸長の鋳型として使用できる。 その結果、ターゲット配列及びその相補的配列のコピーが多数形成される。従っ て増幅条件下では、ターゲット配列が存在すればそのサブターゲット部分をプラ イマーシリーズ集団が増幅する。 一般的には、ＰＣＲでは、ターゲット鎖及びその相補鎖の一部に対して相補的 な２個のプライマーが使用される。ＬＣＲの場合は、４個のプライマー、即ちタ ーゲット配列に対して相補的な２個のプライマー、及びターゲット相補的配列に 対して相補的な２個のプライマーを使用するのが普通である。核酸増幅反応混合 物は、前述のプライマーセット及び酵素の他に、良く 知られている別の試薬、非限定的具体例としてはマグネシウムのような酵素補因 子、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、並びにデオキシヌ クレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデニントリホスフ ェート、デオキシグアニントリホスフェート、デオキシシトシントリホスフェー ト及びデオキシチミントリホスフェートも含み得る。 本発明では、上述の酵素的熱増幅の他に、等温酵素的増幅反応も使用し得る。 例えば、Ｆａｈｙ，Ｅ．ら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ ，１：２５−３３（１９９１）に記載の「３ＳＲ」（Ｓｅｌｆ−Ｓｕ ｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、及びＷａｌｋ ｅｒ，Ｇ．Ｔ．ら，ＰＮＡＳ ８９：３９２−３９６（１９９２）に記載の「Ｓ ＤＡ」（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ）はＰＣＲと類似の増幅反応であり、僅かな改変を加えて本発明の方法で使用 し得る。この種の改変は文献に記述されており、当業者に良く知られている。例 えば３ＳＲでは、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）リバーストランスクリプタ ーゼ（ＲＴ）、大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、並びにリ ボ ヌクレオチドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）を、ＰＣＲで使用される酵素及びｄ ＮＴＰの代わりに使用し得る。また、ＳＤＡでは、例えばＴａｑポリメラーゼに 代わる大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（エキソ−クレノウポリメラーゼ）、及び制 限酵素、例えば ＨｉｎｃＩＩ＋デオキシアデノシン５’−［α−チオ］トリホ スフェートを使用できる。 本発明の方法では、非限定的具体例として前述の反応のような増幅反応を使用 し得る。好ましくは、反応混合物を約１５〜約１００回、より好ましくは約２５ 〜約６０回の増幅サイクルにかける。また、更に留意すべきこととして、例えば 本発明で使用するヌクレオチドトリホスフェート、酵素及び補因子の濃度は、典 型的増幅反応で通常使用される濃度より高くし得る。 プライマーシリーズ集団を増幅反応で使用した後、増幅物が生成されていれば 、これを検出することができる。複数の増幅物が生成され得るため、増幅物を場 所的に分離することが望まれ得る。増幅物の場所的分離は通常、使用する検出方 法の種類に基づいて当業者が適宜選択する問題であると理解されたい。 増幅物の分離が望まれる場合は、増幅物を互いに識別できる程度まで分離する だけでよい。シグナルの配置又は位置に基づ いて、多数の増幅物を場所的に分離することができる。このような場所的識別は 、大きさ、分子量、電荷密度、磁気特性、特異的結合性等によって実施し得る。 一般的には、結合員、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、又は増幅物を場所的 に分離することができる他の任意の方法を用いて、一つ又は複数の増幅物を分離 し得る。 好ましい実施態様では、プライマーシリーズ集団を使用して生成した多数の増 幅物を、イムノクロマトグラフィーストリップを用いて場所的に分離し検出する 。このような検出形態は、１９９４年９月６日出願の米国特許出願明細書第０８ ／３０２，６４６号に開示されている。前記ストリップは通常、毛管作用によっ て液体を運ぶのに適した多孔質材料からなる。少なくとも２種類の特異的捕捉試 薬を、増幅物を含み得る液体の接触部位として使用されるストリップの一端に各 捕捉試薬の不連続スポットが形成されるように、ストリップに固定する。捕捉試 薬は、スポット列が斜線上に形成されるように、水平方向及び鉛直方向で互いに 離間させるのが好ましい。第１図は、前述のように構成したイムノクロマトグラ フィーストリップを示している。第１図に示すように、多孔質材料のストリップ １に捕捉試 薬を点在させて、斜線上に捕捉スポット列２を形成する。 捕捉試薬は典型的には、増幅物との間の特異的結合対を直接的又は間接的に形 成し得る「特異的結合員」を有する。本明細書で使用する特異的結合員とは、結 合対、即ち二つの異なる分子であって、一方の分子が例えば化学的又は物理的手 段で他方の分子に特異的に結合する対の構成員を意味する。抗原及び抗体特異的 結合対以外の特異的結合対の非限定的具体例としては、アビジンとビオチンとの 結合対、それぞれ１９９３年４月２１日出願の米国特許出願明細書第０８／０４ ９，８８８号及び１９９３年７月１日出願の米国特許出願明細書第０８／０８４ ，４９５号に記載のアダマンタン及びカルバゾールのようなハプテンとハプテン に特異的な抗体との結合対、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子もしくは基質 と酵素との結合対等が挙げられる。第１図に基づいて説明する該実施態様では、 各捕捉試薬スポットが、典型的には、別個の増幅物に対して特異性を示す。その ため、個々の増幅物を場所的に分離することができる。 増幅反応後は、第１図に示す前述のイムノクロマトグラフィーストリップの先 端３を、多数の増幅物を含み得る反応混合物に接触させる。その結果、反応混合 物及びその中に含まれる増 幅物がストリップに沿って移送され、捕捉試薬スポットを通過する。捕捉部位に 存在する結合員との結合対を形成する増幅物が存在していれば、その増幅物はス トリップ上の別個の捕捉部位に固定されることになる。ストリップ上の増幅物の 存在は、「標識」を使用して検出することができる。 標識という用語は、検出が可能な性質又は特徴を有する分子又は部分を意味す る。標識は直接検出できるもの、例えば放射性同位体、発蛍光団、発化学ルミネ センス団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等であり得る。又は標識は、間接的 に検出できるもの、例えば特異的結合員であってもよい。直接的標識の場合は、 標識の検出を可能にする補助成分、例えば基質、誘発試薬、光等が必要である。 検出のために間接的標識を使用する場合は、典型的には「結合体」と組み合わせ て使用する。結合体は典型的には、直接検出できる標識に結合した特異的結合員 である。結合体を合成するための結合化学は当業者に良く知られており、例えば 、特異的結合員の特異的結合性又は標識の検出可能特性を破壊しない任意の化学 的手段及び／又は物理的手段を使用し得る。 従って、ストリップに固定された増幅物が直接検出できる標 識を有する場合は、固定増幅物を直接検出することができる。増幅物が間接的標 識を有する場合は、その間接的標識に特異的な結合員からなる結合体を使用して 、ストリップ上の増幅物の存在を検出できる。 一般的には、増幅物は、不均一イムノアッセイの実施に広く使用されている別 の方法を用いて検出することができる。例えば、増幅反応後に、該反応によって 生成された多数の増幅物が存在すれば、それを「固相試薬」と接触させて固定し 得る。固相試薬は、固相に結合した特異的結合員からなり得る。固相試薬の製造 には前述の特異的結合員も使用できる。 固相は、不溶性の、又は後続反応によって不溶性にすることができる任意の物 質を意味する。固相は、結合員を誘引し固定して固相試薬を形成する能力を本来 備えているものを選択し得る。あるいは、固相は、結合員を誘引し固定して固相 試薬を形成する能力を有する補助的受容体を保持できるものであってもよい。補 助的受容体は、結合員に対して、又は結合員に結合した帯電物質に対して逆の電 荷を有する帯電物質を含み得る。あるいは、受容体分子は、固相上に固定され（ 固相に結合し）、特異的結合反応を介して別の結合員を固定することができる任 意の特異的結合員であってもよい。受容体分子は、アッセイを実施する前、又は アッセイの実施中に、結合員を固相材料に間接的に結合させる。固相は例えば、 試験官、微量滴定ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び他の当業者に公 知の構造体の、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしく は非磁性金属、ガラス又はケイ素の表面からなり得る。本発明では、固相は、必 要に応じて結合体のアクセスを可能にするのに十分な多孔率を有する任意の適当 な多孔質材料であってもよい。通常は多孔質構造が好ましいが、水和状態でゲル 構造を有する材料も使用し得る。既に実証されているように、ニトロセルロース の多孔質構造は、優れた吸収性と、結合員を含む広範囲の試薬に対する吸着性と を有する。ナイロンも類似の特性を有し、やはり適当な材料である。この種の材 料は、例えばフィルム、シートもしくはプレートといったような適当な形状で使 用し得、又は適当な不活性担体、例えば紙、ガラス、プラスチックフィルムもし くは布の上にコーティング、接着もしくは積層し得る。 増幅物を固相試薬に固定し得る方法は色々存在する。例えば、増幅物との結合 対を形成するポリヌクレオチドで固相試薬をコ ーティングし得る。あるいは、固相に結合した結合員との間で特異的結合対を形 成する間接的標識で増幅物を標識してもよい。固相試薬からなる特異的結合員は 、増幅反応で生成され得る増幅物の総てとの間で結合対を形成し得、又は固相試 薬を含む多数の特異的結合対は個々の増幅物に対して特異的であり得ることが理 解されよう。当業者にはまた、増幅物中に標識を組み込む種々の方法が存在し、 使用可能であることが認識されよう。 増幅物が存在すれば、それらの増幅物が固相試薬に固定された後に、固相試薬 上の増幅物の存在を前述の方法と類似の方法で検出することができる。特定的に は、標識を使用して種々の増幅物を検出できる。標識が場所的分離に基づいて識 別されない時は、別の方法、例えば識別可能な標識で各増幅物を標識することに よって標識を識別できる。例えば、異なる波長で光を発する別個の発蛍光団で各 増幅物を直接的又は間接的に標識し得る。あるいは、種々の蛍光発生物質の存在 下でシグナルを発する種々の酵素で各増幅物を標識してもよい。更に別の方法と して、発蛍光団及び酵素で増幅物を標識し、標識がシグナルを生じる時点に基づ いてシグナルを識別することもできる。特定的には、発蛍光団及び酵素からのシ グナルは、発蛍光団からの 一定シグナルの読取り、及び酵素からのレートシグナルの読取りによって識別で きる。それによって、一定シグナルが存在すれば、該シグナルが、レートシグナ ルの開始点であるベースラインシグナルとなる。この種の検出方法は、１９９４ 年１２月２２日出願の同じ出願人の係属中の米国特許出願第０８／３６２，０３ ６号に開示されている。 別の実施態様では、ウイルスゲノムをターゲット配列として用いて、検査試料 中に存在し得るウイルスの相対量を決定することができる。例えば、ＰＣＲ用の プライマーシリーズ集団は３個のプライマーセットを含み得る。これら３個のプ ライマーセットの感度は、調整したプライマーセット１（ＡＳＰ−１）が４０回 の増幅サイクル後に試料１００μｌ当たり１００個のターゲット配列という閾値 濃度を有し、調整したプライマーセット２（ＡＰＳ−２）が４０回の増幅サイク ル後に試料１００μｌ当たり１，０００個のターゲット配列という閾値濃度を有 し、調整したプライマーセット３（ＡＰＳ−３）が４０回の増幅サイクル後に試 料１００μｌ当たり１０，００００個のターゲット配列という閾値濃度を有する ように決定又は調整し得る。プライマーの感度は、例えば個々のプライマーセッ トの一連の 希釈物を形成し、ターゲット配列の選択した濃度（閾値濃度）の存在下で一連の 希釈物の各希釈物について増幅反応を実施することにより決定又は調整すること ができる。次いで、種々の反応の生成物を検出し得る。検出可能増幅物を生成す るプライマー濃度が最も低い希釈物を、その濃度で、プライマーシリーズ集団に 使用し得る。 また、各プライマーセットの一つのプライマーを一般的な結合員、例えばビオ チンで標識し、プライマーセットの残りのプライマーを別個の標識で標識するこ ともできる。例えば、ＡＰＳ−１の残りのプライマーをカルバゾールで標識し、 ＡＰＳ−２の残りのプライマーをアダマンタンで標識し、ＡＰＳ−３の残りのプ ライマーをフルオレセインで標識し得る。 次いで、プライマーシリーズ集団を含む反応混合物を、ターゲット配列を含ん でいる疑いのある適当に処理した検査試料１００μｌと接触させる。得られた混 合物は４０回の増幅サイクルにかけ得、サイクル後の反応混合物は、例えばセレ ニウムコロイド粒子に結合したビオチンに対して特異的な結合員を含む抗ビオチ ン結合体と組合わせ得る。次いで、種々の増幅物が存在すればその存在を検出す ることができる。検出は、第１図 に示すものと類似の形態のニトロセルロースストリップで実施できる。しかしな がら、この場合は３個の捕捉スポットで十分に検出できる。１個の捕捉スポット は抗カルバゾール抗体からなり得、別の捕捉スポットは抗アダマンタン抗体から なり得、３個目の捕捉スポットは抗フルオレセイン抗体からなり得る。第２図ａ は、スポット４がカルバゾール捕捉スポットであり、スポット５がアダマンタン 捕捉スポットであり、スポット６がフルオレセイン捕捉スポットである前述のよ うなニトロセルロースストリップ構造を示している。このニトロセルローススト リップの先端７は反応混合物と接触し得、それによって反応混合物が捕捉スポッ トを通りながら移送される。捕捉スポットは、種々の増幅物が存在すればこれら の増幅物を特異的部位でニトロセルロースストリップに固定させる。例えば、Ａ ＰＳ−１を含む増幅物はスポット４に固定され、ＡＰＳ−２を含む増幅物はスポ ット５に固定され、ＡＰＳ−３を含む増幅物はスポット６に固定される。 増幅中に十分な量の増幅物が生成されていれば、可視シグナルを形成するのに 十分な（増幅物に結合した）結合体が捕捉スポットに蓄積される。特定捕捉スポ ットの可視シグナルは、調 整したプライマーセットの閾値濃度が検査試料中に存在していたことを示す。タ ーゲット配列はウイルスゲノムからなっていたのであるから、ウイルスが少なく とも当該調整プライマーセットの閾値濃度に対応する濃度で存在していたことに なる。 例えば、検査試料中に１，０００〜１０，０００個のウイルス粒子が存在して いたと想定すれば、ニトロセルロースストリップを反応混合物及び結合体に接触 させた後に、第２図ｂに示すような状態が生じる。即ち、ＡＰＳ−１を含む増幅 物がスポット４に固定され、ＡＰＳ−２を含む増幅物がスポット５に固定される 。しかしながら、スポット６にはシグナルが検出されない。これは、ＡＰＳ−３ の閾値濃度が検査試料中に存在していなかったからである。表１はこのような状 態から得られた結果を示すものであり、増幅物が検出された場合は正符号（＋） で表し、検出可能増幅物が存在しない場合は負符号（−）で表している。 ニトロセルロースストリップと表１に示す同じ結果とに基づいて結論すれば、 ＡＰＳ−１及びＡＰＳ−２に関しては正の結果が得られたため、検査試料中に１ ００を超えるターゲット配列コピー及び１，０００を超えるターゲット配列コピ ーが存在していたと決定することができる。また、ＡＰＳ−３は検出可能増幅物 を生成しなかったため、検査試料中に１０，０００未満のターゲット配列コピー が存在していたと決定できる。従って、検査試料中には１，０００〜１０，００ ０個のターゲット配列が存在していたことになる。よって、検査試料中には１， ０００〜１０，０００個のウイルス粒子が含まれていたと結論される。 別の実施態様では、増幅反応自体を有効にするために対照配列を使用し得る。 例えば、２個のプライマーセットＡＰＳ−１ 及びＡＰＳ−２を、それぞれ４０回の増幅サイクル後に試料１００μｌ当たり１ ，０００個のターゲット配列という閾値濃度、及び試料１００μｌ当たり１０， ０００個のターゲット配列という閾値濃度を有するように調整し得る。対照配列 としては既知の核酸配列を使用し得る。 対照配列のプライマーは通常は調整しないが、場合によっては調整が望ましい こともあり得る。対照プライマーに要求されるのは、これらのプライマーを使用 する反応で使用される増幅サイクル回数の後に検出可能増幅物を生成する能力を 備えていることである。 次いで、ＡＰＳ−１、ＡＰＳ−２、対照配列及び対照プライマーを含む核酸増 幅混合物を、適当に処理した１００μｌの検査試料と接触させる。その結果形成 された反応混合物を４０回の増幅サイクルにかける。検出可能増幅物が生成され れば、これを前述と類似の方法で検出することができる。例えば、発蛍光団のよ うな直接検出できる標識を、各プライマーセットの一つのプライマー中に組込む ことにより、種々の増幅物に取り付けることができる。プライマーセットの残り のプライマーは前述のような別個の結合員で標識し得る。ニトロセルローススト リップに、対照増幅物と二つのプライマーセット増幅物とを固定する捕捉部分を 具備し得る。このようなニトロセルロースストリップを反応混合物アリコートと 接触させた後、固定された増幅物があれば、蛍光シグナルの存在を調べることに よってそれを検出することができる。前述のように、捕捉部分のシグナルは特定 プライマーセットの閾値濃度の存在を示す。しかしながら、対照増幅物の捕捉に 使用した部分のシグナルは、増幅が効果的であったことを示す。このようなシグ ナルが発生しなければ増幅は効果的ではなかったことになり、従って結果に信頼 性がないこと意味する。 ターゲット配列がウイルスゲノムであると想定した場合、対照捕捉部分から正 のシグナルが発生し且つ残りの捕捉部分から検出可能シグナルが発生しなければ 、（ｉ）増幅が効果的であり、（ｉｉ）検査試料中に１，０００未満のウイルス 粒子が存在していたことになる。しかしながら、対照捕捉部分又は調整プライマ ーセット捕捉部分のいずれにも検出可能シグナルが得られなければ、増幅反応は 効果的ではなく、従って前述のような結果は信頼できないということになる。 以下の実施例は本発明を更に説明するためのものであり、本 発明の範囲を限定するものではない。実施例 以下の実施例で使用する略号の意味は下記の通りである： ・ ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味する。 ・ ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパ ンスルホン酸）を意味する。 ・ ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。 ・ ＴＲＩＳ（登録商標）はトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタンを意味 する。 ・ ＴＴＰはチミジントリホスフェートを意味する。実施例１ プローブセット濃度の調整並びにβ−グロブリン及びＨＩＶ微量ターゲット配列 の同時ＬＣＲ増幅 この実施例では、プライマーセットの閾値濃度を調整又は決定する方法を明ら かにする。大幅に異なる濃度の二つの微量ターゲット配列をＬＣＲで同時増幅し 、あるプライマーセットの濃度変化がそのプライマーセットの感度に及ぼす作用 を示す。 一つの微量ターゲット配列（配列番号１）は説明を簡単にす るために一本鎖として示すが、実際には二重形態で使用した。配列番号１は、Ｇ ｅｎＢａｎｋ，受託番号Ｊ００１７９，ＮＣＢＩ配列番号１８３８０７に開示さ れているように、ヒトβ−グロブリン遺伝子の地図位置６２２５２〜９２２８８ に対応する。もう一つの微量ターゲット配列（配列番号２）も簡明化のために一 本鎖として示すが、やはり二重形態で使用した。配列番号２はＳａｎｃｈｅｚ− Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：４８４−４９２（１９８ ５）に開示されているように、ＨＩＶ ｐｏｌ遺伝子の地図位置３５５４〜３６ ０１に対応する。これら二つの配列を下記の表２に５’−３’方向で示す。 前記ターゲット配列をＬＣＲで増幅し検出するようにターゲット特異的プロー ブ（本明細書では「増幅プローブ」とも称する）を設計した。第一の増幅プロー ブセットは配列番号１（「β −グロブリン配列」）及びその相補的鎖に特異的である。このセットの２個のプ ローブ（配列番号３及び配列番号４）を、ビオチン「Ｂｔ」でハプテン化した。 残りのプローブのうちの一つ（配列番号６）をアダマンタン「Ａｄ」でハプテン 化した。配列番号３を配列番号５に連結し、配列番号４を配列番号６に連結でき るように、配列番号４及び配列番号５の５’末端をホスフェート基「ｐ」で官能 性にした。配列番号４及び配列番号６は配列番号１に対して相補的であり、配列 番号３及び配列番号５は配列番号１の相補的鎖に対して相補的であった。β−グ ロブリン配列を増幅し検出するために使用したプローブセットを下記の表３に示 す。この表では、個々のプローブが５’から３’方向で示されている。 もう一つの増幅プローブセットは、配列番号２（「ＨＩＶ配 列」）及びその相補的鎖を増幅し検出するように設計した。プローブのうちの二 つ（配列番号７及び配列番号８）をフルオレセイン「Ｆｌ」でハプテン化し、残 りの二つのプローブ（配列番号９及び配列番号１０）をビオチンでハプテン化し た。配列番号８及び配列番号１０は配列番号２とハイブリダイズし、配列番号７ 及び配列番号９は配列番号２の相補的鎖とハイブリダイズした。前述のように、 「ｐ」はホスフェート基を表す。ＨＩＶ配列を増幅し検出するために使用したプ ローブセットを下記の表４に示す。この表は個々のプローブを５’から３’方向 で示している。 本質的に欧州特許出願公開明細書第４３９１８２号に記載の方法でＧＬＣＲに より微量ターゲット配列を同時増幅するために、前述のプローブセットを種々の 濃度で使用した。各反応を 実施するための反応成分は次の通りであった：５０ｍＭ ｐＨ７．８ ＥＰＰＳ 緩衝液、２０ｍＭ Ｋ⁺、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０μＭ ＮＡＤ、１．７μＭ ＴＴＰ、９０Ｕ／μｌリガーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅ ｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍｉｌａｗｕｋｅｅ，ＷＩ）、０．０１Ｕ／μｌＴａｑポリメ ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）及び下記の表５に 示す濃度のプローブ。各反応の最終容量は１００μｌであった。前記成分は２× 濃度で調製し、アリコートに分けて毛管に供給した。ターゲット配列（表５参照 ）も２×濃度にしたか、１００℃で３分間加熱し、次いで冷却してから毛管に加 えた。 １９９３年１０月２１日出願の米国特許出願明細書第０８／１４０，７３１号 に記載の毛管サーマルサイクラーで熱サイクルを実施した。前記毛管サーマルサ イクラーを使用して下記のサイクルを５０回実施した：８８℃で１０秒間、５３ ℃で６０秒間。 プローブセットの濃度、及びそれぞれの微量ターゲット配列の反応当たりの量 を下記の表５に示す。 次のように形成したイムノクロマトグラフィーストリップを使用してＧＬＣＲ 増幅生成物を検出した：７ｍｍ×４０ｍｍニトロセルロースストリップ（Ｓｃｈ ｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨから市販）の左下から 右上方向に４個の抗体スポット（抗アダマンタン、抗キノリン、抗ダンシル及び 抗フルオレセイン）を噴霧して、捕捉スポットの斜線アレイを形成した。各捕捉 スポットには、６．４９×１０^-10μｌの抗体溶液を噴霧した。抗キノリン、抗 ダンシル及び抗フ ルオレセイン抗体は濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、抗体アダマンタン抗体は濃度１．０ ｍｇ／ｍｌとした。抗体溶液は総て、０．１％ＢＳＡと極微量のフェノールレッ ドとを加えたＴＢＳ（ＴＲＩＳ（登録商標）緩衝食塩水）を使用して調製した。 増幅後、反応生成物の５μｌ試料を、０．０５％固形分のブルーラテックス結 合体２５μｌ、及びＴＢＳ中３％カゼイン２０μｌに加えた。ブルーラテックス 結合体は、ブルーラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮから市販、０．４％固形分）を１０μｇ／ｍｌウサギ抗ビオ チン抗体溶液と共に３０秒間撹拌することによって形成した。結合体を１０ｍＭ ＴＲＩＳ（登録商標）緩衝液中０．０５％カゼインでブロックした。結合体／ 反応試料溶液を混合して、ビオチンでハプテン化した増幅物末端を抗ビオチンブ ルーラテックス結合体と複合させた。 前記溶液を、前述のように形成したイムノクロマトグラフィーストリップに接 触させた。溶液はストリップを辿って上方に移動し、抗体スポットが特異的ハプ テンを捕捉した。増幅反応中に生成された増幅物はイムノクロマトグラフィース トリップ上に捕捉され、その結果適当な捕捉スポットにブルーラテック スが集中した。種々の捕捉スポットに任意に存在するブルーラテックスを、Ｓｃ ａｎＪｅｔ Ｃフラットベッドスキャナー(Ｈｅｗｅｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)でクロマトグラフィーストリップをＴＩＦＦファ イルに走査することにより検出した。ＴＩＦＦファイルをＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（ 登録商標）１．５５（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａ ｌｔｈ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｉｖｃｅ Ｂｒａｃｈ，ＮＩＭＨの公共部 門で入手可能）に入れ、現像されたスポットの画像をゲル分析マクロでピーク部 分について分析した。結果は表６に示す。 予想通りに、且つ総てのストリップによって明らかにされように（データ示さ ず）、キノリン及びダンシル捕捉スポットにシグナルは観察されなかった。しか しながら、フルオレセイン及びアダマンタン捕捉スポットには種々の量のシグナ ルが観察された。表６のデータから明らかなように、これらのスポットのシグナ ル強度はプローブ濃度の増加に伴って増加した。即ち、プローブセットの感度は 、増幅反応におけるプローブセット濃度の増幅に伴って増幅した。従って、プロ ーブセットの感度はその濃度を変えることによって制御できる。また、プローブ は種々のターゲットに向かったが、プローブセットの閾値濃度は異なっていた（ β−グロブリンセットは、１０〜１００コピーのＨＩＶを認識するＨＩＶセット と類似のシグナル強度で、１×１０⁵のターゲットを認識している）。実施例２ プライマーセット濃度の調製及び二つの肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）ターゲット 配列の同時ＰＣＲ増幅 この実施例では、大幅に異なる感度を有する二つのプライマーセットを使用し て、ＨＢＶターゲット配列の二つの別個のサブターゲット部分の同時ＰＣＲを実 施する。 第一のサブターゲット配列は、Ｏｎｏ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，１１：（６）１７４７−１７５７（１９８３）及びＯｋａｍｏｔｏ ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２５７５−２５８３（１９８８）に 開示されているように、ＨＢＶの地図位置２３６〜７１２に対応する。配列全体 を、説明の簡明化のために一本鎖形態の配列番号１１として下記の表７に示す。 この配列は以後「長いＨＢＶターゲット」と称する。この実施例で使用するもう 一つのサブターゲット配列は、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ ｌ ．６９：２５７５−２５８３（１９８８）に開示されているように、ＨＢＶの 地図位置１８６３〜１９３４に対応する。この配列（配列番号１２）も一本鎖配 列として下記の表７に示し、以後「短いＨＢＶターゲット」と称する。どちらの サブターゲットも表７には５’から３’方向で示されている。 前記サブターゲット配列を増幅し検出するために使用したＰＣＲプローブを下 記の表８に示す。配列番号１３は前記長いＨＢＶ配列の一部分と適合し、その相 補的鎖とハイブリダイズする。配列番号１４は前記長いＨＢＶ配列にハイブリダ イズする。配列番号１３及び配列番号１４は以後、「長配列プローブ」と総称す る。配列番号１５は前記短いＨＢＶ配列の一部分に適合し、その相補的鎖とハイ ブリダイズする。配列番号１６は前記短いＨＢＶ配列とハイブリダイズする。配 列番号１５及び配列番号１６は以後、「短配列プローブ」と総称する。ＰＣＲ後 、 長配列プローブは約４７７塩基の生成物を生成し、短配列プローブは約７２塩基 の生成物を生成する。これらのプローブは総て５’から３’方向で下記の表に示 す。従って、配列番号１３及び配列番号１５は順方向で示されており、配列番号 １４及び配列番号１６は逆方向で示されている。 表８に示したプローブは、本質的に米国特許明細書第４，６８３，１９５号及 び米国特許明細書第４，６８３，２０２号に記載の方法でＰＣＲで使用した。Ｐ ＣＲは０．６５ｍｌ Ｇｅｎｅ−Ａｍｐ薄壁反応管（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で、下記の成分を含む２５μｌ容量で実施した：１× ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ｐＨ８．３ ＴＲＩＳ（登録商標）−ＨＣＬ、４０ｍ Ｍ ＫＣｌ、０．００１％ｗ／ｖゼラチン）、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、各々２００ μＭのｄＮＴＰ及 び２．５Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）（総てＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから入手）、０．５５μｇ ＴａｑＳｔａｒｔ（登録商標 ）抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、及び長配列プローブ の場合は２００ｎＭのプライマー、短配列プローブの場合は１μＭのプローブ。 各管に鉱油を一滴加えた。 どちらのサブターゲット配列のＰＣＲも二つ組で実施し、サブターゲット配列 は、Ａｂｂｏｔｔ ＨＢＶアッセイ陽性対照（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから市販）から精製したＨＢＶゲノム ＤＮＡの形態でＧｅｎｅ−Ａｍｐ管に加えた。従って、ＨＢＶゲノムをターゲッ ト配列として使用した。各二つ組管に加えるターゲット配列の量は下記のような 変化させた。総ての試薬及びターゲットを管内に配置した後、９４℃で２分間加 熱した。次いで該混合物を、９４℃で３０秒間、６７℃で１分間というプログラ ムした温度変化サイクルに４０回かけた。サイクル終了後、管を４℃で貯蔵した 。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ製ＰＥ４８０サーマルサイ クラーで熱サイクルを実施した。 サイクル終了後、１０μｌアリコートを管から採取し、３μｌのブロモフェノ ールブルー、キシレンシアノール、フェナントリジニウムトリアミン（ＰＴＡ、 １９９４年６月２３日出願の米国特許出願明細書第０８／２６５，３４２号に開 示）及びグリセロールと混合した（混合物中の最終濃度は７．７μＭＰＴＡ、７ ．７％グリセロール、微量のブロモフェノールブルー及びキシレンシアノールで あった）。得られた混合物を予備成型したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ （１０％アクリルアミド）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で泳動 させた（１００Ｖ、ブロモフェノールブルーはゲルの底部に泳動）。ゲルの写真 を撮影した。これは第４図に示す。 第４図に示すゲルの第一レーンでは分子量マーカーを泳動させた。該マーカー は、長さ１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、３００ｂｐ、１５０ｂｐ、５ ０ｂｐのＰｒｏｍｅｇａ ＰＣＲマーカー４５６９４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ ｉｓｏｎ，ＷＩ）からなっていた。種々のターゲット配列濃度で生成されたＰＣ Ｒ生成物を、ゲルの残りのレーンで泳動させた。二つ組管をターゲット配列の種 々の濃度で操作した。レーン２及び３は、ＰＣＲ同時増幅を約３０，０００個の ＨＢＶ ＤＮＡ分子 で実施した管から採取した試料である。レーン４及び５は、ＰＣＲ同時増幅を約 ３００分子のＨＢＶ ＤＮＡで実施した管からの試料である。レーン６及び７は 、ＰＣＲ同時増幅を約３０分子のＨＢＶ ＤＮＡで実施した管の試料である。レ ーン８及び９は、ＰＣＲ同時増幅をＨＢＶ ＤＮＡなしに実施した対照管からの 試料である。 ゲルの写真から明らかなように、二つのセットの感度は種々の濃度でほぼ同等 である。特定的には、３０，０００及び３００の主要ターゲット配列で、どちら のプローブセットもＰＣＲ後に検出可能増幅物を生成した。しかしながら、これ ら二つのプローブセットは、試料中に含まれるターゲット配列の数が３００未満 の場合には検出可能増幅物を生成しなかった。 次いで、ＰＣＲに使用したプローブセットのうち一つのプローブセットの濃度 を変えることによって、プローブセットの感度を調整した。この増幅ラウンドで は、長プローブセットの濃度を６０μＭにした以外は、試薬及びサイクル条件は 総て前述と同じである。 管を前述のようにサイクルにかけ、前述のようにサンプリングし、前述のよう にゲル上で泳動させた。得られたゲルの写真 を撮影した。これを第５図に示す。表９は、複製管のレーン数と、増幅の前に前 記管内に配置したＨＢＶ ＤＮＡの量とを示している。レーン１１は空白レーン であり、レーン１０及び１５は前述の分子量マーカーを含んでいた。 第５図のゲルの写真から明らかなように、長プローブセットをその濃度の減少 によって調整すると、該プローブセットの感度が低下する。使用したプローブセ ット濃度では、長プローブセットはＨＢＶ濃度が３×１０⁵分子になるまで検出 可能増幅物を生成しなかった。従って、前記条件では、短プローブセットの閾値 濃度は３×１０⁵であった。一方、長プローブセットの閾値濃度は３００ＨＢＶ 分子未満であった。プローブセットを前記条件及び前記濃度で使用すれば、検査 試料中の未知のＨＢＶ量の相対量を決定できる。特定的には、少なくとも３００ 、 ３００〜３×１０⁵、又は３×１０⁵を超えるＨＢＶ ＤＮＡゲル分子が検査試料 中に存在しているかどうかを決定することができる。次いで、この相対量を検査 試料中のＨＢＶ量に相関させ得る。 以上、特定実施例を挙げて本発明を詳細に説明してきたが、当業者には明らか なように、これらの実施例は、本発明の思想及び範囲を逸脱せずに様々に変形し 得る。また、前出の特許明細書及び出版物は総て参考として本明細書に包含され る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 検査試料中のターゲット核酸配列の概算量を決定する方法であって、（ａ ）前記検査試料を、前記ターゲット核酸配列の第一のサブターゲット部分とハイ ブリダイズできる第一のプライマーセットと、前記ターゲット核酸配列の第二の サブターゲット部分とハイブリダイズできる第二のプライマーセットとを含む核 酸増幅反応混合物に接触させ、但し前記第一及び第二のサブターゲット部分は互 いに異なり、前記第一及び第二のプライマーセットは、（ｉ）前記第一のプライ マーセットは必ず前記ターゲット核酸配列の第一の閾値濃度かそれ以上の濃度の 時にのみ検出可能増幅物を生成することができ、（ｉｉ）前記第二のプライマー セットは必ず前記ターゲット核酸配列の第二の閾値濃度かそれ以上の濃度の時に のみ検出可能増幅物を生成することができ、且つ（ｉｉｉ）前記第一及び第二の 閾値濃度が互いに異なるように、選択し、（ｂ）得られた反応混合物を、検査試 料がターゲット核酸配列をプライマーセットによる検出可能増幅物の生成が可能 な閾値濃度又はそれ以上の濃度で含んでいる場合に、少なくとも一方のプライマ ーセットから検出可 能増幅物を生成させるのに十分な増幅条件下におき、及び（ｃ）前記反応混合物 中で少なくとも一方のプライマーセットから増幅物が生成されたかどうかを検出 して、検査試料がターゲット核酸配列を本質的に前記少なくとも一方のプライマ ーセットに対応する前記閾値濃度又はそれ以上の濃度で含んでいるかどうかを決 定するステップを含む、前記方法。 ２． 前記増幅条件が、前記反応混合物を熱サイクルに２０〜１００回かけるこ とからなる請求項１に記載の方法。 ３． 前記プライマーセットの各々のセットの少なくとも一つのプライマーが標 識を備えている請求項１に記載の方法。 ４． 増幅物が生成されたかどうかを検出する操作が、（ａ）前記反応混合物を 固相試薬と接触させて増幅物／固相試薬複合体を形成し、（ｂ）前記増幅物／固 相試薬複合体を結合体と接触させ、（ｃ）前記増幅物の存在を示すものとしてシ グナルを検出するステップからなる請求項３に記載の方法。 ５． 前記標識が直接検出できるものである請求項３に記載の方法。 ６． 増幅物が生成されたかどうかを検出する操作が、（ａ）前記反応混合物を 固相試薬と接触させて増幅物／固相試薬複合 体を形成し、（ｂ）前記増幅物の存在を示すものとしてシグナルを検出するステ ップを含む請求項５に記載の方法。 ７． 前記固相試薬が、結合員でコーティングしたニトロセルロースストリップ を含む請求項６に記載の方法。 ８． 少なくとも一つのプライマーセットの感度を調整する請求項１に記載の方 法。 ９． 前記感度を濃度調整によって調整する請求項８に記載の方法。 １０． 前記増幅反応混合物が更に、前記ターゲット核酸配列の第三のサブター ゲット部分とハイブリダイズできる第三のプライマーも含み、前記第三のサブタ ーゲット部分は前記第一及び第二のサブターゲット部分と異なるものであり、前 記第三のプライマーセットを、（ａ）前記第三のプライマーセットは必ず前記タ ーゲット核酸配列の第三の閾値濃度かそれ以上の濃度の時にのみ検出可能増幅物 を生成することができ、且つ（ｂ）前記第三の閾値濃度が前記第一及び第二の閾 値濃度と異なるように、選択する請求項１に記載の方法。