JPH0362433B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液中の有害成分を除去した血漿の
製造方法、さらに詳しくは、リポ蛋白、特に低密
度リポ蛋白（LDL）を選択的に吸着除去した血
漿の製造方法に関する。 （従来の技術と課題） 血液中に存在するリポ蛋白のうちLDLはコレ
ステロールを多く含み、動脈硬化の原因となるこ
とが知られている。とりわけ家族性高脂血症等の
高コレステロール症では正常値の数倍のLDL値
を示し、冠動脈の硬化等をひきおこす。この治療
のため、血中LDLの低下を目的として食事療法、
プロブコール、コレスチラミン等の薬物療法が行
なわれているが効果に限界があり、副作用も懸念
されている。特に家族性高脂血症に対しては患者
の血漿を分離した後、正常血漿あるいはアルブミ
ン等を成分とする補液と交換する、いわゆる血漿
交換療法が現在のところほぼ唯一の効果的な治療
法である。しかしながら周知のごとく血漿交換療
法は、(1)高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用い
る必要がある、(2)肝炎ビールス等の感染のおそれ
がある、(3)有害成分のみでなく有用成分も同時に
除去してしまう等の欠点を有する。これらの欠点
を解消する目的で膜による有害成分の除去が試み
られているが、選択性の点で満足できるものはい
まだ得られていない。また同じ目的で抗原、抗体
等を固定した、いわゆる免疫吸着体を用いる試み
がなされており、これは選択性の点ではほぼ満足
できるものの、用いる抗原、抗体の入手が困難か
つ高価であるという致命的な欠点を有する。 さらには有害成分に親和性を有する化合物（い
わゆるリガンド）を固定した、いわゆるアフイニ
テイークロマトグラフの原理による吸着体も試み
られている。これに用いるリガンドは比較的安価
で、選択性も比較的よく好都合であるが、担体に
アガロースに代表されるソフトゲルを用いている
ため、カラムに充填した場合に十分な流量を得る
のが困難であつた。すなわち近年発達した体外循
環回路を用いた血液、血漿かん流療法（いわゆる
プラズマフエレーシス等）にこれらの吸着体を用
いようとすれば、高流量を得るためにカラム形状
に特別の工夫を要し、またしばしば詰りを生ずる
ため予備のカラムを用意しておく必要があるなど
問題点が多く、安定して治療を行なえる状況には
到つていない。吸着体の流れ特性を向上させるた
めには機械強度の大きい担体を用いればよいのは
明白であるが、これらの担体を用いるとアガロー
ス等のソフトゲルに比べて吸着能力が低下するこ
とが知られている。 一方、硫酸化多糖等のポリアニオン化合物がリ
ポ蛋白と親和性を持ち、金属イオンの共存下で沈
殿を形成することが知られており〔例えばM.
Burnstein and H.R.Scholnick.Adv.in Lipid、
Res.、11、67（1973）〕、臨床分析等に用いられて
いる。しかしながらこの方法で患者の血中から
LDLを除去しようとすれば、処理しようとする
血漿に対し少くとも0.05％のポリアニオン化合物
および0.02M以上の金属イオンを添加しなければ
ならず、また生じた沈殿を遠心分離等の方法で分
離する必要が生じ、操作が煩雑で危険性が高く、
事実上適用不可能であつた。 （課題解決のための手段） 本発明者らは鋭意研究の結果、特定のポーラス
ポリマーハードゲルを用い、これにリポ蛋白に親
和性を有するポリアニオン化合物を固定すること
により、安価で流れ特性がよく、かつソフトゲル
を担体に用いた場合に比し吸着能力が低下しな
い、除去能力に優れたリポ蛋白吸着体を得、これ
を用いてリポ蛋白を除去した血漿を製造し、本発
明に到達した。 すなわち本発明は、球状蛋白質の排除限界分子
量が100万以上１億以下のポーラスポリマーハー
ドゲルにリポ蛋白に親和性を有するポリアニオン
化合物を固定してなるリポ蛋白吸着体をカラムに
充填し、血液から分離した血漿を該カラムに通す
ことを特徴とするリポ蛋白を除去した血漿の製造
方法を要旨とする。 以下詳細に本発明を説明する。 本発明に用いるに適した吸着体の担体は、(1)耐
圧性であること、(2)比較的大きな径の細孔を有す
ることが必要であり、ポリマーハードゲルは本発
明に最も適した担体である。 ここでいうハードゲルとは、デキストラン、ア
ガロース、アクリルアミド等のソフトゲルに比べ
溶媒による膨潤が少なく、また圧力により変形し
にくいゲルのことをいう。ハードゲルとソフトゲ
ルは次の方法により区別することができる。すな
わち後記参考例に示したごとくゲルを円筒状カラ
ムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損
失と流量の関係が、ハードゲルではほぼ直線とな
るのに対し、ソフトゲルでは圧力がある点を越え
るとゲルが変形し圧密化して流量が増加しなくな
る。本発明では後記参考例に示したカラムを用い
た場合、少くとも0.3Kg／cm²まで上記直線関係の
あるものをハードゲルと称する。 次に要求される性質は比較的大きな径の細孔を
有することである。すなわちLDLは分子量が少
くとも100万以上といわれる巨大分子であり、こ
れを吸着除去するためにはLDLが細孔内に侵入
できることが必要である。 次にLDLが細孔内に侵入できても、細孔内に
侵入する確率がある程度大きくなければ吸着体と
しての性能は低い、すなわち移動相と固定相（細
孔内）間の分配比（固定相の濃度／移動相の濃
度）が大きいほど好ましいと考えられる。従つて
細孔径が大きい程有利と思われる。 細孔径の測定法には種々あり、水銀圧入法が最
もよく用いられているが、ポリマーハードゲルの
場合には適用できないことがある。したがつて細
孔径の目安として排除限界分子量を用いるのが適
当である。排除限界分子量とは成書（例えば波多
野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラ
フ、化学同人）等に述べられているごとく、ゲル
浸透クロマトグラフイーにおいて細孔内に侵入で
きない（排除される）分子のうち最も小さい分子
量をもつものの分子量をいう。現象的には、排除
限界分子量以上の分子は移動相体積Vo近傍に溶
出されることから、種々の分子量の化合物を用い
て溶出体積との関係を調べれば排除限界分子量を
求めることができる。排除限界分子量は対象とす
る化合物の種類により異なることが知られてお
り、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチ
レングリコール等についてよく調べられている
が、リポ蛋白についてはほとんど調べられていな
い。従つて最も類似している球状蛋白質（ビール
スを含む）を用いて得られた値を用いるのが適当
である。 排除限界の異なる種々の担体を用いて検討した
結果、予想に反し排除限界分子量がLDLの分子
量より小さい100万程度のものである程度のLDL
吸着能を示し、また細孔径の大きいもの程能力が
大きいわけではなく、むしろLDL以外の蛋白が
除去されることから最適な細孔径の範囲が存在す
ることが明らかになつた。すなわち100万未満の
排除限界分子量を持つ担体を用いた場合はLDL
の除去量は小さく実用に耐えないが、排除限界分
子量が100万乃至数百万とLDLの分子量に近い担
体でも、ある程度実用に供しうる吸着体が得られ
る。一方排除限界分子量とLDLの吸着量、およ
びLDL以外の蛋白質の吸着（いわゆる非特異吸
着）との関係を調べると、排除限界分子量が大き
くなるにつれLDLの吸着量が増加するが、この
増加は排除限界が1000万を越えると頭打ちとな
り、一方LDL以外の蛋白、例えばLGG、IGM等
の吸着が目立つようになることがわかつた。さら
に排除限界分子量が１億をこえるとリガンドの固
定化量が減少して結果的にLDLの吸着量が減り、
非特異吸着が無視できなくなる。従つて本発明に
用いる担体の好ましい排除限界分子量は100万以
上１億以下であり、最も好ましくは300万以上
7000万以上である。 次に担体の多孔構造については表面多孔性より
も全多孔性が好ましく、空孔容積が20％以上であ
ることが好ましい。担体の形状は、粒状、繊維
状、膜状、ホローフアイバー状等任意の形状を選
ぶことができる。粒子状の担体を用いる場合、そ
の粒子径は1μ以上5000μ以下であるのが望まし
い。 さらに担体表面には固定化反応に用い得る官能
基あるいは容易に活性化し得る官能基が存在して
いると好都合である。これらの官能基の代表例と
しては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基、チオール基、酸無水物基、サクシニルイミ
ド基、塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポキ
シ基等があげられる。 本発明に適したポリマーハードゲルの代表例と
しては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、
架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋されたビニルエーテル−無水マレイン酸
共重合体、架橋されたスチレン−無水マレイン酸
共重合体、架橋ポリアミド等の合成高分子の硬質
多孔体、およびこれらの表面に多糖類、合成高分
子等をコーテイングしたもの等があげられるが、
これらに限定されるわけではない。これらのポリ
マーハードゲルは単独で用いてもよいし２種類以
上混合して用いてもよい。 本発明に用いるに適したリポ蛋白に親和性を有
するポリアニオン化合物の代表例としては、ヘパ
リン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、
コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン酸、ケラタン
硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸、カロニン
硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キトサン硫
酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫
酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カ
ラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫
酸、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫
酸、メペサルフエート等の硫酸化多糖、リンタン
グステン酸、ポリ硫酸化アネトール、ポリビニル
アルコール硫酸、ポリリン酸等があげられる。最
も好ましい例としては、ヘパリン、デキストラン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸があげられる。 リポ蛋白に親和性を有する化合物（リガンド）
を担体に固定する方法としては既知の種々の方法
を用いることができる。すなわち物理的吸着法、
イオン結合性、共有結合法等である。本発明に用
いる吸着体は、滅菌時等にリガンドが脱離しない
ことが重要であるので結合の強固な共有結合法が
望ましく、イオン結合法を用いるにしてもリガン
ドを共有結合的に架橋しておくことが望ましい。
また必要によりスペーサーを担体とリガンドの間
に導入してもよい。 リガンドの固定化量については、リガンドの性
状、活性により異なるが、有意のリポ蛋白吸着量
を得るにはカラム体積１mlあたり0.02mg以上が好
ましく、また経済性を考慮すると100mg以下が望
ましい。さらに好ましくはカラム体積１mlあたり
0.5mg以上20mg以下である。 本発明において、リポ蛋白を除去した血漿の製
造を行うには、先ず血液から血漿を分離した後、
血漿をカラムに通すのがよい。 本発明の如く吸着体を用いてLDLを除去する
際、処理しようとする血漿に多価金属イオンを添
加することにより除去効率、選択性を向上させる
ことが可能である。この目的に用いる多価金属イ
オンとしては、カルシウム、マグネシウム、バリ
ウム、ストロチウム等のアルカリ土類金属イオ
ン、アルミニウム等の属元素イオン、マンガン
等の属元素イオン、コバルト等の元素イオン
等があげられる。 （実施例） 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明す
る。 参考例 両端に孔径15μｍのフイルターを装着したガラ
ス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）に、
ソフトゲルとしてアガロースゲル（Biorad社製
Biogel A5ｍ、粒径50〜100メツシユ）、ポリマー
ハードゲルとして東洋曹達工業(株)製トヨパール
HW65（粒径50〜100μｍ）を、それぞれ均一に充
填し、ペリスタテイツクポンプにより水を流し、
流量と圧力損失の関係を求めた。結果を図１に示
す。それによるとポリマーハードゲルが圧力の増
加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、アガ
ロースゲルは圧密化をひきおこし圧力を増加させ
ても流量が増加しないことを示している。 実施例 １ 架橋アクリレートゲル（全多孔性のハードゲ
ル）であるトヨパールHW55〔球状蛋白質の排除
限界分子量（以下、蛋白質の排除限界と略称す
る）700000、粒径50〜100μｍ〕、同HW60（蛋白質
の排除限界1000000、粒径50〜100μｍ）、同HW65
（蛋白質の排除限界5000000、粒径50〜100μｍ）、
同HW75（蛋白質の排除限界50000000、粒径50〜
100μｍ）各10mlに飽和NaOH水溶液６ml、エピ
クロルヒドリン15mlを加え攪拌しながら50℃で２
時間反応しエポキシ化ゲルを得た。このゲルに濃
アンモニア水20mlを加え50℃で２時間攪拌しアミ
ノ基を導入した。 次にヘパリン200mgを10mlの水に溶解しPH4.5に
調整した後、これに３mlの上記アミノ基含有ゲル
を加えた。これに１−エチル−３−（ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド200mgをPHを4.5
に保ちながら添加し４℃で24時間振とうした。反
応終了後、２モル食塩溶液、0.5モル食塩溶液、
水で洗浄しヘパリン固定化ゲルを得た。固定化さ
れたヘパリンの量はそれぞれ2.2mg／ml、1.8mg／
ml、1.4mg／ml、0.8mg／mlであつた。 実施例 ２ ヘパリンをコンドロイチンポリ硫酸にかえた他
は実施例１と同じ方法でコンドロイチンポリ硫酸
固定化トヨパールゲルHW65を得た。固定化量は
1.2mg／mlであつた。 実施例 ３ 実施例１〜２で合成した吸着体各１mlを試験管
にとり、これに人血漿３ml（CaCl₂0.02M含有）
を加えて攪拌し、20℃で15分間静置後、上澄みの
コレステロール濃度およびLDL（β−リポ蛋白）
量を測定した。結果を表１に示す。 表−１から分かる通り、本発明に使用する吸着
体を用いた場合、リポ蛋白の吸着が良好であり、
従つて上澄みのコレステロール濃度およびLDL
（β−リポ蛋白）が比較例より減少している。 【表】

【図面の簡単な説明】

図１は、参考例の各種ゲルを用いて流速と圧力
損失の関係を調べたグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 球状蛋白質の排除限界分子量が100万以上１
   億以下のポーラスポリマーハードゲルにリポ蛋白
   に親和性を有するポリアニオン化合物を固定して
   なるリポ蛋白吸着体をカラムに充填し、血液から
   分離した血漿を該カラムに通すことを特徴とする
   リポ蛋白を除去した血漿の製造方法。 ２ ポーラスポリマーハードゲルが合成高分子か
   らなる特許請求の範囲第１項記載のリポ蛋白を除
   去した血漿の製造方法。 ３ ポリアニオン化合物が硫酸化多糖である特許
   請求の範囲第１項記載のリポ蛋白を除去した血漿
   の製造方法。 ４ 硫酸化多糖が、ヘパリン、デキストラン硫酸
   およびコンドロイチンポリ硫酸から選ばれる少な
   くとも１種である特許請求の範囲第３項記載のリ
   ポ蛋白を除去した血漿の製造方法。 ５ ポリアニオン化合物の固定化量がカラム体積
   １mlあたり0.02mg以上100mg以下である特許請求
   の範囲第１項記載のリポ蛋白を除去した血漿の製
   造方法。