JPH0391495A - クレアチニン分析用一体型多層分析要素 - Google Patents
クレアチニン分析用一体型多層分析要素Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はクレアチニンを測定する分析要素に関し、特に
血液、尿等の体液中のクレアチニンの含有量の測定に適
した一体型多層分析要素に関するものである。
血液、尿等の体液中のクレアチニンの含有量の測定に適
した一体型多層分析要素に関するものである。
クレアチニンは血液や尿中に含まれており、例えば腎機
能に異常があるとその濃度が変化するので、これらの体
液中のクレアチニンの濃度を測定することは腎臓疾患を
検査するうえで重要である。
能に異常があるとその濃度が変化するので、これらの体
液中のクレアチニンの濃度を測定することは腎臓疾患を
検査するうえで重要である。
クレアチニンの測定法はアルカリピクレートを用いて橙
赤色に発色させるＪａｆｆ≦法があるが、この方法はク
レアチニン等のクレアチニン類似物質も反応するので正
確な方法ではなく、操作も煩瑣であった。一方、クレア
チニンを酵素反応を利用して測定する方法も知られてお
り、酵素にはクレアチニンアミドヒドロラーゼ等が利用
されているところで、最近操作が簡便で比較的分析精度
が高い方法として多層分析要素が開発されている。
赤色に発色させるＪａｆｆ≦法があるが、この方法はク
レアチニン等のクレアチニン類似物質も反応するので正
確な方法ではなく、操作も煩瑣であった。一方、クレア
チニンを酵素反応を利用して測定する方法も知られてお
り、酵素にはクレアチニンアミドヒドロラーゼ等が利用
されているところで、最近操作が簡便で比較的分析精度
が高い方法として多層分析要素が開発されている。
例えば特開昭６２−２５７４００号公報に開示されてい
る分析要素は、ザルコシンオキシダーゼ、過酸化水素及
び過酸化性物質の存在下に検出可能な色素を生成しうる
イミダゾールロイコ色素、前記口イコ色素に対して実質
的に不活性な状態で存在するクレアチニンアミジノヒド
ロラーゼ並びに律速量で存在するクレアチニンアミドヒ
ドロラーゼを含む、クレアチニンの測定用分析要素であ
る。
る分析要素は、ザルコシンオキシダーゼ、過酸化水素及
び過酸化性物質の存在下に検出可能な色素を生成しうる
イミダゾールロイコ色素、前記口イコ色素に対して実質
的に不活性な状態で存在するクレアチニンアミジノヒド
ロラーゼ並びに律速量で存在するクレアチニンアミドヒ
ドロラーゼを含む、クレアチニンの測定用分析要素であ
る。
この分析要素においては、クレアチニンをクレアチニン
アミドヒドロラーゼでクレアチニンに変換し、生成した
クレアチニンをクレアチニンアミジノヒドロラーゼによ
ってザルコシンに変換している。そして、このザルコシ
ンをザルコシンオキシダーゼで分解して過酸化水素を生
成させ、これに過酸化水素検出試薬組成物を作用させて
イ貴ダゾールロイコ色素を発色させ比色定量しているの
である。試料に含まれているクレアチンによる誤差を除
く手段として、クレアチニンアミドヒドロラーゼの含有
量を律速量とし、レート法で定量している。
アミドヒドロラーゼでクレアチニンに変換し、生成した
クレアチニンをクレアチニンアミジノヒドロラーゼによ
ってザルコシンに変換している。そして、このザルコシ
ンをザルコシンオキシダーゼで分解して過酸化水素を生
成させ、これに過酸化水素検出試薬組成物を作用させて
イ貴ダゾールロイコ色素を発色させ比色定量しているの
である。試料に含まれているクレアチンによる誤差を除
く手段として、クレアチニンアミドヒドロラーゼの含有
量を律速量とし、レート法で定量している。
特開昭６３−３０５２５４号公報に開示されている分析
要素は、酵素クレアチニンアミドヒドロラーゼ２００〜
１，２００１υ／ボ、酵素クレアチニンアミジノヒドロ
ラーゼ３５．０００〜６５，０００ ＩＵ／ボ及び酵素
サルコシンオキシダーゼ（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｏｘｉ
ｄａｓｅ） ２．ＯＯＯ〜３．５００１Ｕ／ｒｒｒ並び
に過酸化水素及び過酸化性物質の存在下に検出し得る染
料を生威し得るロイコ色素を含有する吸収性キャリヤー
物質からなり、該クレアチンアミジノヒドロラーゼが各
ロイコ色素に実質的に不活性であるような状態で存在し
、該クレアチニンアミドヒドロラーゼが速度限定量で存
在し、前記３種の全ての酵素がｐＨ約６．５〜６．９で
存在する。クレアチニンの測定用分析要素である。
要素は、酵素クレアチニンアミドヒドロラーゼ２００〜
１，２００１υ／ボ、酵素クレアチニンアミジノヒドロ
ラーゼ３５．０００〜６５，０００ ＩＵ／ボ及び酵素
サルコシンオキシダーゼ（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｏｘｉ
ｄａｓｅ） ２．ＯＯＯ〜３．５００１Ｕ／ｒｒｒ並び
に過酸化水素及び過酸化性物質の存在下に検出し得る染
料を生威し得るロイコ色素を含有する吸収性キャリヤー
物質からなり、該クレアチンアミジノヒドロラーゼが各
ロイコ色素に実質的に不活性であるような状態で存在し
、該クレアチニンアミドヒドロラーゼが速度限定量で存
在し、前記３種の全ての酵素がｐＨ約６．５〜６．９で
存在する。クレアチニンの測定用分析要素である。
この分析要素においてもクレアチンによる誤差は前記の
分析要素と同様にクレアチニンアミドヒドロラーゼの含
有量を律速量とし、レート法で定量することによってク
レアチン量を差し引く方法をとっている。
分析要素と同様にクレアチニンアミドヒドロラーゼの含
有量を律速量とし、レート法で定量することによってク
レアチン量を差し引く方法をとっている。
特開昭６４−２５９９号公報に開示されている分析要素
は、支持体上に試薬層、その上方に多孔性展開層を有し
、少なくともクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザル
コシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物を含有
する、液体試料中にクレアチニンを分析するための多層
分析素子において、該クレアチナーゼが、クレアチニナ
ーゼ含有層よりも該展開層により近い層及び／又は展開
層に含有され、かつ素子内にクレアチニナーゼに比べて
クレアチナーゼの活性が高くなるのに十分な緩衝剤が含
有されていることを特徴とするクレアチニン分析用多層
分析素子である。この分析素子においては、試料に含ま
れているクレアチニンによる誤差を除く手段として、ク
レアチナーゼ（すなわちクレアチンアミジノヒドロラー
ゼ）をクレアチニナーゼ（すなわちクレアチニンアミド
ヒドロラーゼ）より先に液体試料に接触させて内因性の
クレアチンの分解を先行させる方式をとっている。
は、支持体上に試薬層、その上方に多孔性展開層を有し
、少なくともクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザル
コシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物を含有
する、液体試料中にクレアチニンを分析するための多層
分析素子において、該クレアチナーゼが、クレアチニナ
ーゼ含有層よりも該展開層により近い層及び／又は展開
層に含有され、かつ素子内にクレアチニナーゼに比べて
クレアチナーゼの活性が高くなるのに十分な緩衝剤が含
有されていることを特徴とするクレアチニン分析用多層
分析素子である。この分析素子においては、試料に含ま
れているクレアチニンによる誤差を除く手段として、ク
レアチナーゼ（すなわちクレアチンアミジノヒドロラー
ゼ）をクレアチニナーゼ（すなわちクレアチニンアミド
ヒドロラーゼ）より先に液体試料に接触させて内因性の
クレアチンの分解を先行させる方式をとっている。
クレアチニンアミドヒドロラーゼの量を規制する方法は
含有量の少ないクレアチニンアミドヒドロラーゼの含有
量によって反応速度が異るので製造ロット間の差の制御
が容易でなく、また経時変化によって生じるクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼの活性の変化も誤差の原因になる
。また、試料にクレアチンアミジノヒドロラーゼを先に
作用させる方法は高価格のクレアチニンアミジノヒドロ
ラーゼ及びクレアチニンアミドヒドロラーゼを大量に必
要とするので、分析要素の価格が高くなるという問題点
がある。
含有量の少ないクレアチニンアミドヒドロラーゼの含有
量によって反応速度が異るので製造ロット間の差の制御
が容易でなく、また経時変化によって生じるクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼの活性の変化も誤差の原因になる
。また、試料にクレアチンアミジノヒドロラーゼを先に
作用させる方法は高価格のクレアチニンアミジノヒドロ
ラーゼ及びクレアチニンアミドヒドロラーゼを大量に必
要とするので、分析要素の価格が高くなるという問題点
がある。
本発明は上記の問題点を解決して試料に予め含まれてい
るクレアチンによる分析誤差を簡単な手段で確実に除き
うる手段を提供するものである。
るクレアチンによる分析誤差を簡単な手段で確実に除き
うる手段を提供するものである。
かかる本発明は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ及び過酸化水素検出試薬組成物を含有し、少なくとも
光透過性水平透過性支持体、前記の酵素及び試薬組成物
の全部又は一部を含む試薬層及び展開層がこの順に積層
されているクレアチニン分析用一体型多層分析要素にお
いて、クレアチンを基質とするが過酸化水素を生成しな
い酵素反応試薬組成物を含有するクレアチン除去層を試
薬層の支持体と反対側に有することを特徴とするクレア
チニン分析用一体型多層分析要素に関するものである。
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ及び過酸化水素検出試薬組成物を含有し、少なくとも
光透過性水平透過性支持体、前記の酵素及び試薬組成物
の全部又は一部を含む試薬層及び展開層がこの順に積層
されているクレアチニン分析用一体型多層分析要素にお
いて、クレアチンを基質とするが過酸化水素を生成しな
い酵素反応試薬組成物を含有するクレアチン除去層を試
薬層の支持体と反対側に有することを特徴とするクレア
チニン分析用一体型多層分析要素に関するものである。
本発明の分析要素においてクレアチニンを検出する反応
系自体は従来の分析要素と同様であり下記のように進行
する・。
系自体は従来の分析要素と同様であり下記のように進行
する・。
ＣＮ
クレアチニン十ＨｚＯ：クレアチニン
Ｉ
クレアチン十ＨｚＯ→ザルコシン＋尿素Ｏ
ザルコシン十〇、 ＋ Ｈ，０→グリシン＋ＩＣｌ０十
Ｈｔ（ｈ０Ｄ Ｏ２＋色原体＋カプラー又はロイコ色素０発色又は色変
化 ＣＮ：クレアチニンアミドヒドロラーゼＣＩ：クレアチ
ンアミジノヒドロラーゼＳＯ：ザルコシンオキシダーゼ ＰＯＤ ：ベルオキシダーゼ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３，５，２，１
０）はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｆｕａ＋ １ｉｉｆｌ
菌、Ｐｓｅｕｄｏｔａｏｎａｓ ７１４細菌、Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｆｌａｖｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属細菌、旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌など種々の
微生物が産生ずることが知られており、そのいずれも本
発明の分析要素に利用することができる。また、クレア
チンアミジノヒドロラーゼ〔ＥＣ３・５・３・３〕もＰ
ｓｅｕｄｏａｏｎａｓ属細菌、Ｆｌａｖｏｎｏｂａｃｔ
ｅｒｉ曲属細菌等が産生ずることが知られている。これ
らの酵素は例えばり、Ｔｓｕｒｕ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ ａｎｄ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１−ｄｓ＋ ３
５＋ ３１（１９７７）＋ Ｊ、Ｓｚｕ１ｗ＋ａｊｓｔ
ｅｒ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ。
Ｈｔ（ｈ０Ｄ Ｏ２＋色原体＋カプラー又はロイコ色素０発色又は色変
化 ＣＮ：クレアチニンアミドヒドロラーゼＣＩ：クレアチ
ンアミジノヒドロラーゼＳＯ：ザルコシンオキシダーゼ ＰＯＤ ：ベルオキシダーゼ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３，５，２，１
０）はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｆｕａ＋ １ｉｉｆｌ
菌、Ｐｓｅｕｄｏｔａｏｎａｓ ７１４細菌、Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｆｌａｖｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属細菌、旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌など種々の
微生物が産生ずることが知られており、そのいずれも本
発明の分析要素に利用することができる。また、クレア
チンアミジノヒドロラーゼ〔ＥＣ３・５・３・３〕もＰ
ｓｅｕｄｏａｏｎａｓ属細菌、Ｆｌａｖｏｎｏｂａｃｔ
ｅｒｉ曲属細菌等が産生ずることが知られている。これ
らの酵素は例えばり、Ｔｓｕｒｕ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ ａｎｄ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１−ｄｓ＋ ３
５＋ ３１（１９７７）＋ Ｊ、Ｓｚｕ１ｗ＋ａｊｓｔ
ｅｒ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ。
ｐｈｙｏ、Ａｃｔａ、３０． １５４（１９５８Ｌ Ｔ
、Ｕｗａｊｉｍａ ａｎｄ Ｏ，Ｔｅｒａｄａ、 Ａｇ
ｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋ ４０＋ １０５５（１９
７６）等に報告されている。ザルコシンオキシダーゼ［
ＥＣ１・５・３・１］はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ５、
Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ属等の微生物が産生ずること
が知られており、また、各種動物のミトコンドリアから
も抽出することができる。
、Ｕｗａｊｉｍａ ａｎｄ Ｏ，Ｔｅｒａｄａ、 Ａｇ
ｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋ ４０＋ １０５５（１９
７６）等に報告されている。ザルコシンオキシダーゼ［
ＥＣ１・５・３・１］はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ５、
Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ属等の微生物が産生ずること
が知られており、また、各種動物のミトコンドリアから
も抽出することができる。
ザルコシンオキシダーゼはＮ 、Ｍｏｒｉｅｔａｌ、
Ａｇｒ。
Ａｇｒ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、 ４４．１３９１（１９８０）
、Ｍ、５ｕｚｕｋｉ、 Ｊ、Ｂｉ。
、Ｍ、５ｕｚｕｋｉ、 Ｊ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、＋ ８９ ５９９（１９８１） 米国特許
第４．２１６．２９２号等に報告されている。これらの
酵素はいずれも市販されておりそれらを購入して使用す
ることができる。一方、本発明の分析要素用としてはこ
れらの酵素は純品でなくともよく、例えば微生物の発酵
液あるいはそれから沈澱等の手段で得た粗製酵素を利用
することもできる。
第４．２１６．２９２号等に報告されている。これらの
酵素はいずれも市販されておりそれらを購入して使用す
ることができる。一方、本発明の分析要素用としてはこ
れらの酵素は純品でなくともよく、例えば微生物の発酵
液あるいはそれから沈澱等の手段で得た粗製酵素を利用
することもできる。
過酸化水素検出試薬組成物としてはペルオキシダーゼを
含む試薬組成物が好ましい、ペルオキシダーゼはワサビ
、ジャガイモ、大根、イチジク等の植物起源のもの、白
血球、乳汁等の動物起源のもの、コクリオボルス（Ｃｏ
ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、タルプラリア（Ｃｕｒｖｕ
ｌａｒｉａ）属等の微生物起源のもの等が知られており
、これらのいずれであっても使用できるが市販品を利用
するのが簡便である。
含む試薬組成物が好ましい、ペルオキシダーゼはワサビ
、ジャガイモ、大根、イチジク等の植物起源のもの、白
血球、乳汁等の動物起源のもの、コクリオボルス（Ｃｏ
ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、タルプラリア（Ｃｕｒｖｕ
ｌａｒｉａ）属等の微生物起源のもの等が知られており
、これらのいずれであっても使用できるが市販品を利用
するのが簡便である。
また、この試薬組成物はさらに発色試薬ｍ酸物を含む、
発色試薬組成物は色原体（水素供与体ともいわれる）と
カプラーを含みペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素
により色原体とカプラーが酸化カプリングしてキノンイ
ミン染料を形成して発色する組成物、またはロイコ色素
または自己酸化発色性色原体でペルオキシダーゼの存在
下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色する化
合物である。
発色試薬組成物は色原体（水素供与体ともいわれる）と
カプラーを含みペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素
により色原体とカプラーが酸化カプリングしてキノンイ
ミン染料を形成して発色する組成物、またはロイコ色素
または自己酸化発色性色原体でペルオキシダーゼの存在
下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色する化
合物である。
色原体としては、Ａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
＋ ６＋ ２４−２７ （１９６９）に記載の４−アミ
ノアンチピリン（別名４−アミノフェナジン、すなわち
１−フェニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピ
ラゾリン−５−オン）、特開昭５９−５４９６２等に記
載の１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３
−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、
１−（３，５−ジクロロフェニル）−２，３−ジメチル
−４−アミノ−３−ピラジリンー５−オン等のトリ置換
−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、特公昭５５
−２５８４０等に記載の１−フェニル−２，３−ジメチ
ルアミノ−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノア
ンチビリン類似体を用いることができる。これらの化合
物のうちでは、４−アミノアンチピリン、１−（２，４
，６−トリクロロフエニル）−２，３−ジメチル−４−
アミノル３−ピラゾリン−５−オン、１−（３，５−ジ
クロロフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３
−ビラプリン−５−オン等が好ましい。
＋ ６＋ ２４−２７ （１９６９）に記載の４−アミ
ノアンチピリン（別名４−アミノフェナジン、すなわち
１−フェニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピ
ラゾリン−５−オン）、特開昭５９−５４９６２等に記
載の１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３
−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、
１−（３，５−ジクロロフェニル）−２，３−ジメチル
−４−アミノ−３−ピラジリンー５−オン等のトリ置換
−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、特公昭５５
−２５８４０等に記載の１−フェニル−２，３−ジメチ
ルアミノ−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノア
ンチビリン類似体を用いることができる。これらの化合
物のうちでは、４−アミノアンチピリン、１−（２，４
，６−トリクロロフエニル）−２，３−ジメチル−４−
アミノル３−ピラゾリン−５−オン、１−（３，５−ジ
クロロフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−３
−ビラプリン−５−オン等が好ましい。
カプラーとしては、Ａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｎ
、、 ６＋ ２４−２７ （１９６９）、特公昭５５−
２５８４０、特公昭５８−４５５９９、特公昭５８−１
８６２８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭５６１２
４３９８、特開昭５６−１５５８５２等に記載のフェノ
ール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、４−
ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３゜５−ジクロ
ロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、２−ヒ
ドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン酸、２
−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン酸
等のフェノールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩を含む）、１−ナフトール、２−ナフトール
、■。
、、 ６＋ ２４−２７ （１９６９）、特公昭５５−
２５８４０、特公昭５８−４５５９９、特公昭５８−１
８６２８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭５６１２
４３９８、特開昭５６−１５５８５２等に記載のフェノ
ール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、４−
ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３゜５−ジクロ
ロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、２−ヒ
ドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン酸、２
−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホン酸
等のフェノールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩を含む）、１−ナフトール、２−ナフトール
、■。
７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキシナフタレ
ン；１−°ヒドロキシー２−ナフタレンスルホン酸、１
−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホンＭｅのナフトー
ルスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を
含む）、その他のフェノールまたはナフトール誘導体が
ある。これらの化合物のうちでは、１．７−ジヒドロキ
シナフタレン、ｌ−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホ
ン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、３．５−ジクロ
ロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸（Ｎａ塩
、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。
ン；１−°ヒドロキシー２−ナフタレンスルホン酸、１
−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホンＭｅのナフトー
ルスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を
含む）、その他のフェノールまたはナフトール誘導体が
ある。これらの化合物のうちでは、１．７−ジヒドロキ
シナフタレン、ｌ−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホ
ン酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、３．５−ジクロ
ロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸（Ｎａ塩
、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。
ロイコ色素として、特公昭５７−５５１９に記載の２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）４．
５−ビス（４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダゾ
ール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭
５９−１９３３５２に記載の２−（３，５−ジメトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）−４（４−（、ジメチルア
ξ〕）フェニル〕−５−フェネチルイミダゾール等のジ
アリールイミダゾール０４コ色素；特開昭６１−４９６
０に記載の２−（２−フェニル−３−インドリル）−４
，５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダゾ
ール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素
、特開昭６１−２２９８６８に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３゜５−ジメトキシフェニル）−３−アセチル−
４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フェニル〕イξ
ダゾール等のトリアリールモノアシルイ果ダゾールロイ
コ色素；２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
ェニル）−３−メチル−４，５−ビス〔４−（ジエチル
アミノ）フェニルコイミダゾール等のトリアリールモノ
アルキルイミダゾール０４コ色素等がある。
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）４．
５−ビス（４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダゾ
ール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭
５９−１９３３５２に記載の２−（３，５−ジメトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）−４（４−（、ジメチルア
ξ〕）フェニル〕−５−フェネチルイミダゾール等のジ
アリールイミダゾール０４コ色素；特開昭６１−４９６
０に記載の２−（２−フェニル−３−インドリル）−４
，５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダゾ
ール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素
、特開昭６１−２２９８６８に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３゜５−ジメトキシフェニル）−３−アセチル−
４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フェニル〕イξ
ダゾール等のトリアリールモノアシルイ果ダゾールロイ
コ色素；２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
ェニル）−３−メチル−４，５−ビス〔４−（ジエチル
アミノ）フェニルコイミダゾール等のトリアリールモノ
アルキルイミダゾール０４コ色素等がある。
本発明の一体型多層分析要素は少なくとも光透過性水平
透過性支持体、試薬層及び展開層がこの順に積層されて
いる。
透過性支持体、試薬層及び展開層がこの順に積層されて
いる。
光透過性水平透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。
されている公知のものを利用すればよい。
その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのポリマーからなる厚さ約５Ｏｎから約１ｍ
ｍ、好ましくは約８０−から約３００ｎの範囲の透明支
持体を用いることができる。支持体の表面には必要によ
り前記の諸特許明細書等により公知の下塗層または接着
層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等との接着
を強固にすることができる。
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのポリマーからなる厚さ約５Ｏｎから約１ｍ
ｍ、好ましくは約８０−から約３００ｎの範囲の透明支
持体を用いることができる。支持体の表面には必要によ
り前記の諸特許明細書等により公知の下塗層または接着
層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等との接着
を強固にすることができる。
試薬層は前記の酵素及び試薬ｍ放物の全部又は一部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。
微多孔性で水浸透性の試薬層は後述する布地層間層と同
様の布地、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ポリ
マー繊維バルブ含有抄造紙、特開昭５７−１２５８４７
等に記載の繊維と親水性ポリマーの分散液を塗布して形
成した多孔性層等の繊維質多孔性層；特公昭５３−２１
６７７、米国特許３９９２１５８等に記載のメンブラン
フィルタ−層（プラッシュポリマー層）、ポリマーミク
ロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダーで点接
触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性層、
特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーごクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接触され
てなる連続空隙含有等方的多孔性層（三次元格子状粒状
構造物層）等の非繊維等方的多孔性層等の微多孔性層に
試薬組成物を含有させた層又は固体微粒子と親水性ポリ
マーバインダーから構成される微多孔性構造体に試薬組
成物を含有させた層である。微多孔性試薬層の乾燥時の
層厚は約７μ−から約２５０μｍ、好ましくは約１０μ
ｍから約２５０μ−の範囲である。
様の布地、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ポリ
マー繊維バルブ含有抄造紙、特開昭５７−１２５８４７
等に記載の繊維と親水性ポリマーの分散液を塗布して形
成した多孔性層等の繊維質多孔性層；特公昭５３−２１
６７７、米国特許３９９２１５８等に記載のメンブラン
フィルタ−層（プラッシュポリマー層）、ポリマーミク
ロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダーで点接
触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性層、
特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーごクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接触され
てなる連続空隙含有等方的多孔性層（三次元格子状粒状
構造物層）等の非繊維等方的多孔性層等の微多孔性層に
試薬組成物を含有させた層又は固体微粒子と親水性ポリ
マーバインダーから構成される微多孔性構造体に試薬組
成物を含有させた層である。微多孔性試薬層の乾燥時の
層厚は約７μ−から約２５０μｍ、好ましくは約１０μ
ｍから約２５０μ−の範囲である。
微多孔性試薬層の上に展開層を設ける場合には、両層の
間は特開昭６１−４９５９ 、特開昭６２−１３８７５
６等に記載の多孔性接着によるのが好ましい。
間は特開昭６１−４９５９ 、特開昭６２−１３８７５
６等に記載の多孔性接着によるのが好ましい。
本発明の多層分析要素の１態様として、展開層に前述の
試薬組成物を含有させ、展開層の下に（必要におうじて
接着層を介して）吸水層又は検出層を設けた構成の多層
分析要素がある。別の１態様として、試薬層のポリマー
バインダーとして、水性液体試料の溶媒に溶解又はゾる
化するポリマー例工ばポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルホキシミチルセルロース、アルギン
酸ナトリウム、非硬化ゼラチン、寒天等を用いて試薬層
を形成し、その上に前記の微多孔性試薬層として用いる
微多孔性の薄シート状部材を多孔性検出層として積層接
着した構成の多層分析要素がある。
試薬組成物を含有させ、展開層の下に（必要におうじて
接着層を介して）吸水層又は検出層を設けた構成の多層
分析要素がある。別の１態様として、試薬層のポリマー
バインダーとして、水性液体試料の溶媒に溶解又はゾる
化するポリマー例工ばポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルホキシミチルセルロース、アルギン
酸ナトリウム、非硬化ゼラチン、寒天等を用いて試薬層
を形成し、その上に前記の微多孔性試薬層として用いる
微多孔性の薄シート状部材を多孔性検出層として積層接
着した構成の多層分析要素がある。
試薬層には公知のｐＨｌ１街剤組成物、高分子ｐＨ緩衝
剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を
含有させることができる。
剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を
含有させることができる。
展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンブランフィルタ（プラッシュポリマー層）、ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示のポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ等で水が膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非
繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３５６
号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に開示の織物
展開層、特願昭５９−７９１５８号明細書に開示の織物
展開層、特願昭５７−１４８２５０号公報に開示の有機
ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。
のメンブランフィルタ（プラッシュポリマー層）、ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示のポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ等で水が膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非
繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３５６
号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に開示の織物
展開層、特願昭５９−７９１５８号明細書に開示の織物
展開層、特願昭５７−１４８２５０号公報に開示の有機
ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。
展開層は直接あるいは必要により接着層を介して積層さ
れる。
れる。
多層分析要素には前述の諸層のほかに必要に応じて特開
昭５１−４０１９１、特開昭５３−１３１０８９等に開
示の検出層または媒染層、特開昭５４−２９７００等に
開示のミグレーシッン阻止層、特開昭５１−４０１９１
等に開示の中間層、特開昭５６−８５４９に開示の試薬
含有微粒子分散層等を組み込んで設けることができる。
昭５１−４０１９１、特開昭５３−１３１０８９等に開
示の検出層または媒染層、特開昭５４−２９７００等に
開示のミグレーシッン阻止層、特開昭５１−４０１９１
等に開示の中間層、特開昭５６−８５４９に開示の試薬
含有微粒子分散層等を組み込んで設けることができる。
展開層、試薬層、吸水層、検出層、接着層等には界面活
性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含有させるこ
とができる。ノニオン性界面活性剤の例として、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニル
フェノキシポリグリシドール、ポリオキシエチレンオレ
イルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、オキチルグルコシド等がある。ノニオン性界面
活性剤を試薬層、吸水層又は検出層に含有させることに
より分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層、吸水層
又は検出層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また
展開層との液体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノ
ニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水
性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好
になる。ノニオン性界面活性剤の展開層における含有量
は展開層１ｒＩｆ当り約１０■〜約３．０ｇ、好ましく
は約２０■〜約２．０ｇの範囲である。
性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含有させるこ
とができる。ノニオン性界面活性剤の例として、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニル
フェノキシポリグリシドール、ポリオキシエチレンオレ
イルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、オキチルグルコシド等がある。ノニオン性界面
活性剤を試薬層、吸水層又は検出層に含有させることに
より分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層、吸水層
又は検出層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また
展開層との液体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノ
ニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水
性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好
になる。ノニオン性界面活性剤の展開層における含有量
は展開層１ｒＩｆ当り約１０■〜約３．０ｇ、好ましく
は約２０■〜約２．０ｇの範囲である。
本発明の一体型多層分析要素は上述のような分析要素に
おいて、クレアチンを基質とするが過酸化水素を生成し
ない酵素反応試薬組成物を含有するクレアチン除去層を
試薬層の支持体と反対側に設けたことを特徴としている
。
おいて、クレアチンを基質とするが過酸化水素を生成し
ない酵素反応試薬組成物を含有するクレアチン除去層を
試薬層の支持体と反対側に設けたことを特徴としている
。
このような酵素反応試薬組成物としてはクレアチンキナ
ーゼ（ＥＣ２・７・３・２〕とＡＴＰの組合せ、クレア
チンアミジノヒドロラーゼ（ＥＣ３・５・３・３〕、ザ
ルコシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１・５・９９・１ 〕
と電子受容体の組合せ等を挙げることができる。クレア
チンキナーゼとＡＴＰの組合せを用いることによって試
料中のクレアチンをクレアチン燐酸に変えることができ
、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンデヒド
ロゲナーゼと電子受容体の組合せを用いることにとよっ
てクレアチンをザルコシンからさらにグリシンに変えそ
の際電子受容体を共存させることによってＩＩ、０！の
発生を阻止することができる。本発明の一体型多層分析
要素においてはクレアチンキナーゼとＡＴＰの組合せを
用いることが特に好ましい。
ーゼ（ＥＣ２・７・３・２〕とＡＴＰの組合せ、クレア
チンアミジノヒドロラーゼ（ＥＣ３・５・３・３〕、ザ
ルコシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１・５・９９・１ 〕
と電子受容体の組合せ等を挙げることができる。クレア
チンキナーゼとＡＴＰの組合せを用いることによって試
料中のクレアチンをクレアチン燐酸に変えることができ
、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンデヒド
ロゲナーゼと電子受容体の組合せを用いることにとよっ
てクレアチンをザルコシンからさらにグリシンに変えそ
の際電子受容体を共存させることによってＩＩ、０！の
発生を阻止することができる。本発明の一体型多層分析
要素においてはクレアチンキナーゼとＡＴＰの組合せを
用いることが特に好ましい。
クレアチンキナーゼとＡＴＰの組合せを用いる場合には
、生成したクレアチン燐酸をさらに別の物質に変えある
いはＡＤＰをさらに別の物質に変えるか元のＡＴＰに戻
す試薬組成物を併用することが好ましい。例えばフォス
フオニノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２
・７・１・４０）をさらに組合せることによってＡＤＰ
をＡＴＰに戻し、それによってクレアチンをクレアチン
燐酸に変える酵素反応を加速することができる。
、生成したクレアチン燐酸をさらに別の物質に変えある
いはＡＤＰをさらに別の物質に変えるか元のＡＴＰに戻
す試薬組成物を併用することが好ましい。例えばフォス
フオニノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２
・７・１・４０）をさらに組合せることによってＡＤＰ
をＡＴＰに戻し、それによってクレアチンをクレアチン
燐酸に変える酵素反応を加速することができる。
クレアチンキナーゼは動物界に広く存在し、例えばウサ
ギ、゛ニワトリ等の骨格筋等から取得することができる
が、市販品を利用するのが簡便である。ザルコシンデヒ
ドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ等も公知のいかなる
酵素でもよい。
ギ、゛ニワトリ等の骨格筋等から取得することができる
が、市販品を利用するのが簡便である。ザルコシンデヒ
ドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ等も公知のいかなる
酵素でもよい。
酵素反応試薬組成物にはｐＨ緩衝剤、酵素活性化剤等を
さらに組合せることができる。
さらに組合せることができる。
上記の酵素反応試薬組成物を含むクレアチン除去層は試
薬層の支持体と反対側に設けて試料中のクレアチニンを
酵素反応させる前に試料に予め含まれていたクレアチン
を他の物質に変えるようにする。このクレアチン除去層
は新たに独立して設けてもよく、展開層、光遮蔽層等に
酵素反応試薬組成物を含有させて兼用させることもでき
る。新たに設ける場合には例えば前述の試薬層で説明し
た親水性ポリマーバインダー層又は微多孔性層を利用す
ることができる。また、クレアチン除去層は１層に限ら
れるものではなく、酵素反応試薬組成物の各成分を２層
以上に分けて含有せしめてもよい。親水性ポリマーバイ
ンダーを含む独立のクレアチン除去層を設ける場合、ク
レアチン除去層の被覆量は１Ｍ当り約５ｇ〜約２５ｇ、
好ましくは約８ｇ〜約２０ｇの範囲、乾燥厚さは約５μ
糟〜約２５μ曽、好ましくは約８μｍ〜約２０μｍの範
囲である。
薬層の支持体と反対側に設けて試料中のクレアチニンを
酵素反応させる前に試料に予め含まれていたクレアチン
を他の物質に変えるようにする。このクレアチン除去層
は新たに独立して設けてもよく、展開層、光遮蔽層等に
酵素反応試薬組成物を含有させて兼用させることもでき
る。新たに設ける場合には例えば前述の試薬層で説明し
た親水性ポリマーバインダー層又は微多孔性層を利用す
ることができる。また、クレアチン除去層は１層に限ら
れるものではなく、酵素反応試薬組成物の各成分を２層
以上に分けて含有せしめてもよい。親水性ポリマーバイ
ンダーを含む独立のクレアチン除去層を設ける場合、ク
レアチン除去層の被覆量は１Ｍ当り約５ｇ〜約２５ｇ、
好ましくは約８ｇ〜約２０ｇの範囲、乾燥厚さは約５μ
糟〜約２５μ曽、好ましくは約８μｍ〜約２０μｍの範
囲である。
一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンア
ミジノビトロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸
化水素検出試薬組成物も成分の一部は試薬層以外の層に
含有させてもよいが、その場合であっても試料中のクレ
アチニンをクレアチンに変える反応がクレアチン除去層
によって試料中に予め含まれていたクレアチンが除去さ
れた後に起こるように配置する必要がある。
ミジノビトロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸
化水素検出試薬組成物も成分の一部は試薬層以外の層に
含有させてもよいが、その場合であっても試料中のクレ
アチニンをクレアチンに変える反応がクレアチン除去層
によって試料中に予め含まれていたクレアチンが除去さ
れた後に起こるように配置する必要がある。
本発明の一体型多層分析要素における含有量はクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼが４０００〜４５０００ＩＵ／
ｒｒｆ程度、好ましくは１万〜３万ＩＵ／ｒｒｆ程度
、クレアチンアミジノビトロラーゼが５０００〜４万Ｉ
Ｕ／Ｍ程度、好ましくは８０００〜３万ＩＵ／ｒＷ程度
、ザルコシンオキシダーゼが３０００〜３万１０／ ｒ
ｒｆ程度、好ましくは５０００〜２万ＩＵ／ｉｆ程度が
適当である。一方、クレアチン除去用の酵素反応試薬組
成物にクレアチンキナーゼとＡＴＰの組合せを用いると
きは、クレアチンキナーゼは１万〜３０万１０／ ｒｒ
ｆ程度、好ましくは１５０００〜２０万１０／ボ程度、
そしてＡＴＰは０．５〜５０ｇ／ボ程度、好ましくは２
．５〜２０ｇ／ボ程度である。
ニンアミドヒドロラーゼが４０００〜４５０００ＩＵ／
ｒｒｆ程度、好ましくは１万〜３万ＩＵ／ｒｒｆ程度
、クレアチンアミジノビトロラーゼが５０００〜４万Ｉ
Ｕ／Ｍ程度、好ましくは８０００〜３万ＩＵ／ｒＷ程度
、ザルコシンオキシダーゼが３０００〜３万１０／ ｒ
ｒｆ程度、好ましくは５０００〜２万ＩＵ／ｉｆ程度が
適当である。一方、クレアチン除去用の酵素反応試薬組
成物にクレアチンキナーゼとＡＴＰの組合せを用いると
きは、クレアチンキナーゼは１万〜３０万１０／ ｒｒ
ｆ程度、好ましくは１５０００〜２０万１０／ボ程度、
そしてＡＴＰは０．５〜５０ｇ／ボ程度、好ましくは２
．５〜２０ｇ／ボ程度である。
フォスフオニノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを
さらに組合せるときはフォスフオニノールピルビン酸は
１．０〜２０ｇ／ｒｔｆ、好ましくは４．０〜１５ｇ１
ｒｄ程度、そしてピルビン酸キナーゼは１０００〜５万
Ｉｌｌ／ ｒｒｆ程度、好ましくは３０００〜２万［Ｕ
／ｒｄ程度が適当である。クレアチンアミジノビトロラ
ーゼ、ザルコシンデヒドロゲナーゼと電子受容体の組合
せを用いるときはザルコシンデヒドロゲナーゼは５００
０〜５万１０／ボ程度、好ましくは１万〜３万Ｉｌｌ／
ボ程度が適当である。クレアチンアミジノビトロラーゼ
は５０００〜５万ＩＩＩ／ボ程度、好ましくは８０００
〜３５０００１０／ ｒｒｆ程度が適当であるが、この
酵素は前述のクレアチニン分析用のものを必要により増
量して併用させることができる。
さらに組合せるときはフォスフオニノールピルビン酸は
１．０〜２０ｇ／ｒｔｆ、好ましくは４．０〜１５ｇ１
ｒｄ程度、そしてピルビン酸キナーゼは１０００〜５万
Ｉｌｌ／ ｒｒｆ程度、好ましくは３０００〜２万［Ｕ
／ｒｄ程度が適当である。クレアチンアミジノビトロラ
ーゼ、ザルコシンデヒドロゲナーゼと電子受容体の組合
せを用いるときはザルコシンデヒドロゲナーゼは５００
０〜５万１０／ボ程度、好ましくは１万〜３万Ｉｌｌ／
ボ程度が適当である。クレアチンアミジノビトロラーゼ
は５０００〜５万ＩＩＩ／ボ程度、好ましくは８０００
〜３５０００１０／ ｒｒｆ程度が適当であるが、この
酵素は前述のクレアチニン分析用のものを必要により増
量して併用させることができる。
本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。
知の方法により調製することができる。
本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０胴の
正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
公昭５７−２８３３１、実公昭５６−１４２４５４、特
開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特表
昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて化
学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸送
、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的に
よっては長いテープ状でカセットまたはマガジンに収め
て用いること、または小片を開口のあるカードに貼付ま
たは収めて用いることなどもてきる。
正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
公昭５７−２８３３１、実公昭５６−１４２４５４、特
開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特表
昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて化
学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸送
、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的に
よっては長いテープ状でカセットまたはマガジンに収め
て用いること、または小片を開口のあるカードに貼付ま
たは収めて用いることなどもてきる。
本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。例えば約５μｅから約３０μｅ、好ましくは８μｅか
ら１５μｅの範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液体
試料滴を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、約
２０°Ｃから約４０°Ｃの範囲の実質的に一定の温度で
、好ましくは３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度でイン
クベーションし、要素内の発色または変色を可視光又は
紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用い
て光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量
線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のアナラ
イトの含有量を求めることができる。
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。例えば約５μｅから約３０μｅ、好ましくは８μｅか
ら１５μｅの範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液体
試料滴を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、約
２０°Ｃから約４０°Ｃの範囲の実質的に一定の温度で
、好ましくは３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度でイン
クベーションし、要素内の発色または変色を可視光又は
紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用い
て光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量
線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のアナラ
イトの含有量を求めることができる。
測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開昭６０−２
２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５８−
１６１８６７、特開昭６３−３１３０６３等に記載の化
学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析
を実施できる。
２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５８−
１６１８６７、特開昭６３−３１３０６３等に記載の化
学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析
を実施できる。
本発明の分析要素で採用されているクレアチニン分析用
の反応系はクレアチニンをクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼがクレアチンに変換し、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼがこれをザルコシンに変える。ザルコシンをザル
コシンオキシダーゼがグリシンに変えその際に過酸化水
素が生成する。
の反応系はクレアチニンをクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼがクレアチンに変換し、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼがこれをザルコシンに変える。ザルコシンをザル
コシンオキシダーゼがグリシンに変えその際に過酸化水
素が生成する。
この過酸化水素を過酸化水素検出試薬組成物によって比
色定置するのである。このような反応系では試料中に予
め含まれているクレアチンも検出されて誤差の原因とな
る。本発明の分析要素においてはこのクレアチンをクレ
アチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼが作用する
前にクレアチン除去用の酵素反応試薬組成物で他の物質
に変えて誤差を除いているのである。この酵素反応試薬
組成物にクレアチンキナーゼとＡＴＰを用いた場合には
クレアチンをクレアチン燐酸に変えてクレアチニン分析
用の反応系で反応しないようにしている。
色定置するのである。このような反応系では試料中に予
め含まれているクレアチンも検出されて誤差の原因とな
る。本発明の分析要素においてはこのクレアチンをクレ
アチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼが作用する
前にクレアチン除去用の酵素反応試薬組成物で他の物質
に変えて誤差を除いているのである。この酵素反応試薬
組成物にクレアチンキナーゼとＡＴＰを用いた場合には
クレアチンをクレアチン燐酸に変えてクレアチニン分析
用の反応系で反応しないようにしている。
〔実施例〕
実施例１
ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５μ市の無色透明ＰＥ
Ｔフィルム支持体の上に下記組成のクレアチニン測定用
試薬層を乾燥後の層厚が約１５即になるようにして塗布
し乾燥した。
Ｔフィルム支持体の上に下記組成のクレアチニン測定用
試薬層を乾燥後の層厚が約１５即になるようにして塗布
し乾燥した。
クレアチニン測定用試薬組成
クレアチニンアミドヒドロラーゼ１５，０００ ＩＵ／
ｒｒｆクレアチンアミジノヒドロラーゼ１７．０００
ＩＵ／ ％ザルコシンオキシダーゼ １０．０
００ ＩＵ／ ｎ−ｒＮ−トリス（ヒドロキシメチル） メチル−２−アミツメタンスルホン ／く２酸緩衝液
−ｔ＋ ｇ ／ボ２−（３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４
−（ジメチルアミノ）フェニル〕５−フエネチルーイご
ダゾール５５０ｍｇ／ ｒｒＩ ペルオキシダーゼ ２５，０００ ＩＵ
／ボ（エチレンジニトリロ）四酢酸 ５５０ｍｇ／
ｒｔｆ脱イオンゼラチン １０ｇ／
ボッニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均１０
オキシ工チレン単位含有） １００ｍｇ／ ｎＫ燐酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ４０ｇ／
ｒｌ（この試薬層の上に０．２ｇのノニルフェノキシポ
リエトキシエタノール（平均１０オキシ工チレン単位含
有）、８ｇの二酸化チタン微粒子（ルチル型、粒子径０
．２５〜０．４０ｓ）及び１ｇの脱イオンゼラチンの割
合の水分散液を塗布し乾燥して乾燥層厚が約５Ｑの光遮
蔽層を設けた。
ｒｒｆクレアチンアミジノヒドロラーゼ１７．０００
ＩＵ／ ％ザルコシンオキシダーゼ １０．０
００ ＩＵ／ ｎ−ｒＮ−トリス（ヒドロキシメチル） メチル−２−アミツメタンスルホン ／く２酸緩衝液
−ｔ＋ ｇ ／ボ２−（３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４
−（ジメチルアミノ）フェニル〕５−フエネチルーイご
ダゾール５５０ｍｇ／ ｒｒＩ ペルオキシダーゼ ２５，０００ ＩＵ
／ボ（エチレンジニトリロ）四酢酸 ５５０ｍｇ／
ｒｔｆ脱イオンゼラチン １０ｇ／
ボッニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均１０
オキシ工チレン単位含有） １００ｍｇ／ ｎＫ燐酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ４０ｇ／
ｒｌ（この試薬層の上に０．２ｇのノニルフェノキシポ
リエトキシエタノール（平均１０オキシ工チレン単位含
有）、８ｇの二酸化チタン微粒子（ルチル型、粒子径０
．２５〜０．４０ｓ）及び１ｇの脱イオンゼラチンの割
合の水分散液を塗布し乾燥して乾燥層厚が約５Ｑの光遮
蔽層を設けた。
次いで、この光遮蔽層の上に下記＆［１１のクレアチン
除去層を乾燥後の層厚が１０μｍになるようにして塗布
し乾燥した。
除去層を乾燥後の層厚が１０μｍになるようにして塗布
し乾燥した。
クレアチン除去層用試薬組成
クレアチンキナーゼ ２０万ＩＵ／ｎｆＡＴＰ
１５ ｇ／ポ硫酸マグネ
シウム １００ ｍｇ／ボ還元型グルタチ
オン １００ Ｂ／ボ脱イオンゼラチン
１０ｇ／ボ更に、このクレアチニン除去層の
上に２．７ ｇ／ボの脱イオンゼラチンと１３０ｍｇ／
ｎ（のノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均
１０オキシ工チレン単位含有）の被覆量の接着Ｎ（乾燥
層厚約２即）を１００ａｌ！の水に溶解させた溶液を塗
布し乾燥しての接着層を設けた。
１５ ｇ／ポ硫酸マグネ
シウム １００ ｍｇ／ボ還元型グルタチ
オン １００ Ｂ／ボ脱イオンゼラチン
１０ｇ／ボ更に、このクレアチニン除去層の
上に２．７ ｇ／ボの脱イオンゼラチンと１３０ｍｇ／
ｎ（のノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均
１０オキシ工チレン単位含有）の被覆量の接着Ｎ（乾燥
層厚約２即）を１００ａｌ！の水に溶解させた溶液を塗
布し乾燥しての接着層を設けた。
次いで、太さ約５０Ｄ相当のＰＥＴ紡績糸からなる厚さ
約２５０μｍの水洗脱脂済トリコット編生地で、その片
面を６０秒グロー放電処理（１，６ｋＷ／ｒｒｆ ；酸
素濃度は減圧調整）した編物生地を用意した。
約２５０μｍの水洗脱脂済トリコット編生地で、その片
面を６０秒グロー放電処理（１，６ｋＷ／ｒｒｆ ；酸
素濃度は減圧調整）した編物生地を用意した。
ついで接着層を水でほぼ均一に湿潤させ、その上に前述
のトリコツ）Ｉ物生地をグロー放電処理時の電極側表面
を接着層に向きあわせて重ね全体を加圧ローラー間を通
過させ接着層に均一にラミネートして編物展開層を設け
た。
のトリコツ）Ｉ物生地をグロー放電処理時の電極側表面
を接着層に向きあわせて重ね全体を加圧ローラー間を通
過させ接着層に均一にラミネートして編物展開層を設け
た。
ついで編物展開層の上から下記Ｍｉ戒の編物展開層含浸
処理用水溶液を１ｒｒｒ当り１５０ｄの割合で塗布し乾
燥してクレアチニン濃度定量用一体型多層分析要素を調
製した。
処理用水溶液を１ｒｒｒ当り１５０ｄの割合で塗布し乾
燥してクレアチニン濃度定量用一体型多層分析要素を調
製した。
織物展開層含浸処理用水溶液の組成
メチルセルロース
（２％水溶液の２０°Ｃでの粘度５０ｃｐｓ） ２
０ ｇオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（
ＯＥ単位の平均縮台数３０． ＨＬＢ値１７．４） １
０ ｇ水
１０００ ｇこの分析要素を１５ａａＸ１５ｍｍの
正方形のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公
報記載のプラスチックマウントに入れて測定を行った。
０ ｇオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（
ＯＥ単位の平均縮台数３０． ＨＬＢ値１７．４） １
０ ｇ水
１０００ ｇこの分析要素を１５ａａＸ１５ｍｍの
正方形のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公
報記載のプラスチックマウントに入れて測定を行った。
検体には、健康で正常な底入の血液をヘパリン採血して
用いた。この血漿にクレアチニン及びクレアチンを添加
して、各種レベルの検体を調整した。波長６２５ｎｍで
要素内の発色光学濃度を透明支持体側から反射測光した
ところ、下記の結果を得た。
用いた。この血漿にクレアチニン及びクレアチンを添加
して、各種レベルの検体を調整した。波長６２５ｎｍで
要素内の発色光学濃度を透明支持体側から反射測光した
ところ、下記の結果を得た。
検体 クレアチン クレアチニン ０ＤＲ１０，３ｍｇ
／ａ ２．５ ｍｇ／ａ Ｏ，２８７２０，８４，
３０，３３１ ３０，３１０，４０，４６５ ４１，７１４，２０，５４２ ５２，３２３，６０，７２７ ６１，５３，００，３０５ （００Ｒは反射光学濃度） この結果を第１図に示す。第１図のグラフは検量線であ
って、この検量線から、本発明の一体型多層分析要素は
血液中に含まれるクレアチンの干渉を受けることなく、
血液中のクレアチニン含有量を精度よく定量分析できる
ことが明らかである。
／ａ ２．５ ｍｇ／ａ Ｏ，２８７２０，８４，
３０，３３１ ３０，３１０，４０，４６５ ４１，７１４，２０，５４２ ５２，３２３，６０，７２７ ６１，５３，００，３０５ （００Ｒは反射光学濃度） この結果を第１図に示す。第１図のグラフは検量線であ
って、この検量線から、本発明の一体型多層分析要素は
血液中に含まれるクレアチンの干渉を受けることなく、
血液中のクレアチニン含有量を精度よく定量分析できる
ことが明らかである。
実施例２
クレアチン除去層に下記の組成物を使用した以外は実施
例１の要素と全く同一の要素を作成した。
例１の要素と全く同一の要素を作成した。
クレアチン除去層
クレアチンキナーゼ １７．０００ＩＵ／
ポピルビン酸キナーゼ １５．０００１１
１／ポフオスフオエノールビルビン酸 ２．０ｇ／ｒ
ｒｒ脱イオンゼラチン １０ ｇ／ボ
ＡＴＰ ６００ ｍｇ／
ｒｒｆ硫酸マグネシウム ８０ ｒ
ｎｇ／ボ還元型グルタチオン １００
ｍｇ／ボこの分析要素も実施例１と同様の検量線を与え
た。
ポピルビン酸キナーゼ １５．０００１１
１／ポフオスフオエノールビルビン酸 ２．０ｇ／ｒ
ｒｒ脱イオンゼラチン １０ ｇ／ボ
ＡＴＰ ６００ ｍｇ／
ｒｒｆ硫酸マグネシウム ８０ ｒ
ｎｇ／ボ還元型グルタチオン １００
ｍｇ／ボこの分析要素も実施例１と同様の検量線を与え
た。
本発明の分析要素は試料に含まれているクレアチンを排
除してクレアチニンを正確に定量することができる。
除してクレアチニンを正確に定量することができる。
第１図は本発明の分析要素を用いて血液中のクレアチニ
ンを測定した結果を示すものである。
ンを測定した結果を示すものである。
Claims (1)
- （１）光透過性水平透過性支持体の上に試薬層及び展開
層がこの順に積層されている一体型多層分析要素であっ
て、前記試薬層にクレアチニンアミドヒドロラーゼ、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ及び過酸化水素検出試薬組成物を含むクレアチニン測
定試薬組成物の全成分又は一部の成分が含有されており
、さらにクレアチンを基質とするが過酸化水素を生成し
ない酵素を含む試薬組成物を含有するクレアチン除去層
を前記試薬層より上側に有することを特徴とするクレア
チニン分析用一体型多層分析要素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22965189A JPH0391495A (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | クレアチニン分析用一体型多層分析要素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22965189A JPH0391495A (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | クレアチニン分析用一体型多層分析要素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0391495A true JPH0391495A (ja) | 1991-04-17 |
Family
ID=16895539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22965189A Pending JPH0391495A (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | クレアチニン分析用一体型多層分析要素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0391495A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012235771A (ja) * | 2011-04-28 | 2012-12-06 | Arkray Inc | クレアチニン測定用乾式試験片及びクレアチニン測定法 |
-
1989
- 1989-09-05 JP JP22965189A patent/JPH0391495A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012235771A (ja) * | 2011-04-28 | 2012-12-06 | Arkray Inc | クレアチニン測定用乾式試験片及びクレアチニン測定法 |
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