JPH0399268A - 一体化された分画工程を用いる高速診断器具によるｈｄｌコレステロールの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的液体中のＨＤＬ［高比重りボタンバ
ク（旦ｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌ　１ｐｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）コの定量測定方法に関する。

（従来の技術） 血液、血漿および血清中の全コレステロールは、冠状動
脈性心疾患の程度に関する危険性を評価するために最も
良く知られているパラメーターの１つである。しかし、
全コレステロールの濃度は、個々の危険性の評価のため
の唯一の限定された値である。一方では低比重のりボタ
ンバク［低比重りボタンバク（Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ
　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）　＝ＬＤＬ］中の、他方で
は高比重のりボタンバク［高比重りボタンバク（Ｈｉｇ
ｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）＝ＨＤ
Ｌ］中のコレステロールの測定は、より有意である。疫
学的および臨床学的研究によって、ＬＤＬコレステロー
ルと冠状動脈性心疾患の間に陽性の相互関係があり、Ｈ
ＤＬコレステロールと冠状動脈性心疾患の間には陰性の
相互関係があることが分かった。

密に類似しているので、ＨＤＬおよび全コレステロール
の測定は危険性の評価に充分である。この方法は、現在
、診断において好ましく行われている。

ＨＤＬコレステロールを独立して測定するめだに、存在
する他のりボタンバク類（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミ
クロン）を分離しなければならない。可能な分離方法は
、浮揚比重の差（逐次的な浮揚または平衡沈澱、両方と
も超遠心分離における）、異なる表面電荷（担体として
紙またはアガロースによる電気泳動）、またはアポリポ
タンパクの違い（特異性抗体を用いる免疫化学的方法）
に基づいている。これら分離方法の全ては、高価であり
、時間を要し、日常研究においては確立されていない。

特性が粒径および表面電荷による沈澱反応［モノグラフ
ス・オンやアテロスフレオシス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ
　ｏｎ　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、Ｖｏｌ、
　１１　（１９８２）、クラノクソン（Ｃ１ａｃｋｓｏ
ｎ、　Ｔ、　Ｂ、　）、フリッチニブスキー（Ｋｒｉｔ
ｃｈｅｖｓｋｙ、　Ｄ、　）、ボタン（Ｐｏｌ　ｌａｋ
、　Ｏ，Ｊ、　）編；リポプロティン・プレシピテーシ
ョン（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ
ｉｏｎ）、バースタイン（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　
）、レグマン（Ｌｅｇｍａｎｎ、　Ｐ、　）およびＭｅ
ｔｈ、　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　
１２９　（１９８６）コは、安価で、比較的取り扱い易
（、従って普及している。

重合物質は、沈澱試薬として役に立ち、これらは、通常
、ポリアニオン的性質のものであるが、荷電されていな
いポリマーも好適である。−船釣に、ポリアニオンは、
それらの沈澱効果を促進するために、二価のカチオンを
必要とし、非荷電ポリマーは、それらを必要としない。

組み合わせた沈澱薬に関して使用される試験方法および
濃度は、ＨＤＬ以外の全てのりボタンバクを定量的に沈
澱させ、適切な方法で試料の液状画分とこれらの沈澱物
とを分離し、次いで、コレステロール測定によって試料
の液状画分中のＨＤＬを定量化するように設計される。

このために、試験を行う方法に依存して、定義された量
の沈澱剤（適切な濃度）を定義された量の被測定試料と
強く混合する。従来技術は、沈澱に関して少なくとも１
０分間の反応時間が必要であり、この時間が経過した後
、遠心分離によって、沈澱した非−ＨＤＬリポタンパク
沈澱物と液状画分に残存しているＨＤＬを分離すること
ができる。遠心分離工程も若干の時間を必要とする。

この方法は、日常試験としては多くの時間を要し過ぎる
。また、上澄み液の分離による遠心分離工程は、複雑化
された付加的装置および移動工程を必要とする。さらに
、定義された量の上澄み液を取り出すのに必要なピペッ
ト工程は、測定があまり正確なものでなくなる誤差の原
因である。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、従来技術の欠点を回避し、より迅速に、かつ
複雑化された付加的装置を有さずに行うことができ、よ
り迅速でより簡単なＨＤＬコレステロール測定を行うこ
とができる生物学的液体から非−ＨＤＬリポタンパクを
分離する方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、液体を流通させることができかつ非−ＨＤＬ
デポタンパクに対する沈澱剤を含有する担体に、非−Ｈ
ＤＬリポタンパクを含有している生物学的液体を適用す
ることを特徴とする生物学的液体から非−ＨＤＬリポタ
ンパクを分離する方法を提供するものである。

また、本発明は、非−ＨＤＬリポタンパク分離用試薬お
よびこの試薬を含有する高速診断器具を提供するもので
ある。

液体を流通させることができる担体に慣用で周知の沈澱
剤を微細に分散した形態で適用し、この担体に試料を流
通させさえすれば、これら沈澱剤を用いて非−ＨＤＬリ
ポタンパクの沈澱が特に迅速かつ特異的に進むことが分
かった。−船釣には、該沈澱時間は１分以下である。液
体を流通させることができる担体としては、以下のもの
が挙げられる：紙、例えばポリエステルもしくはポリア
ミドなどのような合成繊維から作られた織物、例えば綿
もしくはシルクなどのような天然繊維から作られた織物
またはこれらの物質の混合物。これに関連して、該織物
の構造は、モノフィラメントまたはマルチフィラメント
であってよく、マルチフィラメント型が好ましい。

液体を流通させることができる担体を構成する繊維は、
好ましくは、繊維の直径が３〜１００μｌ、より好まし
くは５〜５０μ友である。該担体は、特に、厚さ０．０
３０〜０．１５０３１１１で、単位面積当たりの重量が
１０〜１００ｇ／ｘ”、好ましくは１０〜５０９／ｘ”
であり、吸水能力は、上記の厚さで２５〜１００９／買
２、好ましくは４０〜７０９／ｊ！！である。

他の好適な担体は、ガラス繊維およびガラス繊維と液体
を流通させることができる上記繊維類−好ましくはフリ
ース（ｆｌｅｅｃｅ）の形態−との混合物の配列物なら
びに種々の形態の膜である。

該膜は、親水特性を有しており、厚さが２０〜２５０μ
ｌ、好ましくは７０〜１５０μｌであり、孔径が０．２
〜２０μ１１好ましくは５〜１５μｍである。

これらの担体における液体の移動は、毛管力に基づいて
いる。

沈澱剤は、好ましくは、沈澱剤の溶液、エマルジョンま
たは懸濁液を担体に染み込ませ、次いで、乾燥すること
によって担体に適用する。この方法において、ｐＨ緩衝
剤または洗剤などのような他の有用な添加剤を適用する
こともできる。

この構造において、全ての化学物質が沈澱剤として適し
ており、それらが試料溶液中に充分に迅速に溶解する限
り、リポタンパクの沈澱に関する「湿潤化学的」方法に
おいて用いることもできる。

特定のポリアニオンと二価のカチオンとの組み合わせは
、特に知られている。これらの例としては、リンタング
ステン酸と塩化マグネシウム、ヘパリンと塩化マグネシ
ウム（Ｉｔ）または硫酸デキストランと塩化マグネシウ
ムの組み合わせが挙げられる。

原則的には、各ポリアニオンは、３つのカチオン（Ｍｇ
”、Ｍｎ’°またはＣａ２つのそれぞれと組み合わせる
ことができるが、これらのりボタンバクを沈澱させる能
力に僅かな差が生じることに注意すべきである［バース
タイン（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ）、１９８６］。したがって
、選択されたカチオンの濃度は、非−ＨＤＬリポタンパ
クを特異的に沈澱させるように適応させることができる
。使用するポリアニオンの分子サイズもリポタンパクを
沈澱させる能力に影響を与え、濃度を選択する際に考慮
すべきである。

例えば、分子量が５０００００および５００００の硫酸
デキストランの使用が知られている。両者とも、液体を
流通させることができる担体への適用に適しているが、
５００００の分子量を有する硫酸デキストランとＭ　ｇ
　＊　”との組み合わせが好ましく、この場合、Ｍ　ｇ
　ｔ　”は、好ましくは、酢酸マグネシウムの形態で使
用される。しかしながら、大体においては、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウムおよびアスパラギン酸マグネ
シウムを用いることもできる。

沈澱剤の濃度は、被験試料の量に正確に適応させること
ができる。

液体を流通させることができ、かつ沈澱剤を含有してい
る担体に、試料を接触させることによって非−ＨＤＬリ
ポタンパクを沈澱させる。該沈澱反応は、この方法によ
って開始される。試料を沈澱側担体において沈澱剤と接
触させる時間は、担体の隙間量または親水性によって吸
引圧を変化させることによる簡単な手段で調節すること
ができる。担体を通る試料の流速は、試験の実施に非常
に重要である。沈澱物形成は、１分も経たない後に、最
も好ましくは約１０秒の後に完了し、該液体を担体物質
から取り出すことができる。これは、例えばデカントす
ることによって、重力を用いることによって、または吸
引することによって、連続的にまたは断続的に行うこと
ができる。該液体は、好ましくは、毛管力によって別の
担体中に吸い込み、その中で、沈澱した非−〇　Ｄ　Ｌ
リポタンパクを分離する。この方法は、担体をお互いに
接触させることが必要である。遠心分離のような他の方
法による沈澱物の分離は、速い沈澱という利点を失わず
に可能であるとしてもあまり好ましくない。

生物学的試料において上記ポリアニオンと二価のカチオ
ンとの組み合わせの作用によって形成されるリポタンパ
ク沈澱物を繊維のメ・クシ二に維持することができるこ
とが分かった。

該メツシュにおける繊維の配列は、好ましくは、無秩序
である。該繊維として、好ましくは、ガラス繊維、セル
ロース繊維、ポリアミド繊維およびポリエステル繊維ま
たはそれらの混合物が用いられる。ガラス繊維および上
記繊維の混合物が特に好ましい。メツシュを作る繊維は
、好ましくは、直径が０．２〜１０、Ｏμ１１特に好ま
しくは、直径が０．５〜５．０μｌである。該メツシュ
は、単位面積当たりの重量が２０〜５０９／ｉ’、好ま
しくは、２３〜３０９／ｘ２であり、厚さ０．１９〜０
゜２３ＲＩＩで吸水容量が２５０〜５００ｇ／ｚ″、特
に好ましくは３２０〜４２０９／ｍ”である。

ガラス繊維、それらの可能な空間配列および該繊維の大
きさを含む系は、西ドイツ特許ＤＥ３Ｑ２９５７９号に
詳述されている。さらに、繊維のメツシュは、無機性（
例えば、水ガラス）または有機性（例えば、ポリ酢酸ビ
ニル、ポリアクリル酸エステルのようなポリマーまたは
類似のポリマー）のいずれかの好適な結合剤の添加によ
って硬化することができる。これらの添加剤は、とりわ
け、繊維がお互いに接触する位置で該繊維を膠着し、こ
の方法で、それらは繊維メツシュの構造安定性を改善す
る。

適用した試料の液体画分は、メ、ノシ二全体を介して妨
げられずに拡散し、幾何学的配列が好適である場合また
は該メツシュの内部毛管力に打ち勝つことによってそれ
を残すこともできる。この方法では、沈澱した非−ＨＤ
Ｌリポタン／＜りと沈澱していないＨＤＬとの分離は、
簡単な器具を用いて達成することができる。本発明によ
って非−ＨＤＬＩＪボタンバクを分離することができる
生物学的液体は、特に、全血、血清および血漿である。

非−〇ＤＬリポタンパクの分離に関する本発明の方法は
、特に好都合には、試験スト１ル／プ上でのＨＤＬコレ
ステロールの定量測定に関する方法において用いること
ができる。このため、非−ＨＤＬリポタンパクを上記方
法に従って分離した液体を、試験反応、例えばコレステ
ロールに関する試験反応を行うために必要なまたは／お
よび有用な試薬と接触させる。このような試薬は、例え
ば、欧州特許ＥＰ−Ｂ−００１６３８７号から当業者に
公知であり、予測されるコレステロール濃度（０〜１０
０ｉｙ／ｄのに適応させることができる。それらは、例
えば、多孔性担体上にフィルムまたはコーティングの形
態で存在することもできる。このような試薬形態の具体
例は、当技術分野の当業者には公知である。

非−〇　Ｄ　Ｌリポタンパクを分離するための好ましい
具体例を含むＨＤＬコレステロールの測定方法の具体例
を第１図に示す。高速診断器具（１）は、容器（２）中
に幾つかの担体の層を含有している。

液体を流通させることができ、かつ沈澱剤を染み込ませ
た担体（４）の下に、選択された試料の量に合わせるこ
とができるリポタンパク沈澱物に関する分離容量を有す
る繊維メツシュ（５）が配置されている。これと隣接し
て、該繊維メツシュによって沈澱物を取り除いた液体を
吸収することかできる適切な吸収性コレステロール試験
フィルム（６）が配置されている。該試験フィルムは、
透明ホイル（７）上に塗布されている。沈澱剤に関する
担体上に試料液体を適用することによって測定が開始さ
れる。展開する測定信号を該構造のホイル側から肉眼で
または光度測定的に評価することができこの簡単な形態
は、全血の研究に関しては適切ではない。全血を使用す
べき場合は、例えば西ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３０２
９５７９号に詳述されている試薬によって、沈澱剤に関
する担体の前の層（３）において血球（ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ　ｂｌｏｏｄ）成分を分離するのが好ましい。

周知の酵素反応の温度依存性に関して、該試験形態の幾
何学的配列は、コレステロール試験が先の反応工程から
時間によって分離されるように選択してもよい。これは
、該試験工程の温度を制御・調整してもよい。相当する
試験構造は、西ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３１３０７４
９号に概要が記載されている。試験ストリップ型のＨＤ
Ｌに関する高速診断器具（１１）の好ましい構造を第２
図に示す。支持ホイル（１２）の上に、繊維メツシュ（
１５）、液体を流通させることができ、かつ沈澱剤を含
有している担体（１４）ならびに細胞成分に関する分離
層（１３）がお互いの上部に配置されている。該繊維メ
ツシュ（１５）は、フラップに向かって担体（１３）お
よび（１４）の下から突き出している。該フラップは、
透明ホイル（１７）とコレステロールに関する試験フィ
ルム（１６）から構成されており、接合部（１８）を介
して支持ホイル（１２）に取り付けられている。

被験試料は、層（１３）に適用され、層（１４）および
（１５）を通って（その間に非−ＨＤＬリポタンパクが
分離される）、フラップの下方のメツシュ（１５）中に
流れる。層（１５）の上に、試験層（１６）を用いてフ
ラップを押圧することによって試験反応が開始される。

光度計または反射光度計によって色の変化を追跡するこ
とができる。

第１図に概要を示した具体例と比較して、この方法では
繊維メツシュの横方向の分離能も効果的である。

本発明の方法は、他に、公知の方法よりも非常に優れて
いる点を有している。非常に少量の液体試料を用いるこ
とも可能である。本発明の器具の取り扱いは、非常に簡
単である。２つの基本的な取り扱い工程、すなわち、液
体試料の適用および特定時間の後に測定値を読むことだ
けが必要である。定量測定の場合の適切な光度計は別に
して、他の装置は必要ではない。移動工程は必要ではな
い。血液の全てのタイプ、全血でさえ、最初に細胞に関
する分離パッドを使用すると、容易に使用することがで
きる。被験試料に抗凝集剤を添加する場合は、該抗凝集
剤の測定に与える影響を補整することを推奨する。非−
ＨＤＬリポタンパクの分離は、６０秒以下で行うことが
できる。試料のの計量は非常に簡単である。

以下に、本発明の実施例を挙げる。

実施例１： ＥＤＴＡ血漿用の沈殿剤担体（１４または４）マルチフ
ィラメントポリエステル織物（メツシュサイズ１００μ
肩、織物の厚さ１０５μＲ，Ｃ１１当たり５５糸、Ｃお
よび秒当たりの水通過量８１５１２）を下記組成の溶液
に浸漬した。

ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液、５０ｘＭ；ｐＨ７，０７
８，ＯＯｙ酢酸マグネシウム　ｘ　　４Ｈ，Ｏ１５，６
８ｇ硫酸デキストラン（ＭＷ　５００００）　　　２．
５７９ウシ皿清アルブミン　　　　　　　　　　１．７
８１？約５７ｘＬ／ｚ”のコーティングが得られた。

温かい空気流下で乾燥した後、浸漬した繊維を、対応す
る試験方法に適合する適当な単位面積に切断し、これら
を試験構造に一体化させた。

実施例２： 血清用の沈殿剤担体（１４または４） 下記浸漬液を実施例１と同様の方法に用いた。

ヘペス緩衝液、５０１Ｍ；ｐＨ７，０７８，００ｇ酢酸
マ’）”＊　’／　’７　ムＸ　　４　ＨｔＯ１０，ｌ
　０９硫酸デキストラン（ＭＷ５０００ｏ）　２．５７
ｇウシ血清アルブミン　　　　　　　　　１．７８９Ｈ
，０５，５８９ 実施例３： 血液用の沈殿剤担体（１４または４） 適切な厚さおよび吸収性を有する紙、例えば単位面積当
たりの重量が１２９／ｃｆｆ”であり、厚さが５０μ肩
であるティーバッグペーパーを下記浸漬溶液に浸漬した
。

ヘペス緩衝液、５０ｇＭ；ｐＨ７，０７０，２０？酢酸
マグネシウムＸ　　４Ｈ，０４，７８ｇ硫酸デキストラ
ン（ＭＷ　５００００）　　　２．５４ｇウシ血清アル
ブミン　　　　　　　　　１．６０９Ｈ，０７，８０ｇ この担体について約６３　ＲＱ／Ｍ”のコーティングが
得られた。

実施例４ 試験フィルム ＨＤＬコレステロールを定量するための試薬フィルムの
製造のために、下記組成の分散液を調製した。

リン酸に／ＮａＮ級塩液、０．５Ｍ；ｐＨ７，０１７，
１４９ケルトロール（ＫｅｌＬｒｏｌ）　Ｆ　　　　　
　　　Ｏ，ｌ　９ｇＴｒｏｔ（粉末）　　　　　　　　
　　　　　　１．３１９スルホコハク酸ジオクチルナト
リウム　　０．４０９ポリプロピオン酸ビニル分散液 （Ｈ，Ｏ中、５０％）　　　　　　　　　　１１．７０
９ケイソウ土 ［セラトム（Ｃｅｌａｔｏｍ）　ＭＷ　２５］　　　　
１７．６５９フエニルセミカルバジド ０、０２５９ ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ二塩酸塩　
　　　　　　　　　　　　　　０．０６１ｇメタノール
　　　　　　　　　　　　　　１．７４９Ｈ，０４６，
２８９ コレステロールエステラーゼ　　　　　　２３７００Ｕ
コレステロールオキシラーゼ　　　　　　　６５００Ｕ
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　２３００００Ｕ
ヘキサノール　　　　　　　　　　　　　２．０７ｇこ
の分散液をポリカーボネートホイル上に厚さ３００μ肩
の層として塗布し、温風で乾燥させた。

得られた試薬コーティングは、コレステロール含有量に
よって、コレステロールを含有している液体によって階
調の青い着色を形成した。

実施例５ 繊維メツシュ 繊維径が約０．６μ肩のホウケイ酸塩ガラス繊維と繊維
径が約４μ肩のセルロース繊維との、好ましくは９：１
の割合の混合物。メツシュの厚さ約０．２１ｘｚで単位
面積当たりの重量約２５９／ｘ”；水を吸収する能力約
３７０９／’ＩＩ’。

実施例６ ＨＤＬ測定用の高速診断器具（１１）の製造第２図の試
験構造を選択し、種々の層について以下の大きさのもの
を用いた。

１２：１００Ｘ６ｚｘ １３：５Ｘ６１ｆｆ（西ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３０
２９５７９号によるホウケイ酸塩、 フリース、単位面積当たりの重量 約６０９／肩２） １４：６Ｘ６１１ １５：１６Ｘ６＋ｕ １６／１７　：　１５Ｘ６ｘｍ この具体例は、試料の量が２８〜３２μｇである場合に
適しており、特に有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＨＤＬコレステロールに関する高速
診断器具の断面図である。 第２図は、本発明のＨＤＬコレステロールに関する試験
ストリップ型高速診断器具の断面図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体を流通させることができ、かつ非−ＨＤＬリ
   ポタンパクに対する沈澱剤を含有する担体に、非−ＨＤ
   Ｌリポタンパクを含有している生物学的液体を適用する
   ことを特徴とする生物学的液体から非−ＨＤＬリポタン
   パクを分離する方法。
2. （２）生物学的液体を、沈澱工程を行った後に、液体を
   流通させることができる別の担体と接触させる請求項（
   １）記載の方法。
3. （３）非−ＨＤＬリポタンパクを含有している試料中の
   ＨＤＬコレステロールの測定方法であって、液体を流通
   させることができ、かつ非−ＨＤＬリポタンパクに対す
   る沈澱剤を含有する担体に、該試料を適用し、次いで、
   流出した液体を、液体を流通させることができ、かつ沈
   澱した成分を保持することができる別の担体と接触させ
   、そこから流出した液体のＨＤＬコレステロール含有量
   を試験することを特徴とする測定方法。
4. （４）液体を流通させることができる担体および非−Ｈ
   ＤＬリポタンパクに対する沈澱剤を含有することを特徴
   とする生物学的液体から非−ＨＤＬリポタンパクを分離
   する器具。
5. （５）液体を流通させることができ、かつ沈澱した成分
   を保持することができる担体を含有する請求項（４）記
   載の器具。
6. （６）液体を流通させることができ、かつ非−ＨＤＬリ
   ポタンパクに対する沈澱剤を含有している担体、液体を
   流通させることができ、かつ沈澱した成分を保持するこ
   とができる担体、および測定反応を行うのに必要な試薬
   を含有することを特徴とする生物学的液体中のＨＤＬコ
   レステロール測定用高速診断器具。