JPH03502997A - ヒト抗Rh(D)モノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト抗Rh(D)モノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト抗Rh (D)モノクローナル抗体本発明はヒト赤血球のRh (D)抗原
に対するヒトモノクローナル抗体に関する。特に本発明は、D−陽性、“弱D″
又はD 細胞のいずれかにおける正常Rh (D)抗原のみならずRh (D)
抗原の重要な変異体をも検出するために用いられるIgに3サブクラスのこのよ
うな抗体に関する。
いわゆるRh血液型系の抗原の中では、Rh (D)抗原が対応抗体保有患者へ
の輸血後における最も重篤な反応の一部に関与している。Rh (D+)血液を
うけた抗Rh (D)保有Rh (D−)個体はRh (D)表現型不適合のせ
いで実質的赤血球(RBC)破壊をうけやすいことから、ドナー及び受血者の血
液は抗Rh (D)抗体との凝集試験によりRh (D+)又はRh (D−)
としてルーチンに分類される。RBCのRh表現型は普通更にフィッシャー・レ
ース(Flsher−Race)系に基づき定義されるが、これはRh抗原の遺
伝は非常に近接して結合した座で作用する3対の対立遺伝子C−c s D −
d及びE−eで決定されるという仮定に基づいている。この理論によれば、ヒト
は彼の両親の各々から3つのRh遺伝子、即ち(1)C又はc、(2)D又はd
、(3)E又はeの一組を受は継ぐ(d抗原はまだ同定されていないが、但し記
号“d”はD抗原を産生じないD遺伝子と対立する遺伝子の存在を示すために用
いられている)。例えば、Rh (D+)者は片親からCDe及び他方からcd
eを受は継いでいる。イギリス人をフィッシャm−レース系に関して調べた場合
に最も共通するRh遺伝子組合せの割合が、特に言語上用いられる“短記号°と
共に下記第1表で示されている。
第1表
イギリス人に関する共通Rh遺伝子の割合短記号 CDE名
割合(%)r c d e 38.9r
= Cd e O,01何年にもわたる拡大
調査にもかかわらず、フィッシャー・レース系はRh系で観察されたすべての反
応を説明する上で十分ではなかった〔モリソン、 P、 L、 。
1983年、臨床医学における輸血、第7版、ブラックウェル・サイエンティフ
ィック、オックスフォード(Mo111son、P、L、、(1983) Bl
ood Transfuslon InC11n1cal Medlcine、
7th edn、、Blackvell 5cient1f1c。
0xford) )。それにもかかわらず、世界保健機構では単純性及び画一性
の理由からこの命名法が世界的に採用されるべきであると推奨してきたため、以
下で示されるすべてのRh遺伝子型は慣用的フィッシャー・レース系に基づき定
義される。
RBCのRh型判定に関する抗Rh (D)抗体の必要性に加えて、このような
抗体は新生児溶血症(HDN)を防止するためRh (D−)母親の受動免疫に
とっても非常に必要とされる。この症状は、妊娠中胎盤を通過して胎児RBC破
壊を引き起こすIgG抗Rh (D)抗体に起因してRh (D)抗原に既に感
作されたRh (D−)母親の新生Rh (D+)児で生じる。Rh (D)抗
原によるRh (D−)母親の感作は、母親の循環に入って母親の免疫系により
認識されるある胎児RBCのせいで第−Rh (D+)子の誕生時に生じたので
あろう。HDNの発生率を低下させるため、母親の循環に入ったいがなるRh(
I)+)RBCも速やかに除去されるようRh(D+)児の誕生直後Rh (D
−)母親に抗Rh (D)抗体を投与することがイギリス及び他の多数の国にお
けるルーチン的実務である〔モリソン、 P、 L、 。
1983年、前掲;レーロスやジュニア、 R,K。
(Laros Jr、、R,に、)、 1986年、 “妊娠中の血液型疾患
2中における″胎児赤芽球症°、第7章、第103頁〕。
現在、RBCのRh型判定及びRh (D−)母親の受動免疫の双方における使
用のための抗Rh (D)抗体は、妊娠中に免疫された女性ドナーから又は免疫
された男性ボランティアから直接主に得ている。しかしながら、Rh (D−)
女性へのヒト抗Rh (D)免疫グロブリンの産後予防投与プログラムの成功で
、自然アロ免疫女性の数に関し著しい減少を招いた〔アーバニアック、S。
Jl、 “新生児のRhD溶血症:変化する状況°、プリテッシュ・メディシナ
ル・ジャーナル、1985年。
第291巻、第4−6頁(tlrbanlak 、S、J、。
“RhD haemolytlc disease of the newbo
rn:thechanging 5cene”、Br1tish Medici
nal Journal(1985)291.4−6))。更に、Rh (D+
)RBCによる個体の意図的な免疫には、いかなるRBC輸血をうけた場合にも
共通するリスク、例えば肝炎ウィルス及びHIVの移入のリスクを伴う。したが
って、診断及び治療双方の目的のためヒトモノクローナル抗Rh (D)抗体を
得ることに多大な関心が集まっているのである。
上記のようにルーチンの血液試験において、血液型は抗Rh (D)の凝集試験
で示されるようにRBC上のRh (D)抗原の見掛上の存在又は非存在に基づ
きRh(D+)及びRh (D−)に分けられる。しかしながら、見掛上Rh
(D−)血液を有するヒトの少数は、このようなルーチン試験において抗Rh
(D)により直接凝集されないが、D型判定試験が選択された抗Rh (D)試
薬を用いて間接的抗グロブリン試験で実施された場合には反応するRBCを有し
ている。こうして同定された細胞はD と表示される。D 表現型の割合は全体
で約0.2%、コーカサス人中0.6%及び全Rh (D−)妊娠女性巾約1.
5%である。少なくとも3つの異なるメカニズム、即ち(1)完全Rh (D)
抗原の一部の遺伝的欠如、(2))ランス位置におけるCによるDの抑制に関す
る遺伝子相互作用及び(3)弱抗原を産生ずるD遺伝子が、D 表現型の発現に
関与しているのであろう。
1950年代初期、Rh (D+)血液の輸血後又はRh (D+)児を出産し
た妊娠の後、D 表現型の個体における抗Rh (D)の存在に関する報告が最
初にみられた。血液がRh (D+)に分類された一部の個体においてRh (
D)抗原の一部がRBCから欠落していることが、その後明らかになった。輸血
又は妊娠により完全Rh (D)抗原を有するRh (D+)RBCと接触され
た場合、不完全Rh (D)抗原をRBC上に有するヒトは彼等が欠如するRh
(D)抗原部分に対するアロ抗りを産生ずることができる。このような個体の
血液は、RBCがルーチン抗Rh (D)試薬と直接反応する場合にはD変異体
と呼ばれ又は細胞が間接的抗グロブリン技術でのみ反応する場合にはD 変異体
と呼ばれる。
Rh (D+)RBCを有する患者でアロ抗Rh (D)が産生されるという観
察から、用語“Dモザイク”の共通の用法としてその完全天然型のRh (D)
抗原を表すようになった。ルーチン抗Rh (D)試薬では、Dモザイクの一部
を欠<RBCをすべてのD成分を有するRBCから通常区別しえない。D変異体
表現型はチベツ) (Ttppett)及びサンガー(Sanger) (ボッ
クス・サング(Vox、Sang)、 1962年、第7巻、第9−13頁〕
により類別された。この系はD−及びDu変異体個体からのRBC及び血清の相
互作用に基づいている。6つのカテゴリー(下記第■表参照)に大別され、小分
類がカテゴリー■、■及びVで既に認められている。カテゴリー1及び■は、そ
れらが現在単一のサブグループとして通常考えられるほど多数の類似性を有する
ことが判明した。
第■表
抗Rh (D)のD−又はDu陽性血液に関するチベット及びサンガーカテゴリ
ー1 白人 DCe■
Ha 黒人
mb 通常黒人 Dceme 白人
IVa 大部分黒人、一部白人IVb 白人
DceVa 黒人及び白人
vb 白人 DuCeVc 黒人及
び白人
■ はぼすべて白人 D’Ce一方、さほど用いられない
が、ウィーナ−(Wlener)に゛よる分類ではローマ数字の代わりに文字A
、B、C,Dを用いている。2つの系間に直接の相互関係はないが、DB及びD
VKは互換性があると通常考えられる。
人口中におけるD及びDu変異体個体の割合は比較的低いけれども、輸血又は妊
娠による非変異体Rh CD+)細胞との接触のせいで現実的な抗Rh (D)
形成のリスクを潜在的に有するこれら血液型の個体の総数は決して微々たるもの
ではない。更にRh (D+)又はD 児を生んだRh CD−)女性に加えて
、Rh (D+)児を生んだDu変異体女性もHDNのリスクを低下させるため
産後抗Rh (D)治療から利益を得るであろう〔ホワイト、 C,A、 ら
、1983年、アメリカン拳ジャーナル・オブ・オブステトリカル・ギネコロジ
ー、第145巻。
第1069−1073頁(White、C,^、et al、(1983)^m
erican Journal of 0bstetrical Gyneco
logy、145゜1069−1073)] 、 D及ヒD u変i体RB C
ヲ区別L ウZ抗血清は広く入手しえない。したがって、D及びD 変異体RB
Cに関しである範囲の結合特異性を有する抗Rh(D)モノクローナル抗体の供
給は、このような細胞を有する個体(特に予防的抗Rh (D)治療の適切な候
補者であるD又はDu変異体妊娠女性)の更に容易な確認及び類別化を可能にし
並びにRh (D)抗原複合体に関する構造情報を更に得る上で有用とみられる
。
ヒトモノクローナル抗Rh (D)抗体産生は既に=Cり抗Rh (D)陽性ド
ナーのBリンパ球に由来するエプスタイン・バール(Epstein Barr
)ウィルス形質転換ロリンパ球細胞系(以下、EBV形質転換LCLと称される
)を直接クローニングする〔英国特許出願第2127434号明細書;クロフォ
ードら、1983年、ランセット、第1@、第386−388頁(Cravfo
rd etal、(1983) Lancet、1.388−388) ;及
びベアーら。
1986年、イムノロジー・レターズ、第13巻。
第137−141頁(Paire etal、(1988) 1mtaunoI
ogyLetters、 13.137−141)参照〕 ;(b)抗Rh (
D)産生EBV形質転換LCLをマウス、マウス−ヒト又はヒトミエローマ細胞
系と融合させて形成されるハイブリドーマ細胞系をクローニングする〔同時係属
英国特許出願第8709748号明細書;トンプソン(Thompson)ら、
1986年、イムノロジー、第58巻、第157−160頁;及び欧州特許出願
第162918号明細書参照〕 :又は
(C)ヒトL、CLと免疫B細胞との融合〔ローウニ(Love)ら、1986
年、ボックス・サング、第51巻。
第212−216頁〕 ;
により達成された。
しかしながら抗Rh (D)陽性ドナーからのEBV形質転換LCLをクローニ
ングすることにより、我々は以前に開示されたいずれの抗Rh (D)モノクロ
ーナル抗体試薬の場合でも示されていない特に有用な結合特異性スペクトルを有
するIgGクラスのモノクローナル抗Rh (D)抗体を得ることができた。
本発明によれば、我々は下記の本質的特徴:(a)Rh血液型系のCSc、、E
又はe抗原ではなくRh (D)抗原に対して活性を示す;(b)I gG3タ
ンパク質である;
(c)にL鎖を有する;
(d)アロタイプ03m (21)に属する;(e)間接的抗グロブリン試験で
v u m胞に対して活性を示す;
VV
(f)D、D 及びDTar変異抗原に対して活性を示す;及び
■
(g)D 又はDB変異抗原に対して不活性である;を有するヒトモノクローナ
ル抗体及びその抗原結合性断片を提供する。
しかも本発明のモノクローナル抗体はiN抗原に対して活性を示すことがわかっ
た。
このようなモノクローナル抗体は、RBCをD陽性、Du又はD陰性に分類しう
るルーチン抗DgNとして使用可能である。この目的のため、本発明のモノクロ
ーナル抗体は単独で、又は1以上の付加的結合特異性を有する更に1種以上の抗
Rh (D)モノクローナル抗体と共に、のいずれでも用いることができる。こ
のため例えば本発明のモノクローナル抗体は、D■変異RBCをD陽性として分
類しうる更に広い特異性のある抗Rh (D)試薬を得るためDvI変異体と結
合しうる更にもう1種のモノクローナル抗体と混合されることが有利であろう。
このような抗Rh (D)試薬にお゛いて、本発明のIgG1抗体は、例えば英
国特許出願第8722020号の優先権を主張する本出願と同日付の我々の同時
係属国際特許出願中で開示されたタイプの下記結合特徴を有するIgG1モノク
ローナル抗体と混合される:(a)Rh血液型系のC,c、E又はe抗原ではな
くRh (D)抗原に対して活性を示す;V Tar VI B
(b)D SD 、D 及びD 変異抗原に対して活性を示す;及び
(c)IAG試験において非パパイン処理り■細胞と実質上非反応性である。
このような抗体の中では、本発明の抗Rh (D)モノクローナル抗体と共に使
用する上で、イギリス、ポートン・ダウン(Porton Dowrt)のヨー
ロピアン・コレクション争オブ・アニマル拳セル・カルチャーズ(Europe
anCollectlon or Animal Ce1l Cu1tures
)に受理魔ECACC86091603号として1987年9月16日付で寄託
されたB7と称されるモノクローナル抗体が特に好ましい。
本発明のモノクローナル抗体がD9変異体に対して反応性の抗Rh (D) 、
例えば適切なポリクローナル抗Rh (D)血清と共にRh型判定に用いられる
場合において、後者に関する凝集試験で陽性結果を示すが但し本発明のモノクロ
ーナル抗体に関して陰性結果を示す血液サンプルは主に又は完全にD■カテゴリ
ーに属すると予測することができる(これは新規モノクローナル抗体が不活性な
事実上唯一のD変異抗原であるためである)。
慣用的凝集試験でRh (D+)又はDuとして分類されるが但し抗りを産生し
うる個体の中では、高率でDvr変異抗原を有することが確立されていた〔モリ
ソン、P。
L、、1983年、 “臨床医学における輸血″、第8章。
第339頁〕。そのため本発明のモノクローナル抗体の一使用例は、人口中にお
けるDVl型個体の発生率を研究することである。
本発明のモノクローナル抗体は、抗Du活性のない又は非常に弱い、即ち慣用的
凝集試験でDu細胞をD陰性細胞から信頼性をもって区別しつるにはこのような
細胞に対して不十分な活性である抗Rh (D)の特異性を補うため抗Rh (
D)型判定試薬における使用にとっても特に価値がある。実際に、米国規制市販
抗Rh (D)型判定試薬に関する食品医薬品局(FDA)の規制下では、この
ような試薬はD RBCを真のD陰性RBCから区別しうることが要求されて
いる。本発明の組合せ抗Rh(D)試薬の中では、本発明のIgG抗Rh (D
)が非常に弱いD 活性のIgM抗Rh (D) 、例えば特に欧州特許出願公
開第251440号明細書の主題をなす寄託されたハイブリドーマ細胞系MAD
−2(ECACC86041803号)及びFOM−1(ECACC87021
301号)のモノクローナルIgMから選択されるIgMモノクローナル抗Rh
CD)と共に用いられた上記条件を満足するこのような試薬が特に好ましい。
このような試薬は間接的抗グロブリン試験でDu赤血球との活性を個別的に示す
更に少なくとも1種のIgGモノクローナル抗Rh (D)抗体で更に補充され
ることが有利であり、その結果混合試薬は同一の試験でDu、DIV、DV及び
D9細胞と反応するようになる。Rh型判定がこのような試薬で行われる場合、
D陽性細胞は最初にIgM抗Rh (D)で直接凝集される。次いで残りの非凝
集細胞(見掛上り陰性)は間接的抗グロブリン試験用の慣用的クームス(Coo
Ilb’s)試薬の添加により真のD陰性及びD 細胞に分けられるが、その場
合IgG抗体に結合するDu細胞は凝集されるため区別される。
本発明のモノクローナル抗Rh (D)抗体は、モノクローナル抗体の産生に関
して公知の常法により、特に、必要な抗体に関する上記特徴を有した抗Rh (
D)免疫グロブリンの分泌に基づき選択されるEBV形質転換ヒトBリンパ球の
培養により得ることができる。こうして得られた培養上澄は、本発明の特徴を有
している。
我々は上記のようなIgG3抗Rh (D)モノクローナル抗体を産生ずるクロ
ーニングされたEBV形質転換LCL5つについて今や詳細に研究した。これら
は以下でA4、A5、A6、A7及びA8と称される。これらすべてのクローニ
ングされた細胞系は、選択された抗Rh (D) ドナーの末梢Bリンパ球か
ら出発し、所望の特異性をもつモノクローナル抗体を産生ずるEBV形質転換L
CLを確立しかつクローニングするため英国特許出願第2145113号明細書
で記載された操作又は実質上同様の操作を用いることにより得た(例1参照)。
10%(V/Vン無マイコプラズマ牛脂児血清、0. 2mg/mlアルギニン
及びマイコプラズマ増殖を予防する抗生物−質で補充されたRPM11640培
地を用いた連続培養において、それらは高度に安定であって、RIRl(CD
e / CD e ) RB Cに対する低イオン強度塩水中での間接的抗グロ
ブリン(IAG)アッセイにより測定した場合に2000〜16000の範囲内
の抗Rh (D)力価を有する培養上澄を生じることが見出された。このような
培養上澄は濃縮必要性のないRh型判定での使用に適しているが、実際には使用
上希釈してもよい。
連続培養における上記具体的クローンの抗体産生特徴は、上記第ma及びmb表
で要約されている。これらすべてのクローンは、少なくとも8ケ月間にわたる連
続培養で安定な力価を維持しうることか示された。IAG試験における凝集の程
度は、常法に従いスケール0〜6に等級分けされた。
第Ha表
IAG力価(低イオン強度塩水中3%RBC)R1r細胞
84−258RIR1細胞 2000
−18000R1r細胞 32−258プロメ
ライン処理R2R2細胞の微量滴定 gooo〜18000抗Rh (D)
(IU/ml) 2−12−12Iμg/ml)
1.1−2.8第mb表
A4 A5 A6 A7 A8培養上澄 低イオン強度塩水中3
%RBCに対する上澄のIAG反応性(等級:0〜6)
赤血球表現型
RIRl6 6 6 6 5
試験された本発明のモノクローナル抗体は表現型R2r G−1hr8−1RI
R2及びR2R2のRBCと反応するが、但しr″Gr、r”s rG%r −
sr。
hr−1rr及びRh33+とは陰性であることが更に判明した。
本発明の更にもう1つの面によれば、我々は本発明のモノクローナル抗Rh (
D)免疫グロブリンの水性溶液が用いられるRBCのRh型判定法を提供する。
モノクローナル免疫グロブリンは、直接又はより一般的には希釈後用いられる培
養上澄中に含有されることが好ましい。
前記のように、本発明のI gG3抗体を異なる特異性の抗Rh (D)モノク
ロ−六ル抗体の1種以上、例えば更に抗DVI活性を存するIgG抗体と混合す
ることが望ましい。適切な希釈剤としては、有利には牛血清アルブミン及びツイ
ーン(Twee口)80又はメチルセルロースのような界面活性剤又は懸濁化剤
を含有した生理塩水又はリン酸緩衝液がある。
本発明のIgG3抗Rh (D)抗体は単球及びマクロファージによるRh (
D+)RBC結合及び食作用の優れた促進剤であって、このためHDN予防用の
有効な予防抗り治療剤を提供するという観点からも大きな関心がある。実際に、
細胞系A4及びA5の培養上澄はインビトロアッセイにおいて慣用的ポリクロー
ナル抗Rh (D)血清よりもU937単球による感作RBCのロゼツト化及び
食作用を更に高度に誘導することが判明した。しかも同様の培養上澄は、γ−イ
ンターフェロン刺激単球由来培養マクロファージに対する感作RBCの結合を媒
介する上で慣用的ポリクローナル抗Rh (D)血清に匹敵する(例1のセクシ
ョン(3)及び(4)参照)。
このため本発明のもう1つの面によれば、我々はRh(D)抗原に対する母親の
感作を防止するためRh(D+) 児の誕生後Rh (D−) 、D又G;LD
u変異体母親の受動免疫用に本発明のモノクローナルI gG3抗体を提供する
。ヒト注射用のかかる抗体の無菌溶液は、いずれかの生理学上許容される水性媒
体、例えば等張リン酸緩衝液又は血清で処方される。一方、抗体は使用前に再調
整される凍結乾燥処方剤として供給してもよい。
HDNの予防用として高度に有効な予防製剤を提供するため、本発明のモノクロ
ーナル抗Rh (D)は更に1種以上の抗Rh (D)抗体と共に用いられる。
ルーチン使用のためには、抗DVI抗体が含有されていることが望ましい。本発
明の抗体は、その内容が参考のため本明細書に組込まれる英国特許出願第872
2018号の優先権を主張した本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願に
おけるIgG1抗Rh (D)モノクローナル抗体を補助する予防製剤としての
用途も有する。
上記のクローニングされたEBV形質転換リンす球細胞系A7は、イギリス、ボ
ートン・ダウンのヨーロピアン−コレクション中オブーアニマル・セルーカルチ
ャーズに受理ThECACC86091606号として1987年9月16日付
で寄託された。
この寄託細胞系の産生及びその連続培養上澄の同定特徴に関する詳細は、下記非
制限例の例1で示されている。
例1
(D+)児を生んだ)中に免疫され、分娩4年後にパック詰めRh (D +
) (R2r ) RB CO−5mlで追加免疫され及び追加免疫の8日後
に彼女の血清抗Dレベルが60IU/mlになったとき得られた末梢血液サンプ
ルで追加免疫された女性。
(b)細胞系の確立
ドナーAの末梢血単核細胞をリンホプレブ(Lywphoprep) Cニエガ
ード社(Nyegaard and Co、))で分離し、EBV (濾過され
た無マイコプラズマB95−8細胞系からの培養上澄1ml/107細胞)の存
在下37℃で1時間インキュベートし、リン酸緩衝液(P B S)で洗浄した
。一部を、1%(V/V)フィトヘマグルチニン(PHA)又は0.5μg/m
lシクロスポリンA(CsA)のいずれかで補充されたリンパ芽球細胞培地〔1
0%(v/v)無マイコプラズマ牛脂児血清(F CS)、0、 21g/ml
アルギニン、100Iυ/ mlペニシリン(グラクツ(Glaxo) ) 、
50μg/mlストレプトマイシン(グラクツ) 、2510/mlポリミキシ
ン(グラクツ)、25μg/mlカナマイシン(ギブコ(Glbco) )、2
0 ul /mlフンギシン(スクイブ(Squibb))、25μg/ml硫
酸ゲンタマイシン(シグマ(Slgma) )及び20μg/mlトoビシン(
アップジョン(UpJohn))を含有したRPM11640培地〕を用いマウ
ス腹膜マクロファージ供給細胞層上で2mlウェル中0.5X106細胞/ m
lで培養した。
次いで、すべての培養物を5%CO2,95%湿空気中37℃でインキュベート
した。培地変更を3〜4日毎に行い、3週間の培養後細胞を50m1フラスコに
移した。
すべての細胞系を3〜4週間週間口ゼツト化することにより豊富化させた。
(c)クローニング
細胞をマウス腹膜マクロファージの供給細胞層上平底96ウエルプレート中5及
び10細胞/ウエルで限定希釈下培養した〔ドイルら、1985年、ヒユーマン
・イムノロジー、第13巻、第199−209頁(Doyle etal、(1
985) Husan I+nuno1ogy、13.199−209>) o
培養物に1週間1回基質添加したところ、3〜4週間後抗りに陽性のクローニン
グ細胞が生じた。
(d)クローンの誘導
クローンA4を生じるドナーAポリクローナル細胞系をPHAで開始し、続いて
クローニング前に13回ロゼツト化することにより抗Rh (D)陽性細胞につ
いて豊富化させた。
1 gGBサブクラスの抗Rh (D)抗体を産生する更に4つのクローン(A
5、A6、A7及びA8と称される)は、クローンA4のBリンパ球から誘導さ
れた。
クローンA5、A6及びA7は優先権出願(英国特許出願公開第8722019
号)で各々B4、B5及びB6と誤記された。上記選択細胞系の組織型及び核型
分析の結果は、上記第■表で示されている。
第■表
細胞系 A5 A6 A7 A8性別
女性
組織型
HLA : A 2.v198 44.35
D R3,5
核型
性染色体 xx
倍数性 一部二倍体細胞、一部四倍体細胞上澄中における抗Rh (D)活
性は、オートアナライザーでイギリスナショナルスタンダードに対して定量され
た。少なくとも2回の測定平均が計算された。IgGの定量的評価は、ELIS
A (ウェイクツイールドら。
クリ二カ・キミ力・アクタ、1982年、第123巻。
第303−310頁(νakefield et al、、cIinlcaCh
imlca Acta(1982) 123.303−310>の方法の修正〕
により各上澄毎に少なくとも8回の測定で行われた。コーティング抗体〔アフィ
ニティー精製ヤギ抗ヒトIgG(シグマ)〕をpH9,6の0.05M炭酸緩衝
液中1/200で用いた。上澄及びスタンダード〔精製ヒトIgG(シグマ)〕
をRPM、11640+10%FC5で希釈した。ペルオキシダーゼ複合化ヤギ
抗ヒトIgG(シグマ)をPBS+0.05%ツイーン20で11500希釈し
たが、基質はTMB (3,3−,5,5−−テトラメチルベンジジン)であっ
た。
異なる実験条件下で確立されたすべての細胞系が安定な抗体産生を示したのでは
なかった。しかしながら、その後でクローニングされたすべての細胞系は6月間
以上にわたり高力価(微jl?fl定で1/33,000以上)の抗Rh (D
)を維持した。これら細胞系からのすべてのクローンは抗Rh (D)に関して
陽性であり、連続培養期間中それらの力価を維持した(例えば、A4の場合2年
間以上)。倍加時間は3〜7日であっノ;。細胞は抗体産生の低下なしに懸濁培
養物中でよく増殖した。
(f)免疫グロブリンクラス及びサブクラス決定イムノドツトアッセイ 〔マク
ドウガル(McDouga I )ら。
1983年、第63巻、第281−290頁〕がニトロセルロースに吸着された
モノクローナル抗Rh (D)抗体と抗IgG、抗1gM、抗に及び抗λ抗血清
〔セロチック(Serotec) )との反応を調べるため用いられ、陽性ツク
)しかる後4−クロロ−1−ナフトールでの発色により検出した。IgGサブク
ラスは、モノクローナル抗サブクラス抗体〔ユニパス(Unipath) )に
よる抗り被覆RBCの凝集から評価された。
アイコブ(Iseove’s)上澄(無血清)を15%ポリアクリルアミドゲル
上還光条件下で電気泳動に付した〔レムリ、ネーチャー、1970年、第227
巻、第680−685頁(Laemsll、Nature (1970) 22
7,880−685) )−次いで、分離されたタンパク質を電気泳動でニトロ
セルロース膜に移し〔プラネット、アンルズ・オブ・バイオケミストリー、19
81年、第112巻、第195−203頁(Brunette、Annals
or B!ochem1stry (1981)112.195−203
)) 、これを抗IgG抗血清(セロチック)でプローブ処理し、上記のように
検出した。
細胞系A4.A5、A6及びA7のモノクローナル抗体はすべて分子量約61.
000ドルトンのH鎖を有することが判明した。
(h)プロティンA吸着
上澄2ml容量をプロティンAセファロースC1−4B(シグマ)の25+am
(1ml)カラムに2回通し、抗りの吸着を滴定で評価した。選択された細胞系
の抗Rh (D)は、! gG3サブクラスの免疫グロブリンに関して予想され
るようにプロティンAで吸着されなかった。
(i)Gmアロタイプ判定
RBCをモノクローナル抗Rh (D)抗体でコーティングし、凝集をGmアロ
タイプ判定試薬〔バーミンガム(B1 rllngham)又はアムステルダム
(Amsterdam) )で評価した。
(2)血清学
選択された細胞系の連続培養による培養上澄は、低イR1r、Rlr又はRo
r細胞を用いてIAG試験により測定された(第Ha及びmb表参照)。同一の
上澄は同一の条件下でD変異体RBCのパネルに対しても試験された(下記第V
表参照)。凝集の程度は常法に従いスケール0〜5又は0〜6に等級分けされた
。
第7表
IAGによるモノクローナル抗Rh (D)抗体と“部分的″D陽性赤血球との
反応
培養上澄 A4 A5 A6 A7(等級二〇〜5)
バック詰め0RIR2RBC100μgを37℃で60分間にわたり抗D(既に
1μg / mlに調整されている)500μgで感作し、洗浄し、RPMI中
1×108細胞/mlで再懸濁した。U937細胞を対数増殖期に採取し、50
U/mlでγ−インターフェロン〔アマ−ジャム(Asershas))の存在
下又は非存在下のいずれかで2日間培養した。次いで45×106の赤血球を1
.5X106のU937細胞のベレットに加え、混合して30:1の比率にした
。ロゼツト化アッセイの場合、細胞を室温で5分間インキュベートし、600
rpmで3分間遠心し、更に5〜20分間後分間吐血器で試験した。
食作用は細胞を37℃で3時間インキュベートした直後に評価した。結果は1以
上の付着又は貧食された赤血球に関する単球の率として示された。
クローンA4及びA5の培養上澄並びに慣用的ポリクローナル抗Rh (D)血
清に関して得られた結果の比較は、第1及び2図で示されている。クローンA8
の培養上澄で感作された赤血球は、(γ−インターフェロンの非存在下で培養さ
れた場合)0937細胞の100%とロゼツトを形成した。
(4)マクロファージ結合アッセイ
RB C(R2r ) (1容量部)をモノクローナル抗Rh(D)(未処理
培養上澄2容量部)で感作し、単球由来培養マクロファージと共にインキュベー
トした。マクロファージをアッセイにおけるそれらの使用前48時間にわたり組
換え免疫インターフェロン〔ジュネーブのバイオゲン(Biogen)) 50
0 U /mlで刺激した。マクロファージに対するRBCの結合は肉眼で評価
され、マクロファージ結合インデックス(−100のマクロファージに付着した
又はそれで貧食された赤血球の数)として示された。
上記第■表は、クローンA4及びA5の培養上澄に関して得られた結果について
示している。赤血球−マクロファージ相互作用を起こしうるこれら上澄の能力は
、陽性コントロールとして機能するポリクローナル抗Rh(D)の場合と類似し
ていた。
第■表
抗り源 培養上澄 培養上澄 ポリクローナルA4 A5
抗Rh (D)血清クローンA4、A5、A7及びA8の培養上澄をリンパ球抗
体性細胞毒性(ADCC)アッセイで試験した。
等容量(50μg)の標的細胞(クロム51標識RIRIRBC懸濁液)、エフ
ェクター細胞(Kリンノ々球)及び抗Rh (D)培養上澄を穏やかな遠心後マ
イクロプレート中37℃で一夜インキユベートシ、クロム51放出量を測定した
〔アーバニア・ツク、1979年。
プリティシュtジャーナルーオブ・ヘマトロジー。
第42巻、第303−314頁(Urbaniak (1979)Brltls
h Journal or Haesatology、42.303−314)
) oエフエクター二標的細胞の比率は15:1であった。
試験された培養上澄はいずれも有意のADCC活性を示さないことが判明した(
下記第■表参照)。
第■表
モノクロ−A4 A5 A7 A8 抗Rh(D)ナル抗体
血清特異的溶解率%
エフェクターKF −210* 95エフエクターBW 4 0
0 * 92エフエクターTJ * * 本 0
*本測定せず
o t”、 ト、(e 2六r:8fn4t:/s)’16−LF−”P”i’
2ζtt 、i# r: *k1.Et: kフッ’b+’rた”す;ン=補
正書の翻訳文提出書(特許法第184条の8)平成 2 年 3 月 17[1
1、国際出願の表示
PCT/GB 88100756
2、発明の名称
ヒト抗Rh (D)モノクローナル抗体名 称 セントラル、ブラッド、ラ
ボラド1ノーズ、オーソリティー
5、 補正書の提出年月日
1989年 12月 11日
6、 添付書類の目録
(1) 補正書の翻訳文 1 通添附
の「請求の範囲」の補正は第11項が追加されて(穐る旨上申します。
1、明細書第6頁第13〜14行に「6つのカテゴリー」とあるを「7つのカテ
ゴリー」に補正する。
2、同第7頁第■表中rVIJの行の下に「■ 白人
DCe Jを挿入する。
3、 第10頁第5行及び第11頁第5行にr DTar Jとあるを「DvI
」に補正する。
4、第10頁第14〜17行に
「この目的のため、・・・・・・用いることができる。」とあるを
「この目的のため、本発明のモノクローナル抗体は単独で、又は更に1種以上の
抗Rh (D)抗体、好ましくは1以上の付加的結合特異性を有するモノクロー
ナル抗体と共に、のいずれでも用いることができる。」に補正する。
5、第10頁下から第2行〜第11頁第2行に「例えば・・・・・・混合される
:」とあるを「例えば本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願(公開第W
O39/2443号明細書)中で開示されたタイプの下記結合特徴を有するIg
G1モノクローナル抗体と混合される:」に補正する。
6、第17頁第14〜15行に「同時係属国際特許出願における」とあるを「同
時係属国際特許出願(公開第WO39/2442号明細書)における」に補正す
る。
7、第23頁末行に「0〜5又は0〜6」とあるを「0〜6」に補正する。
8、第24頁第V表中「(等級二〇〜5)」及び「Dlar」とあるをそれぞれ
「(等級:0〜6)」及び「DVII」に補正する。
請求の範囲
1、 下記の本質的特徴:
(a)Rh血液型系のC5cSE又はe抗原ではなくRh (D)抗原に対して
活性を示す;(b)IgG3タンパク質である;
(C)にL鎖を有する;
(d)アロタイプ03m (21)に属する;(e)間接的抗グロブリン試験で
Du細胞に対して活性を示す;
(g)D”又はDB変異抗原に対して不活性である;を有するヒトモノクローナ
ル抗体及びその抗原結合性断片。
2、 細胞系ECACC86091606により産生される、請求項1に記載の
モノクローナル抗体。
3、 請求項1又は2に記載されたモノクローナル抗体が1以上の付加的結合特
異性を有する更に1種以上の抗Rh (D)抗体と混合された抗Rh (D)試
薬。
4、 DVI変異体と結合しうるモノクローナル抗体が存在する、請求項3に
記載の抗Rh (D)試薬。
5、 抗体成分が:
(a)請求項1に記載されたモノクローナル抗体;(b)抗D 活性のない又は
非常に弱いIgM抗Rh(D);
を含む、請求項3に記載の抗Rh (D)試薬。
6、 抗体成分が間接的抗グロブリン試験でDvI赤血球に対する活性を示しつ
るIgGモノクローナル抗Rh(D)を更に含む、請求項5に記載の抗Rh (
D)試薬。
7、 成分(b)が寄託されたハイブリドーマ細胞系MAD−2(ECACC8
6041803)及びFOM−1(ECACC87021301)のモノクロー
ナルIgMから選択される、請求項5又は6に記載の抗Rh (D)試薬。
8、 請求項1に記載されたモノクローナル抗体を産生しうるヒトリンパ球由来
細胞系。
9、 ヨーロピアン争コレクションφオブ・アニマル・セル・カルチャーズに
受理1kEcAcc 86091606号として寄託された、請求項8に記載
の細胞系。
10、 新生児の溶血症を防止するための受動免疫用である、請求項1又は2
に記載のモノクローナル抗体。
11、請求項8又は9に記載された細胞系の培養により得られた培養上澄。
12、 新生児の溶血症を防止する受動免疫用医薬組成物であって、
生理学上許容される担体又は希釈剤と共に請求項1又は2に記載されたモノクロ
ーナル抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
13、 抗体成分がDvT変異体と結合しうるモノクローナル抗体を更に含む
、請求項12に記載の医薬組成物。
14、 請求項1又は2に記載されたモノクローナル抗体又は請求項3〜7のい
ずれか一項に記載された抗Rh (D)試薬が用いられ、上記モノクローナル抗
体又は上記試薬が水性溶液の形態であることを特徴とするRh型判定方法。
手続補正書(方式)
平成 3年 4月11日
特許庁長官 植 松 敏 Wi il 事件の表示
PCT/GB 88100756
2 発明の名称
ヒト抗Rh (D)モノクローナル抗体3 補正をする者
事件との関係 特許出願人
発送日 平成 3年 3月 12日
6 補正の対象
7 補正の内容
国際調査報告
−M+1+1組111M1^1111111+噛れNCP口T/CBBB100
756特表千3−502997 (12)
Claims (13)
- 1.下記の本質的特徴: (a)Rh血液型系のC、c、E又はe抗原ではなくRh(D)抗原に対して活 性を示す; (b)IgG3タンパク質である; (c)kL鎖を有する; (d)アロタイプG3m(21)に属する;(e)間接的抗グロブリン試験でD U細胞に対して活性を示す; (f)DIV、DV及びDTar変異抗原に対して活性を示す;及び (g)DVI又はDB変異抗原に対して不活性である;を有するヒトそノクロー ナル抗体及びその抗原結合性断片。
- 2.細胞系ECACC86091606により産生される、請求項1に記載のモ ノクローナル抗体。
- 3.請求項1又は2に記載されたモノクローナル抗体が1以上の付加的結合特異 性を有する更に1種以上の抗Rh(D)抗体と混合された抗Rh(D)試薬。
- 4.DVI変異体と結合しうるモノクローナル抗体が存在する、請求項3に記載 の抗Rh(D)試薬。
- 5.抗体成分が: (a)請求項1に記載されたモノクローナル抗体;(b)抗DU活性のない又は 非常に弱いIgM抗Rh(D); を含む、請求項3に記載の抗Rh(D)試薬。
- 6.抗体成分が間接的抗グロブリン試験でDVI赤血球に対する活性を示しうる IgGモノクローナル抗Rh(D)を更に含む、請求項5に記載の抗Rh(D) 試薬。
- 7.成分(b)が寄託されたハイプリドーマ細胞系MAD−2(ECACC86 041803)及びFOM−1(ECACC87021301)のモノクローナ ルIgMから選択される、請求項5又は6に記載の抗Rh(D)試薬。
- 8.請求項1に記載されたモノクローナル抗体を産生しうるヒトリンパ球由来綴 胞系。
- 9.ヨーロピアン・コレクション・オプ・アニマル・セル・カルチャーズに受理 NaECACC86091606号として寄託された、請求項8に記載の細胞系 。
- 10.新生児の溶血症を防止するための受動免疫用である、請求項1又は2に記 載のモノクローナル抗体。
- 11.新生児の溶血症を防止する受動免疫用医薬組成物であって、 生理学上許容される担体又は希釈剤と共に請求項1又は2に記載されたモノクロ ーナル抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 12.抗体成分がDVI変異体と結合しうるモノクローナル抗体を更に含む、請 求項1に記載の医薬組成物。
- 13.請求項1又は2に記載されたモノクローナル抗体又は請求項3〜7のいず れか一項に記載された抗Rh(D)試薬が用いられ、上記モノクローナル抗体又 は上記試薬が水性溶液の形態であることを特徴とするRh型判定方法。
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