JPH11332417A

JPH11332417A - 遺伝子欠損マウスとこのマウスを用いた試験方法

Info

Publication number: JPH11332417A
Application number: JP11082643A
Authority: JP
Inventors: Naomi Eguchi; 直美江口; Yoshihiro Urade; 良博裏出; Nobuaki Yoshida; 進昭吉田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 1999-12-07
Anticipated expiration: 2019-03-25
Also published as: JP4076667B2

Abstract

(57)【要約】【課題】Ｌ−ＰＧＤＳ遺伝子がノックアウトされてお
り、この合成酵素の欠損によって中枢神経系機能、循環
器系機能および生殖機能等に、先天性または反応性の障
害を呈する遺伝子欠損マウスを提供する。【解決手段】ゲノムＤＮＡのリポカリン型プロスタグ
ランジンＤ合成酵素遺伝子が、そのエクソンIIからエク
ソンＶがネオマイシン耐性遺伝子に置換された変異配列
に相同組換えされたマウス胚性幹細胞を導入した初期胚
を雌マウス体内で個体へと発生させて産出させたキメラ
マウスの子孫個体であって、生殖細胞および体細胞ゲノ
ムＤＮＡのリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素
遺伝子が変異配列に置換されている遺伝子欠損マウス
と、この遺伝子欠損マウスを用いた各種薬効物質の試験
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、遺伝子欠損マウ
スと、この遺伝子欠損マウスを用いた各種試験方法に関
するものである。さらに詳しくは、この発明は、リポカ
リン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）
をコードする遺伝子がノックアウト（機能破壊）されて
おり、この合成酵素の欠損によって中枢神経系機能、循
環器系機能および生殖機能等に、先天性または反応性の
障害を呈する遺伝子欠損マウスと、この遺伝子欠損マウ
スを用いて上記機能障害に対する予防または治療薬剤の
有効成分を試験する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−ＰＧＤＳ（J.Biol.Chem. 260:12410
-12415, 1985; J.Biol.Chem. 264:1041-1045, 1989; Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA. 88:4020-4024, 1991; Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA. 89:5376-5380,1992; J.Biol.Chem. 26
7:23202-23208, 1992; J.LipdMediators Cell Signalin
g 12:257-273, 1995; J.Biol.Chem. 270:1422-1428, 19
95）は、各種の生理活性の有する体内物質プロスタグラ
ンジンＤ₂（ＰＧＤ₂ ：Prostaglandins Leukotrienes E
ssent. Fatty Acids 37:219-234, 1989; FASEBJ. 5:257
5-2581, 1991; Adv.Neuroimmunol. 5:211-216, 1995;
J.Lipd Mediators Cell Signaling 14:71-82, 1996）の
産生機能と、細胞分化因子であるビタミンＡ群の輸送機
能（Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 88:4020-4024, 1991; J.
Biol.Chem. 272:15789-15795, 1997）を併せ持つ酵素で
あり、中枢神経系、循環器系および生殖器官で発現し
（Arch.Biochem.Biophys. 260:521-531, 1988; Br.J.Op
hthalmology 72:461-464, 1988; Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA. 90:9070-9074, 1993; Prostaglandins 51:298, 199
6; J.Neurosci. 16:6119-6124, 1996）、体液中に分泌
されている（Biochem.Biophys.Res.Commun. 203:1110-1
116, 1994; Proc.Japan.Acad. 72:108-111, 1996; Clin
ical Cheminsry 42:1984-1991, 1996）。そして、これ
らの各器官でのＬ−ＰＧＤＳの発現量の増減が、種々の
身体障害や疾患に密接に関係していることも知られてい
る。

【０００３】例えば、ＰＧＤ₂は現在までに明らかにさ
れている内因性睡眠物質のうちで最も強い催眠作用を示
すが、その合成酵素であるＬ−ＰＧＤＳの阻害物質（Ar
ch.Biochem.Biophys. 289:161-166, 1991）を動物の脳
室内に投与すると顕著な睡眠障害が生じる（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 88:9046-9050, 1991）ことから、脳内に
おけるＬ−ＰＧＤＳの合成不全が不眠症の一因であるこ
とが示唆されている。また、中枢神経系でのＰＧＤ₂の
増減は、侵害的な刺激（例えば痛覚刺激）に対する感受
性の変化（Brain Res. 510:26-32, 1990; J.Pharmacol.
Exp.Ther. 278:1146-1152, 1996）および排卵誘発を促
す黄体ホルモンの分泌量の変化（Endocrinology 110:22
07-2209, 1982）にも関与することも知られている。

【０００４】一方、循環器系でのＬ−ＰＧＤＳ発現とし
ては、例えば、動脈硬化の病巣においてＬ−ＰＧＤＳが
特異的に発現することが知られている（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA. 94:14689-14694, 1997）。これは、Ｌ−Ｐ
ＧＤＳにより合成されるＰＧＤ ₂の血液凝固抑制作用（P
rostaglandins 16:373-388, 1978）によって狭窄した血
管を閉鎖させないためであると推測されている。従っ
て、血液中のＬ−ＰＧＤＳは動脈硬化のマーカーとして
有望視されている。また、Ｌ−ＰＧＤＳは腎臓の近尿細
管の特定部位に局在して発現しているが、その部位はヒ
トにおける塩分過多を原因とする腎機能低下に関係する
部位であるとされていることから、Ｌ−ＰＧＤＳは腎機
能低下症の発症機構に密接に関係するものと考えられて
もいる。

【０００５】さらに、生殖器官におけるＬ−ＰＧＤＳの
発現は、不妊に関係していることも知られている。すな
わち、Ｌ−ＰＧＤＳは精巣・副睾丸で産生され、精液中
に分泌されるが、男性不妊要因である精液減少症の患者
の精液中のＬ−ＰＧＤＳ濃度は健常人に比べて有意に低
い（Biol.Reprod. 58:600-607, 1998）。また、ウシ精
液の高受胎率関連蛋白質として報告されたＳＰ２６はＬ
−ＰＧＤＳであることも判明している（Biol.Reprod. 5
8:826-833, 1998）。ただし、精液中にはＰＧＤ₂がほと
んど検出されないことから（Biol.Reprod. 58:600-607,
1998）、Ｌ−ＰＧＤＳはＰＧＤ₂合成機能とは別の機能
によって生殖機能に関係していると考えられる。

【０００６】またＬ−ＰＧＤは女性の妊娠にも関係して
いる。すなわち、Ｌ−ＰＧＤＳは妊娠後期の胎児中枢神
経系で発現し、羊水中に分泌されるが、その量は胎児の
成長に伴って増加することがヒトおよび動物で確認され
ている。このため、Ｌ−ＰＧＤＳは妊娠異常のマーカー
としての利用が期待されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上のとおり、Ｌ−Ｐ
ＧＤＳが生物個体の様々な生理機能に密接に関係してお
り、その欠損が種々のヒト疾患要因となりうることが示
唆されている。しかしながら、Ｌ−ＰＧＤＳ活性の欠損
が動物個体に対してどの様に作用するのかについて、統
制された条件下での研究を可能とするモデル動物系は確
立されていない。

【０００８】また、そのようなモデル動物は、Ｌ−ＰＧ
ＤＳ活性の欠損によって生じる各種疾患の予防もしくは
治療薬剤の開発等にも極めて有効であろうと期待され
る。この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてな
されたものであって、遺伝的にＬ−ＰＧＤＳ活性を欠損
しているマウス個体を提供することを目的としている。
またこの出願は、このマウス個体を用い、Ｌ−ＰＧＤＳ
活性の欠損によって生じる各種疾患の予防もしくは治療
物質の有効性を試験する方法を提供することを目的とし
てもいる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記の課題
を解決するための発明として、ゲノムＤＮＡのＬ−ＰＧ
ＤＳ遺伝子が、そのエクソンIIからエクソンＶがネオマ
イシン耐性遺伝子に置換された変異配列に相同組換えさ
れたマウス胚性幹細胞を導入した初期胚を雌マウス体内
で個体へと発生させて産出させたキメラマウスの子孫個
体であって、生殖細胞および体細胞ゲノムＤＮＡのＬ−
ＰＧＤＳ遺伝子が変異配列に置換されている遺伝子欠損
マウスを提供する。

【００１０】なお、この遺伝子欠損マウスは、Ｌ−ＰＧ
ＤＳの対立遺伝子の両方または片方が変異配列に置換さ
れていることを好ましい態様の一つとしている。さらに
この出願は、以下の各種試験方法を提供する。（１）睡眠調節物質の個体内活性を試験する方法であ
って、上記の遺伝子欠損マウスに候補物質を投与し、こ
のマウスの睡眠状態を測定することを特徴とする試験方
法。（２）鎮痛物質の個体内活性を試験する方法であっ
て、上記の遺伝子欠損マウスに候補物質を投与し、この
マウスの痛覚刺激に対する反応性を測定することを特徴
とする試験方法。（３）血液凝固抑制物質の個体内活性を試験する方法
であって、上記の遺伝子欠損マウスに候補物質を投与
し、このマウスの動脈硬化の程度を測定することを特徴
とする試験方法。（４）腎機能促進物質の個体内活性を試験する方法で
あって、上記の遺伝子欠損マウスに候補物質を投与し、
このマウスの腎機能を測定することを特徴とする試験方
法。（５）不妊改善物質の個体内活性を試験する方法であ
って、上記遺伝子欠損マウスの雄に候補物質を投与し、
この雄マウスの精子の成熟の程度または繁殖率の零度を
測定することを特徴とする試験方法。（６）不妊改善物質の個体内活性を試験する方法であ
って、請求項１記載の遺伝子欠損マウスの雌に、妊娠前
または妊娠後に候補物質を投与し、この雌マウスの子宮
における受精卵の着床状態または胎仔の発育状態を測定
することを特徴とする試験方法。（７）麻酔物質の個体内活性を試験する方法であっ
て、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候補物質を投与
し、このマウスの麻酔状態および／または麻酔からの覚
醒状態を測定することを特徴とする試験方法。（８）生理不順改善物質の個体内活性を試験する方法
であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスの雌に候補
物質を投与し、この雌マウスの性周期、排卵数および／
または各種ホルモン量を測定することを特徴とする試験
方法

【００１１】

【発明の実施の形態】この発明の遺伝子欠損マウスは、
公知の標的遺伝子組換え法（ジーン・ターゲティング：
例えば、Methods in Enzymology 225:803-890, 1993）
を用いることにより、例えば以下のとおりに作成するこ
とができる。先ず、単離したＬ−ＰＧＤＳ遺伝子の配列
中のエクソンIIからＶをネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅ
ｏ^r遺伝子）と置換し、またＬ−ＰＧＤＳ遺伝子の端部
にヘルペスウイルスのサイミジンカイネース遺伝子（Ｈ
ＳＶ−ｔｋ遺伝子）を付加してターゲティング・ベクタ
ーを作成する。このターゲティング・ベクターをマウス
の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡ
のＬ−ＰＧＤＳ遺伝子がターゲティング・ベクター中の
変異配列に相同組換えされた細胞を選択する。このよう
な遺伝子組換え細胞の選択は、Ｇ４１８を細胞培地に添
加してＮｅｏ^r遺伝子を持たない非組換え細胞を除去
し、さらにガンシクロビルを添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝
子が残存するランダムな組換え細胞を除去することによ
って行うことができる。選択された遺伝子組換え細胞の
Ｌ−ＰＧＤＳ遺伝子は、そのコード配列中にＮｅｏ^r遺
伝子が挿入された変異配列であり、Ｌ−ＰＧＤＳを産生
することはできない。

【００１２】次いで、この遺伝子組換えされたＥＳ細胞
をマウスの初期胚（胚盤胞）に注入し、この初期胚を雌
マウスの体内で個体へと発生させ、キメラマウスを産出
させる。そして、このキメラマウスと野生型マウスとを
交配して子孫マウスを産出させ、これらの子孫マウスの
中から、対立遺伝子の両方または片方に変異配列を有す
るマウス個体を選別することによって、この発明の遺伝
子欠損マウスを得ることができる。Ｌ−ＰＧＤＳ産生能
を持たない、またはＬ−ＰＧＤＳ産生量が野生型に比べ
て低い遺伝子欠損マウスを作成することができる。な
お、後記する実施例にも示したように、対立遺伝子の両
方が変異配列に置換されている遺伝子欠損マウス（ホモ
接合体：−／−）は、野生型マウス（＋／＋）に比べＬ
−ＰＧＤＳ活性は１０％以下である。また、対立遺伝子
の片方が変異配列に置換されている遺伝子欠損マウス
（ヘテロ接合体：＋／−）はＬ−ＰＧＤＳ産生量が野生
型マウス（＋／＋）の約半分である。

【００１３】このようにして作成した遺伝子欠損マウス
は、以下のとおりの試験方法に用いることができる。（１）睡眠調節物質の試験方法野生型マウス等にＬ−ＰＧＤＳ活性阻害剤を脳室内投与
すると、顕著な睡眠障害が認められるが、この発明の遺
伝子欠損マウスは遺伝形質としての睡眠障害を呈する。
そこで、催眠薬等の有効成分となる睡眠調節物質の候補
物質を遺伝子欠損マウスに投与し、マウスの睡眠状態を
測定することによって、例えば副作用の少ない睡眠調節
物質の探索、そのような物質を有効成分とする催眠薬の
開発が可能となる。また、このような睡眠調節物質の探
索等をとおして、哺乳動物における睡眠調節機構の解明
も可能となる。なお、マウスの睡眠状態の測定は、例え
ば脳波、筋電、活動量、摂食・摂水量、体温等を経時的
に計測することによって行うことができる。（２）鎮痛物質の試験方法ヒトは健康時には接触刺激によって痛みを感じることは
ないが、例えば帯状疱疹に罹患した場合のような病的状
況下では軽い触覚刺激でも激痛を起こす。これはアロデ
ィニアと呼ばれる現象であり、熱刺激や機械刺激による
痛覚過敏とは区別されている（Textbook of Pain, 3rd
Ed, pp165-200, 1994; Pain 68:13-23,1996）。この発
明の遺伝子欠損マウスは、人為的操作によるアロディニ
アを全く示さず、熱刺激に対する痛覚過敏症状を示すこ
とを特徴としている。

【００１４】従って、この発明の遺伝子欠損マウスは、
アロディニアおよび痛覚過敏誘発機構の解明に利用する
ことができる。また、鎮痛物質の候補をマウスに投与
し、このマウスの痛覚刺激に対する反応性を測定するこ
とによって、痛覚反応に選択的な鎮痛薬を開発すること
が可能となる。さらに、痛覚誘発機構の解明と新規の鎮
痛薬の開発は、例えばモルヒネで抑えることのできない
ガン末期の激痛メカニズムを解明し、その対処療法を開
発するにも有効である。（３）血液凝固抑制物質の試験方法従来、動脈硬化モデル動物としては、強制的に動脈硬化
を生じさせたラットやウサギが用いられていたが、マウ
スはヒトによく似た摂食による動脈硬化を発症させるこ
とができる（Atheroscleosis 57:65-73, 1985）。また
前述のとおり、動脈硬化の病巣には特異的にＬ−ＰＧＤ
Ｓが発現し、それによって合成されるＰＧＤ₂によって
凝固した血液を溶解して血管閉鎖を防止することが知ら
れている。この発明の遺伝子欠損マウスは、Ｌ−ＰＧＤ
Ｓをほとんど、または約半分程度しか産生しないため、
より顕著な形で動脈硬化症状を発症させることができ
る。

【００１５】従って、動脈硬化を生じさせた遺伝子欠損
マウスに血液凝固抑制物質の候補を投与し、このマウス
の動脈硬化の程度を測定することによって、ヒトの動脈
硬化発症機構の解明とともに、新しい血液凝固抑制薬を
開発することが可能である。（４）腎機能促進物質の試験方法前述のとおり、Ｌ−ＰＧＤＳは腎機能の低下に関係する
部位に特異的に発現している。従って、このＬ−ＰＧＤ
Ｓ遺伝子欠損マウスは、例えば塩分摂取量によって容易
に腎機能低下症を生じさせることができ、そのようなモ
デルマウスに候補物質を投与してマウスの腎機能を測定
することにより、新規な腎機能促進薬を開発することが
可能となる。また、ヒトの腎機能低下症の発症機構の解
明にも有効である。（５）男性要因による不妊改善物質の試験方法前述のとおり、男性不妊要因である精子減少症患者の精
液中Ｌ−ＰＧＤＳ濃度は有意に低い。従って、この発明
のＬ−ＰＧＤＳ遺伝子欠損マウスの雄は、精子減少症の
有効なモデル動物であり、このマウスに候補物質を投与
し、この雄マウスの精子の成熟や繁殖率の程度を測定す
ることによって、不妊治療薬の開発が可能となる。ま
た、男性要因による不妊の解明にも有効である。（６）女性要因による不妊改善物質の試験方法野生型の雌マウスでは、妊娠中期の胎盤で特異的かつ一
過性にＬ−ＰＧＤＳが発現するのに対し、この発明の遺
伝子欠損マウスでは、分娩は正常ではあるが、妊娠期間
の顕著な延長が認められる。従って、この遺伝子欠損マ
ウスは、受精卵の着床不全や胎児の発育遅滞の優れた動
物モデルであり、マウスの妊娠前または妊娠後に候補物
質を投与し、この雌マウスの子宮における受精卵の着床
状態または胎児の発育状態を測定することによって、女
性要因による不妊を改善するための薬剤の開発が可能と
なる。（７）麻酔物質の試験方法外科手術等の際には吸入麻酔物質を用いて全身麻酔を行
う場合があるが、理想的な麻酔とは低濃度の吸入麻酔剤
による無痛・筋弛緩・軽い睡眠状態をいう。しかし、麻
酔状態には、性別・年齢・体格・健康状態等に依存した
個体差があり、麻酔のかかりにくい患者では高濃度の吸
入麻酔剤の使用により死に至る場合もある。このため、
吸入麻酔剤の濃度は慎重に決定される必要があるが、吸
入麻酔物質の中枢神経系への作用機序がほとんど解明さ
れていないために、医療現場では熟練医師の経験則に頼
らざるを得ないのが現状である。この発明の遺伝子欠損
マウスは、吸入麻酔物質による麻酔の深度が浅いため、
麻酔下および／または覚醒後の状態を測定することによ
って、痛覚消失・筋弛緩・睡眠に至るメカニズムを各々
分離して解析することが可能である。これにより、現在
使用されている吸入麻酔物質のより詳細な薬効評価が可
能となるばかりか、新規の吸入麻酔物質の開発も可能と
なる。なお、マウスの麻酔状態としては、例えば正向反
射の消失、無痛、筋弛緩、睡眠状態等をそれぞれ常法に
従って測定することができる。また、覚醒状態は、例え
ば正向反射の回復、痛覚反応、筋力の回復、覚醒を測定
することができる。（８）生理不順改善物質の試験方法排卵周期と睡眠および活動量が同調することが知られて
いる（Gen.Comp.Endocrinol. 7:10-17, 1996; Physiol.
Behav. 49:1079-1084, 1991; Brain Res. 734:275-285,
1996; Brain Res. 811:96-104, 1998）。生活リズムの
変調により生理不順が起こるが、ホルモンの分泌異常に
よる生理不順は社会生活に支障をきたすような、例えば
過剰睡眠等を引き起こす。この発明の遺伝子欠損マウス
は、排卵期前後が延長された性周期を示し、その結果、
野生型マウスに比べて性周期が長い。ＰＧＤ₂は排卵誘
発を促すホルモンの分泌量を変化させるため、この発明
の遺伝子欠損マウスは、排卵の誘発機構および生理不順
による過剰睡眠等の誘発機構を解明するために有効であ
り、新規の生理不順改善物質の開発が可能となる。

【００１６】以上のとおりの各試験方法においては、こ
の発明の遺伝子欠損マウスのホモ接合型（−／−）およ
びヘテロ接合型（＋／−）を適宜に使い分けることによ
って、Ｌ−ＰＧＤＳ産生量に依存した各種症状と、それ
に対する試験物質の効果を詳細に分析することが可能で
ある。

【００１７】

【実施例】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
に説明するが、この発明は以下の例に限定されるもので
はない。実施例１（遺伝子欠損マウスの作成）公知のラットＬ−ＰＧＤＳ遺伝子ｃＤＮＡ（J.Biol.Che
m. 264:1041-1045, 1989）に基づいて調製したプローブ
を用い、ラット細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡラ
イブラリーからラットＬ−ＰＧＤＳ遺伝子のｃＤＮＡを
単離し、さらにこのｃＤＮＡをプローブとして、マウス
のゲノムＤＮＡよりＬ−ＰＧＤＳ遺伝子（約３kb）を含
む15kbのＤＮＡ断片をクローニングした。そして、この
Ｌ−ＰＧＤＳ遺伝子のエクソンII（Ｌ−ＰＧＤＳの活性
部位コード領域）からエクソンＶを含む領域をＮｅｏ^r
遺伝子に置換し、さらにＬ−ＰＧＤＳ遺伝子の約10Kb上
流にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を組み込んで変異配列を調製
し、この変異配列をベクターに組み込んでターゲティン
グ・ベクターを作成した（図１参照）。なお、図１にも
示した様に、変異配列のＬ−ＰＧＤＳコード領域は約３
kbとなっている。

【００１８】電気穿孔法により、未分化の培養ＥＳ細胞
（1.2×１0⁷個）にターゲティング・ベクターを４８μ
ｇ／ｍｌの割合で導入して遺伝子導入ＥＳ細胞を得た。
これらの細胞をプレートに播き、２日目後にＧ４１８お
よびガンシクロビルを培地に添加して更に７日間培養
し、Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示すコロニ
ーを得た。これらのコロニーを個別に分離し、さらに培
養したのち、ＤＮＡを抽出してサザンブロッティングに
より相同組換えＥＳ細胞を選別した。

【００１９】次いで、この相同組換えＥＳ細胞を、Ｃ５
７ＢＬ／６系マウスの胚盤胞へ常法により注入し、仮親
マウスへ移植して個体へと発生させた。その結果、１０
匹のキメラマウスを得た。得られたキメラマウスのう
ち、雄の個体と雌の野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスとを
交配させて初代（Ｆ₁）マウスを得た。これらのＦ₁マウ
スから、サザンブロット分析により２倍体染色体の一方
に変異配列が確認された個体（♂、♀）を選別し、これ
らを交配させて第２世代（Ｆ₂）マウスを得た。

【００２０】最終的に、これらＦ₂マウスから、サザン
ブロット分析により２倍体染色体の両方に変異配列が確
認された個体（ホモ接合体）および片方に変異配列が確
認された個体（ヘテロ接合体）を選別し、この発明の遺
伝子欠損動物を作成した。なお、Ｆ₂マウスの野生型：
ヘテロ接合体：ホモ接合体の比は約１：２：１であり、
雌雄比は約１：１であった。ホモ接合体およびヘテロ接
合体とも胎仔性致死は認められなかった。

【００２１】図２は、各マウスの尾部から抽出したＤＮ
Ａのサザンブロット分析の結果であり、野生型（＋／
＋）は５kb、ホモ欠損型（−／−）は３kb、ヘテロ欠損
型（＋／−）はその両者の発現が確認された。図３は、
マウスの脳から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロット分
析の結果であり、Ｇ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３
−リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡ量には差は見られない
が、Ｌ−ＰＧＤＳｍＲＮＡは野生型およびヘテロ欠損型
でのみ発現が認められた。

【００２２】図４は、各マウスの脳より抽出したＬ−Ｐ
ＧＤＳの酵素活性の分析結果である。ホモ欠損型マウス
のＬ−ＰＧＤＳ活性は、野生型マウスの１０％以下、ヘ
テロ欠損型では約５０％であった。実施例２（遺伝子欠損マウスの痛覚感受性の計測）実施例１で得たホモ欠損型マウスの生理的条件下での熱
刺激に対する痛覚感受性を調べた。すなわち、サイトカ
インの一種であるＰＧＥ₂溶液（１〜100ng/５μl）をマ
ウスの髄腔内に投与し、３０分後にホットプレート５５
℃上に置き、プレートから後肢を離すまでの時間を計測
した。その結果、反応時間は、コントロールとして生理
食塩水を投与した場合と比べ約３５％減であり、野生型
マウスと差がなかった。すなわち、この発明の遺伝子欠
損マウスは、生理的条件下での痛覚過敏反応を示した
が、その程度は野生型マウスと同程度であった。

【００２３】次に、病的条件下での触覚刺激による痛覚
過敏反応（アロディニア）について調べた。すなわち、
ＰＧＥ₂溶液（１〜100ng/５μl）をマウスの髄腔内に投
与し、５分後から５０分後まで５分毎に極細のペイント
ブラシで後肢や横腹に軽く触れ、マウスの回避行動およ
び発声等の痛み反応を点数化し、積算した。結果は図５
Ａに示したとおりである。この図では、マウスが全ての
痛み反応を示したと仮定した場合の点数積算値を１００
とし、アロディニア誘発度を％で表示した。この図５Ａ
から明らかなように、野生型マウスは約８０％以上のア
ロディニアを示したが、この発明の遺伝子欠損マウス
（ホモ接合型）は全くアロディニアを示さなかった。

【００２４】また、遺伝子欠損マウスにＰＥＧ₂および
ＰＧＤ₂の混合溶液を髄腔内投与し、アロディニア誘発
への影響を調べた。結果は図５Ｂに示したとおりであ
り、生理濃度に近いフェントグラム濃度のＰＧＤ₂によ
り、ＰＥＧ₂誘発アロデイニアが復活した。しかしなが
ら、それより低濃度のＰＧＤ₂では効果がなく、また、
高濃度では再びＰＥＧ₂誘発アロディニアは消失した。

【００２５】さらに、ＰＥＧ₂／ＰＧＤ₂混合溶液を髄腔
内投与してアロデイニアを復活させた遺伝子欠損マウス
に、ＰＧＤ₂の１０倍量のＢＷＡ８６８Ｃ（ＰＧＤ₂受
容体アンタゴニスト）をＰＥＧ₂／ＰＧＤ₂混合溶液と同
時に投与した。結果は図５Ｃに示したとおりであり、Ｐ
ＥＧ₂誘発アロデイニアは顕著に減少した。以上の結果
から、この発明の遺伝子欠損マウスは、病的条件下での
痛覚過敏反応（アロディニア）の発現機序を解明するた
めのモデル動物として有用であり、また新規な鎮痛薬成
分をスクリーニングする系としても有効であることが確
認された。実施例３（遺伝子欠損マウスの雄の産仔数の計測）実施例１で得たＦ₂マウスの雄（野生型およびホモ欠損
型）を同じくＦ₂マウスの雌（野生型およびホモ欠損
型）と交配させ、産仔数を計測した。

【００２６】結果は図６に示したとおりであり、ホモ欠
損型マウスの雄の産仔数は、野生型の雄マウスの産仔数
より有意（ｐ＜0.01）に少なかった。この結果から、こ
の発明の遺伝子欠損マウスの雄が、男性要因による不妊
モデルとして有用であることが確認された。実施例４（遺伝子欠損マウスの雌の妊娠期間におけるＬ
−ＰＧＤＳｍＲＮＡの発現量の計測）実施例１で得たＦ₂マウスの雌（ホモ欠損型、ヘテロ欠
損型および野生型）を妊娠させ、その胎盤、羊膜および
子宮から、また胎仔の脳および肝臓から抽出したＬ−Ｐ
ＧＤＳｍＲＮＡを逆転写酵素ＰＣＲにより定量した。

【００２７】結果は図７に示したとおりである。野生型
マウスの場合には、妊娠中期の胎盤にのみ一過性にＬ−
ＰＧＤＳｍＲＮＡの発現が認められた。また、野生型マ
ウスの胎仔の脳では、妊娠中期以降にその成長に伴いｍ
ＲＮＡの発現量が増加したが、肝臓ではｍＲＮＡの発現
は検出されなかった。さらに、野生型マウスの場合、羊
水中のｍＲＮＡの発現は妊娠１４日目から検出され、そ
の量は胎仔の成長に伴って増加した。

【００２８】一方、ホモ欠損型マウスの場合には、その
胎仔も含め、検査したいずれの期間および臓器でもＬ−
ＰＧＤＳｍＲＮＡの発現は検出されなかった。実施例５（遺伝子欠損マウスの妊娠期間の計測）実施例１で得たＦ₂マウスの雄雌（ホモ欠損型、ヘテロ
欠損型および野生型）をランダムに同居させ、毎朝交配
成立のマーカーとなる雌膣口のプラグの有無を調べた。
プラグを確認した場合、直ちに雌を分離し、出産までの
期間を計測した。

【００２９】結果は図８に示したとおりである。通常の
野生型マウスの妊娠期間は１８〜２０日間であり、これ
を１日でも過ぎると胎仔の巨大化により胎盤が劣化し死
産となる。一方、ホモ欠損型マウスの場合には、雌雄が
ホモ欠損型の場合には約３０日間に延長した。ただし、
雌雄がヘテロ欠損型の場合には、このような妊娠期間の
延長は認められなかった。また、雄の遺伝子欠損の影響
は、ヘテロ欠損型は影響がなく、ホモ欠損型であっても
雌が野生型であれば影響がないことも確認された。

【００３０】以上の結果から、この発明の遺伝子欠損マ
ウスの雌が、女性要因による不妊モデルとして有用であ
ることが確認された。実施例６（遺伝子欠損マウスにおける吸入麻酔の効果の
計測）密閉系の観察ケージ（４０ｃｍ×６０ｃｍ×４０ｃｍ）
に吸入麻酔物質セボフランを充満させた。セボフラン濃
度は経時的にモニターし、濃度を一定に調節した。この
観察ケージに野生型マウスと遺伝子欠損マウスを各１匹
同時に入れ、密閉系を維持したまま、５分毎に正向反射
の消失（実験者の手に対する行動反応）および痛覚消失
（マウスの尾部付け根を軽くクリップした刺激に対する
行動反応）までの時間を計測した。この測定を２時間行
った後、野生型マウスと遺伝子欠損マウスを同時にケー
ジから取り出し、歩行開始、探索行動およびグルーミン
グ開始までの時間を計測した。

【００３１】結果は表１に示したとおりである。この発
明の遺伝子欠損マウスは、麻酔下での正向反射および痛
覚反射の消失時間が野生型マウスよりも遅く、また覚醒
後の各行動開始時間は、グルーミングを除いて野生型マ
ウスよりも早いことから、麻酔深度が浅いことが判明し
た。従って、この発明の遺伝子欠損マウスは、吸入麻酔
物質に対する低感受性患者のモデルとして有効であるこ
とが確認された。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例７（遺伝子欠損マウスの性周期の計
測）成熟した雌マウス６匹を１ケージに入れた群飼育と、１
匹の単飼育の２種類の飼育条件により、１２時間明暗サ
イクル、室温２３〜２４℃の環境下で３週間馴化した。
その後、毎朝一定時間に、湿らせた綿棒を用いて膣口か
ら粘膜細胞を採取し、その細胞の種類と組み合わせから
発情前期（Ｐ）、発情期（Ｅ）、発情後期−１（Ｍ
１）、発情後期−２（Ｍ２）および発情休止期（Ｄ）に
分類した。

【００３４】結果は図９に示したとおりである。群飼育
および単飼育とも、野生型マウスの性周期は３〜５日で
あるのに対し、この発明の遺伝子欠損マウスの性周期は
５〜９にと有意に長いことが判明した。従って、この発
明の遺伝子欠損マウスは、生理不順のモデルとして有効
であることが確認された。

【００３５】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、Ｌ−ＰＧＤＳ遺伝子がノックアウトされてお
り、この合成酵素の欠損によって中枢神経系機能、循環
器系機能および生殖機能等に、先天性または反応性の障
害を呈する遺伝子欠損マウスが提供される。この遺伝子
欠損マウスを用いることによって、上記の機能障害に対
する予防または治療薬剤の有効成分を動物個体レベルで
試験することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＬ−ＰＧＤＳ遺伝子の構造（上段）、タ
ーゲティング・ベクターにおける変異配列の構造（中
段）および相同組換え後のマウスゲノムＤＮＡ構造（下
段）を示す模式図である。

【図２】各マウスの尾部から抽出したＤＮＡのサザンブ
ロット分析の結果である。

【図３】各マウスの脳から抽出したｍＲＮＡのノーザン
ブロット分析の結果である。

【図４】各マウスの脳より抽出したＬ−ＰＧＤＳの酵素
活性の分析結果である。

【図５】遺伝子欠損マウスの痛覚感受性の分析結果であ
る。

【図６】遺伝子欠損マウスの雄の産仔数の計測結果であ
る。

【図７】野生型マウスの雌の妊娠期間におけるＬ−ＰＧ
ＤＳｍＲＮＡの発現量の分析結果である。

【図８】遺伝子欠損マウスの妊娠期間の計測である。

【図９】野生型マウスおよび遺伝子欠損マウスの性周期
の計測結果である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノムＤＮＡのリポカリン型プロスタグ
ランジンＤ合成酵素遺伝子が、そのエクソンIIからエク
ソンＶをネオマイシン耐性遺伝子に置換した変異配列に
相同組換えされたマウス胚性幹細胞を導入した初期胚を
雌マウス体内で個体へと発生させて産出させたキメラマ
ウスの子孫個体であって、生殖細胞および体細胞ゲノム
ＤＮＡのリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素遺
伝子が変異配列に置換されている遺伝子欠損マウス。
【請求項２】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成
酵素の対立遺伝子の両方が変異配列に置換されている請
求項１の遺伝子欠損マウス。
【請求項３】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成
酵素の対立遺伝子の片方が変異配列に置換されている請
求項１の遺伝子欠損マウス。
【請求項４】睡眠調節物質の個体内活性を試験する方
法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候補物
質を投与し、このマウスの睡眠状態を測定することを特
徴とする試験方法。
【請求項５】鎮痛物質の個体内活性を試験する方法で
あって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候補物質を
投与し、このマウスの痛覚刺激に対する反応性を測定す
ることを特徴とする試験方法。
【請求項６】血液凝固抑制物質の個体内活性を試験す
る方法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候
補物質を投与し、このマウスの動脈硬化の程度を測定す
ることを特徴とする試験方法。
【請求項７】腎機能促進物質の個体内活性を試験する
方法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候補
物質を投与し、このマウスの腎機能を測定することを特
徴とする試験方法。
【請求項８】不妊改善物質の個体内活性を試験する方
法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスの雄に候
補物質を投与し、この雄マウスの精子の成熟の程度およ
び／またはこの雄マウスの繁殖率の程度を測定すること
を特徴とする試験方法。
【請求項９】不妊改善物質の個体内活性を試験する方
法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスの雌に、
妊娠前または妊娠後に候補物質を投与し、この雌マウス
の子宮における受精卵の着床状態および／または胎仔の
発育状態を測定することを特徴とする試験方法。
【請求項１０】麻酔物質の個体内活性を試験する方法
であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスに候補物質
を投与し、このマウスの麻酔状態および／または麻酔か
らの覚醒状態を測定することを特徴とする試験方法。
【請求項１１】生理不順改善物質の個体内活性を試験
する方法であって、請求項１記載の遺伝子欠損マウスの
雌に候補物質を投与し、この雌マウスの性周期、排卵数
および／または各種ホルモン量を測定することを特徴と
する試験方法