JPH11187874A - 生物学的に許容される低分子量ポリエチレンイミン - Google Patents
生物学的に許容される低分子量ポリエチレンイミンInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は低分子量ポリエチレンイミン，細胞
へ核酸を挿入するための，低分子量ポリエチレンイミン
を含むベクター，ならびにこの低分子量ポリエチレンイ
ミンおよびベクターの調製方法と使用を提供する。 【解決手段】 細胞へ核酸を挿入するためのベクターで
あって、上記ベクターは低分子量ポリエチレンイミン
（ＬＭＷ ＰＥＩ）および核酸を含み，このＬＭＷＰＥ
Ｉの分子量は５０，０００Ｄａ未満であるベクター。エ
チレンイミン単量体を水溶液中で塩酸の添加により重合
することを特徴とする、５０，０００Ｄａ未満の分子量
を有する低分子量ポリエチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ）の調製方法。適正量のＬＭＷ ＰＥＩを適正量の核
酸と水溶液中で混合することを特徴とする上記ベクター
の調製方法。
へ核酸を挿入するための，低分子量ポリエチレンイミン
を含むベクター，ならびにこの低分子量ポリエチレンイ
ミンおよびベクターの調製方法と使用を提供する。 【解決手段】 細胞へ核酸を挿入するためのベクターで
あって、上記ベクターは低分子量ポリエチレンイミン
（ＬＭＷ ＰＥＩ）および核酸を含み，このＬＭＷＰＥ
Ｉの分子量は５０，０００Ｄａ未満であるベクター。エ
チレンイミン単量体を水溶液中で塩酸の添加により重合
することを特徴とする、５０，０００Ｄａ未満の分子量
を有する低分子量ポリエチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ）の調製方法。適正量のＬＭＷ ＰＥＩを適正量の核
酸と水溶液中で混合することを特徴とする上記ベクター
の調製方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，低分子量ポリエチ
レンイミン，細胞へ核酸を挿入ための低分子量ポリエチ
レンイミンを含むベクター，ならびにこの低分子量ポリ
エチレンイミンおよびこのベクターの調製と使用に関す
るものである。
レンイミン，細胞へ核酸を挿入ための低分子量ポリエチ
レンイミンを含むベクター，ならびにこの低分子量ポリ
エチレンイミンおよびこのベクターの調製と使用に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、 in vivo における治療目的のＤ
ＮＡ投与は，ヒトの臨床研究ではなんら有意に実を結ぶ
治療結果には至らなかった。その理由は，特に、低い遺
伝子伝達（transfer）効率，遺伝子情報の制約された発
現 [Cottonら，Meth. Enzymol.217: 618-644 (1993)]
，および採用されるカチオン担体材料の不十分な生物
学的適合性（biocompatibility) ［Choksakulnimitr
ら，J. Control. Rel. 34: 233-241 (1995) ］に見いだ
される。レトロウイルス［Miller, Nature 357: 455-46
0 (1992)] またはアデノウイルス [Mulligan, Science
260: 926-932 (1993)]等のウイルスベクターは in vitr
o では極めて見込のある結果を与えたが，これらの炎症
性，免疫原的性質，ならびに突然変異誘発および細胞ゲ
ノム中への組み込みの危険性が特に原因してこれらの i
n vitoにおける使用は制限された［Crystal, Science 2
70: 404-410 (1995)］。ウイルス系よりも取り扱いが簡
単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率よく集
中させることが可能な非ウイルスベクターにより，可能
性のある代替物が提供された［Tomlinson および Rolla
nd, J. Contr. Rel. 39: 357-372 (1996) ］。
ＮＡ投与は，ヒトの臨床研究ではなんら有意に実を結ぶ
治療結果には至らなかった。その理由は，特に、低い遺
伝子伝達（transfer）効率，遺伝子情報の制約された発
現 [Cottonら，Meth. Enzymol.217: 618-644 (1993)]
，および採用されるカチオン担体材料の不十分な生物
学的適合性（biocompatibility) ［Choksakulnimitr
ら，J. Control. Rel. 34: 233-241 (1995) ］に見いだ
される。レトロウイルス［Miller, Nature 357: 455-46
0 (1992)] またはアデノウイルス [Mulligan, Science
260: 926-932 (1993)]等のウイルスベクターは in vitr
o では極めて見込のある結果を与えたが，これらの炎症
性，免疫原的性質，ならびに突然変異誘発および細胞ゲ
ノム中への組み込みの危険性が特に原因してこれらの i
n vitoにおける使用は制限された［Crystal, Science 2
70: 404-410 (1995)］。ウイルス系よりも取り扱いが簡
単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率よく集
中させることが可能な非ウイルスベクターにより，可能
性のある代替物が提供された［Tomlinson および Rolla
nd, J. Contr. Rel. 39: 357-372 (1996) ］。
【０００３】時が経つにつれて古典的形態のトランスフ
エクションの代替物として，ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬ
Ｌ）［Wu および Wu, Biotherapy 3: 87-95 (199
1)］，ＤＥＡＥ- デキストラン［Gopal, Mol, Cell, Bi
ol. 5: 1183-93 (1985) ］，デンドリマー（dendrimer
s）［Haenslerおよび Szoka, Bioconjugate Chem. 4:37
2-379(1993)］またはカチオン性メタクリル酸誘導体［W
olfert ら，Hum. Gene Ther.7: 2123-2133 (1996) ］等
の水溶性カチオンポリマーに準拠する合成ベクター，す
なわちカチオン脂質を用いる”リポフエクション（lipo
fection ）”［Gao および Huang, Gene therapy 2: 71
0-722 (1995)］および両親媒性物質 [Behr, Bioconjuga
te Chem. 5: 382-389 (1994)］が開発された。カチオン
ポリマーを用いる”ポリフエクション（polyfection
）”の決定的有利性は，ポリマーの物理化学的および
生物学的特性に影響し得る構造的変形の可能性が無限に
あることであり，かつ好ましい態様におけるこれらのプ
ラスミド／ポリマー複合体にある。実質的に、トランス
フエリン［Wagnerら， Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 34
10-3414 (1990)］，アシアログリコタンパク［Wu およ
び Wu, J. Bio. Chem. 262: 4429-4432 (1987) ］，お
よび各種抗体［Trubetskoyら，Bioconjugate Chem. 3:
323-327 (1992)］および炭水化物［Midouxら，Nucleic
Acid Research 21: 871-878 (1993)］等の細胞特異的リ
ガンドを追加的に結合することにより，これらベクター
の効率を増加することができた。
エクションの代替物として，ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬ
Ｌ）［Wu および Wu, Biotherapy 3: 87-95 (199
1)］，ＤＥＡＥ- デキストラン［Gopal, Mol, Cell, Bi
ol. 5: 1183-93 (1985) ］，デンドリマー（dendrimer
s）［Haenslerおよび Szoka, Bioconjugate Chem. 4:37
2-379(1993)］またはカチオン性メタクリル酸誘導体［W
olfert ら，Hum. Gene Ther.7: 2123-2133 (1996) ］等
の水溶性カチオンポリマーに準拠する合成ベクター，す
なわちカチオン脂質を用いる”リポフエクション（lipo
fection ）”［Gao および Huang, Gene therapy 2: 71
0-722 (1995)］および両親媒性物質 [Behr, Bioconjuga
te Chem. 5: 382-389 (1994)］が開発された。カチオン
ポリマーを用いる”ポリフエクション（polyfection
）”の決定的有利性は，ポリマーの物理化学的および
生物学的特性に影響し得る構造的変形の可能性が無限に
あることであり，かつ好ましい態様におけるこれらのプ
ラスミド／ポリマー複合体にある。実質的に、トランス
フエリン［Wagnerら， Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 34
10-3414 (1990)］，アシアログリコタンパク［Wu およ
び Wu, J. Bio. Chem. 262: 4429-4432 (1987) ］，お
よび各種抗体［Trubetskoyら，Bioconjugate Chem. 3:
323-327 (1992)］および炭水化物［Midouxら，Nucleic
Acid Research 21: 871-878 (1993)］等の細胞特異的リ
ガンドを追加的に結合することにより，これらベクター
の効率を増加することができた。
【０００４】多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ラ
イン中では，３次元的分岐構造のカチオンポリマーであ
るポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ある場合には平均
以上の大きさトランスフエクション率を引き起こす結果
になった［Boussif ら， Gene Therapy 3: 1074-1080
(1996) ］。例えば，３Ｔ３繊維芽細胞の９５％形質転
換が in vitro で達成された。in vivo での遺伝子のマ
ウス脳中へのＰＥＩ仲介伝達では，ニュ−ロンおよびグ
リア細胞中のリポーター遺伝子およびＢｃｌ2 遺伝子の
長期発現が起きる結果になり，アデノウイルス遺伝子伝
達の場合と同じ程度のものであった［Abdallahら，Hum.
Gene Ther. 7 : 1947-1954 (1996)］。
イン中では，３次元的分岐構造のカチオンポリマーであ
るポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ある場合には平均
以上の大きさトランスフエクション率を引き起こす結果
になった［Boussif ら， Gene Therapy 3: 1074-1080
(1996) ］。例えば，３Ｔ３繊維芽細胞の９５％形質転
換が in vitro で達成された。in vivo での遺伝子のマ
ウス脳中へのＰＥＩ仲介伝達では，ニュ−ロンおよびグ
リア細胞中のリポーター遺伝子およびＢｃｌ2 遺伝子の
長期発現が起きる結果になり，アデノウイルス遺伝子伝
達の場合と同じ程度のものであった［Abdallahら，Hum.
Gene Ther. 7 : 1947-1954 (1996)］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＰＬＬ［Zenke ら，Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 87: 3655-3659 (1990）］，メタ
クリレート誘導体［Cherngら，Pharm. Res. 13: 1038:
1042(1996)］，またはＤＥＡＥ−デキストラン［Gopal,
Mol. Cell.Biol. 5: 1183-93 (1985)］等の文献で既知
の他のポリカチオンとの比較で，ポリエチレンイミンは
ぬきん出た性質を有している。その架橋構造および高電
荷密度の結果，プラスミドを高い程度で濃縮し（conden
se），複合体形成し得る。次いでＤＮＡはこれら複合体
の形態で細胞中に集中される。上記摂取に関与する機
構，細胞内プロセシングおよびＰＥＩ／プラスミド複合
体のリソトロピック活性（Iysotropic activity ）はこ
れまでのところ最終的に解明されていない。
oc. Natl. Acad. Sci. 87: 3655-3659 (1990）］，メタ
クリレート誘導体［Cherngら，Pharm. Res. 13: 1038:
1042(1996)］，またはＤＥＡＥ−デキストラン［Gopal,
Mol. Cell.Biol. 5: 1183-93 (1985)］等の文献で既知
の他のポリカチオンとの比較で，ポリエチレンイミンは
ぬきん出た性質を有している。その架橋構造および高電
荷密度の結果，プラスミドを高い程度で濃縮し（conden
se），複合体形成し得る。次いでＤＮＡはこれら複合体
の形態で細胞中に集中される。上記摂取に関与する機
構，細胞内プロセシングおよびＰＥＩ／プラスミド複合
体のリソトロピック活性（Iysotropic activity ）はこ
れまでのところ最終的に解明されていない。
【０００６】ＰＥＩの決定的に有利な点は，その構造中
のｐＨ依存性電荷にあると考えられ，その結果としてエ
ンドソーム／リソソーム区画の不安定化が起こり，これ
により細胞質中への複合体の放出が容易になる。特に，
異なったｐＫａ値を有するこの分子のアミノ官能基が，
際立った緩衝能力（”プロトンスポンジ”）を有するＰ
ＥＩに対して責任があり，この能力の結果としてエンド
ソームの酸性化に伴ってプロトン化（protonation ）お
よびポリマーの結果的膨潤が起こり，これにより小胞膜
の破壊が起きる。エンドソームＡＴＰａｓｅにより仲介
されるプロトン流入が，同時にアニオン塩化物の受動的
流入の増加をもたらすと考えられ，ＰＥＩの存在下でこ
れが全イオン濃度の著しい増加と，エンドソームの結果
的浸透性膨潤を引き起こすと思われる［Behr, Chimia 5
1: 34-36 (1997) ］。この理由で，例えばＰＬＬをトラ
ンスフエクションするのに必須なクロロキン（chloroqu
ine)等のリソソーム向性因子（lysosomotropic agent）
はＰＥＩがトランスフエクションされる率にはなんらの
影響も与えない［Remy および Behr ，J. Lip. Res.
6: 535-544 (1996)］。
のｐＨ依存性電荷にあると考えられ，その結果としてエ
ンドソーム／リソソーム区画の不安定化が起こり，これ
により細胞質中への複合体の放出が容易になる。特に，
異なったｐＫａ値を有するこの分子のアミノ官能基が，
際立った緩衝能力（”プロトンスポンジ”）を有するＰ
ＥＩに対して責任があり，この能力の結果としてエンド
ソームの酸性化に伴ってプロトン化（protonation ）お
よびポリマーの結果的膨潤が起こり，これにより小胞膜
の破壊が起きる。エンドソームＡＴＰａｓｅにより仲介
されるプロトン流入が，同時にアニオン塩化物の受動的
流入の増加をもたらすと考えられ，ＰＥＩの存在下でこ
れが全イオン濃度の著しい増加と，エンドソームの結果
的浸透性膨潤を引き起こすと思われる［Behr, Chimia 5
1: 34-36 (1997) ］。この理由で，例えばＰＬＬをトラ
ンスフエクションするのに必須なクロロキン（chloroqu
ine)等のリソソーム向性因子（lysosomotropic agent）
はＰＥＩがトランスフエクションされる率にはなんらの
影響も与えない［Remy および Behr ，J. Lip. Res.
6: 535-544 (1996)］。
【０００７】細胞内へのＤＮＡのトランスフエクション
のための，分子量５０ｋＤａおよび８００ｋＤａ（分子
質量はそれぞれ５０，０００ｇ／ｍｏｌ および８０
０，０００ｇ／ｍｏｌ）の高分子量ポリエチレンイミン
の使用はＷＯ第 9602655号Ａ1公報に記載がある。
のための，分子量５０ｋＤａおよび８００ｋＤａ（分子
質量はそれぞれ５０，０００ｇ／ｍｏｌ および８０
０，０００ｇ／ｍｏｌ）の高分子量ポリエチレンイミン
の使用はＷＯ第 9602655号Ａ1公報に記載がある。
【０００８】メーカー（例えば Fluka, Neu Ulm ）提供
の情報によれば，市販のＰＥＩの分子量は６００−１０
００ｋＤａである。かかる高分子量のＰＥＩ調製物（Ｈ
ＭＷＰＥＩ）は濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ以上，ならびに
３時間の短時間保温後に著しい毒性を示す。加えて，こ
のポリエチンイミン構造は酵素的にも加水分解的にも分
解できず，結果として生物学的分解性がない。その上，
ＨＭＷ ＰＥＩは糞便または腎臓のいずれの経路でも排
出できないと考えられる。
の情報によれば，市販のＰＥＩの分子量は６００−１０
００ｋＤａである。かかる高分子量のＰＥＩ調製物（Ｈ
ＭＷＰＥＩ）は濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ以上，ならびに
３時間の短時間保温後に著しい毒性を示す。加えて，こ
のポリエチンイミン構造は酵素的にも加水分解的にも分
解できず，結果として生物学的分解性がない。その上，
ＨＭＷ ＰＥＩは糞便または腎臓のいずれの経路でも排
出できないと考えられる。
【０００９】結論として，例えば遺伝子治療の関連内で
はこれまで使用されてきたＨＭＷＰＥＩの in-vivo で
の投与は実質的危険性を伴う。
はこれまで使用されてきたＨＭＷＰＥＩの in-vivo で
の投与は実質的危険性を伴う。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は分子量５０，０
００Ｄａ未満，好ましくは５００Ｄａから３０，０００
Ｄａ（低分子量ＰＥＩ：ＬＭＷ ＰＥＩ）のポリエチレ
ンイミンに関し，このＬＭＷ ＰＥＩの調製方法（すな
わちプロセス）に関し，および細胞へヌクレオチド配列
を挿入するためにウイルスおよび非ウイルスヌクレオチ
ド配列または核酸との複合体でのＬＭＷ ＰＥＩの使用
に関し，疾病の予防または治療達成のための上記細胞の
哺乳類への投与に関し，および疾病の予防または治療達
成のためのＬＭＷ ＰＥＩのヌクレオチド配列との複合
体での哺乳類への投与に関する。
００Ｄａ未満，好ましくは５００Ｄａから３０，０００
Ｄａ（低分子量ＰＥＩ：ＬＭＷ ＰＥＩ）のポリエチレ
ンイミンに関し，このＬＭＷ ＰＥＩの調製方法（すな
わちプロセス）に関し，および細胞へヌクレオチド配列
を挿入するためにウイルスおよび非ウイルスヌクレオチ
ド配列または核酸との複合体でのＬＭＷ ＰＥＩの使用
に関し，疾病の予防または治療達成のための上記細胞の
哺乳類への投与に関し，および疾病の予防または治療達
成のためのＬＭＷ ＰＥＩのヌクレオチド配列との複合
体での哺乳類への投与に関する。
【００１１】本発明は，低分子量ポリエチレンイミン
（ＬＭＷ ＰＥＩ）および核酸（ヌクレオチド配列）を
含むベクターに関し，この場合のＬＭＷ ＰＥＩは５
０，０００Ｄａ未満の分子量を有する。特に本発明は，
分子量５０，０００Ｄａ未満のポリチレンイミンおよ
び，好ましくは非ウイルスまたはウイルス性核酸構造物
である核酸からなる複合体を含むベクタ−を用いて細胞
へ核酸構造物（construct ）を挿入するためのベクター
に関する。
（ＬＭＷ ＰＥＩ）および核酸（ヌクレオチド配列）を
含むベクターに関し，この場合のＬＭＷ ＰＥＩは５
０，０００Ｄａ未満の分子量を有する。特に本発明は，
分子量５０，０００Ｄａ未満のポリチレンイミンおよ
び，好ましくは非ウイルスまたはウイルス性核酸構造物
である核酸からなる複合体を含むベクタ−を用いて細胞
へ核酸構造物（construct ）を挿入するためのベクター
に関する。
【００１２】好ましくは，このＬＭＷ ＰＥＩは５００
〜３０，０００Ｄａの分子量を有する。本発明の好まし
い実施態様では，このＬＭＷ ＰＥＩの分子量は１００
０から５０００Ｄａである。約２０００Ｄａの分子量が
特に好ましい。
〜３０，０００Ｄａの分子量を有する。本発明の好まし
い実施態様では，このＬＭＷ ＰＥＩの分子量は１００
０から５０００Ｄａである。約２０００Ｄａの分子量が
特に好ましい。
【００１３】本発明は，単量体エチレンイミンに関して
好ましくは０．１％濃度から９０％濃度および濃塩酸
（３７％濃度）に関して好ましくは０．１％濃度から１
０％濃度である水性溶液を用いて，水性溶液中の単量体
エチレンイミンを塩酸を添加することにより重合させて
調製した低分子量ポリチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）
と核酸とを含むベクターに関する。
好ましくは０．１％濃度から９０％濃度および濃塩酸
（３７％濃度）に関して好ましくは０．１％濃度から１
０％濃度である水性溶液を用いて，水性溶液中の単量体
エチレンイミンを塩酸を添加することにより重合させて
調製した低分子量ポリチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）
と核酸とを含むベクターに関する。
【００１４】本発明は，ｐＨ４から１０の異なったｐＨ
値の範囲における０．１Ｍリン酸緩衝液中で実施した膨
潤の研究で濁りまたは沈殿を一切示さないＬＭＷ ＰＥ
Ｉを用いた，低分子量ポリエチレンイミンと核酸とを含
むベクターに関する。
値の範囲における０．１Ｍリン酸緩衝液中で実施した膨
潤の研究で濁りまたは沈殿を一切示さないＬＭＷ ＰＥ
Ｉを用いた，低分子量ポリエチレンイミンと核酸とを含
むベクターに関する。
【００１５】本発明はこのベクターを用いた場合，１％
を上回るトランスフエクション率，好ましくは５％また
はそれ以上，および特別の態様では１０％またはそれ以
上のトランスフエクション率を達成する，低分子量ポリ
エチレンイミンと核酸とを含むベクターに関する。
を上回るトランスフエクション率，好ましくは５％また
はそれ以上，および特別の態様では１０％またはそれ以
上のトランスフエクション率を達成する，低分子量ポリ
エチレンイミンと核酸とを含むベクターに関する。
【００１６】この核酸は例えばＤＮＡまたはＲＮＡであ
ることができる。この核酸はオリゴヌクレオチドまたは
核酸構造物であることができる。この核酸は好ましくは
ウイルスまたは非ウイルス核酸構造物である。この核酸
構造物は遺伝子またはプラスミドであることが好まし
い。この核酸構造物は導入遺伝子（transgene ）を含ん
でもよい。この核酸構造物は一つまたは二つ以上のエフ
エクター遺伝子を含んでいてもよい。例えばエフエクタ
ー遺伝子は薬理学的活性化合物またはそのプロドラッグ
をコード，および／または酵素をコードできる。この核
酸構造物は，その遺伝子（例えばエフェクター遺伝子ま
たは導入遺伝子）が具体的には例えば、ウイルス特異的
に（すなわち例えばウイルス感染細胞においてのみ），
具体的には代謝に関して（標的）細胞特異的に，具体的
には発生（development ）に関して細胞サイクル特異
的，またはその他非特異的に発現されるように構成され
るのが好ましい。最も単純な場合，この核酸は所望タン
パクをコードする遺伝子，および特定プロモーター配列
および，適切な場合，さらに調節配列を含む。例えばウ
イルスプロモーター配列および／またはエンハンサー配
列は遺伝子発現を増加および／または延長の目的で存在
できる。この種プロモーター配列および／またはエンハ
ンサー配列については例えば Dillon, TiBTech 11, 167
(1993) 中に概説がある。これら配列の例は， Rous sa
rcoma ウイルスおよびレトロウイルスのＬＴＲ配列，Ｃ
ＭＶウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域，
ＡＡＶウイルスのＩＴＲ配列および／またはプロモータ
ー配列ｐ５，ｐ１９およびｐ４０，アデノウイルスのＩ
ＴＲおよび／またはプロモーター配列，ワクシニアウイ
ルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列，ヘルペ
スウイルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列，
パルボウイルスのプロモーター配列および乳頭腫ウイル
スのプロモーター配列（上流調節領域）である。
ることができる。この核酸はオリゴヌクレオチドまたは
核酸構造物であることができる。この核酸は好ましくは
ウイルスまたは非ウイルス核酸構造物である。この核酸
構造物は遺伝子またはプラスミドであることが好まし
い。この核酸構造物は導入遺伝子（transgene ）を含ん
でもよい。この核酸構造物は一つまたは二つ以上のエフ
エクター遺伝子を含んでいてもよい。例えばエフエクタ
ー遺伝子は薬理学的活性化合物またはそのプロドラッグ
をコード，および／または酵素をコードできる。この核
酸構造物は，その遺伝子（例えばエフェクター遺伝子ま
たは導入遺伝子）が具体的には例えば、ウイルス特異的
に（すなわち例えばウイルス感染細胞においてのみ），
具体的には代謝に関して（標的）細胞特異的に，具体的
には発生（development ）に関して細胞サイクル特異
的，またはその他非特異的に発現されるように構成され
るのが好ましい。最も単純な場合，この核酸は所望タン
パクをコードする遺伝子，および特定プロモーター配列
および，適切な場合，さらに調節配列を含む。例えばウ
イルスプロモーター配列および／またはエンハンサー配
列は遺伝子発現を増加および／または延長の目的で存在
できる。この種プロモーター配列および／またはエンハ
ンサー配列については例えば Dillon, TiBTech 11, 167
(1993) 中に概説がある。これら配列の例は， Rous sa
rcoma ウイルスおよびレトロウイルスのＬＴＲ配列，Ｃ
ＭＶウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域，
ＡＡＶウイルスのＩＴＲ配列および／またはプロモータ
ー配列ｐ５，ｐ１９およびｐ４０，アデノウイルスのＩ
ＴＲおよび／またはプロモーター配列，ワクシニアウイ
ルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列，ヘルペ
スウイルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列，
パルボウイルスのプロモーター配列および乳頭腫ウイル
スのプロモーター配列（上流調節領域）である。
【００１７】ＬＭＷ ＰＥＩは二つの出発物質を混合す
ることにより核酸と複合体を形成する。混合比を選択し
て中性またカチオン電荷を有する複合体とすることが好
ましい。５０％（重量％）を超えるＬＭＷ ＰＥＩを含
む複合体からなるベクターとなるようにすることが好ま
しい。このベクターはＬＭＷ ＰＥＩ対核酸が３：１ま
たはそれを上回る，特に好ましくは５：１もしくはそれ
を上回るまたは８：１もしくはそれを上回る重量比を示
すのが好ましい。
ることにより核酸と複合体を形成する。混合比を選択し
て中性またカチオン電荷を有する複合体とすることが好
ましい。５０％（重量％）を超えるＬＭＷ ＰＥＩを含
む複合体からなるベクターとなるようにすることが好ま
しい。このベクターはＬＭＷ ＰＥＩ対核酸が３：１ま
たはそれを上回る，特に好ましくは５：１もしくはそれ
を上回るまたは８：１もしくはそれを上回る重量比を示
すのが好ましい。
【００１８】このエフエクター遺伝子の配列以外にも，
例えばもしこの核酸構造物がリガンドをコードする配列
も含むと，融合タンパクとしてのリガンドと一緒にエフ
エクター遺伝子が発現され得る。
例えばもしこの核酸構造物がリガンドをコードする配列
も含むと，融合タンパクとしてのリガンドと一緒にエフ
エクター遺伝子が発現され得る。
【００１９】極めて一般的態様では本発明は，ＬＭＷ
ＰＥＩ，核酸および適切な場合にはリガンドを含むベク
ターに関する。このベクターの個々の成分は共有結合お
よび／または吸着結合で連結されるのが好ましい。例え
ば，コードされたタンパクおよび／またはＬＭＷ ＰＥ
Ｉはリガンドに結合され得る。特に本発明は，低分子量
ポリエチレンイミンが細胞特異的（または標的細胞特異
的）リガンドに結合しているベクターに関する。
ＰＥＩ，核酸および適切な場合にはリガンドを含むベク
ターに関する。このベクターの個々の成分は共有結合お
よび／または吸着結合で連結されるのが好ましい。例え
ば，コードされたタンパクおよび／またはＬＭＷ ＰＥ
Ｉはリガンドに結合され得る。特に本発明は，低分子量
ポリエチレンイミンが細胞特異的（または標的細胞特異
的）リガンドに結合しているベクターに関する。
【００２０】このリガンドは細胞特異的または標的細胞
特異的リガンドであることが好ましい。標的細胞特異的
リガンドは標的細胞好ましくは動物またはヒト標的細胞
の外膜に結合できる。標的細胞特異的リガンドは標的細
胞に対する高い特異性を示す。標的細胞特異的リガンド
を含むベクターは核酸の標的細胞特異的伝達（transfe
r）に使用できる。例えば標的細胞は，内皮細胞，筋細
胞，マクロフアージ，リンパ球，グリア細胞，造血細
胞，例えば白血病細胞等の腫瘍細胞，ウイルス感染細
胞，気管支上皮細胞または肝細胞例えば肝臓のシヌソイ
ド細胞であり得る。
特異的リガンドであることが好ましい。標的細胞特異的
リガンドは標的細胞好ましくは動物またはヒト標的細胞
の外膜に結合できる。標的細胞特異的リガンドは標的細
胞に対する高い特異性を示す。標的細胞特異的リガンド
を含むベクターは核酸の標的細胞特異的伝達（transfe
r）に使用できる。例えば標的細胞は，内皮細胞，筋細
胞，マクロフアージ，リンパ球，グリア細胞，造血細
胞，例えば白血病細胞等の腫瘍細胞，ウイルス感染細
胞，気管支上皮細胞または肝細胞例えば肝臓のシヌソイ
ド細胞であり得る。
【００２１】内皮細胞に特異的に結合するリガンドは，
例えば内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体もしくは
それらの断片，末端にマンノースを有する糖タンパク，
糖脂質もしくは多糖類，サイトカイン，成長因子，接着
分子（adhesion molecules）からなる群，または特に好
ましい実施態様では内皮細胞に対して向性（tropism）
を有するウイルスエンベロープ由来の糖タンパクからな
る群から選択できる。平滑筋細胞に特異的に結合するリ
ガンドは例えば，アクチンに特異的なモノクローナル抗
体もしくはそれらの断片，細胞膜受容体および成長因子
からなる群，または特に好ましい実施態様では平滑筋細
胞に対して向性を有するウイルスエンベロープからの糖
タンパクからなる群から選択できる。マクロフアージお
よび／またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは例
えば，マクロフアージおよび／またはリンパ球上の膜抗
原に特異的なモノクローナル抗体，マクロフアージおよ
び／またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナ
ルもしくはモノクローナル抗体の完全な（intact）免疫
グロブリンもしくはＦｃ断片，サイトカイン，成長因
子，末端にマンノースを有するペプチド，タンパク，脂
質もしくは多糖類からなる群，または特に好ましい実施
態様ではウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク，特
にヌクレオチド位８７２中に変異があるインフルエンザ
ＣウイスＨＥＦタンパクまたは触媒三つ組残基セリン７
１，ヒスチジン３６８もしくは３６９およびアスパラギ
ン酸２６１を含むインフルエンザＣウイルスＨＥＦ開裂
産物からのグリコタンパクからなる群から選択できる。
グリア細胞に特異的に結合するリガンドは例えば，グリ
ア細胞の膜構造に特異的に結合する抗体および抗体断
片，接着分子，末端にマンノースを有するペプチド，タ
ンパク質，脂質もしくは多糖類，成長因子からなる群，
または特に好ましい実施態様では，グリア細胞に対して
向性を有するウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク
からなる群から選択され得る。造血細胞に特異的に結合
するリガンドは例えば，幹細胞因子受容体に特異的な抗
体もしくは抗体断片，ＩＬ−１（特に受容体タイプＩま
たはＩＩ），ＩＬ−３（特に受容体タイプａもしくは
β），ＩＬ−６もしくはＧＭ−ＣＳＦ，およびまた完全
な免疫グロブリンもしくはこの特異性を示すＦｃ断片な
らびにＳＣＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−３，ＩＬ−６もしくは
ＧＭ−ＤＳＦ等の成長因子および関連受容体に結合する
これらの断片からなる群から選択され得る。白血病細胞
に特異的に結合するリガンドは例えば，抗体，抗体断
片，免疫グロブリンもしくはＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ
１５，ＣＤ３３，ＣＡＭＡＬ，シアロシル−Ｌｅ，ＣＤ
５，ＣＤ１ｅ，ＣＤ２３，Ｍ３８，ＩＬ−２受容体，Ｔ
細胞受容体，ＣＡＬＬＡもしくはＣＤ１９等の白血病細
胞上の膜構造に特異的に結合するＦｃ断片，およびまた
成長因子もしくはこれに由来する断片もしくはレチノイ
ドからなる群から選択され得る。ウイルス感染細胞に特
異的に結合するリンガンドは例えば，抗体，抗体断片，
完全免疫グロブリン，もしくはウイルス感染後に感染細
胞の細胞膜上に発現されるウイルス抗原に特異的なＦｃ
断片からなる群から選択され得る。気管支上皮細胞，肝
臓のシヌソイド細胞または肝細胞に特異的に結合できる
リガンドは例えば，トランスフエリン，アシアロオロソ
ムコイド等のアシアログリコプロテイン，ネオグリコプ
ロテインもしくはガラクトース、インスリン，末端にマ
ンノースを有するペプチド，タンパク，脂質もしくは多
糖類，完全免疫グロブリンもしくは標的細胞に特異的に
結合するＦｃ断片からなる群，ならびに特に好ましい実
施態様では，標的細胞に特異的に結合するウイルスのエ
ンベロープ由来の糖タンパクからなる群から選択され得
る。他のリガンドの詳細な例については例えば欧州ＥＰ
第 0790312号および欧州ＥＰ第 0846772号に開示があ
る。
例えば内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体もしくは
それらの断片，末端にマンノースを有する糖タンパク，
糖脂質もしくは多糖類，サイトカイン，成長因子，接着
分子（adhesion molecules）からなる群，または特に好
ましい実施態様では内皮細胞に対して向性（tropism）
を有するウイルスエンベロープ由来の糖タンパクからな
る群から選択できる。平滑筋細胞に特異的に結合するリ
ガンドは例えば，アクチンに特異的なモノクローナル抗
体もしくはそれらの断片，細胞膜受容体および成長因子
からなる群，または特に好ましい実施態様では平滑筋細
胞に対して向性を有するウイルスエンベロープからの糖
タンパクからなる群から選択できる。マクロフアージお
よび／またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは例
えば，マクロフアージおよび／またはリンパ球上の膜抗
原に特異的なモノクローナル抗体，マクロフアージおよ
び／またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナ
ルもしくはモノクローナル抗体の完全な（intact）免疫
グロブリンもしくはＦｃ断片，サイトカイン，成長因
子，末端にマンノースを有するペプチド，タンパク，脂
質もしくは多糖類からなる群，または特に好ましい実施
態様ではウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク，特
にヌクレオチド位８７２中に変異があるインフルエンザ
ＣウイスＨＥＦタンパクまたは触媒三つ組残基セリン７
１，ヒスチジン３６８もしくは３６９およびアスパラギ
ン酸２６１を含むインフルエンザＣウイルスＨＥＦ開裂
産物からのグリコタンパクからなる群から選択できる。
グリア細胞に特異的に結合するリガンドは例えば，グリ
ア細胞の膜構造に特異的に結合する抗体および抗体断
片，接着分子，末端にマンノースを有するペプチド，タ
ンパク質，脂質もしくは多糖類，成長因子からなる群，
または特に好ましい実施態様では，グリア細胞に対して
向性を有するウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク
からなる群から選択され得る。造血細胞に特異的に結合
するリガンドは例えば，幹細胞因子受容体に特異的な抗
体もしくは抗体断片，ＩＬ−１（特に受容体タイプＩま
たはＩＩ），ＩＬ−３（特に受容体タイプａもしくは
β），ＩＬ−６もしくはＧＭ−ＣＳＦ，およびまた完全
な免疫グロブリンもしくはこの特異性を示すＦｃ断片な
らびにＳＣＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−３，ＩＬ−６もしくは
ＧＭ−ＤＳＦ等の成長因子および関連受容体に結合する
これらの断片からなる群から選択され得る。白血病細胞
に特異的に結合するリガンドは例えば，抗体，抗体断
片，免疫グロブリンもしくはＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ
１５，ＣＤ３３，ＣＡＭＡＬ，シアロシル−Ｌｅ，ＣＤ
５，ＣＤ１ｅ，ＣＤ２３，Ｍ３８，ＩＬ−２受容体，Ｔ
細胞受容体，ＣＡＬＬＡもしくはＣＤ１９等の白血病細
胞上の膜構造に特異的に結合するＦｃ断片，およびまた
成長因子もしくはこれに由来する断片もしくはレチノイ
ドからなる群から選択され得る。ウイルス感染細胞に特
異的に結合するリンガンドは例えば，抗体，抗体断片，
完全免疫グロブリン，もしくはウイルス感染後に感染細
胞の細胞膜上に発現されるウイルス抗原に特異的なＦｃ
断片からなる群から選択され得る。気管支上皮細胞，肝
臓のシヌソイド細胞または肝細胞に特異的に結合できる
リガンドは例えば，トランスフエリン，アシアロオロソ
ムコイド等のアシアログリコプロテイン，ネオグリコプ
ロテインもしくはガラクトース、インスリン，末端にマ
ンノースを有するペプチド，タンパク，脂質もしくは多
糖類，完全免疫グロブリンもしくは標的細胞に特異的に
結合するＦｃ断片からなる群，ならびに特に好ましい実
施態様では，標的細胞に特異的に結合するウイルスのエ
ンベロープ由来の糖タンパクからなる群から選択され得
る。他のリガンドの詳細な例については例えば欧州ＥＰ
第 0790312号および欧州ＥＰ第 0846772号に開示があ
る。
【００２２】さらに本発明は，アジリジン（aziridine
）（エチレンイミン単量体）の開環重合による低分子
量カチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基ずくポ
リマーコンジュゲート（ＬＭＷ ＰＥＩ）の製造方法に
関する。
）（エチレンイミン単量体）の開環重合による低分子
量カチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基ずくポ
リマーコンジュゲート（ＬＭＷ ＰＥＩ）の製造方法に
関する。
【００２３】かかる状況下で上記エチレンイミンは， W
enker (JACS 57: 2328 (1935))の方法によりエタノール
アミンから調製するのが好ましい。この沸点は好ましく
は５５．０−５６．０℃である。
enker (JACS 57: 2328 (1935))の方法によりエタノール
アミンから調製するのが好ましい。この沸点は好ましく
は５５．０−５６．０℃である。
【００２４】ドイツ特許出願第 665,791号（1938) には
酸または三フッ化ホウ素等の触媒を液状エチレンアミン
単量体に添加することによるＰＥＩの合成が記載されて
いる。本発明によば， Dick ら，J. Macromol. Sci. A
4: 1301-1314 (1970)に準拠して塩酸の添加・存在下に
水溶液中でエチレンイミン単量体を重合できる。
酸または三フッ化ホウ素等の触媒を液状エチレンアミン
単量体に添加することによるＰＥＩの合成が記載されて
いる。本発明によば， Dick ら，J. Macromol. Sci. A
4: 1301-1314 (1970)に準拠して塩酸の添加・存在下に
水溶液中でエチレンイミン単量体を重合できる。
【００２５】重合には，蒸留水中０．１％濃度から９０
％濃度のエチレンイミン（単量体）溶液を撹拌しながら
調製し，触媒として０．１％から１０％の濃塩酸（３７
％）を添加する。１−３０日，好ましくは４日間３０−
７０℃好ましくは５０℃で重合する。
％濃度のエチレンイミン（単量体）溶液を撹拌しながら
調製し，触媒として０．１％から１０％の濃塩酸（３７
％）を添加する。１−３０日，好ましくは４日間３０−
７０℃好ましくは５０℃で重合する。
【００２６】ポリマーは例えば 13 Ｃ−ＮＭＲ分光法，
サイズ排除クロマトグラフイー，光散乱および／または
粘度法の手段で特性化する。光散乱法を用いる分子量の
測定法は，B. Vollmert (1962) "Grundriss der Makrom
olekularen Chemie (Outlineof macromolecular chemis
try -高分子化学の概況）”，Springer Verlag Berlin,
216-225 頁中に原理的な記載がある。この分子量の決
定は光散乱法，特に例えば Wyatt Dawn DSP 分散光度計
を用いてＫ5 測定セル中への直接注入に続いて６３３ｎ
ｍでレーザー散乱光測定法により実施するのが好まし
い。分子量は例えばトルエン中で決定した較正定数およ
び初期の既知試料重量を用いて測定できる。
サイズ排除クロマトグラフイー，光散乱および／または
粘度法の手段で特性化する。光散乱法を用いる分子量の
測定法は，B. Vollmert (1962) "Grundriss der Makrom
olekularen Chemie (Outlineof macromolecular chemis
try -高分子化学の概況）”，Springer Verlag Berlin,
216-225 頁中に原理的な記載がある。この分子量の決
定は光散乱法，特に例えば Wyatt Dawn DSP 分散光度計
を用いてＫ5 測定セル中への直接注入に続いて６３３ｎ
ｍでレーザー散乱光測定法により実施するのが好まし
い。分子量は例えばトルエン中で決定した較正定数およ
び初期の既知試料重量を用いて測定できる。
【００２７】上記記載の方法は分子サイズが５００Ｄａ
から５０，０００Ｄａの低分子量ＰＥＩ（ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ）の調製に使用できる。したがってこの低分子量ＰＥ
Ｉ（ＬＭＷ ＰＥＩ）の分子量はＨＭＷ ＰＥＩの分子
量よりも著しく低く，かつ腎臓排出の保証をすべきとす
る意味の５０ｋＤａという腎臓のしきい値（threshold
）よりも著しく低い。
から５０，０００Ｄａの低分子量ＰＥＩ（ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ）の調製に使用できる。したがってこの低分子量ＰＥ
Ｉ（ＬＭＷ ＰＥＩ）の分子量はＨＭＷ ＰＥＩの分子
量よりも著しく低く，かつ腎臓排出の保証をすべきとす
る意味の５０ｋＤａという腎臓のしきい値（threshold
）よりも著しく低い。
【００２８】意外なことに，核酸または核酸構造物を細
胞へ挿入するためのベクターとしてのその有効性に関し
て，および生物学的許容性（tolerability）に関しては
ＬＭＷ ＰＥＩはＨＭＷ ＰＥＩよりも著しく優れてい
ることが判った。分子サイズが１０００Ｄａから３０，
０００ＤａのＬＭＷ ＰＥＩが最も好適であることが証
明された。ＬＭＷ ＰＥＩは正の性質のＤＮＡと結合，
濃縮（condense）およびこれを増加し得る。リポーター
遺伝子を含むＤＮＡと複合体形成すると，例えば約２０
００Ｄａ分子量のＬＭＷ ＰＥＩは［血清の存在下に］
哺乳類細胞［例えばマウス繊維芽細胞（３Ｔ３）および
ヒト内皮細胞ＥＣＶ３０４）］中のリポーター遺伝子発
現のレベルを，市販高分子量（ＨＭＷ）ＰＥＩが達成す
るレベルよりも１００倍も高いレベルに引き上げた。同
時に繊維芽細胞の場合のＬＭＷＰＥＩの細胞毒性はＨＭ
Ｗ ＰＥＩの場合に比べて著しく低減した。
胞へ挿入するためのベクターとしてのその有効性に関し
て，および生物学的許容性（tolerability）に関しては
ＬＭＷ ＰＥＩはＨＭＷ ＰＥＩよりも著しく優れてい
ることが判った。分子サイズが１０００Ｄａから３０，
０００ＤａのＬＭＷ ＰＥＩが最も好適であることが証
明された。ＬＭＷ ＰＥＩは正の性質のＤＮＡと結合，
濃縮（condense）およびこれを増加し得る。リポーター
遺伝子を含むＤＮＡと複合体形成すると，例えば約２０
００Ｄａ分子量のＬＭＷ ＰＥＩは［血清の存在下に］
哺乳類細胞［例えばマウス繊維芽細胞（３Ｔ３）および
ヒト内皮細胞ＥＣＶ３０４）］中のリポーター遺伝子発
現のレベルを，市販高分子量（ＨＭＷ）ＰＥＩが達成す
るレベルよりも１００倍も高いレベルに引き上げた。同
時に繊維芽細胞の場合のＬＭＷＰＥＩの細胞毒性はＨＭ
Ｗ ＰＥＩの場合に比べて著しく低減した。
【００２９】従って，本発明は分子量５０，０００Ｄａ
未満，好ましくは５００Ｄａから３０，０００Ｄａのポ
リエチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）に関し，このＬＭ
ＷＰＥＩの調製方法に関し，かつ細胞ヘヌクレオチド配
列を挿入するためのウイルスおよび非ウイルスヌクレオ
チド配列との複合体の形態でのＬＭＷ ＰＥＩの使用に
関し，疾病の予防または治療達成の目的でこの細胞の哺
乳類への投与に関し，および疾病の予防または治療達成
の目的でヌクレオチド配列との複合体の形におけるＬＭ
Ｗ ＰＥＩの哺乳類への投与に関するものである。
未満，好ましくは５００Ｄａから３０，０００Ｄａのポ
リエチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）に関し，このＬＭ
ＷＰＥＩの調製方法に関し，かつ細胞ヘヌクレオチド配
列を挿入するためのウイルスおよび非ウイルスヌクレオ
チド配列との複合体の形態でのＬＭＷ ＰＥＩの使用に
関し，疾病の予防または治療達成の目的でこの細胞の哺
乳類への投与に関し，および疾病の予防または治療達成
の目的でヌクレオチド配列との複合体の形におけるＬＭ
Ｗ ＰＥＩの哺乳類への投与に関するものである。
【００３０】本発明は，分子量５０，０００Ｄａ未満の
低分子量ポリエチレンイミン，好ましくは上記方法によ
り調製されたＬＭＷ ＰＥＩに関する。
低分子量ポリエチレンイミン，好ましくは上記方法によ
り調製されたＬＭＷ ＰＥＩに関する。
【００３１】本発明は，分子量５０，０００Ｄａ未満，
好ましくは１０００〜３０，０００Ｄａ特に約２０００
ＤａのＬＭＷ ＰＥＩの使用にも関する。このＬＭＷ
ＰＥＩは例えば細胞へ核酸を挿入するために，細胞へ核
酸を挿入するためのベクターを調製するために，または
医薬の調整のために，および／または遺伝子治療におい
て使用できる。
好ましくは１０００〜３０，０００Ｄａ特に約２０００
ＤａのＬＭＷ ＰＥＩの使用にも関する。このＬＭＷ
ＰＥＩは例えば細胞へ核酸を挿入するために，細胞へ核
酸を挿入するためのベクターを調製するために，または
医薬の調整のために，および／または遺伝子治療におい
て使用できる。
【００３２】その上，本発明は細胞へ核酸を挿入するた
めのベクターの調製方法に関する。例えばこのベクター
はＬＭＷ ＰＥＩの適正量を適正量の核酸と混合して調
製できる。このＬＭＷ ＰＥＩと核酸とは水溶液中で混
合することが好ましい。
めのベクターの調製方法に関する。例えばこのベクター
はＬＭＷ ＰＥＩの適正量を適正量の核酸と混合して調
製できる。このＬＭＷ ＰＥＩと核酸とは水溶液中で混
合することが好ましい。
【００３３】その上，本発明はこのベクターの使用に関
する。例えば，このベクターは細胞もしくは標的細胞へ
の核酸の挿入のために（トランスフエクションまたはポ
リフエクション），または医薬の調製のために，および
／または遺伝子治療に使用できる。好ましくは本発明
は，非ウイルスもしくはウイルス核酸構造物を細胞へ挿
入するためのベクターの使用および疾病の予防および治
療達成の目的でのこの（トランスフエクションされた）
細胞の患者への投与に関し，この場合の細胞は例えば内
皮細胞，リンパ球，マクロフアージ，肝細胞，繊維芽細
胞，筋細胞または上皮細胞であることができ，およびこ
の細胞は例えば皮膚上へ，皮下へ，筋肉内へ，傷内へ，
体腔内へ，臓器（organ ）もしくは血管内へ局所的に注
射できる。他の好ましい態様での本発明は，疾病の予防
または治療達成のためのこのベクターの使用に関し，こ
の場合のベクターは例えば皮膚上へ，皮下へ，筋肉内
へ，傷内へ，体腔内へ，臓器もしくは血管内へ局所的に
注射できる。
する。例えば，このベクターは細胞もしくは標的細胞へ
の核酸の挿入のために（トランスフエクションまたはポ
リフエクション），または医薬の調製のために，および
／または遺伝子治療に使用できる。好ましくは本発明
は，非ウイルスもしくはウイルス核酸構造物を細胞へ挿
入するためのベクターの使用および疾病の予防および治
療達成の目的でのこの（トランスフエクションされた）
細胞の患者への投与に関し，この場合の細胞は例えば内
皮細胞，リンパ球，マクロフアージ，肝細胞，繊維芽細
胞，筋細胞または上皮細胞であることができ，およびこ
の細胞は例えば皮膚上へ，皮下へ，筋肉内へ，傷内へ，
体腔内へ，臓器（organ ）もしくは血管内へ局所的に注
射できる。他の好ましい態様での本発明は，疾病の予防
または治療達成のためのこのベクターの使用に関し，こ
の場合のベクターは例えば皮膚上へ，皮下へ，筋肉内
へ，傷内へ，体腔内へ，臓器もしくは血管内へ局所的に
注射できる。
【００３４】このＬＭＷ ＰＥＩ，またはＬＭＷ ＰＥ
Ｉを含むベクターは例えば細胞／標的細胞へ核酸を挿入
するのに使用できるが，この場合の細胞／標的細胞は内
皮細胞，リンパ球，マクロフアージ，肝細胞，繊維芽細
胞，筋細胞または上皮細胞である。
Ｉを含むベクターは例えば細胞／標的細胞へ核酸を挿入
するのに使用できるが，この場合の細胞／標的細胞は内
皮細胞，リンパ球，マクロフアージ，肝細胞，繊維芽細
胞，筋細胞または上皮細胞である。
【００３５】さらに本発明は，トランスフエクションさ
れた細胞または標的細胞の調製方法に関し，この場合，
ＬＭＷ ＰＥＩおよび／またはベクターはこの細胞と共
に保温される。トランスフエクションは in vitro で実
施するのが好ましい。また本発明はＬＭＷ ＰＥＩおよ
び／または新規ベクターを含むトランスフエクションさ
れた細胞または標的細胞にも関する。その上，本発明は
例えば医薬としてのトランスフエクションされた細胞の
使用，または医薬調製用および／または遺伝子治療のた
めのトランスフエクションされた細胞の使用に関するも
のである。
れた細胞または標的細胞の調製方法に関し，この場合，
ＬＭＷ ＰＥＩおよび／またはベクターはこの細胞と共
に保温される。トランスフエクションは in vitro で実
施するのが好ましい。また本発明はＬＭＷ ＰＥＩおよ
び／または新規ベクターを含むトランスフエクションさ
れた細胞または標的細胞にも関する。その上，本発明は
例えば医薬としてのトランスフエクションされた細胞の
使用，または医薬調製用および／または遺伝子治療のた
めのトランスフエクションされた細胞の使用に関するも
のである。
【００３６】さらに本発明は，ＬＭＷ ＰＥＩおよび／
または新規ベクターおよび／またはトランスフエクショ
ンされた細胞を含む医薬に関する。また本発明は，医薬
の調製方法に関し，この場合，核酸がＬＭＷ ＰＥＩと
共に混合され，適切な場合さらに添加剤も混合される。
または新規ベクターおよび／またはトランスフエクショ
ンされた細胞を含む医薬に関する。また本発明は，医薬
の調製方法に関し，この場合，核酸がＬＭＷ ＰＥＩと
共に混合され，適切な場合さらに添加剤も混合される。
【００３７】この新規ＬＭＷ ＰＥＩの分岐の程度はＨ
ＭＷ ＰＥＩの場合よりもかなり少なく，したがってＨ
ＭＷ ＰＥＩの場合よりも多くのアミノ基を含み，ＨＭ
ＷＰＥＩに比べてＬＭＷ ＰＥＩは細胞特異的リガンド
に結合する機会がはるかに多い。従って本発明は，細胞
特異的リガンドへのＬＭＷ ＰＥＩの結合に関し，かつ
ウイルスまたは非ウイルス核酸配列との複合体での結合
生成物の使用であって，このヌクレオチド配列を細胞へ
挿入したり，または疾病の予防もしくは治療達成の目的
でこの複合体を哺乳類へ投与するための結合生成物の使
用に関するものである。既に特許出願欧州ＥＰ第 97101
506.0 号および独国ＤＥ第 19649645.4 号には細胞特異
的リガンドの調製および結合の可能性についての詳細が
すでに記載されている。これらの特許出願をここに引用
により包含する。
ＭＷ ＰＥＩの場合よりもかなり少なく，したがってＨ
ＭＷ ＰＥＩの場合よりも多くのアミノ基を含み，ＨＭ
ＷＰＥＩに比べてＬＭＷ ＰＥＩは細胞特異的リガンド
に結合する機会がはるかに多い。従って本発明は，細胞
特異的リガンドへのＬＭＷ ＰＥＩの結合に関し，かつ
ウイルスまたは非ウイルス核酸配列との複合体での結合
生成物の使用であって，このヌクレオチド配列を細胞へ
挿入したり，または疾病の予防もしくは治療達成の目的
でこの複合体を哺乳類へ投与するための結合生成物の使
用に関するものである。既に特許出願欧州ＥＰ第 97101
506.0 号および独国ＤＥ第 19649645.4 号には細胞特異
的リガンドの調製および結合の可能性についての詳細が
すでに記載されている。これらの特許出願をここに引用
により包含する。
【００３８】ＬＭＷ ＰＥＩ適切な場合に細胞特異的リ
ガンドに結合したＬＭＷ ＰＥＩとウイルスもしくは非
ウイルス核酸構造物との間の複合体は遺伝子治療用ベク
ターを構成する。好ましい態様におけるこれらのベクタ
ーは、体腔へ，臓器中へ，血液循環系へ，呼吸経路へ，
胃腸管へ，もしくは尿生殖器管へ，または筋肉内もしは
皮下へ，外的もしくは内的に患者に局所投与される。
ガンドに結合したＬＭＷ ＰＥＩとウイルスもしくは非
ウイルス核酸構造物との間の複合体は遺伝子治療用ベク
ターを構成する。好ましい態様におけるこれらのベクタ
ーは、体腔へ，臓器中へ，血液循環系へ，呼吸経路へ，
胃腸管へ，もしくは尿生殖器管へ，または筋肉内もしは
皮下へ，外的もしくは内的に患者に局所投与される。
【００３９】この新規ベクターはエフエクター遺伝子を
非細胞特異的もしくは細胞特異的態様で標的細胞へ集中
するのに使用でき，この場合，このエフエクター遺伝子
は活性化合物の不活性前駆体を活性化合物へと開裂する
薬理学的活性化合物もしは酵素をコードする遺伝子であ
ることが好ましい。このエフエクター遺伝子の選択によ
り，薬理学的活性化合物または酵素を融合タンパクとし
てのリガンドと一緒に発現させたり，このリガンドを例
えば細胞表面に結合させて内皮細胞もしくは腫瘍細胞を
増殖させることができる。
非細胞特異的もしくは細胞特異的態様で標的細胞へ集中
するのに使用でき，この場合，このエフエクター遺伝子
は活性化合物の不活性前駆体を活性化合物へと開裂する
薬理学的活性化合物もしは酵素をコードする遺伝子であ
ることが好ましい。このエフエクター遺伝子の選択によ
り，薬理学的活性化合物または酵素を融合タンパクとし
てのリガンドと一緒に発現させたり，このリガンドを例
えば細胞表面に結合させて内皮細胞もしくは腫瘍細胞を
増殖させることができる。
【００４０】本発明はまた，新規ＬＭＷ ＰＥＩを用い
て核酸構造物を挿入した酵母もしくは哺乳類細胞に関す
る。特に好ましい実施態様では，この新規ＬＭＷ ＰＥ
Ｉは核酸構造物の細胞ラインへの導入に用いられ，次い
でトランスフエクションされた後にこの導入遺伝子の発
現に用いることができる。従ってこれらの細胞は患者用
薬剤の調製用に使用することができる。核酸構造物との
複合体での新規ＬＭＷＰＥＩの好ましい使用は疾病治療
の目的のものであり，この場合の薬剤の調製には標的細
胞への核酸構造物の挿入，およびウイルス特異的または
標的細胞特異的または代謝特異的または非特異的ならび
に細胞サイクル特異的態様での構造物の発現が包含され
る。
て核酸構造物を挿入した酵母もしくは哺乳類細胞に関す
る。特に好ましい実施態様では，この新規ＬＭＷ ＰＥ
Ｉは核酸構造物の細胞ラインへの導入に用いられ，次い
でトランスフエクションされた後にこの導入遺伝子の発
現に用いることができる。従ってこれらの細胞は患者用
薬剤の調製用に使用することができる。核酸構造物との
複合体での新規ＬＭＷＰＥＩの好ましい使用は疾病治療
の目的のものであり，この場合の薬剤の調製には標的細
胞への核酸構造物の挿入，およびウイルス特異的または
標的細胞特異的または代謝特異的または非特異的ならび
に細胞サイクル特異的態様での構造物の発現が包含され
る。
【００４１】さらに本発明は疾病治療のための薬剤を調
製するために，新規ＬＭＷ ＰＥＩを用いて核酸構造物
が挿入された哺乳類細胞の投与に関する。例えば，内皮
細胞を血液から単離し， in vitro で新規ベクターで処
理し，次いで例えば患者へ静脈注射することができる。
製するために，新規ＬＭＷ ＰＥＩを用いて核酸構造物
が挿入された哺乳類細胞の投与に関する。例えば，内皮
細胞を血液から単離し， in vitro で新規ベクターで処
理し，次いで例えば患者へ静脈注射することができる。
【００４２】in vitroでトランスフエクションされた，
かかる細胞は新規ベクターとの組合わせで患者に投与す
ることができる。この組み合わせは，細胞とベクターと
を含み，それぞれは同時もしくは異なった時間に，およ
び同一部位もしくは異なった部位に投与もしくは注射さ
れる。
かかる細胞は新規ベクターとの組合わせで患者に投与す
ることができる。この組み合わせは，細胞とベクターと
を含み，それぞれは同時もしくは異なった時間に，およ
び同一部位もしくは異なった部位に投与もしくは注射さ
れる。
【００４３】実施例： １）方法 ａ）低分子量ポリエチレンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）の
調製 ＬＭＷ ＰＥＩは酸触媒を用いて水性溶液中での開環重
合によりアジリジン（aziridine ）から得られる。この
場合，１０％濃度エチレンイミン単量体水溶液（エチレ
ンイミン単量体５ｍｌ＋蒸留水４５ｍｌ，撹拌して溶
解）を例えば触媒としての濃塩酸（３７％）の１％
（０．５ｍｌ）の添加存在下に５０℃で４日間撹拌し，
次いで回転蒸発にかけ，真空下に室温で乾燥した。分子
量測定はレーザー散乱光測定（Wyatt Dawn DSP分散光度
計）の手法でＫ5 測定セル中に直接注入の後６３３ｎｍ
で実施した。分子質量はトルエン中で決定した補正定数
および既知の試料初期重量に基づいて決める。
調製 ＬＭＷ ＰＥＩは酸触媒を用いて水性溶液中での開環重
合によりアジリジン（aziridine ）から得られる。この
場合，１０％濃度エチレンイミン単量体水溶液（エチレ
ンイミン単量体５ｍｌ＋蒸留水４５ｍｌ，撹拌して溶
解）を例えば触媒としての濃塩酸（３７％）の１％
（０．５ｍｌ）の添加存在下に５０℃で４日間撹拌し，
次いで回転蒸発にかけ，真空下に室温で乾燥した。分子
量測定はレーザー散乱光測定（Wyatt Dawn DSP分散光度
計）の手法でＫ5 測定セル中に直接注入の後６３３ｎｍ
で実施した。分子質量はトルエン中で決定した補正定数
および既知の試料初期重量に基づいて決める。
【００４４】分散分析の手法による分子量測定は２００
０Ｄａの値を与えた。比較のため、市販（Fluka, Neu U
lm から入手) ＰＥＩの分散分析による分子量は７９１
ｋＤａ（ＨＭＷ ＰＥＩ）であった。
０Ｄａの値を与えた。比較のため、市販（Fluka, Neu U
lm から入手) ＰＥＩの分散分析による分子量は７９１
ｋＤａ（ＨＭＷ ＰＥＩ）であった。
【００４５】二つの調製品（ＬＭＷ ＰＥＩおよびＨＭ
Ｗ ＰＥＩ）を試験で比較した。 ｂ）ポリヌクレオチド複合体の調製 Boussif ら［Boussif ら，Proc. Natl. Acad. Sci. 92;
7297-7301 (1995)]の方法に従ってプラスミドＤＮＡを
ＰＥＩを用いて複合体形成した。５０％市販ＨＭＷ Ｐ
ＥＩ溶液９ｍｇまたはＬＭＷ ＰＥＩの９ｍｇを２重蒸
留水９ｍｌ中に溶解し，この溶液を１Ｎ ＨＣｌを用い
てｐＨ７．４に調製し，水で最終容量１０．０ｍｌに仕
上げた。仕上がり溶液を濾過（０．２μｍ）により滅菌
すると、４℃で比較的長時間の貯蔵ができた。
Ｗ ＰＥＩ）を試験で比較した。 ｂ）ポリヌクレオチド複合体の調製 Boussif ら［Boussif ら，Proc. Natl. Acad. Sci. 92;
7297-7301 (1995)]の方法に従ってプラスミドＤＮＡを
ＰＥＩを用いて複合体形成した。５０％市販ＨＭＷ Ｐ
ＥＩ溶液９ｍｇまたはＬＭＷ ＰＥＩの９ｍｇを２重蒸
留水９ｍｌ中に溶解し，この溶液を１Ｎ ＨＣｌを用い
てｐＨ７．４に調製し，水で最終容量１０．０ｍｌに仕
上げた。仕上がり溶液を濾過（０．２μｍ）により滅菌
すると、４℃で比較的長時間の貯蔵ができた。
【００４６】複合体形成のために，プラスミド１０μｇ
および異なった量のＰＥＩストック溶液を各場合に最終
容量が２５０μｌになるように１５０ｍＭＮａＣｌ中に
希釈し，ボルテックス（vortex）中で混合した。複合体
の混合および当量比の一欄を表１に示す。室温で１０分
間保温（incubation）後，ポリマー溶液を複数回プラス
ミド溶液に滴下し，ボルテックス中で混合した。この複
合体を細胞培地に添加するに先立ってさらに１０分間保
温した。
および異なった量のＰＥＩストック溶液を各場合に最終
容量が２５０μｌになるように１５０ｍＭＮａＣｌ中に
希釈し，ボルテックス（vortex）中で混合した。複合体
の混合および当量比の一欄を表１に示す。室温で１０分
間保温（incubation）後，ポリマー溶液を複数回プラス
ミド溶液に滴下し，ボルテックス中で混合した。この複
合体を細胞培地に添加するに先立ってさらに１０分間保
温した。
【００４７】ｃ）アガロースシフト検定（assay ） 異なったＰＥＩのプラスミド結合能力を，アガロースゲ
ルシフト検定で確認した。このために各場合，ＨＭＷ
ＰＥＩの１．３５−２７μｇおよびＬＭＷ ＰＥＩの
２．７−９０μｇをプラスミド１０μｇで複合体形成し
た（表１）。５０μｌのアリコットを厚さ約０．５ｃｍ
の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上に装填し，Tris-EDT
A 緩衝液，pH 7.4中，８０ｍＶで２時間展開した。ＤＮ
Ａの位置は臭化エチジウムとの反応後に２５４ｎｍで可
視化した。
ルシフト検定で確認した。このために各場合，ＨＭＷ
ＰＥＩの１．３５−２７μｇおよびＬＭＷ ＰＥＩの
２．７−９０μｇをプラスミド１０μｇで複合体形成し
た（表１）。５０μｌのアリコットを厚さ約０．５ｃｍ
の１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上に装填し，Tris-EDT
A 緩衝液，pH 7.4中，８０ｍＶで２時間展開した。ＤＮ
Ａの位置は臭化エチジウムとの反応後に２５４ｎｍで可
視化した。
【００４８】この複合体からプラスミドを置換する目的
で，各場合に複合体の形成後３０分でデキストラン硫酸
溶液（Mw 5000, 10mg/ml, Sigma, Deisenhofen) ５０μ
ｌまたは１００μｌをＤＮＡ複合体１０μｇに加えた。
で，各場合に複合体の形成後３０分でデキストラン硫酸
溶液（Mw 5000, 10mg/ml, Sigma, Deisenhofen) ５０μ
ｌまたは１００μｌをＤＮＡ複合体１０μｇに加えた。
【００４９】ｄ）細胞培養 当業者には周知の標準条件下にＬ９２９マウス繊維芽細
胞を培養した。これらの細胞を密度８０００細胞／ウエ
ルで９６−ウエル細胞培養プレート中に接種し，次いで
毒性実験に使用するのに先立ち２４時間培養した。３Ｔ
３繊維芽細胞も同様に標準条件下に培養した。
胞を培養した。これらの細胞を密度８０００細胞／ウエ
ルで９６−ウエル細胞培養プレート中に接種し，次いで
毒性実験に使用するのに先立ち２４時間培養した。３Ｔ
３繊維芽細胞も同様に標準条件下に培養した。
【００５０】外見上は正常の臍の緒から確立し，自然発
生的に形質転換された粘着性ヒト内皮細胞ラインである
ＥＣＶ ３０４（ATCC, Rockville, MD USA)を、５％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ），５％ウマ血清および１％Ｎ−ア
セチル−Ｌ−アラニル−グルタミン（全て Gibco, Egge
nsteinから）を含む Dulbecco's 修飾イーグルの培地
（ＤＭＥＭ）（Gibco, Eggenstein ）中で培養した。
生的に形質転換された粘着性ヒト内皮細胞ラインである
ＥＣＶ ３０４（ATCC, Rockville, MD USA)を、５％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ），５％ウマ血清および１％Ｎ−ア
セチル−Ｌ−アラニル−グルタミン（全て Gibco, Egge
nsteinから）を含む Dulbecco's 修飾イーグルの培地
（ＤＭＥＭ）（Gibco, Eggenstein ）中で培養した。
【００５１】３７℃、相対環境湿度９５％および５％Ｃ
Ｏ2 で保温した細胞を，集合（confluence）到達後にト
リプシン／ＥＧＴＡ溶液（トリプシンの２．５％ストッ
ク溶液，エチレングリコール四酢酸の５０ｍＭ溶液，Ｐ
ＢＳ，ｐＨ７．４，比率１：１：８）を用いて１週２回
継代接種した。この細胞は個々よりも寧ろ細胞集塊で基
板（substratum）から離れるので，各場合に１／８継代
を実施した。
Ｏ2 で保温した細胞を，集合（confluence）到達後にト
リプシン／ＥＧＴＡ溶液（トリプシンの２．５％ストッ
ク溶液，エチレングリコール四酢酸の５０ｍＭ溶液，Ｐ
ＢＳ，ｐＨ７．４，比率１：１：８）を用いて１週２回
継代接種した。この細胞は個々よりも寧ろ細胞集塊で基
板（substratum）から離れるので，各場合に１／８継代
を実施した。
【００５２】Bowmanら［１９］および Mischekら［Misc
hek ら，Cell. Tiss. Res. 256: 221-226 (1989)] の方
法に従って大脳毛細管内皮細胞を単離し培養した。トラ
ンスフエクション実験の場合，単離して約５０％集合ま
で培養した直後、それらを６−ウエル細胞培養プレート
中に接種した。
hek ら，Cell. Tiss. Res. 256: 221-226 (1989)] の方
法に従って大脳毛細管内皮細胞を単離し培養した。トラ
ンスフエクション実験の場合，単離して約５０％集合ま
で培養した直後、それらを６−ウエル細胞培養プレート
中に接種した。
【００５３】ｅ）毒性研究 Mosmann ら［Mosmann, J. Immunol.Methods 65: 55-63
(1983)] の方法に従ってＭＴＴ検定を用いてＬ９２９マ
ウス繊維芽細胞に及ぼす上記ポリマーの毒性を測定し
た。１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥ
Ｍ中でポリマーの希釈系列を調製し，濾過（０．２μ
ｍ，Schleicher & Schuell, Dassel) により滅菌した。
必要に応じて溶液のｐＨおよび浸透圧を補正した。２４
時間の予備保温後，このポリマー溶液で細胞を処理し，
１，３，１２および２４時間保温した。細胞生存力をホ
ルマザン濃度測定によりＵＶ−測光で定量した。
(1983)] の方法に従ってＭＴＴ検定を用いてＬ９２９マ
ウス繊維芽細胞に及ぼす上記ポリマーの毒性を測定し
た。１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥ
Ｍ中でポリマーの希釈系列を調製し，濾過（０．２μ
ｍ，Schleicher & Schuell, Dassel) により滅菌した。
必要に応じて溶液のｐＨおよび浸透圧を補正した。２４
時間の予備保温後，このポリマー溶液で細胞を処理し，
１，３，１２および２４時間保温した。細胞生存力をホ
ルマザン濃度測定によりＵＶ−測光で定量した。
【００５４】第２実験系列では，一般に１時間細胞をポ
リマーで処理しただけであり，次いで洗浄し，無ＰＥＩ
細胞培地中でさらに３，１２および２４時間培養した。
評価は上記のように行った。
リマーで処理しただけであり，次いで洗浄し，無ＰＥＩ
細胞培地中でさらに３，１２および２４時間培養した。
評価は上記のように行った。
【００５５】ｆ）トランスフエクション ３ｃｍ2 ペトリ皿中に接種したＥＣＶ３０４細胞および
３Ｔ３マウス繊維芽細胞，および６−ウエル培養プレー
ト中に接種した一次（primary ）内皮細胞を実験直前に
ＰＢＳ，ｐＨ７．４で洗浄し，新しく血清を補充した培
地を供給した。３．３３μｇＤＮＡ／ウエルまたは皿に
該当するＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷＰＥＩ複合体を添
加し，３７℃で１時間保温した。この細胞を引き続き６
０時間保温し，ルシフエラーゼまたはβ−ガラクトシダ
−ゼ活性をメーカー指示書に準拠して測定した。［この
ＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩ複合体はその対応
ベクターである；これらはＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ
ＰＥＩのそれぞれ，およびこの場合はプラスミドＤＮ
Ａである核酸を含む］
３Ｔ３マウス繊維芽細胞，および６−ウエル培養プレー
ト中に接種した一次（primary ）内皮細胞を実験直前に
ＰＢＳ，ｐＨ７．４で洗浄し，新しく血清を補充した培
地を供給した。３．３３μｇＤＮＡ／ウエルまたは皿に
該当するＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷＰＥＩ複合体を添
加し，３７℃で１時間保温した。この細胞を引き続き６
０時間保温し，ルシフエラーゼまたはβ−ガラクトシダ
−ゼ活性をメーカー指示書に準拠して測定した。［この
ＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩ複合体はその対応
ベクターである；これらはＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ
ＰＥＩのそれぞれ，およびこの場合はプラスミドＤＮ
Ａである核酸を含む］
【００５６】実施例２： 結果 ａ）ＰＥＩの物理化学的性質 エンドソーム／リソソーム区画中での反応に関してこれ
らポリマーの挙動を，ｐＨ４−１０範囲の異なったｐＨ
値で０．１Ｍリン酸緩衝液中で実施した膨潤研究により
で詳しく調べた。ＨＭＷ ＰＥＩはｐＨ９およびｐＨ１
０で溶解して透明溶液を形成し残渣はなかったが，一方
ｐＨ８およびそれ未満では著しい濁度が観察された。こ
の濁りはｐＨ７およびｐＨ８では大いに安定していた。
数時間（several hours ）後に沈降のサインが現れただ
けである。対照的に，容易に再懸濁される沈降物が酸性
範囲のｐＨ値で３０分以内に形成された。同一条件下で
は，ＬＭＷ ＰＥＩは濁りや沈殿は生成せず，透明な溶
液を形成した。
らポリマーの挙動を，ｐＨ４−１０範囲の異なったｐＨ
値で０．１Ｍリン酸緩衝液中で実施した膨潤研究により
で詳しく調べた。ＨＭＷ ＰＥＩはｐＨ９およびｐＨ１
０で溶解して透明溶液を形成し残渣はなかったが，一方
ｐＨ８およびそれ未満では著しい濁度が観察された。こ
の濁りはｐＨ７およびｐＨ８では大いに安定していた。
数時間（several hours ）後に沈降のサインが現れただ
けである。対照的に，容易に再懸濁される沈降物が酸性
範囲のｐＨ値で３０分以内に形成された。同一条件下で
は，ＬＭＷ ＰＥＩは濁りや沈殿は生成せず，透明な溶
液を形成した。
【００５７】ｂ）細胞毒性研究 ＰＥＩの毒性を in vitro でＬ９２９マウス繊維芽細胞
につき測定した。この細胞はポリマーの毒性および生物
学的適合性を測定するための標準細胞培養モデルとして
種々の標準組織体が推奨している細胞である。形成した
ホルマザンの吸収と１×１０3 および３×１０4 細胞数
範囲との間の直線的正比例関係は先行実験で確立されて
いた。２４時間成長期に続いて，８０００細胞／ウエル
をこのポリマー溶液で処理し，１，３，１２および２４
時間保温した。０−１．０ｍｇ／ｍｌ範囲では，ＨＭＷ
ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩの観察された毒性効果は
２４時間までの期間に亙って時間および濃度依存的であ
り，高分子量および低分子量ＰＥＩの毒性プロフイール
は著しい差異を示した。このように，ＨＭＷ ＰＥＩの
場合には，ＩＣ50は０．０６ｍｇ／ｍｌ（１時間保温）
から０．０４ｍｇ／ｍｌ（２４時間保温）であったが，
一方ＬＭＷ ＰＥＩ濃度０．１から１．０ｍｇ／ｍｌで
は１２時間保温後にのみ毒性になり，２４時間保温後に
は約０．１ｍｇ／ｍｌのＩＣ50値を測定し得るだけであ
った。
につき測定した。この細胞はポリマーの毒性および生物
学的適合性を測定するための標準細胞培養モデルとして
種々の標準組織体が推奨している細胞である。形成した
ホルマザンの吸収と１×１０3 および３×１０4 細胞数
範囲との間の直線的正比例関係は先行実験で確立されて
いた。２４時間成長期に続いて，８０００細胞／ウエル
をこのポリマー溶液で処理し，１，３，１２および２４
時間保温した。０−１．０ｍｇ／ｍｌ範囲では，ＨＭＷ
ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩの観察された毒性効果は
２４時間までの期間に亙って時間および濃度依存的であ
り，高分子量および低分子量ＰＥＩの毒性プロフイール
は著しい差異を示した。このように，ＨＭＷ ＰＥＩの
場合には，ＩＣ50は０．０６ｍｇ／ｍｌ（１時間保温）
から０．０４ｍｇ／ｍｌ（２４時間保温）であったが，
一方ＬＭＷ ＰＥＩ濃度０．１から１．０ｍｇ／ｍｌで
は１２時間保温後にのみ毒性になり，２４時間保温後に
は約０．１ｍｇ／ｍｌのＩＣ50値を測定し得るだけであ
った。
【００５８】ｃ）アガロースゲルシフト検定 プラスミドとＲＥＩとの間の最適結合比率および量的比
率を確認する目的で、一定量のプラスミド（１０μ）
を，異なった濃度のＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷＰＥＩ
を用いて指示された様に複合体形成化し，次いで電気泳
動により分析した。研究した複合体の混合比，使用した
ストック溶液容量およびＰＥＩの絶対量の概要を表１に
示す。
率を確認する目的で、一定量のプラスミド（１０μ）
を，異なった濃度のＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷＰＥＩ
を用いて指示された様に複合体形成化し，次いで電気泳
動により分析した。研究した複合体の混合比，使用した
ストック溶液容量およびＰＥＩの絶対量の概要を表１に
示す。
【００５９】 ａ） 混合比 ストック ＨＭＷ ＰＥＩ プラスミド／ＨＭＷ ＰＥＩ 溶液の容量 絶対量 ［当量］ ［μｌ］ ［μｇ］ １＋１ ３ １．３５ １＋６．６７ ２０ ９ １＋１０ ３０ １３．５ １＋１３．３３ ４０ １８ １＋２０ ６０ ２７ ｂ） 混合比 ストック ＬＭＷ ＰＥＩ プラスミド／ＬＭＷ ＰＥＩ 溶液の容量 絶対量 ［当量］ ［μｌ］ ［μｇ］ １＋２ ３ ２．７ １＋１３．３３ ２０ １８ １＋２０ ３０ ２７ １＋２６．６７ ４０ ３６ １＋４０ ６０ ５４ １＋５３．３３ ８０ ７２ １＋６６．６６ １００ ９０ 表１：ａ）ＨＭＷ ＰＥＩおよびｂ）ＬＭＷ ＰＥＩを含み，電気泳動および トランスフエクションに使用した複合体の混合比の概要
【００６０】プラスミドおよびこれら複合体の位置は臭
化エチジウムによる染色で可視化された。このＤＮＡは
プラスミドのスーパーコイルの環状形に該当し，アノー
ド方向に移動した二つの蛍光バンドを形成した。
化エチジウムによる染色で可視化された。このＤＮＡは
プラスミドのスーパーコイルの環状形に該当し，アノー
ド方向に移動した二つの蛍光バンドを形成した。
【００６１】１＋１の比率でＨＭＷ ＰＥＩと複合体形
成するＤＮＡは，積載（loading ）部位で部分的だが依
然としてプラスミドの不完全な遅延（retardation ）を
生じた。全積載の低減および／または直径の増加は生成
複合体のゲルマトリックス中での移動を防止した。
成するＤＮＡは，積載（loading ）部位で部分的だが依
然としてプラスミドの不完全な遅延（retardation ）を
生じた。全積載の低減および／または直径の増加は生成
複合体のゲルマトリックス中での移動を防止した。
【００６２】比率１＋６から１＋２０の複合体は蛍光を
示さなかったので検出できなかった；このことはこれら
の構造が効果的に濃縮され，ＨＭＷ ＰＥＩにより物理
的に圧縮されるために，臭化エチジウムがプラスミドか
ら締め出されることを示した。これらの複合体の場合，
アニオン／カチオン比は１：１．２（１＋６）から１：
４（１＋２０）で変化する。その結果，この複合体は全
体として正の電荷を有するべきである。
示さなかったので検出できなかった；このことはこれら
の構造が効果的に濃縮され，ＨＭＷ ＰＥＩにより物理
的に圧縮されるために，臭化エチジウムがプラスミドか
ら締め出されることを示した。これらの複合体の場合，
アニオン／カチオン比は１：１．２（１＋６）から１：
４（１＋２０）で変化する。その結果，この複合体は全
体として正の電荷を有するべきである。
【００６３】２．７μｇのＬＭＷ ＰＥＩが１０μｇの
プラスミドを殆ど完全に結合し，かつ遅延し得た。しか
し，この複合体は全体として依然として負電荷を有し，
アノードを指向して移動した。しかし，このＤＮＡの完
全なカチオン化および濃縮は５４μｇおよびそれを上回
るＬＭＷ ＰＥＩを用いた際にのみ観察された。
プラスミドを殆ど完全に結合し，かつ遅延し得た。しか
し，この複合体は全体として依然として負電荷を有し，
アノードを指向して移動した。しかし，このＤＮＡの完
全なカチオン化および濃縮は５４μｇおよびそれを上回
るＬＭＷ ＰＥＩを用いた際にのみ観察された。
【００６４】高分子量および低分子量ＰＥＩによる濃縮
の影響を実証する目的で，過剰のデキストラン硫酸を用
いてこのＤＮＡを完成複合体から置換させた。この硫酸
デキストランはカチオンポリマーとの競合反応に加わ
る。ＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩ両方の場合，
このＤＮＡが複合体から再度放され，このＤＮＡの全て
もしくは一部はゲルマトリックス中へ移動するのが可能
であった。臭化エチジウムの場合は挿入（intercalate
）が再度可能であったので、このＤＮＡを蛍光により
検出できた。
の影響を実証する目的で，過剰のデキストラン硫酸を用
いてこのＤＮＡを完成複合体から置換させた。この硫酸
デキストランはカチオンポリマーとの競合反応に加わ
る。ＨＭＷ ＰＥＩおよびＬＭＷ ＰＥＩ両方の場合，
このＤＮＡが複合体から再度放され，このＤＮＡの全て
もしくは一部はゲルマトリックス中へ移動するのが可能
であった。臭化エチジウムの場合は挿入（intercalate
）が再度可能であったので、このＤＮＡを蛍光により
検出できた。
【００６５】ｄ）In-vitro でのトランスフエクション
効率 このＰＥＩ複合体のトランスフエクション効率を細胞ラ
イン（３Ｔ３マウス繊維芽細胞およびヒト内皮細胞ライ
ンＥＣＶ３０４）および一次培養物（ブタ脳毛細内皮細
胞）の両方を用いて測定した。ＳＶ ４０プロモーター
およびエンハンサーの制御下にルシフエラーゼ遺伝子を
有する，Promega 市販のｐＧＬ3 対照ベクターをリポー
ター遺伝子として用いた。プラスミドとポリマーが複合
体中で混合された比率は電気泳動に用いた場合と同じで
あった。
効率 このＰＥＩ複合体のトランスフエクション効率を細胞ラ
イン（３Ｔ３マウス繊維芽細胞およびヒト内皮細胞ライ
ンＥＣＶ３０４）および一次培養物（ブタ脳毛細内皮細
胞）の両方を用いて測定した。ＳＶ ４０プロモーター
およびエンハンサーの制御下にルシフエラーゼ遺伝子を
有する，Promega 市販のｐＧＬ3 対照ベクターをリポー
ター遺伝子として用いた。プラスミドとポリマーが複合
体中で混合された比率は電気泳動に用いた場合と同じで
あった。
【００６６】ＨＭＷ ＰＥＩ（１．３５μｇから２７μ
ｇ）／ＤＮＡ（１０μｇ）濃度が試験された。ＨＭＷ
ＰＥＩ（１８μｇ）の場合に最高トランスフエクション
が得られた。ポリマー濃度のさらなる増加はルシフェラ
ーゼ発現の比較的僅かな減少が起きただけであった。
ｇ）／ＤＮＡ（１０μｇ）濃度が試験された。ＨＭＷ
ＰＥＩ（１８μｇ）の場合に最高トランスフエクション
が得られた。ポリマー濃度のさらなる増加はルシフェラ
ーゼ発現の比較的僅かな減少が起きただけであった。
【００６７】ＬＭＷ ＰＥＩ（２０−８０μｇ）／ＤＮ
Ａ（１０μｇ）濃度がＬＭＷ ＰＥＩの場合に試験され
た。ＨＭＷ ＰＥＩの状況とは対照的に，ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ濃度が増加するにつれてトランスフエクション効率の
安定した増加がＥＣＶ細胞中に検出された。ＬＭＷ Ｐ
ＥＩの８０μｇ／ＤＮＡの１０μｇでリポーター遺伝子
活性を測定したが，それは，最大活性を示したＨＭＷ
ＰＥＩ（１８μｇ）／ＤＮＡ（１０μｇ）の投与量を用
いて得られた活性よりも約１００倍も高かった。その
上，高分子量ＰＥＩを用いた際に生起するようなルシフ
エラーゼ発現の低減は，ＬＭＷ ＰＥＩ最高濃度でさえ
も観察されなかった。ＥＣＶ細胞および３Ｔ３細胞を用
いた実験は同一結果を与えた。
Ａ（１０μｇ）濃度がＬＭＷ ＰＥＩの場合に試験され
た。ＨＭＷ ＰＥＩの状況とは対照的に，ＬＭＷ ＰＥ
Ｉ濃度が増加するにつれてトランスフエクション効率の
安定した増加がＥＣＶ細胞中に検出された。ＬＭＷ Ｐ
ＥＩの８０μｇ／ＤＮＡの１０μｇでリポーター遺伝子
活性を測定したが，それは，最大活性を示したＨＭＷ
ＰＥＩ（１８μｇ）／ＤＮＡ（１０μｇ）の投与量を用
いて得られた活性よりも約１００倍も高かった。その
上，高分子量ＰＥＩを用いた際に生起するようなルシフ
エラーゼ発現の低減は，ＬＭＷ ＰＥＩ最高濃度でさえ
も観察されなかった。ＥＣＶ細胞および３Ｔ３細胞を用
いた実験は同一結果を与えた。
【００６８】比較のために，リポーター遺伝子としてβ
ガラクトシダーゼを用いたトランスフエクション研究
を，内皮一次細胞培養物について，かつＨＭＷ ＰＥＩ
およびＬＭＷ ＰＥＩ複合体の最高許容可能，非毒性投
与量（ＭＴＤ）を用いても実施した。この in-vitro Ｍ
ＴＤ値はＨＭＷ ＰＥＩ（１３．５μｇ）／ＤＮＡ（１
０μｇ）およびＬＭＷ ＰＥＩ（９０μｇ）／ＤＮＡ
（１０μｇ）であった。１０μｇのＤＮＡおび１３．５
μｇのＨＭＷ ＰＥＩからなる複合体と共に保温した培
養ブタ脳毛細内皮細胞をほんのわずかトランスフエクシ
ョンするのが可能なだけであった。細胞核の領域で特有
の青色を示したのは培養ウエル当たり２−３細胞だけで
あった。うまくトランスフエクションされた処理細胞は
１％未満であった。これとは対照的に，９０μｇのＬＭ
Ｗ ＰＥＩおよび１０μｇのＤＮＡからなる複合体と保
温すると，この内皮細胞中のマーカータンパクの有意の
発現に至った。全細胞数に関して，培養ウエル当たりの
青色染色細胞の％表示の割合，すなわちトランスフエク
ション成功率は５％から１０％であった。ポリマー／Ｄ
ＮＡ複合体が細胞に与える毒性の影響は，いずれの場合
も光顕微鏡では観察できなった。
ガラクトシダーゼを用いたトランスフエクション研究
を，内皮一次細胞培養物について，かつＨＭＷ ＰＥＩ
およびＬＭＷ ＰＥＩ複合体の最高許容可能，非毒性投
与量（ＭＴＤ）を用いても実施した。この in-vitro Ｍ
ＴＤ値はＨＭＷ ＰＥＩ（１３．５μｇ）／ＤＮＡ（１
０μｇ）およびＬＭＷ ＰＥＩ（９０μｇ）／ＤＮＡ
（１０μｇ）であった。１０μｇのＤＮＡおび１３．５
μｇのＨＭＷ ＰＥＩからなる複合体と共に保温した培
養ブタ脳毛細内皮細胞をほんのわずかトランスフエクシ
ョンするのが可能なだけであった。細胞核の領域で特有
の青色を示したのは培養ウエル当たり２−３細胞だけで
あった。うまくトランスフエクションされた処理細胞は
１％未満であった。これとは対照的に，９０μｇのＬＭ
Ｗ ＰＥＩおよび１０μｇのＤＮＡからなる複合体と保
温すると，この内皮細胞中のマーカータンパクの有意の
発現に至った。全細胞数に関して，培養ウエル当たりの
青色染色細胞の％表示の割合，すなわちトランスフエク
ション成功率は５％から１０％であった。ポリマー／Ｄ
ＮＡ複合体が細胞に与える毒性の影響は，いずれの場合
も光顕微鏡では観察できなった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/407 Ａ６１Ｋ 35/407 47/48 47/48 Ｚ 48/00 48/00 Ｃ０８Ｇ 73/04 Ｃ０８Ｇ 73/04 (72)発明者 ダクマー、フィッシャー ドイツ連邦共和国マールブルク、シューマ ルクト、２ (72)発明者 ハンス‐ペーター、エルゼッサー ドイツ連邦共和国マールブルク、ハーンベ ルクシュトラーセ、12 (72)発明者 トルステン、ビーバー ドイツ連邦共和国ニーデラウラ、リッテル シュトラーセ、32
Claims (33)
- 【請求項１】細胞へ核酸を挿入するためのベクターであ
って，分子量５０，０００Ｄａ未満の低分子量ポリエチ
レンイミン（ＬＭＷ ＰＥＩ）および核酸を含むベクタ
ー。 - 【請求項２】ＬＭＷ ＰＥＩが５００から３０，０００
Ｄａの分子量を有する，請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】ＬＭＷ ＰＥＩが１０００から５０００Ｄ
ａの分子量を有する，請求項１または２に記載のベクタ
ー。 - 【請求項４】ＬＭＷ ＰＥＩが約２０００Ｄａの分子量
を有する，請求項１から３のいずれか一項に記載のベク
ター。 - 【請求項５】核酸がウイルスまたは非ウイルス核酸構造
物である，請求項１から４のいずれか一項に記載のベク
ター。 - 【請求項６】核酸構造物が一つまたは二つ以上のエフエ
クター遺伝子を含む，請求項１から５のいずれか一項に
記載のベクター。 - 【請求項７】少なくとも一つのエフエクター遺伝子が薬
理学的に活性な化合物またはそのプロドラッグ形態をコ
ードする，請求項１から６のいずれか一項に記載のベク
ター。 - 【請求項８】少なくとも一つのエフエクター遺伝子が酵
素をコードする，請求項１から７のいずれか一項に記載
のベクター。 - 【請求項９】少なくとも一つのエフエクター遺伝子が融
合タンパク質として細胞特異的リガンドと共に発現され
る，請求項１から８のいずれか一項に記載のベクター。 - 【請求項１０】ＬＭＷ ＰＥＩが細胞特異的リガンドに
結合されている，請求項１から９のいずれか一項に記載
のベクター。 - 【請求項１１】細胞特異的リガンドが標的細胞の外膜に
結合している，請求項１から１０のいずれか一項に記載
のベクター。 - 【請求項１２】標的細胞が，内皮細胞，筋肉細胞，マク
ロフアージ，リンパ球，グリア細胞，造血細胞，腫瘍細
胞，ウイルス感染細胞，気管支上皮細胞または肝細胞で
ある，請求項１から１１のいずれか一項に記載のベクタ
ー。 - 【請求項１３】ＬＭＷ ＰＥＩ対核酸の重量比が３：１
またはそれを上回る，請求項１から１２のいずれか一項
に記載のベクター。 - 【請求項１４】ＬＭＷ ＰＥＩ対核酸の重量比が８：１
またはそれを上回る，請求項１から１３のいずれか一項
に記載のベクター。 - 【請求項１５】エチレンイミン単量体を水溶液中で塩酸
の添加により重合することを特徴とする、５０，０００
Ｄａ未満の分子量を有する低分子量ポリエチレンイミン
（ＬＭＷ ＰＥＩ）の調製方法。 - 【請求項１６】水溶液がエチレンイミン単量体０．１％
濃度から９０％濃度であり，濃塩酸０．１％濃度から１
０％濃度である，請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】反応温度３０℃から７０℃で重合を実施
する，請求項１５または１６に記載の方法。 - 【請求項１８】反応時間が１日から３０日である，請求
項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】請求項１５から１８のいずれか一項に記
載の方法により調製される，５０，０００Ｄａ未満の分
子量を有する低分子量ポリエチレンイミン。 - 【請求項２０】請求項１から１４のいずれか一項に記載
のベクターを調製するための，５０，０００Ｄａ未満の
分子量を有する低分子量ポリエチレンイミンの使用。 - 【請求項２１】適正量のＬＭＷ ＰＥＩを適正量の核酸
と水溶液中で混合することを特徴とする，請求項１から
１４のいずれか一項に記載のベクターの調製方法。 - 【請求項２２】細胞へ核酸を挿入するための請求項１か
ら１４のいずれか一項に記載のベクターの使用。 - 【請求項２３】細胞が内皮細胞，リンパ球，マクロフア
ージ，肝細胞，繊維芽細胞，筋細胞または上皮細胞であ
る，請求項２２に記載のベクターの使用。 - 【請求項２４】請求項１から１４のいずれか一項に記載
のベクターを in vitro でこの細胞と保温することを特
徴とする，トランスフエクションされた細胞の調製方
法。 - 【請求項２５】請求項１から１４のいずれか一項に記載
のベクターを含むトランスフエクションされた細胞。 - 【請求項２６】医薬調製のための，請求項２５に記載の
トランスフエクションされた細胞の使用。 - 【請求項２７】医薬調製のための，請求項１９に記載の
低分子量ポリエチレンインミンの使用。 - 【請求項２８】医薬調製のための，請求項１から１４の
いずれか一項に記載のベクターの使用。 - 【請求項２９】遺伝子治療用医薬の調製のための，請求
項１から１４のいずれか一項に記載のベクターの使用。 - 【請求項３０】核酸とＬＭＷ ＰＥＩとを混合すること
を特徴とする，医薬の調製方法。 - 【請求項３１】請求項１から１４のいずれか一項に記載
のベクターを含む医薬。 - 【請求項３２】請求項１９に記載のＬＭＷ ＰＥＩを含
む医薬。 - 【請求項３３】請求項２５に記載のトランスフエクショ
ンされた細胞を含む医薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19743135A DE19743135A1 (de) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine |
| DE19743135.6 | 1997-09-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11187874A true JPH11187874A (ja) | 1999-07-13 |
| JP4399042B2 JP4399042B2 (ja) | 2010-01-13 |
Family
ID=7844109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27863998A Expired - Fee Related JP4399042B2 (ja) | 1997-09-30 | 1998-09-30 | 生物学的に許容される低分子量ポリエチレンイミン |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8003734B2 (ja) |
| EP (1) | EP0905254B1 (ja) |
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| KR (1) | KR19990030290A (ja) |
| AR (1) | AR015726A1 (ja) |
| AT (1) | ATE324397T1 (ja) |
| AU (1) | AU758239B2 (ja) |
| BR (1) | BR9803982A (ja) |
| CA (1) | CA2249058A1 (ja) |
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| CZ (1) | CZ310598A3 (ja) |
| DE (2) | DE19743135A1 (ja) |
| DK (1) | DK0905254T3 (ja) |
| ES (1) | ES2264180T3 (ja) |
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| TR (1) | TR199801933A2 (ja) |
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| JP2007043972A (ja) * | 2005-08-10 | 2007-02-22 | Tokyo Institute Of Technology | アパタイト粒子及びその作製方法、遺伝子−アパタイト粒子複合体及びその作製方法、並びに遺伝子導入方法及び遺伝子導入用キット |
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| JP2018074984A (ja) * | 2016-11-11 | 2018-05-17 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 遺伝子導入された細胞の製造方法及びポリエチレンイミンの置換体ポリマー |
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| DE19960206A1 (de) * | 1999-12-14 | 2001-07-19 | Frank Czubayko | Komplexierung von RNS mit Polyethyleniminen zur deren Stabilisierung und zellulären Einschleusung |
| ATE326499T1 (de) * | 2000-02-18 | 2006-06-15 | Centelion | Verfahren zur herstellung von funktionalierten polyalkyleniminen, diese enthaltende zusammenstellungen und ihre verwendungen |
| DE10145134A1 (de) * | 2000-10-09 | 2002-05-16 | Bayer Ag | Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen |
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