JPH11344460A - 液体および培地の評価法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被検試料液中の複数の成分、特にグルコース
と乳酸を含む溶液を簡易な操作で迅速に定量して、被検
試料液を評価する方法を提供する。 【解決手段】 絶縁性の基板上に形成された２組の電極
系、グルコース酸化能を有する酵素を含む反応試薬層お
よび乳酸酸化能を有する酵素を含む反応試薬層を具備す
るバイオセンサを用い、被検試料液を前記２つの反応試
薬層に供給して前記被検試料液と前記酵素を電子受容体
の存在下で反応させる工程、および前記酵素反応に伴っ
て還元された電子受容体を電気化学的に測定する工程を
含み、被検試料液中のグルコースおよび乳酸をそれぞれ
定量して液体を評価する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検試料液中の二
つの特定成分を同時に定量して、迅速かつ高精度に被検
試料液を評価する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、液体中の特定成分を評価する方法
として、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフ
ィーを利用する方法、または酵素を利用する方法が知ら
れている。酵素を利用する方法には、酵素反応に伴って
変化する色素を反応系に共存させ、この色素を発色させ
て分光学的に測定する方法と、酵素反応に伴って還元さ
れる物質を反応系に含ませ、その還元された物質の量を
電気化学的に測定する方法がある。

【０００３】例えば、酵素と発色試薬を用いて試料液中
のグルコースを測定する方法について、和光純薬工業
（株）から「グルコースＢ−テストワコー」の商品名で
販売されているセットを用いて説明する。まず、発色試
薬液として、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼおよび４−アミノアンチピリンを含む発色剤を緩衝液
に溶解させたものを調製する。次に、２種類のグルコー
ス標準液（２００ｍｇ／ｄｌおよび５００ｍｇ／ｄｌ）
を適当に希釈して、５から６種類の濃度のグルコース溶
液を調製する。

【０００４】そして、調製したグルコース溶液０．０２
ｍｌに、発色試薬液３．０ｍｌをよく混合し、３７℃で
２０分間加温した後、この混合溶液の５０５ｎｍにおけ
る吸光度をそれぞれ測定する。同様にして、種々の濃度
のグルコース溶液に対する吸光度を測定し、横軸にグル
コース濃度、縦軸に吸光度をプロットして検量線を得
る。被検試料液の測定は、グルコース溶液の代わりに、
被検試料液０．０２ｍｌを用い、上記と同様にして、５
０５ｎｍにおける吸光度を測定する。そして、先に求め
た検量線から、被検試料液中のグルコース濃度を算出す
る。

【０００５】また、酵素と発色試薬を用いて試料液中の
Ｌ−乳酸を測定する方法について、ベーリンガー・マン
ハイム（株）から「Ｆ−キット Ｌ−乳酸製」の商品名
で販売されているセットを用いて説明する。まず、Ｌ−
グルタミン酸の緩衝溶液１．００ｍｌ、ニコチンアミド
−アデニンジヌクレオチド溶液０．２０ｍｌ、蒸留水
１．００ｍｌおよびグルタミン酸−ピルビン酸アミノ基
転移酵素溶液０．０２ｍｌを混合して混合溶液を調製す
る。そして、混合５分後の３４０ｎｍにおける吸光度を
測定する。続いて、Ｌ−乳酸脱水素酵素溶液０．０２ｍ
ｌを加え、２０分間反応させた後、吸光度を測定する。
このとき得られた吸光度と最初に測定した吸光度の差を
求めブランク値とする。

【０００６】被検試料液の測定は、まず上記と同様にし
て混合溶液を調製し、この混合溶液に被検試料液０．１
０ｍｌを加えて混合する。そして、混合５分後の３４０
ｎｍにおける吸光度を測定する。続いて、Ｌ−乳酸脱水
素酵素溶液０．０２ｍｌを加え、２０分後の吸光度を測
定する。このとき得られた吸光度と、先に求めたブラン
ク値、および吸光度係数などの定数からＬ−乳酸の濃度
を測定する。

【０００７】また、電気化学的な方法で試料液中に特定
成分を測定するには、例えば、特公平７−１１４７０５
号公報に開示されているバイオセンサを用いる方法があ
る。図５は、このバイオセンサの一例を示す平面図であ
る。また、図６は、図５の縦断面図である。絶縁性の基
板１上にスクリーン印刷等の方法で測定極１９、対極２
０および参照極２１からなる電極系を形成する。次に、
絶縁層８を形成して各電極の露出面積を一定にした後
に、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子
受容体からなる反応試薬層２２を形成したものである。

【０００８】このようにして作製されたバイオセンサの
反応試薬層上に、基質を含む試料液を滴下すると、反応
試薬層が溶解して酵素と基質が反応し、これに伴い電子
受容体が還元される。酵素反応終了後、この還元された
電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸
化電流値と予め測定装置に記憶されている検量線に基づ
いて被検試料液中の基質濃度が算出される。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ガスクロマトグラフィ
ー、液体クロマトグラフィーおよび発色試薬を用いる酵
素法によって被検試料液中の特定成分を定量するには、
測定する試料液の量を正確にする必要があり、また、測
定時間には少なくとも数分から数十分要するため、簡便
性に欠けていた。さらに、いずれの測定方法においても
高価な測定装置が必要であった。また、培地の特定成分
を測定するには、濾過、除菌といった前処理が必要であ
り、操作が煩雑であった。

【００１０】バイオセンサを用いる場合は、簡易な操作
で高精度な測定が可能であるが、複数の特性成分の濃度
を同時に測定するには、それぞれを測定するバイオセン
サが必要となり、手技が煩雑であった。本発明は、上記
課題を鑑み、被検試料液中の複数の成分、特にグルコー
スと乳酸を含む溶液を簡易な操作で迅速に定量して、被
検試料液を評価する方法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明による液体の評価
法は、絶縁性の基板、前記基板の同一面上または異なる
面上に形成された２組の電極系、および前記２組の電極
系上にそれぞれ形成された２つの反応試薬層からなり、
前記反応試薬層の一方が少なくともグルコース酸化能を
有する酵素を含み、前記反応試薬層の他方が少なくとも
乳酸酸化能を有する酵素を含むバイオセンサを用い、被
検試料液を前記２つの反応試薬層に供給して前記被検試
料液と前記酵素を電子受容体の存在下で反応させる工
程、および前記酵素反応に伴って還元された電子受容体
を電気化学的に測定する工程を含み、被検試料液中グル
コースおよび乳酸をそれぞれ定量することを特徴とす
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明に用いるバイオセンサは、
少なくとも測定極と対極からなる電極系２組を絶縁性の
基板の同一面上、または異なる面上に形成し、それぞれ
の電極系上に少なくとも酸化還元酵素を含む反応試薬層
を形成したものである。一つの反応試薬層には、グルコ
ース酸化能を有する酵素、もう一つの反応試薬層には、
乳酸酸化能を有する酵素を含ませることによって、被検
試料液中のグルコースおよび乳酸が一つのバイオセンサ
で精度よく定量することができる。電子受容体には、フ
ェリシアン化イオン、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメ
トサルフェート、フェロセンなど水溶性で、酵素−電極
間の電子移動を媒介しうる化合物を任意に使用できる。

【００１３】このようにして作製されたバイオセンサの
２つの反応試薬層に、グルコースおよび乳酸を含む被検
試料液を含浸させると、グルコース酸化能を有する酵素
を含むグルコース反応試薬層ではグルコースが、乳酸酸
化能を有する酵素を含む乳酸反応試薬層では乳酸がそれ
ぞれ反応し、この酵素反応に伴ってそれぞれの反応試薬
層に含まれる電子受容体が還元される。そして、グルコ
ース反応試薬層下の電極系および乳酸反応試薬層下の電
極系によって、それぞれの酵素反応に伴って還元された
電子受容体を酸化し、このとき得られる酸化電流値と、
測定装置に記憶させておいた濃度−電流値の検量線の基
づいて、被検試料液中のグルコースの濃度と乳酸の濃度
を算出する。このようにして、被検試料液中のグルコー
スおよび乳酸の定量ができるため、被検試料液の成分組
成を迅速に評価することが可能となる。

【００１４】被検試料液として好適なものには、日本酒
や醤油などのグルコースおよびＬ−乳酸を含む醸造食品
が挙げられる。醸造食品において、グルコースは発酵の
原料であり、甘味の成分である。またＬ−乳酸は、味に
影響する重要な成分である。このような醸造食品は、時
間の経過とともに成分の組成が変化するため、醸造食品
中の２つの成分を同時に迅速、簡易、および高精度に定
量することは、品質評価をおこなう上で重要である。ま
た、乳酸菌等の菌を培養する液体培地の状態の評価に本
発明を用いると、迅速、簡易および高精度に、培地中の
グルコースおよびＬ−乳酸の定量が可能となり、培養の
進行度合いを評価したり、栄養源の補給の必要性の有無
などを判断できたりして都合がよい。

【００１５】

【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をよ
り詳細に説明する。図１は、本発明による液体の評価法
の一実施例として用いたバイオセンサの反応試薬層を除
いた分解斜視図である。ポリエチレンテレフタレートか
らなる絶縁性の基板１の片面に、スクリーン印刷により
銀ペ−ストを印刷しリ−ド２、３、４、５を形成した。
次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを
用いて測定極６および７を形成した。測定極６はリード
２、測定極７はリード４とそれぞれ接触している。次
に、絶縁性ペーストを用いて絶縁層８を形成した。絶縁
層８は測定極６、７の露出部分の面積を一定とし、かつ
リ−ド部２、３、４、５を部分的に覆っている。そし
て、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストをリ
ード３、５と接触するように印刷して対極９、１０を形
成した。

【００１６】このようにして電極系を形成した絶縁性基
板１に、スペーサー１３と、空気孔１７と１８を備えた
カバー１４とを、図１中一点鎖線で示すような位置関係
をもって接着し、バイオセンサを作製する。カバーおよ
びスペーサに高分子など透明な材料を用いると、反応試
薬層の状態や被検試料液の導入状況を外部から容易に確
認することが可能である。また、カバーを装着するとカ
バーとスペーサによって出来る空間部の毛細管現象によ
って、被検試料液は試料液供給口１５、１６に接触させ
るだけの簡易操作で容易にセンサ内に導入される。

【００１７】図２は、図１のバイオセンサのスペーサー
とカバーを除いた縦断面図である。図１と同様にして、
絶縁性基板１上に電極系を形成し、測定極６、対極９か
らなる電極系上に電子受容体としてフェリシアン化カリ
ウムを含み、酵素としてグルコースオキシダーゼを含む
溶液を滴下し、乾燥して、反応試薬層１１を形成してい
る。また、測定極７、対極１０からなる電極系上に電子
受容体としてフェリシアン化カリウムを含み、酵素とし
てラクテートオキシダーゼを含む溶液を滴下し、乾燥さ
せて反応試薬層１２を形成している。被検試料液のセン
サ内への供給を円滑にするために、レシチンの有機溶媒
溶液を試料液供給口１５、１６から反応試薬層にわたる
部位に展開し、乾燥させてレシチン層を形成してもよ
い。

【００１８】図３は、本発明の液体の評価法の他の実施
例として用いたバイオセンサの反応試薬層を除いた分解
斜視図である。ポリエチレンテレフタレートからなる絶
縁性の基板１の表面に、スクリーン印刷により銀ペ−ス
トを印刷しリ−ド２、３を形成した。次に、樹脂バイン
ダーを含む導電性カーボンペーストを用いて測定極６を
形成した。測定極６はリード２と接触している。次に、
絶縁性ペーストを用いて絶縁層８を形成した。絶縁層８
は測定極６の露出部分の面積を一定とし、かつリ−ド部
２、３を部分的に覆っている。そして、樹脂バインダー
を含む導電性カーボンペーストをリード３と接触するよ
うに印刷して対極９を形成している。また、基板１の裏
面に、表面と同様にして、リード４、５と、測定極７、
絶縁層８、および対極１０を形成している。このように
して電極系を形成した絶縁性基板１に、空気孔１７また
は１８を備えたカバー１４、および２つのスペーサー１
３を、図３中一点鎖線で示すような位置関係をもって接
着し、バイオセンサを作製する。

【００１９】図４は、図３のバイオセンサの縦断面図で
ある。図３と同様にして、絶縁性基板１の表裏面上に電
極系を形成している。そして、図２と同様にして、測定
極６、対極９からなる電極系上にフェリシアン化カリウ
ムとグルコースオキシダーゼを含む反応試薬層１１を形
成し、測定極７、対極１０からなる電極系上にフェリシ
アン化カリウムとラクテートオキシダーゼを含む反応試
薬層１２を形成している。

【００２０】《実施例１》図２の構成のバイオセンサを
以下のようにして作製した。図１の測定極６、対極９か
らなる電極系上に、フェリシアン化カリウムとグルコー
スオキシダーゼを水に溶解させた混合水溶液を滴下し、
乾燥して、グルコース反応試薬層１１を形成した。ま
た、図１の測定極７、対極１０からなる電極系上にフェ
リシアン化カリウムとラクテートオキシダーゼを水に溶
解させた混合水溶液を滴下し、乾燥して、乳酸反応試薬
層１２を形成した。次に、この基板１にスペーサ１３お
よびカバー１４を図１中一点鎖線で示すような位置関係
をもって接着しバイオセンサを作製した。

【００２１】上記のようにして作製したバイオセンサを
測定装置に装着すると、測定装置はスタンバイ状態にな
った。続いて試料供給孔１５、１６に、グルコースおよ
びＬ−乳酸を含む醸造食品である日本酒を被検試料液と
して接触させた。被検試料液は、毛細管現象で速やかに
応試薬層１１および１２に供給された。反応試薬層が溶
解し、反応試薬層１１上では、日本酒中のグルコースの
みが選択的に反応し、反応試薬層１２上では、日本酒中
のＬ−乳酸のみが選択的に反応する。このとき、反応試
薬層中に共存させておいた電子受容体フェリシアン化カ
リウムが、酵素反応と同時に還元されてフェロシアン化
カリウムに還元される。

【００２２】試料を導入し、一定時間経過後、対極９を
基準にして測定極６にアノード方向へ＋０．５Ｖの定電
圧を印加し、同時に、対極１０を基準にして測定極７
に、同様にして定電圧を印加してフェロシアン化カリウ
ムを酸化した。そして、一定時間後に測定極６と対極９
との間に流れる酸化電流値と、測定極６と対極１０との
間に流れる酸化電流値をそれぞれ測定し、あらかじめ求
めておいた検量線に基づいて、日本酒中のグルコースお
よび乳酸の濃度を算出した。このようにして、日本酒中
の２つの成分が同時に精度よく定量でき、いつでも迅
速、簡易に日本酒の品質の評価ができた。

【００２３】《実施例２》図４の構成のバイオセンサを
以下のようにして作製した。実施例１と同様にして、図
３の測定極６、対極９からなる電極系上にグルコース反
応試薬層１１を形成し、測定極７、対極１０からなる電
極系上に乳酸反応試薬層１２を形成した。そして、基板
１に、スペーサー１３およびカバー１４を図３中一点鎖
線で示すような位置関係をもって接着しバイオセンサを
作製した。試料供給孔１５、１６に、被検試料として乳
酸菌を培養している液体培地を接触させ、毛細管現象で
速やかにグルコース反応試薬層１１および乳酸反応試薬
層１２に供給した。

【００２４】グルコース反応試薬層１１上では、培地中
の乳酸菌の栄養源であるグルコースのみが選択的に反応
する。乳酸反応試薬層１２上では、グルコースを摂取し
た乳酸菌の発酵によって生成したＬ−乳酸のみが選択的
に反応する。試料を導入し、一定時間後、対極９を基準
にして測定極６にアノード方向へ＋０．５Ｖの定電圧を
印加し、同時に対極１０を基準にして測定極７に同様に
して定電圧を印加した。そして、一定時間後に測定極６
と対極９との間に流れる酸化電流値と、測定極７と対極
１０との間に流れる酸化電流値をそれぞれ測定し、あら
かじめ求めておいた検量線に基づいて、培地中のグルコ
ースおよび乳酸の濃度を算出した。このように培地中の
グルコースおよびＬ−乳酸の濃度を測定することによっ
て、培養の進行度合いが評価でき、さらに養源の補給の
必要性の有無などを判断することができた。

【００２５】

【発明の効果】上記のように、本発明によると、日本酒
などの醸造食品や、菌を培養する培地など時間の経過と
共に成分組成が変化する液体を迅速かつ簡便に定量し
て、被検試料液の評価をすることがきる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による液体の評価法の一実施例として用
いたバイオセンサの反応試薬層を除いた分解斜視図であ
る。

【図２】同バイオセンサの、スペーサーおよびカバーを
除いた縦断面図である。

【図３】本発明の液体の評価法の他の実施例として用い
たバイオセンサの反応試薬層を除いた分解斜視図であ
る。

【図４】同バイオセンサの縦断面図である。

【図５】従来のバイオセンサの平面図である。

【図６】同バイオセンサの縦断面図である。

【符号の説明】

１ 絶縁性の基板 ２、３、４、５ リード部 ６、７、１９ 測定極 ８ 絶縁層 ９、１０、２０ 対極 １１ グルコース反応試薬層 １２ 乳酸反応試薬層 １３ スペーサ １４ カバー １５、１６ 試料液導入口 １７、１８ 空気孔 １９ 測定極 ２０ 対極 ２１ 参照極 ２２ 反応試薬層

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絶縁性の基板、前記基板の同一面上また
   は異なる面上に形成された２組の電極系、および前記２
   組の電極系上にそれぞれ形成された２つの反応試薬層か
   らなり、前記反応試薬層の一方が少なくともグルコース
   酸化能を有する酵素を含み、前記反応試薬層の他方が少
   なくとも乳酸酸化能を有する酵素を含むバイオセンサを
   用い、被検試料液を前記２つの反応試薬層に供給して前
   記被検試料液と前記酵素を電子受容体の存在下で反応さ
   せる工程、および前記酵素反応に伴って還元された電子
   受容体を電気化学的に測定する工程を含み、被検試料液
   中のグルコースおよび乳酸の濃度をそれぞれ定量するこ
   とを特徴とする液体の評価法。
2. 【請求項２】 培養の進行に伴って、グルコースを飼料
   とし、乳酸が生産される培地を請求項１記載の液体の評
   価法を用いて評価する培地の評価法。