JPH10204099A

JPH10204099A - 新規抗生物質フェグリマイシン、その製造方法およびその使用

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Publication number: JPH10204099A
Application number: JP9342631A
Authority: JP
Inventors: Laszlo Vertesy; ラースロウ・フエルテシ; Martin Knauf; マルテイン・クナウフ; Joachim Wink; ヨーアヒム・ヴインク; Dieter Isert; デイーター・イーゼルト; Wilhelm Stahl; ヴイルヘルム・シユタール; Gunther Riess; ギユンター・リース; Jozsef Aszodi; ヨージエフ・アソデイ; Dominique Le Beller; ドミニク・ルベレ
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 1998-08-04
Also published as: DK0848064T3; CA2224025A1; US5891851A; EP0848064B1; PT848064E; AU4835997A; AU738970B2; EP0848064A1; DE59705375D1; ATE208825T1; ES2165557T3; US5994307A

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な抗生物質の提供。【解決手段】ストレプトミセス種 DSM 11171 によっ
て産生されるフェグリマイシン：【化１】【効果】優れた抗細菌活性を有するのみでなく、ヒト
免疫不全ウイルスに対しても阻止作用を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規抗生物質フェグ
リマイシン（Feglymycin）、その製造方法および使用に
関する。

【０００２】

【従来の技術】細菌感染疾患の処置には多数の抗生物質
が治療的に使用されてきた。しかしながら、病原体は用
いられた医薬に対し次第に抵抗性を獲得し、個々のグル
ープの抗生物質たとえばラクタム抗生物質またはグリコ
ペプチドもしはマクロライド系のみならず、同時に数種
の抵抗性を有する、いわゆる多重抵抗性細菌による重大
な危険の前兆さえ考えられる。すべての市販抗生物質に
抵抗性を獲得した病原体さえ存在し、このような細菌に
よって起こる感染症にはもはや処置するすべがない。し
たがって、抵抗性の細菌に使用できる新たな薬物には大
きな要求がある。実際、文献には何千という抗生物質が
記載されきたが、大部分は毒性が高すぎて医薬としては
使用できない。

【０００３】抵抗性の発生は、新型のウイルス「ヒト免
疫不全ウイルス」（ＨＩＶ）によって生じる免疫不全、
いわゆるＡＩＤＳ症状の制御においても問題である。現
在もＡＩＤＳ症状を治癒させる医薬なない。これまで使
用されてきた薬物はＨＩＶ感染患者の寿命を明らかに延
長することはできるが、抵抗性ウイルスの発生により新
規な非毒性のウイルス静止剤が熱望されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、上述の問題を解決する新規な抗生物質およびウ
イルス静止剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、驚くべきこと
に、ストレプトミセス種の HAG 4675、DSM 11171が、抗
生物質として活性で高い耐容性を有するのみでなく、
「ヒト免疫不全」ウイルスを効果的に阻害する新規な抗
生物質、フェグリマイシン（feglymycin）を産生できる
ことの発見に基づくものである。

【０００６】したがって、本発明は化合物フェグリマイ
シンならびにその生理学的に耐容性のある塩およびその
自明の化学的均等物に関する。フェグリマイシンは分子
式：Ｃ₉₅Ｈ₉₇Ｎ₁₃Ｏ₃₀を有し、ＭＷは１９００.００で
ある。

【０００７】

【化２】

【０００８】上に示した構造式および分子式から、抗生
物質フェグリマイシンは、文献既知の物質とは異なる。
本発明の化合物は特徴的な紫外線スペクトルを有する。

【０００９】本発明の主題にはさらに上述の化合物の製
造方法が包含される。上述の化合物の製造方法の一つ
は、ストレプトミセス種の微生物 HAG 4674（DSM 1117
1）を水性栄養培地中にて培養し、ついで標的化合物を
単離精製することからなる。上記微生物は、ブタペスト
条約の条件に基づき、ドイツ微生物寄託機関（GermanCo
llection of Microorganisms & Cell Culture, Mascher
oder Weg 1b, D-38124Brunswick）に DSM 11171 として
１９９６年９月２４日に寄託された。

【００１０】ストレプトミセス種 DSM 11171 は白色の
気中菌糸体および黄色の胞子チェーンを有する。それは
らせん形状のストレプトミセテスに特徴的な胞子チェー
ンを形成する。細胞壁には特徴的なアミノ酸としてＬ,
Ｌ−ジアミノピメリン酸ならびに糖としてグルコースお
よびマンノースを含有し、これらはストレプトミセス属
の特徴的な性質である。炭素源および窒素源ならびに慣
用の無機塩を含有する栄養溶液中で、ストレプトミセス
の種 DSM 11171 は化合物フェグリマイシンを産生す
る。

【００１１】株 DSM 11171 に代えて、その突然変異体
および変異体も、それらが本発明の化合物を産生する限
り使用できる。このような突然変異体は既知の方法で、
物理的にはたとえば紫外線もしくはＸ線の照射により、
または、化学的な突然変異誘発物質たとえばメタンスル
ホン酸エチル（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキ
シベンゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−
ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）によって産
生させることができる。

【００１２】本発明の抗生物質を産生する突然変異体お
よび変異体のスクリーニングは培養培地中に蓄積した活
性化合物の生物活性の測定、たとえば抗生物質作用の試
験により実施することができる。

【００１３】好気的発酵に適当な好ましい炭素源は同化
可能な炭化水素および糖アルコールたとえばグルコー
ス、ラクトースまたはＤ−マンニトールならびに炭水化
物含有天然産物たとえば麦芽エキスである。適当な窒素
含有栄養素にはアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質な
らびにそれらの分解生成物、たとえばペプトンもしくは
トリプトン、さらには肉エキス、粉砕種子たとえばトー
モロコシ、小麦、豆類、オート麦、大豆または綿、アル
コール製造の蒸留残留物、肉ミールまたは酵母エキスの
みでなく、アンモニウム塩および硝酸塩も包含される。
栄養溶液に添加できる無機塩はたとえば、アルカリ金属
もしくはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよび
マンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩であ
る。

【００１４】フェグリマイシンの形成は、たとえば約
０.５〜５％のオートフレーク、好ましくは１〜２％な
らびに濃度０.１〜０.５％、好ましくは０.２〜０.３％
の微量元素溶液を含有する栄養溶液中でとくに良好に進
行する。微量元素溶液はＣａＣｌ₂、クエン酸鉄(III)、
ＭｎＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＣｕＳＯ₄、四ホウ酸ナトリウ
ム、ＣｏＣｌ₂およびモリブデン酸ナトリウムを含有す
る。

【００１５】培養は好気的にすなわち、たとえばシェー
カーフラスコまたはファーメンター中で振盪または攪拌
し、必要に応じて空気または酸素を導入しながら深部培
養で行う。発酵はたとえば、様々な容量の広口瓶もしく
は丸底フラスコまたはガラスファーメンターもしくはＶ
₂Ａスチールタンク内で実施することができる。温度範
囲は約２０〜３５℃好ましくは約２５〜３０℃おいて実
施できる。ｐＨは４〜１０、有利には５.５〜８.５でな
ければならない。微生物を一般的にこれらの条件下２０
〜３００時間、好ましくは２４〜１４０時間にわたって
培養する。培養は数段階に分けて行うのが有利である。
すなわち１または２回の前培養液を最初に栄養液体培地
中で準備し、これをついで実際の製造培地、主培養液に
たとえば容量比１：１０で接種する。前培養液はたとえ
ば栄養溶液に出芽菌糸体を接種し、それを約２０〜１２
０時間、好ましは２４〜７２時間増殖させる。出芽菌糸
体はたとえばその株をたとえば１〜４０日間、好ましく
は３〜１０日間、固体または液体栄養培地たとえば酵母
-麦芽アガールまたはポテト-デキストロースアガール上
で増殖させて得ることができる。

【００１６】発酵の経過および抗生物質フェグリマイシ
ンの形成は、本技術分野の熟練者には周知の方法によっ
て、たとえばバイオアッセイによる生物学的活性の試験
またはクロマトグラフィー法たとえば薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）もしくは高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）によってモニターすることができる。

【００１７】抗生物質フェグリマイシンは菌糸体中にも
培養液ろ液中にも存在できるが、通常主要部分は細胞実
質（菌糸体）内に局在する。したがって、これはろ過ま
たは遠心分離によってろ液から分離するのが便利であ
る。ろ液は固相として吸着樹脂を用いて抽出する。菌糸
体はメタノールまたはアセトンによって抽出するのが便
利であるが、他の溶媒も使用できる。

【００１８】抽出は広範囲のｐＨで実施できるが、中性
もしくはわずかに酸性のメジウム中好ましくはｐＨ３〜
７で操作するのが便利である。抽出液は、たとえば真空
中で濃縮し、乾燥できる。

【００１９】フェグリマイシンの単離方法の一つはそれ
自体既知の溶液分配である。

【００２０】精製の他の方法は、吸着樹脂たとえば Dia
ion（登録商標）HP−20（MitsubishiCasei Corp., Toky
o)、Amberlite（登録商標）XAD7（Rohm and Haas, US
A)、Amberchrom（登録商標）CG（Toso Haas, Philadelp
hia, USA）等でのクロマトグラフィーである。多くの逆
相支持体、たとえばＲＰ₁₈は、たとえば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）の関連で一般に知られている
ように、さらに適している。

【００２１】本発明の抗生物質の精製の更なる可能性に
はいわゆる順相クロマトグラフィー支持体、たとえばシ
リカゲルもしくはＡｌ₂Ｏ₃または他のそれ自体既知の方
法の使用がある。

【００２２】単離の別法としては、モルキュラーシー
ブ、たとえば Fractogel（登録商標）TSK HW-40，Sepha
dex（登録商標）G-25 等のそれ自体既知の方法の使用が
ある。さらにフェグリマイシンは濃縮材料から結晶化に
よって得ることも可能である。たとえば無水または水を
添加した有機溶媒またはそれらの混合物がこの目的に適
している。本発明の抗生物質の単離および精製の他の方
法には、陰イオン交換樹脂の好ましくはｐＨ範囲４〜１
０における使用および陽イオン交換樹脂の好ましくはｐ
Ｈ範囲２〜５における使用がある。有機溶媒部分を添加
した緩衝液の使用がこの目的にはとくに適している。

【００２３】抗生物質フェグリマイシンまたはそれに由
来する化学的誘導体は、本技術分野の熟練者には周知の
方法により、相当する医薬的に耐容性のある塩に変換す
ることができる。

【００２４】本発明による化合物の自明な化学的均等物
は、わずかな化学的相違を示す化合物、すなわち本発明
の化合物と同一の活性を有するか、または緩和な条件で
本発明の化合物に変換される化合物である。ここにいう
均等物にはたとえば、本発明の化合物のエステル、アミ
ノ誘導体、複合体または付加物が包含される。

【００２５】本発明の化合物の医薬的に耐容性のある塩
は無機塩および有機塩の両者、たとえば Remington's P
harmaceutical Sciences（17版, 1418頁, 1985）に記載
された塩を意味するものとして理解される。特に有効な
塩は、アルカリ金属、アンモニウムまたはアルカリ土類
金属塩、生理学的に耐容性のあるアミンの塩および無機
または有機酸たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、マレイ
ン酸またはフマール酸との塩である。

【００２６】本発明の抗生物質の物理化学的性質および
スペクトル特性を以下にまとめる。フェグリマイシン：外観：無色の物質、メタノール、アセトニトリルおよび
水に可溶。中性および中等度アルカリ性において安定で
あるが、強酸性および強アルカリ性溶液中では不安定で
ある。分子式：Ｃ₉₅Ｈ₉₇Ｎ₁₃Ｏ₃₀ 分子量：1900.90¹ Ｈ-ＮＭＲ：表１参照Ｅ_max (log)：280nm（4.16） [α]_D ²⁰＝−106°

【００２７】

【表１】

【００２８】

【表２】

【００２９】

【表３】

【００３０】

【発明の実施の形態】本発明の化合物は抗細菌活性を有
することが見出された。フェグリマイシンの最小阻止濃
度を表２に例示としてまとめる。

【００３１】

【表４】

【００３２】さらに、全く驚くべきことに、フェグリマ
イシンはヒト免疫不全ウイルスに対して阻止作用を示す
ことが見出された。多くの活性化合物はウイルスまたは
ウイルス酵素をそれらが単離型で存在する場合にのみ阻
止する。この型の薬物は細胞培養液中、またはたとえば
ヒトおよび動物のような生存生物体中でも、不活性であ
ることが多い。それらは、ウイルスが見出され複製が行
われている細胞の細胞壁を透過することができないから
である。しかしながら、フェグリマイシンは細胞培養ア
ッセイで高い活性を示す。ＩＣ₅₀は７μg／ml未満であ
る。阻止作用はＨＩＶの典型的シンシチウムの光学顕微
鏡による観察によっても測定することができる。この関
連で、フェグリマイシンの場合、シンシチウム形成の低
下が薬物の活性の指標となる。しかしながら、フェグリ
マイシンの活性は、細胞培養上清におけるＨＩＶ粒子の
量を、たとえば市販のｐ２４抗原テストにより測定する
ことによって決定することも可能である。

【００３３】フェグリマイシンの活性濃度およびそれ以
上における耐容性は良好である。細胞傷害作用は認めら
れなかった。

【００３４】したがって、本発明は、本発明の化合物の
医薬としての使用、ならびに細菌およびＨＩＶ感染の処
置および／または予防用医薬の製造のための関連化合物
の使用に関する。

【００３５】さらに、本発明は、本発明の化合物を含有
する医薬に関する。

【００３６】本発明の医薬は、経腸的（経口的）に、非
経口的（筋肉内または静脈内）に、経直腸的または局所
（局所的）に使用することができる。それらは、溶液、
粉末（錠剤、マイクロカプセルを含むカプセル剤）、軟
膏（クリームまたはゲル）または坐剤の形態で投与する
ことができる。このタイプの製剤に適当な補助剤は、医
薬的に慣用される液体もしくは固体充填剤および希釈
剤、溶媒、乳化剤、滑沢剤、フレーバー矯味剤、着色剤
および／または緩衝物質である。有効用量０.１〜１０
００、好ましくは０.２〜１００mg／kg体重が投与され
る。それらは、本発明の化合物の少なくとも有効１日用
量たとえば３０〜３０００、好ましくは５０〜１０００
mgを含有する用量単位として投与するのが便利である。

【００３７】

【実施例】以下の実施例および請求の範囲の内容は本発
明を詳細に説明する意図である。実施例１：産生株の胞子懸濁液の調製１００mlの栄養溶液（水道水１Ｌ中20ｇの麦芽エキス、
２ｇの酵母エキス、10ｇのグルコース、0.5ｇの(NH₄)₂H
PO₄、滅菌前のpH 6.0）を５００mlのエルレンマイヤー
フラスコに取り、産生株を接種し、回転式振盪器上、２
５℃、１４０rpmにおいて７２時間インキュベートす
る。１２０mlの培養液をついで固化させるため予めさら
に寒天１５ｇ／Ｌを加えた栄養培地オートミール浸出液
２.０ｇ／Ｌを含有する５００mlの滅菌エルレンマイヤ
ーフラスコに均一に分布させ、傾瀉する。培養液を２５
℃で１０〜１４日間インキュベートする。この時点で生
じたフラスコ中胞子を１滴の市販非イオン界面活性剤
〔たとえば Triton（登録商標)X-100, Serva)〕を含む
脱イオン水５００mlで洗浄し、直ちに使用するかまたは
５０％グリセロール中−２２℃もしくは１０％ジメチル
スルフォキシド中−１４０℃で保存する。

【００３８】実施例２：エルレンマイヤーフラスコ中産
生株の培養液または前培養液の調製実施例１に記載した栄養溶液１００mlを含有する５００
mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに斜面培養チューブ
での培養液または０.２mlの胞子懸濁液を接種し、振盪
器上１４０rpm、２５℃でインキュベートする。上記式
の化合物の最大産生は約７２時間後に達成される。１０
および１００Ｌのファーメンターの接種では７２時間の
同一栄養溶液での深部培養（接種量約５％）で十分であ
る。

【００３９】実施例３：フェグリマイシンの調製１０Ｌのファーメンターを以下の条件で操作する。栄養培地：２％オートフレーク０.２５％微量元素微量元素： CaCl₂ 2H₂O ０.３％クエン酸鉄(III) ０.１％ MnSO₄ ０.０２％ ZnCl₂ ０.０１％ CuSO₄ 5H₂O ０.００２％四ホウ酸ナトリウム０.０２％ CoCl₂ 6H₂O ０.００１％モリブデン酸ナトリウム０.００１％インキュベーション時間：２４または４８時間インキュベーション温度：２８℃ 攪拌速度：２００rpm 通気：５Ｌ空気／分泡の形成は数滴のエタノール性ポリオール溶液を繰り返
し添加することによって抑制できる。最大産生は約48時
間後に達成される。

【００４０】実施例４：抗生物質フェグリマイシンの単
離実施例３に従って得られた２７Ｌの培養液を遠心分離し
細胞実質（約1.1Ｌ）を各回２.２Ｌのメタノールで２回
攪拌しながら抽出する。抽出液を合わせて真空中で濃縮
し、乾燥し、乾燥物質をジエチルエーテルで浸出する。
この方法で洗浄した脱脂残留物（40ｇ）を水に溶解し、
吸着樹脂 MCl Gel（登録商標）CHP20Pを充填した容量３
Ｌのカラムに適用する。カラムサイズ：幅×高さ：１
１.３cm×30cm。溶出は水中５％イソプロパノールから
５０％イソプロパノールまでの溶媒勾配で行い、カラム
流出液を各２Ｌの分画で収集する。ＨＰＬＣ分析でチェ
ックしたフェグリマイシン含有分画を集め、真空中で濃
縮し、凍結乾燥する。

【００４１】実施例５：フェグリマイシンの高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム：Nucleosil（登録商標）100−5C₁₈AB，250／4 移動相：0.05％トリフルオロ酢酸中25％アセトニトリル流速：１ml／分 210nmにおけるＵＶ吸収で検出フェグリマイシンの保持時間は１２分５０秒であった。

【００４２】実施例６：フェグリマイシンの濃縮実施例４で得られた生成物３ｇを Fractogel（登録商
標）TSK HW-40 s を充填した容量３Ｌのカラム（幅×高
さ：10cm×50cm）に適用する。溶出液：５０％アセトニ
トリル／１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７.０は流速
５０ml／分でポンプによりカラムに送り、カラム流出液
を分画（65ml）して収集する。抗生物質フェグリマイシ
ン２７０mgは主として分画２３〜２７に見出される。

【００４３】実施例７：フェグリマイシンの最終精製実施例６により得られた濃縮されたフェグリマイシン
（270mg）を Nucleosil(登録商標）12Ｃ₁₈ＡＢＨＰＬ
Ｃカラム（幅×高さ：3.2cm×25cm）上０.０５％トリフ
ルオロ酢酸中５〜３０％アセトニトリルを用いる勾配法
で分離する。分析用ＨＰＬＣ（実施例５参照）で検討し
た分画を同様に収集し、真空中で濃縮し凍結乾燥する。
純度９７％のフェグリマイシンの収量２１mg。ＦＡＢ質
量分析で測定したフェグリマイシンの分子量：Ｍ＋Ｍ⁺
＝１９００.５８（モノイソトピックピーク)、１９０
１.５７（ベースピーク)。

【００４４】実施例８：リン酸緩衝液／イソプロパノー
ル系中における製造用ＨＰＬＣによる最終精製実施例７と同様に操作するが、溶出液には、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム，ｐＨ７およびイソプロパノールを使用
する。分離された成分の脱塩は実施例７と同様に行う。
純度９９％のフェグリマイシンの収量１８mg。

【図面の簡単な説明】

【図１】メタノール中で記録したフェグリマイシン紫外
線吸収スペクトル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＸ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者ヨーアヒム・ヴインクドイツ連邦共和国63322レーダーマルク. マクデブルガーシユトラーセ14 (72)発明者デイーター・イーゼルトドイツ連邦共和国65760エシユボルン．インデンヴアインゲルテン１ (72)発明者ヴイルヘルム・シユタールドイツ連邦共和国65510イートシユタイン. ラナエルシユトラーセ84 (72)発明者ギユンター・リースドイツ連邦共和国65795ハテルスハイム. イム・ヘールヒエン44 (72)発明者ヨージエフ・アソデイフランス国77340ポントールコンボール. リユロベスピエール90 (72)発明者ドミニク・ルベレフランス国60880ジヨ．リユデマリヴオ190

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式：【化１】の化合物のフェグリマイシン、その生理学的に耐容性の
ある塩およびその自明の化学的均等物。
【請求項２】微生物 DSM 11171 またはその変異体も
しくは突然変異体の１つを適当な条件下に発酵させ、フ
ェグリマイシンを単離し、ついでそれを所望によりその
塩または化学的均等物に変換することにより製造される
請求項１記載の化合物。
【請求項３】微生物 DSM 11171 またはその変異体も
しくは突然変異体の１つを適当な条件下に発酵させ、フ
ェグリマイシンを単離し、ついでそれを所望によりその
塩または化学的均等物に変換することからなる請求項１
記載の化合物の製造方法。
【請求項４】発酵は好気的条件下、温度２０〜３５
℃、ｐＨ４〜１０において行う請求項３記載の方法。
【請求項５】医薬として使用するための請求項１また
は２記載の化合物。
【請求項６】細菌性疾患またはＨＩＶによる疾患の処
置用医薬の製造のための請求項１または２記載の化合物
の使用。
【請求項７】請求項１または２記載の化合物少なくと
も１種を含有する医薬。
【請求項８】請求項１または２記載の化合物の少なく
とも１種を適当な補助剤および／または賦形剤を用いて
適当な投与形態に調製することからなる請求項７記載の
医薬の製造方法。
【請求項９】ストレプトミセス種 DSM 11171。