JPH03504963A - 仮性狂犬病感染に対する組換えサブユニットワクチンの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、仮性狂犬病ウィルス（Ｐ　ＲＶ）に対する動物の免疫処置に有用な不 活化サブユニットワクチンの調製方法および予防接種した動物と自然にさらされ た動物を区別することができる診断試験の開発に関する。

発明の背景 仮性狂犬病（アラニスキー病）は、ヘルペスウィルス属の一員である仮性狂犬病 ウィルス（ＰＲＶ）によって生じる、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ミンク およびラットを含む家畜の高い感染症であり、５週齢以下の子ブタが最も感染し 易い。成熟ブタは、しばしば、ＰＲＶにさらされた後で潜伏的に感染して、その 後、再活性化されたウィルスを有するだけである。

該疾患は、重篤な呼吸器疾患、流産、−腹子数の減少、成長速度の減少およびし ばしば致命的な脳炎によって特徴付けられる［グスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｏ ｎ）、ディジージズ・オワ・スワイン（Ｄｉｓｅａｓｅｓｏｆ　５ｗ１ｎｅ）、 ダン・アンド・レドマン（Ｄｕｎｎ　ａｎｄ　Ｌｅｄｍａｎ）、　Ｅｄｓ、、ア イオワ・ステート・プレス（Ｉｏｔａ　５ｔａｔｅ　Ｐｒｅｓｓ）、　１９７５ コ。現在の制御方法は、不活化または弱毒化したＰＲＶによる予防接種または試 験および除去方法を含んでいる［上記グスタフソン（１９７５）参照］。

修飾生菌ウィルス（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　１ｉｖｅ　ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ）およ び不活化全ウィルスワクチンは、多くの疾患に対して免疫を誘発する源として広 く用いられてきた。修飾生菌ウィルス貯蔵物は、一般的に、許容または半許容セ ルラインにおける多数の継代によって調製される。

高継代ウィルス貯蔵物の一般的な特徴は２７通常、該貯蔵物があまりビルレント ではないかまたは弱毒されているということである。

ＰＲＶワクチンは、種々の方法によって調製されてきた。しかし、ＭＬＶ型予防 接種によると、ウィルスが環境中に維持される。したがって、ウィルスの完全な 絶滅は不可能である。別の予防接種法は、選択された免疫原性ＰＲＶグリコプロ ティンを発現する不活化組換えワクチンの使用である。このようなワクチンの開 発は、ＰＲＶゲノムおよびそれをフードするグリコプロティンの構造についての 知識を必要とする。

ＰＲＶゲノムは、約９０キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有する二重鎖ＤＮＡ分 子からなっている［ルベンスタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ）およびカブラン（ Ｋａｐｌａｎ）、パイロロン−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　６６：３８５（１９７５ ）］。ゲノムは、逆向き反復配列によって、固有の短い領域（Ｕ、）および固有 の長い領域（ＵＬ）に分離される［ステイーブリー（Ｓｔｅｖｅｌｙ）、ジャー ルスのグリコプロティンは、ゲノムのｔＪｓおよび賑の両領域に位置した遺伝子 によってコードされることがわがった。弱毒ＰＲＶの少なくとも２つの菌株［ノ ーテン（Ｎｏｒｄｅｎ）およびパーサ（Ｂａｒｔｈａ）菌株：ノーテン・ラボラ トリーズ（Ｎｏｒｄｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　　リンカーン。

不ブラスカ］において、弱毒化はゲノム欠失と直接関連があると思われる［ペト ロブスキス（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ）ら、ジャーナル・オワ・パイロロン−（Ｊ 、Ｙｉｒｏｌ、）　６０：１１６６（１９８６）］。該欠失は、通常、約２〜４ 千の塩基対の長さであり、ゲノムのＵ５領域に位置する。少なくとも１つのタン パク、ｇｌは、この欠失領域によってコードされる。

ハングル（Ｈａｍｐｌ）らのジャーナル・オワ・パイロロン−（Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　）５２：５８３（１９８４）には、ＰＲＶのエンベロープ内に一体化され ている５種類のグリコプロティンが開示されている。これらは、ｇｌ（１３０Ｋ ｄ）、ｇＵ　ａ、ｂＳｃ（１２５Ｋｄ、７４Ｋｄ、５８Ｋｄ）、ｇｌＩ［（９８ Ｋｄ）、ｇＩＶ　（９８Ｋｄ）、およびｇＶ（６２Ｋｄ）を含む。ｇＸ（９８Ｋ ｄ）と称されるグリコプロティンをコードした他のウィルスは、感染細胞の培地 中に堆積するのがわかった［リー（Ｒｅａ）ら、ジャーナル・オワ・バイｏｏジ ー（Ｊ、Ｉ／１ｒｏ１．）　５４：２１（１９８５）］。２つの他のウィルスグ リコプロティンは、ｇｐ５０［ワテンＱａｔｈｅｎ）およびワテン（Ｗａｔｈｅ ｎ）。

ジャーナル・オワ・パイロロン−（Ｊ、ｌ’ｉｒｏ＋、）　５１：５７（１９８ ４）コおよびｇｐ６３［ベトロブスキス（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ）ら、ジャーナ ル・オワ・パイロティンのマ／ブ位置が報告されている。ｇｌｌ複合体およびｇ ｉｌｌは、各々、マツプ位置０．１０５〜０．１３０間とマツプ位置０．４０付 近のＵＬ領領域おいて配置されるのがわかった［メツテンライター（Ｍｅｔｔｅ ｎｌｅｉｔｅｒ）ら、パイロロン−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１５２：６６（１９ ８６）　：ロビング（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、ジャーナル・オワ・パイロロン−（ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　５８：３３９（１９８６）］。ｇＸＳｇｐ５０Ｓｇｌおよ びｇｐ６３は、ゲノムのＵ、領域に配置されていた［リーらの上記文献Ｃ１９８ ５）　；ワテンおよびワテンの上記文献（１９８４）　；メツテンライター（Ｍ ｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ）ら、ジャーナル・オワ・パイロロン−（Ｊ、　Ｖｉｒ ｏｌ、　）靜：５２（１９８５）　；ベトロブスキスらの上記文献（１９８６） ］。（第１図参照）ノーテンおよびパーサ菌株において、２つのグリコプロティ ンｇｐ５０およびｇｐ６３が上流側、すなわち遺伝子の出発部でｇｌ欠失をフラ ンクしている。下流側、すなわち遺伝子の末端には、複製によって含まれるＤＮ Ａの領域がある。自然感染にさらされた動物由来の血清は、ｇｐ５０、ｇｐ６３ およびｇｌに対する抗体を含有している。

修飾生菌ウィルスで予防接種した動物は、ｇｌに対する抗体を含んでいない。

インビトロでＰＲＶを中和するいくつかのモノクローナル抗体が産生された。ハ ングルらの上記文献（１９８４）には、ｇｍに対して指向されたモノクローナル 抗体がウィルスを効果的に中和することが報告されている。ｇｌおよびｇＩＩに 対して特異的なモノクローナル抗体は、ウィルス中和活性も有している［ルツィ ハＯ−Ｒｚｔｈａ）、個人的なコミュニケーション；メソテンライターらの上記 文献（１９８６）］。ワテンおよびワテンの上記文献（１９８４）には、ｇｐ５ ０に対して生起されたモノクローナル抗体がウィルス中和活性を有することが報 告されている。さらに、ｇｐ５０に対して指向されたモノクローナル抗体によっ て受動的に免疫されたマウスは、ＰＲＶによる攻撃の後に保護されることがわか った。

ＰＲＶ感染に対する動物の免疫化のために有用なワクチンを開発するために様々 な試みが為されてきた。可能なサブユニットワクチン候補としてのＰＲＶグリコ プロティン、ｇｐ５０の使用は、マーチオリ（Ｍａｒｃｈｉｏｌ　ｉ）らのジャ ーナル・サブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）６１　：３９７７（１９ ８７）によって報告された。ペトロコビイス（ＰｅＬｒｏｋｏｖｉｓ）らの特許 協力条約（Ｐ　ＣＴ）出願１０８７１０２０５８号には、ｇｌ、ｇｐ５０および ｇｐ６３ポリペプチドのうちの１つを用いるＰＲＶに対するサブユニットワクチ ンの製造が開示されている。ＰＲＶ由来のＤＮＡからなる弱毒ＰＲＶワクチンの 製造は、シー（Ｓｈｉｈ）らのＰＣＴ出願Ｗ０８７１０１２８７号によって開示 されている。弱毒ＰＲＶワクチンは、反復配列の一部分が欠失した弱毒ウィルス の複製に必須のＰＲＶの配列を用いて製造される。

温度感受性ＰＲＶ菌株の使用による生菌ＰＲＶの修飾は、米国特許第４．５１４ ．４９７号に開示さ゛れている。原核生物および真核生物発現系におけるＰＲＶ グリフプロティン遺伝子の製造およびそのイムノテンとしての使用は、ロビング （Ｒｏｂｂｉｎｓ）らの欧州特許出願第０１６２７３８号に開示されている。

近年、多くの文献によってワクチンとしてワクシニアウィルス組換え体発現外来 ウィルス遺伝子を用いることの有用性が報告されて３０２：４９０（１９８３） 　；パオレノティ（ＰａｏｌｅｔＬｉ）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショ ナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８１：１９３（１９８４）］、インフルエンザ ウィルス赤血球凝集素しパニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）ら、プロシーディンゲス ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ 、　Ｍａｔ　ｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８０：５３６４（１９８３） コ、単純ヘルペスグリコプロティンＤ［パオレッティらの上記文献（１９８４） 　；フレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２８ニア ３７（１９８５月、狂犬病グリコプロティンＧ［ライフタ−（Ｗｉｋｔｏｒ）ら 、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニ ーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

よびヒトＲＳウィルスＧグリコプロティン［ボール（Ｂａｌｌ）ら、プロン−デ ィンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８３：２４６（１９８ ６）　；エラン：’（Ｅｌａｎｇｏ）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナ ル・アカデミ−・サブ・サイエンス−ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、　８３：１９０６（１９８６）］に関する遺伝子を含有しているもの を含む感染性ワクシニアウィルス組換え体による好結果の発現および免疫化につ いて報告されている。

発明の概要 本発明は、危険な副作用を伴わずに、ＰＲＶによる感染に対する免疫を誘発する ことができる動物に投与するための組換え仮性狂犬病ウィルス（Ｐ　ＲＶ）ワク チンを提供するものである。このようなワクチンは、有効量の組換えＰＲＶ２価 サブユニット抗原、ｇｐ５０：６３からなる。

また、本発明は、ワクシニアウィルス組織培養系中でＰＲＶｆブユニット抗原、 ｇｐ５０・６３を発現し、化学的不活化剤で組換えウィルス処理し、次いで、ワ クチン中に製剤化するために、不活化組換えウィルスおよび細胞抽出物を回収す ることからなるＰＲＶ感染に対するワクチンの製造方法を提供するものである。

さらに、本発明は、経口、鼻腔内、腹腔内、皮下または筋肉内経路による組換え ワタシニアウィルス系において発現された組換えＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ ５０：６３の投与からなるＰＲＶ感染に対する動物の免疫化方法を提供するもの である。

また、本発明は、組換えワクシニアおよび細胞抽出物を不活化するＰＲＶ　ｇｐ ５０　：　６３を発現する組換えワタシニアウィルスを提供するものである。

本発明は、動物への鼻腔内、筋肉内、腹腔内、皮下または経口投与に適しており 、不活化組換えワタシニアウィルス１．０〜１００μ２を含有しているｉ＆０． １〜５．０ＩＱからなるＰＲＶによる感染に対する免疫を誘発するためのワクチ ン投薬ユニットを提供するものである。

さらに、本発明は、危険な副作用を伴わずに、ＰＲＶおよび１またはそれ以上の 他の病原微生物もしくはウィルスによる感染に対する動物における免疫を誘発す ることができる経口、筋肉内、腹腔内、皮下または鼻腔的投与用混合ワクチンを 提供するものである。該混合ワクチンは、ＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ５０： ６３の有効量および他の病原微生物またはウィルスによる感染に対して保護的な １またはそれ以上の他の抗原の有効量からなる。

本発明は、組換えＰＲＶサブユニット抗原、ｇｌからなる動物におけるＰＲＶ感 染の検出用診断キｙ）を提供するものである。

伝子マツプ。斜線は、Ｓｌマツピングによって決定されるｍＲＮＡ転写を表す。

太く濃い線は、遺伝子ｇＸ、ｇｐ５０Ｓｇｐ６３およびｇｌの位置を表す。この 図面の底部の濃い線は、組換えワタシニアベクター内にクローンされたＰＲＶゲ ノムの領域を表す。

発明の詳細な記載 感染症の制御は、好ましくは、該疾患を予防およびモニターする方法を含んでい る。ＰＲＶ感染の研究では、動物を免疫化しつつ、ウィルスの蔓延を予防するこ とが重要であるということが明らかになってきた。今日まで、該問題点は、環境 にウィルスをさらに導入せずに有効なワクチンを得ることであった。本発明の課 題は、環境にＰＲＶをさらに導入せずに動物を感染防御するワクチンの製造であ る。

本発明は、仮性狂犬病感染に対する組換え不活化サブユニットワクチンまたはそ の誘導体の製造方法を提供するものである。ＰＲＶサブユニットワクチンは、自 然に感染にさらされた動物と区別することができる予防接種した動物における免 疫を確立するように構成される。さらに、該ワクチンは、予防接種した動物にお いてＰＲＶ感染症の潜伏状態を誘発しない。

このような性質を有しているワクチンは、ｇｐ５０：６３と同定された単一の抗 原性タンパクとしてのワクチンのサブユニット成分として２種類の仮性狂犬病グ リコプロティン（ｇｐ５０およびｇｐ６３）を用いることによって調製すること ができる。

本発明のワクチンは、づブユニ、１・抗原成分の誘導体を含む。このような誘導 体は、付加、欠失または置換からなり、この変形は、有効なイムノゲンとして作 用する能力に有意に反対の影響を及ぼさない。

本発明において例示するＰＲＶは、インディアナ・ファンクハウザ−（ｌ　ｎｄ ｉａｎａ　Ｆ　ｕｎｋｈａｕｓｅｒ）（ｌ　Ｎ　Ｄ　−Ｆ　）菌株である。他の ＰＲＶ菌株としては、例えば、ブカレスト（Ｂｕｃｈａｒｅｓｔ）（Ｂ　Ｕ　Ｋ ）菌株が利用可能であり、アイオワ、アメスのナショナル・ベテリナリー・サー ビス０ラボラトリ−（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃ ｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＮＶＳＬ）またはメリーランド、ベテスダのアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）のような供給源から入手す ることができる。他方、有用なＰＲＶ菌株は、例えば、三叉神経、スロートスワ ブ（ｔｈｒｏａｔ　ｇｖａｂ）または脳の組織の抽出によって感染動物から得る ことができる。

ＰＲＶ　ＤＮＡは、リード（Ｒｅｅｄ）らのジャーナル・オワ・パイロロジー（ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　６２：２６６（１９８８）によって開示されているような 標準的な方法によってＰ　Ｒ，Ｖから単離される。

ｇｐ５０、ｇｐ６３およびｇｌのＤＮＡ配列は公知である［ペトロブスキスらの 上記文献（１９８６）　：ペトロブスキス（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ）ら、ジャー て、これらのタンパクをコードしている遺伝子の特異的および詳細な同定が行わ れる。ｇｐ５０、ｇｐ６３およびｇｌをコードしているＰＲＶゲノムの領域の単 離は、例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら。

モレキュラー中クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、　　コール ド０スプリングス・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａ ｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）＋１９８２に開示されている標準的なりロー ユング法を用いて行うことができる。ＰＲＶゲノムから単離された領域は、例え ば、ワクシニアウィルスベクター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）ベク ター［マルチオリらの上記文献（１９８７）］、およびエシェリキア・コリ（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ベクター［ベトロブスキスらの上記文献（１ ９８６）］、イーストベクターまたは他のグラム陽性ベクター、例えば、パシラ ス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ）もしくはストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ鋼ｙ ｃｅｓ）［クローニング・ベクターズ（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）、　 ボウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）。

エンゲルーフォルク（Ｅｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ）、　Ｅｄｓ、、　　１９８５］中 にクローンすることができる。

このようにして得られた組換え遺伝子は、真核生物および原核生物宿主細胞の両 方において発現することができる。例えば、原核生ローニング・ベクターズ（１ ９８５）］を用いて達成することができる。

原核生物宿主細胞における発現は、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスタ ー卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｒ−１６１０ハムスター腎臓細胞、ブタ（ｐｏｒｃｉｎ ｅ）腎臓細胞、ブタ（ｓｗｉｎｅ）畢丸細胞；酵母細胞、例ＰＲＶ抗原を免疫原 性粒子の表面で発現する発現系が好ましく、例えば、ワクシニアウィルス、バボ バウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、バルボウィルス、乳頭腫ウィ ルスおよび鶏痘または豚痘ウィルスである。

ワクシニアウィルス発現系を用いる組織培養においてタンパクを発現するために 組換えＤＮＡの方法を用いて、ｇｐ５０およびｇｐ６３に対する遺伝子は、サブ ユニットワクチンの製造のためにワクシニアにおける共直線性遺伝子として一体 化することができる。組換えＤＮＡ法を用いて診断薬、ｇＩを製造して、遺伝子 生成物を発現することができる。このｇＩ遺伝子生成物は、ＥＬＩＳＡ、放射免 疫検査法（ＲＩＡ）およびタンパクブロッティング法のような血清学的検査のた めの抗原として利用することできる。

さらに、ｇｌ遺伝子プローブは、ｇｉ　　ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡクロー ン由来のｇｌをコードしているＤＮＡを精製することによって作製することがで きる。したがって、仮性狂犬病のＵｓ領域内でコードされた遺伝子プローブまた はタンパクは、天然の感染における仮性狂犬病に対する、サブユニットまたは修 飾生菌ＰＲＶワクチンによる予防接種による応答についての診断方法として用い ることができる。５ｔｕｌとＢａ＋ｓＨＩの間の仮性狂犬病Ｕ８領域からコード された遺伝子または遺伝子生成物（第１図参照）は、診断薬の源である。仮性狂 犬病の弱毒ワクチン菌株は、この領域において欠失を含んでいる。したがって、 ｇｌがこの領域から完全にコードされるので、ｇＩに関する遺伝子または遺伝子 生成物が非常に弱毒化された仮性狂犬病の菌株中でみつけることができる。

ｇＬ　ｇｌ抗体またはｇｌ　　ＤＮＡ配列を検出するために設計された診断キッ トは、動物が予防接種されたか、または病原領域菌株にさらされたかを測定する ために使用することができる。本発明のサブユニットワクチンは、ｇ■タンパク またはＤＮＡ配列を含有していないので、同様な検査において用いることもでき る。例えば、ＰＲＶｇｐ５０およびｇｐ６３を含有する不活化組換えワクシニア ウィルスは、感染性ではなく、このウィルスを予防接種した動物においてｐｇ５ ０およびｇｐ６３以外のＰＲＶタンパクに対する免疫応答を開始することができ ない。したがって、これらの動物は、ｇｒに対する抗体を循環することについて 陰性であり、ＰＲＶの修飾生菌または領域菌株によって通常に指向された細胞に 如何なる仮性狂犬病Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇ　Ｉ遺伝子）をも含有しない。

ｇｐ５０暗号領域における制限酵素マツプの試験によって、ｇｐ５０開始フドン の上流の固有のＢｓｔＸ　　Ｉ部位の４４のヌクレオチドの存在を示す（第１図 ）。実施例に記載するような方法を用いて、ｇｐ５０、ｇｐ６３およびｇｌに対 する遺伝子を含有するクローニングベクターを構築することができる。これらの クローニングベクターの消化によって、適当な遺伝子、すなわち、ｇｐ５０、ｇ ｐ６３およびｇｌをコードしているフラグメントとなり、次いで、適当なりロー ニングベクターとライゲートすることができる、例えば、ＢａｍＨＩ／Ｓｍａｌ −一消化ｐＧ　Ｓ　２０、ワクチンウィルス挿入ベクターとのライゲー／ヨンＵ マケ、トらの上記文献（１９８４）］。使用するのに有用なベクターを作成する ｐＧＳ２０の重要な特徴としては、初期および後期ワクチンウィルス転写調節シ グナルを有する７、５Ｋｄ遺伝子プロモーター；外来遺伝子の挿入に対する７、 ５Ｋｄ遺伝子プロモーターのすぐ下流に位置する固有のＢａｍＨＩおよびＳｍａ １部位：およびワク／ニアウィルスゲノムのチミジンキナーセ（ＴＫ）位置中に 相同的組換えを指向するための上記の全てのフランクしているワクシニアウィル スチミジンキナーゼ（ＴＫ）が挙げられる。使用してもよい他のワクシニアベク ター系としては、例えば、パオレティらの上記文献（１９８４）によって開示さ れたものが挙げられる。

上記ライゲーション混合物は、例えば、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨ５［マ ニアティスらの上記文献（１９８２）］に形質転換され、組換えクローンに関し てスクリーンすることができる。

実施例においてさらに完全に５４載するように、正しい方向に挿入されたＰＲＶ フラグメント（ｐ５０　：　６３　：ｇｌ）を有するクローンを単離し、７．５ Ｋｄ遺伝子プロモーターと操作的に結合した。ＤＮＡ配列決定によって、ｇｐ５ ０開始コドンが野生型７．５　Ｋｄポリペプチドに対する主要ｍＲＮＡ出発部位 から下流の８３ヌクレオチドに位置することがわかった。

ワクシニアウィルスへのＰＲＶＤＮΔフラグメントの挿入は、ワクシニアウィル スを用いて、宿主細胞、例えば、ＣＶ−１細胞［ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、 　プロンーデングス・サブ・ナンヨナル・アカデミ−・サブ・サイエンス（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　５３：５３（１９６４）］を 感染し、ＰＲＶタンパクをフードしている遺伝子を担持する発現プラスミドによ って細胞をトランスフェクトすることによって達成された。感染の２日後、５− ブロモ−２°−デオキンウリジン（ＢＵｄＲ）の存在下、後代ウィルスの系列希 釈をＴＫ−細胞、好ましくはヒト］、４３ＢＴＫ−細胞［モス（Ｂ、　Ｍｏ５ｓ ）、ナショナル・インスティチュート・サブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ）から寄贈］の単層に適用して、ＴＫ−組 換えウィルスプラークについて選択することができた。多数のＴＫ−プラークを 拾い上げ、ＢＵｄＲの存在下、ＴＫ−細胞上の２４ウエルプレート中で増殖した 。感染した培養物の微量試料をニトロセルロース上で濾過し、ｇｐ５０領域に対 して特異的な放射標識化プローブ、好ましくは３２ｐを用いてスクリーンした。

この方法で、多数の絹換え体が５．３Ｋｄ　ＰＲＶフラグメントを含有すると同 定された。該組換え体のうちの１つは、ＢＵｄＲの存在下、ＴＫ〜細胞上で３回 精製したプラークであり、貯蔵ウィルス調製物は、ブタ華丸（ＳＴ）細胞を感染 することによって調製した。

組換えウィルスは、Ｖｇｐ５０　：６３　：ｇ　Ｉと称スる。

には実施例に記載のように作製し、これはｇｐ５０・６３（Ｖｇｐ５０　：６３ ）およびｇｌ（Ｖｇｌ）をコードしている領域を含んでいた。組換えＤＮＡ法を 用いて、プラスミドｐ５０：６３：ｇＬ　ｐ５０：６３およびｐｇｌを構築した 。ｐ５０：６３およびｐｇｌを用いて得られた組換えワクシニアウィルスは、各 々、Ｖｇｐ５０：６３およびＶｇｌと記した。

ｇｐ５０の発現を特徴付けるために、ワタシニア組換えＶｇｐ５０：６３　：ｇ 　Ｉで感染されたｃｖ−１細胞をｇｐ５０特異性モノクローナル抗体ＭＣＡ３０ −１［ワテン（Ｍ、　ＷａＬｈｅｎ）から寄贈］と一緒にインキュベートした。

該細胞を洗浄し、フルオレセインコンジュゲートヤギ−抗−マウスＩｇＧと一緒 にインキュベートした。ｇｐ５０は、Ｖｇｌ）５０感染細胞の細胞質中、および 細胞表面上で検出することができたが、非組換えワクシニアウィルスに感染した 細胞においては蛍光を検出することはできなかった。ｇｐ５０発現は、ＭＣＡ３ ０−１を用いてＣ”−グルコサミン放射標識化Ｖｇｐ５０感染ＳＴ細胞抽出物の 免疫沈澱によっても試験された。免疫沈澱物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、６０Ｋ ｄの分子量を有する広がった帯および５５Ｋｄの分子量を有する鮮明な帯を示し た。タンパクは、ワタソニアウイルス感染細胞の免疫沈澱の後は検出されなかっ た。ＰＲＶ感染細胞による免疫沈澱物の分析は、Ｖｇｐ５０　：６３　：ｇ　Ｉ 感染細胞のものと同一のパターンの帯を示した。すなわち、組換えウィルス感染 細胞によって合成されたｇｐ５０はＰＲＶ感染細胞によって合成されたものと類 似していた。

組換えワクシニアウィルスＶｇｐ５０　：６３の発現はＶｇｐ５０　：６３感染 ＣＶ−１細胞を用いて免疫されたマウスから最初に回収した血清によって特徴付 けられた。次いで、Ｖｇｐ５０　：６３マウス血清を用いて、野生型ワク／ニア ［ワイス（Ｗ　ｙ　ｅ　ｔ　ｈ　）菌株、二ニー・ヨーク・ホード・オプ・ヘル ス（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）］、および仮性狂犬 病ブカレスト（ＢＵＫ）およびインディアナ・ファンクノ−ウザ−（ＩＮＤＩ− Ｆ汀メンゲリング（Ｍｅｎｇｅｌ　ｉｎｇ）ら、アーカイブス・サブ・ニアＶｇ ｐ５０：６３：ｇｌ、Ｖｇｐ５０：６３、Ｖｇｌに感染した１４ｃ−グルコサミ ン標識化細胞抽出物を免疫沈澱した。ＰＲＶ（ＢＵＫまたはＩＮＤ−Ｆ）感染細 胞の免疫沈澱物中に、約６２Ｋｄの、そして約５８Ｋｄのより低い分子量までの 領域に及ぶ拡散帯が存在した。

Ｖｇｐ５０　：６３　：ｇ　ＩまたはＶｇｐ５０・６３に感染したＳＴ細胞の免 疫沈澱物においては、さらに限定された６２Ｋｄの帯が観察された。

ｇＩの発現を特徴付けるために、ＳＴ細胞を組換えウィルスＶｇｌで感染し、” Ｃ−グルコサミン細胞抽出物をｇＩ特異性モノクローナル抗体で免疫沈澱した。

１０５Ｋｄのタンパクは、ＰＲＶ＊たはＶｇｌ感染ＳＴ細胞からの免疫性澱物由 来の主なタンパクであり、該組換え体がＰＲＶ感染細胞と同様のタンパクを発現 することを示した。仮性狂犬病ウィルスのＢＵＫ菌株を用いる場合、ＢＵＫ細胞 中にｇＩは存在しない。

ワタシニアベクター系を用いてｇｐ５０　：ｇｐ６３の発現によって作製された 不活化サブユニットワクチンを用いて、ＰＲＶ感染に対して動物を成功裏に免疫 することができる。この方法を用いて作製したワクチンは、無傷のＰＲＶを含ん でいない、すなわち、弱毒化まｈは不活化されたＰＲＶが存在しない。

サブユニット成分として２種類の仮性狂犬病グリコプロティンを用いると、該サ ブユニットワクチンは、宿主細胞抽出物の存在下、組換えワクシニアウィルス調 製物中にｇｐ５０：６３抗原を含有する不活化調製物として投与すると、強い感 染防御免疫を生じることがわかった。

マウスにおけるワクチンｇｐ５０：６３組換え体の試験は、マウスが頭蓋内に接 種される場合、生菌組換え体が最小のピルレントでありかつ最大に感染防御的で あることを示す。二元性エチレン・イミン（ｂｉｎａｒｙ　ｅｔｈｙｌｅｎｅ　 １ｍ１ｎｅ）（Ｂ　Ｅ　Ｉ　）の溶液で不活化された組換えｇｐ５０°６３（Ｖ ｇｐ５０　：６３）調製物の使用は、ワクチンを多くの組織培養系、例えば、ブ タ（ｐｏｒｃｉｎｅ）腎臓細胞、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ｍｌ丸細胞、ｃｖ−１モン キー細胞およびヘロ（Ｖｅｒｏ）細胞（ＡＴＣＣＣＣｌ２１）中で容易に増殖す ることができるので、現在利用可能であるワクチンよりも安全であり、あまり高 価ではない。

本発明の好ましい実施において、８．１　　Ｌｏｇ　１０７ＣＩＤ、、／ｚＱの 力価を示す組換えｇｐ５０：６３のウィルス貯蔵物は、１２０時間ＢＥＩで不活 化し、これを用いて、ブタに接種する。各動物に不活化ウィルス調製物（ＰＲＶ タンパク１〜１０μ９を含有している）約１ｊｌＱを筋肉内投与した。３週目に ブースターを与えた。アジュバントとしてオイル−レシチンを用いた。池のアジ ュバント、例えば、タイルＡ（Ｑｕ’ｉｌ　ＡＴＭ）、アルヒドロゲルまたは鉱 油を用いることができる。ある１グループの動物に、製造者によって推奨された 通常のワクチン投与量を用いて、市販の入手可能なワクチン、ＰＲ−Ｖａｃ（修 飾生菌ウィルス）およびＰＲ−Ｖａｃ（死菌）［ノーデン・ラボラトリーズ（Ｎ ｏｒｄｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｔｉｅｓ）、　　リンカーン、ネプラスカコも投 与した。

最も有意な結果を第１表に示す。２つの投薬の後の組換えｇｐ５０：６３は、非 常に高いレヘルのウィルス中和抗体を生じたが、組換えｇｐ５０　（ｇｐ６０を 含まない）は、血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓ　ｉｏ口）および疾患に対す る感染防御は示さなかった。さらに、従来のワクチンと比較すると組換えｇｐ５ ０：６３によって、ウィルスの攻撃に対して同レベルの感染防御を生じた。ｇｐ ５０：６３の発現は、野生型感染において生じたｇｐ５０およびｇｐ６３よりも 少なかった。しかし、組換えｇｐ５０：６３は、非常に高い抗体応答を生じた。

これらの結果は、投薬およびアジュバントの最適条件下で、組換えｇｐ５０：６ ３をさらして、第１表に記載されたデータよりもさらに強い応答を刺激すること を示す。

第　　　１　　　表 ＰＲＶａｃＳＰＲＶａｅ−死菌または組換えＰＲＶワクチンによる予防接種に対 するブタの血清学的応答 １動物に、鉱油（１１１の中５％し／チンでアジュバントした組換えｇｐ５０： ６３１ｆｆ１２を筋肉内に接種した。ＰＲＶａｃは修飾生菌であり、Ｐ　ＲＶ　 ａｃ−死菌はアルヒドラゲルでアジュバントする。

５組換えｇｐ５０：６３を受けた動物は、３週目に第２接種した。

０動物を、６週目に３　４　　ＴＣＩ　Ｄｓｏ　Ｌｏｇ＋ｏビルレントＰＲＶウ ィルス（ＩＮＩ）−ＦＸ２２０８）で攻撃した。

第１表は、種々のワクチン調製物を用いて予防接種したブタからのウィルス中和 （ＶＮ）抗体力価を示す。動物に、ノーチン・ラボラトリーズによって配給され た認可されたＰＲＶワクチン（修飾生菌もしくは死菌）またはワクンニア感染細 胞からの不活化組織培養抽出物と一緒に、アジュバントとじて鉱油中５％レシチ ンを含有する接種物を投与した。接種物を首に筋肉内（ＩＭ）投与し、３週目に ブースターを投与した（ＰＲＶ修飾生菌にはブースターを投与しなかった）。予 防接種の後６週目にブタをビルレント形態の仮性狂犬病ウィルスで攻撃した。第 １表に示したとおり、２価の生成物のＶＮ力価は、認可された生成物について見 られる平均力価よりもほとんど１０倍高かった。

本発明の方法を用いて、混合ワクチンを製造することもできる。

例えば、組換えＰＲＶワクチンは、他の不活化ワクチンまたは複数のハクテリン と組み合わせて調製することかできる。使用することができるバクテリンとして は、パスツレラ・マルトサイダ法は、実施例に記載する。

第２表の結果、ワクンニアにおいて産生された組換えＰ　ＲＶサブユニットワク チンは、混合ワクチンの最も高い力価を有しており、Ｐ　ＲＶ　ａｃ死菌ワクチ ンだけの投与に関する結果と比べると有利であった。実施例においてさらに充分 に記載する化学的に抽出された仮性狂犬病サブユニットワクチン調製物（ＳＵＶ Ａ月よ、血清転換を示さず、あまり感染防御をもたらさない。すなわち、バクテ リンと組み合わせて、組換えワクンニア不活化調製物（ｇｐ５０　：ｇｐ６３　 ）は、もつとも良く作用した。

第　　２　　表 ＰＲＶａｃ−死菌、５ＵＶＡまたは組換えＰＲＶ混合ワクチンによる予防接種に 対するブタの血清学的応答混合ワクチンに関する仮性狂犬病ＶＮ抗体力価。ワク チン調製物は以下のものを含んでいる。

１）仮性狂犬病死菌ワクチン（ＰＲＶａｃ死菌、ノーチン・ラボラトリーズ）を 非組換え野生型（ワイス）ワクンニアとｍｌで混合し、５％レシチンおよび鉱油 でアジュバントした。

２）従来のＰＲＶａｃ死菌。

３）ＰＲＶａｃ死菌を実施例に記載する混合バクテリンと混合した。ＰＲＶａｃ 死菌２ＲＱをバクテリン調製物２靜と混合した。

４）バクテリン混合物２酎をサブユニットワクチン抗原（ＳＵＶＡ）２１Ｑと混 合した（実施例参照）。

５）不活化組換えワタシニアｇｐ５０：６３　０．７ｘＱを混合バクテリン２酎 と混合した。

６動物に１次接種物を筋肉内投与した。３週目に２次接種物を投与した。

ｂ６６週目終わりに、ピルレント仮性狂犬病ウィルスの３−４　ＴＣＩＤ、。

（Ｌｏｇ＋。）で動物を攻撃した。

０９０ａ 本発明の組換えワクチンを動物に投与して、ＰＲＶ感染から動物を直接保護する ことができる。投薬は安全であるべきであり、すなわち、投与によって、危険な 副作用も生じないし、環境に新しい病原を導入しない。ワクチンの製剤化は、最 少免疫量（ＭＩＤ）および最適なアジュバント研究（ＯＡ　Ｓ　）（不活化調製 物の場合）を行うことを含んでいる。最少投与量は、濃縮工程なしでできる限り 小さく維持すべきである。したがって、生物学的ワクチン生成物に関して、細胞 培養における生合成は、最も高い可能なレベルであるべきである。

ワクチンの投与は重要であり、筋肉内（ＩＭ）；鼻腔内（ＩＮ）、経口（Ｏ）； 腹腔内（ｒｐ）、または皮下（ＳＣ）のようないくつかの経路によって投与する ことができる。アジュバントされたワクチンについて、筋肉内経路は好ましい経 路であり、代表的な投与量は、０゜５〜５ＲＱ、好ましくは１ｘ１２の容量中、 ＰＲＶ　ｇｐ５０：６３約１〜１００μ９、好ましくは５μ９である。

ワクチンは、３〜４週間にわたる単一投薬によって免疫を生じるのが好ましい。

ビルレントウイルスで攻撃された予防接種動物は短く低い発熱応答を経験し、予 防接種をしなかった動物と比較してウイルスシェディング（ｖｉｒｕｓ　ｓｈｅ ｄｄｉｎｇ）が減少した。ビルレントウイルスで攻撃された予防接種動物は、体 重減少をあまりまたは全く経験しなかった。攻撃の後、１４日間にわたって５〜 １０％の体重増加が望ましい。

また、本発明は、ワクチン量のＰＲＶサブユニット抗原またはその誘導体および １またはそれ以上の公知の動物ウィルスからなる混合ワクチンの調製および使用 を提供するものである。例えば、混合ワクチンは、ＰＲＶサブユニット抗原成分 および問題のブタ（ｓｗｉｎｅ）感染ウィルスの１またはそれ以上の病原成分、 例えば伝染性胃腸炎ウィルス（ＴＧＥＶ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）バルボウイ ルス、ブタ（ｓｗｉｎｅ）インフルエンザウィルス、およびマイコプラズマ・ニ ューモニア（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から調製することが できる０このような混合ワクチンの調製および使用は、本明細書に記載の方法に 従って、または、ワクチン製造および使用の技術分野における当業者の知識の範 囲内で行われる。

また、本発明は、動物個体群におけるＰＲＶの存在をモニターおよび診断し、予 防接種した動物を自然にさらされた動物と区別するのに用いる診断キットと一体 化している診断薬を提供するものでもある。診断キットは、充分な試薬とパネル 試験を行うことができる材料を含むように設計されている。

ＰＲＶグリコプロティン、ｇｌは、非常に弱毒化されたウィルスＰＲＶ調製物に おいて欠失するので、診断抗原に関する候補として指向される。非常に弱毒化さ れたウィルスＰＲＶで予防接種した動物は、ｇＩに対して血清陰性である。自然 感染にさらされた動物は、ｇｌに対して血清陽性であることがわかった。

本発明の方法を用いて、診断抗原として用いるための高レベルのｇＩタンパクは 、組換えＤＮＡ発現を介して生成することができる。

種々のクローニングおよび発現系を用いて、ｇＩ診断抗原を発現することができ る。例えば、イー・フリ（Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ）ベクターｐＡｓｌまたはｐＵ　 ｃ　ｓ　ｃ上記クローニング・ベクターズ（１９８５）］を用いて、イー・コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主系を用いて、ｇｌまたはｇＩの誘導体を発現することがで きる。他方、ｇｌ遺伝子をストレプトマイセス（１９８４）］を用いて発現する ことができる。

本発明の好ましい実施において、単一の非常に精製された組換えワクンニアウイ ルスタンパクを、ｇｌタンパクをコードしているゲノムの領域から単離した。こ のｇＩ遺伝子を、標準的なプロトコールを用いてワク／ニア中に伝達した［マケ ノト（λＩａｃｋｅｔｔ）ら、ジャーナル・サブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、）　４９：８５７（１９８３）］。この組換え体かほんとうにｇｌ（１０５ Ｋｄ）を作成したかを測定するために、ｇＩ組換え体で感染されたＳＴ細胞を、 ｇｌに対するモノクローナル抗体によって免疫沈降した。１つのｌ０５Ｋｄの帯 たけが、ｇＩ組換え体感染細胞、および野生型ファンクハウザ−［ＰＲＶ（ＰＲ Ｖ−Ｉｎｄ−Ｆｌ（）のインディアナーファンクハウザ−（Ｉ　ｎｄｉａｎａ− Ｆ　ｕｎｋｈａｕｓｅｒ）菌株、／エルバ（Ｓｃｈｅｒｂａ）ら、ジャーナル・ サブ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・アソシエイション（Ｊ、　Ａｍ 。

た。同様の帯は、ブカレスト（ＢＵＫ）修飾生菌ウィルス感染細胞からは沈降し なかった。したがって、ｇＩ組換え体は、組換えｇｌが正しいタンパクを発現し ていることを示している野生型感染によって作製されたものと大きさが一致する １０５Ｋｄタンパクを合成する。

組換えｇｌによって産生されている生物学的に活性なｇＩの付加的な徴候は、マ ウスビルレンス試験の結果において示される（第３表）。

通常、遺伝子がワクンニアチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されると、組換えウィ ルスは、マウス脳に注射した場合にはビルレンスにおいて有意に減少する（野生 型ワタシニアとＶｇｐ５０：６３を比較）。しかし、ｇｌを含有するワク／ニア 中換え体を頭蓋内に接種するとビルレンスは低下せず、実際にはわずかに増加す る（野生型ワタシニアとＶｇｐ５０：６３：ｇｌ、Ｖｇｌを比較）。さらに、感 染細胞からウィルスの放出は、マーカーレスキュー試験［メソテンライター牡・ ２７６４（１９８７）］において仮性狂犬病のＵ５領域（ｇｌに特異的）を用い る場合に、弱毒ＰＲＶ［パーサ（Ｂ　ａｒｔｈａ）菌株］によって回復させるこ とができる。これらの結果、ならびに弱毒修飾生菌ウィルスＰＲＶにおける特異 的ｇｌ欠失における情報によって、ｇｌがＰＲＶのビルレンスを意味することが わかる。

第３表 攻撃前および後のＩＣ接種物を投与したマウスの生存率マウスの頭蓋内に０．０ ３２Ｃを接種し、２週間、モニターした。生存者を約３０　　ＬＤ６．の野生型 ファンクハウザ−（２２０８）で攻撃（Ｉ　Ｐ）した。

ＮＤ　　測定せず １４１ａ 本発明の好ましい実施に際して、競合ＥＬＩＳＡ診断キットに関する全ウィルス の代わりに、第１抗原として組換えｇｌタンパクを用いることができる。競合Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡを行うための好ましい方法は、実施例において詳細に説明する。

ｇｌ遺伝子欠失をモニターする遺伝子プローブを用いる診断キットも記載する。

実施例にさらに詳しく記載する遺伝子プローブ法を用いて、動物由来組織試料を 分析して、ウィルスにさらされたかまたは予防接種状態であるかを決定すること ができる。

大旗形 以下の実施例は、説明的なものであって、本発明を限定するものではない。全て の酵素は、製造者の推奨に従って用いた。標準的なりローユング法は、マニアテ ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・りローニング、ア・ラボラトリ− ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、　　１９８２によって記載されたものであった。

実質的に先に記載されている方法［ガロン（Ｇａｒｏｎ）ら、プロシーディンゲ ス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ　Ｉ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７５：４８６３（１９７８） ］に従って精製したワクシニアウィルスからワクシニアウィルスＤＮＡを抽出し た。

ＰＲＶの精製のために、ブタ華丸（ＳＴ）細胞（ノーチン・ラボラトリーズ、リ ンカーン、ネブラス力）を細胞当たり５プラーク形成ユニノ）（ＰＦＵ）の多重 度で感染させ、１６時間後、培地を回収し、研究室超濾過装置を用いて濃縮した 。ｉｌＡ縮ウィルスをＴＢＳ［ｌＱ０１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）（シグマ・ケミカ ル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ）、　　セント・ルイス、ミズリー）、 ｐＨ７，２、ｌ　５０ＲＭ　ＮａＣＱ］中３０％スクロースクツ／ヨン（ｃｕｓ ｈｉｏｎ）　５　ａＱ上に積層し、４°Ｃで４５分間、１１゜０００　ｒｐｍで 遠心分離した。内部のウィルス帯を回収し、ＴＢＳ中で希釈し、４°Ｃて３０分 間、５０．００Ｏｒｐｍで遠心分離することによってペレット化した。ウィルス ベレットをＴＢＳ中に再懸濁し、ＴＢＳ中３０％グリセロール−５０％酒石酸塩 勾配液上に積層した。

ウィルス帯を回収し、ＴＢＳで３倍に希釈し、上記のようにペレットした。該ウ ィルスをＴＢＳ中に懸濁し、−７０’Ｃで貯蔵した。

プロテアーゼに緩衝液（５０肩Ｍ　トリス−ＨＣｌ２．ｐＨ７，５，１％ＳＤＳ 、ＩＯＩＭ　ＥＤＴＡ、７５０　μ９／＊ＱプロテアーゼＫ）中に精製ウィルス を懸濁し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、ＤＮＡを抽出した 。次いで、該試料を６５℃で５分間インキュベートし、同量のフェ／−ル：クロ ロホルム：イソアミルアルコール（２５：２５°ｌ）で抽出した。０．３Ｍまで の酢酸ナトリウムおよびエタノール２容量倍の添加によってＤＮＡを沈降させた 。

Ｉｆ、ＰＲＶ制限フラグメントのクローニング制限酵素Ｂａａ＋ＨＩ［二ニー・ イングランド・バイオラブズ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、　　 ビバリー、マサチコーセソッ］を用イテ、ＰＲＶ　　ＤＮＡを消化し、該フラグ メントを０．６％低融点アガロースゲル上で溶解した。該ゲルから、ｇｐ５０： ６３暗号領域を含んでいるＢａｍＨＩ制限フラグメント７（約６．８Ｋｂ）を削 除し、クロウス（Ｃｒｏｕｓｅ）ら（１９８３）によって開示された低融点アガ ロースクローニング法を用いて、ブスミド、）ＢＲ３２２［サトクリッフェ（Ｓ ｕｔｃｌｉｆｆｅ）。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　５：２７２１（１９７８）コにライゲ ートした。得られたプラスミド（ｐＢＡＭ７）を５ａｌｌおよびＢａ１ＩＩＨＩ で消化し、Ｂａａ＋ＨＩフラグメント７を、Ｓａｌ　７Ａ（４，８Ｋｂ）および Ｓａｌ　７Ｂ（２，０Ｋｂ）と称される２つの部分に開裂した。これらのフラグ メント、５ａ１７Ａおよび５ａ１７Ｂを、標準的なりローユング法を用いて、ｐ ＢＲ３２５［クローニング・ベクターズ（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）、 　　ポウエルズ、　Ｅｎｇｅｒ、Ｙａｌｋ　Ｅｄｓ、、　１９８５］にサブクロ ーンして、組換えプラスミドｐｓａ１７Ａおよびｐｓａ１７Ｂを生成した。

■１組換えワクシニアウィルスの単離 ワクシニアウィルスのワイス（Ｗｙｅｔｈ）菌株［クレイギ（Ｃｒａ　ｉｇ　ｉ ｅ）　。

ブリティッシュ・ジャーナル・サブ・イクスペリメンタル・バソロジー（Ｂｒｉ ｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈ、　）　１３：２５９（１９３２）］に感染し たｃｖ−１細胞［ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、　プロシーディンゲス・サブ・ ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ　１．＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　５３：５３（１９６４）］を、記載した［マケットらの上記 文献（１９８４）］リン酸カルシウム沈降プラスミドＤＮＡでトランスフェクト した。

チミジンキナーゼ陰性（ＴＫ→組換え体を、２５μｙ／＊Ｑの５−ブロモ−２″ −デオキシウリジン［シグマ・ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）Ｉ　セント・ルイス、ミズリー］（ＢＵｄＲ）の存在下 で増殖したヒト１４３７に一細胞［モス（Ｂ、　Ｍｏ５ｓ）、ナショナル・イン スティチュース・サブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏ ｒＨｅａｌｔｈ）］のプラーク検査によって選択した。プラークを拾い上げ、こ れを用いて、２４ウエル培養プレート中で増殖しているヒト１４３ＴＫ−細胞を 感染した。感染の４８時間後、感染細胞の微量試料をニトロセルロース濾紙上で 濾過し、標準的な方法［マニアナイスらの上記文献（１９８２）］を用いて、ｇ ｐ５０：６３領域に対して特異的である３＝ｐ　　１ｊｉｊ識化プローブと一緒 にハイブリダイズした。ＰＲＶ配列に対して陽性であるスクリーンしたウィルス をヒト１４３７に一細胞上で２回、プラーク精製し、ｃｖ−１またはＳＴ細胞の 感染によって増幅した。

制限酵素ＢｓｔＸＩを用いてプラスミドｐｓＡＬ７Ｂを消化し、イー・コリ（Ｅ 、ｃｏｌｉ）　Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いて平滑 末端にした。ＢａｍＨＩリンカ−を該ＤＮＡにライゲートし、これによってワタ シニアｐＧｓ２０プラスミドに挿入／削除のために好都合な制限酵素部位が導入 された（第１図）。５ａｉｌによる第２の消化によって約５４０ｂｐのＰＲＶフ ラグメントが遊離された。プラスミドｐｓ　Ａ　Ｌ　７　ＡをＢａｍＨＩおよび ５ａｌＩで２重消化し、４．８Ｋｂ　ＰＲＶ　　７Ａフラグメントを単離した。

このフラグメントは、５ａｉｌ部位から上流のｇｐ５０暗号配列に加えて４．Ｉ ＫｂのＰＲＶ配列（ｇｐ６３およびｇｌをコードしている）を含んでいる。

２つのフラグメントをＢａｍＨＩ−消化ｐＧｓ２０、ワクンニアウイルス挿入ベ クター［マケットらの上記文献（１９８４）］にライゲートした。

上記ライゲーション混合物をイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＨ５中で形質転換 し、組換えクローンについてスクリーンした。クローンを単離し、これは、７． ５　Ｋｂ遺伝子プロモーターに関して正しい方向に挿入されたＰＲＶフラグメン ト（ｐ５０：６３：ｇｌ）を有していた。

ｐＲＶ　ＤＮＡフラグメントのワクシニアウィルスへの挿入は、ワタシニアウイ ルスでＣＶ−１細胞を感染し、ｐＶ５０：６３：ｇＩによって該細胞をトランス フェクトすることによって行った。感染の２日後、後代ウィルスの系列希釈をＢ ＵｄＲの存在下で１４３Ｂ　ＴＫ−細胞の単層に吸収し、ＴＫ−組換えウィルス プラークについて選択した。多くのＴＫ−プラークを拾い上げ、ＢＵｄＲの存在 下でＴＫ−細胞上において２４ウエルプレート中で増殖した。感染した培養物の 微量試料をニトロセルロース上で濾過し、ｇｐ５０領域に対して特異的であるＩ Ｐ標識化プローブによってスクリーンした。この方法で、多くの組換え体が５． ３Ｋｂ対ＰＲＶフラグメントを含有していると同定された。該組換え体のうちの １つは、ＢＵｄＲの存在下、ＴＫ−細胞上で３回精製したプラークであり、ＳＴ 細胞を感染させることによって、貯蔵ウィルス調製物を製造した。組換えウィル スをＶｇｐ５０　：６３　：ｇ　Ｉと命名した。

ｇｐ５０　：６３　（Ｖｇｐ５０　：６３）およびｇＩ（Ｖｇｌ）をコートしテ ィる領域を含んでいる２つの別の組換えワクシニアウィルス構築物を作製した。

プラスミドｐ５０：６３：ｇｌをＢａｍＨＩおよびＤｒａｌで消化し、２．４　 Ｋｂフラグメント（ｇｐ５０　：６３暗号領域、第１図）および２．３Ｋｂフラ グメント（ｇｌ暗号領域、第１図）を遊離した。２．４ＫｂフラグメントをｐＧ 　Ｓ　２０のＳｍａＩ部位に対してＢａｍＨＩ中にクローンして、プラスミドｐ ５０　：６３を生成した。２．８　Ｋｂフラグメントを、フレノウフラグメント ＤＮＡポリメラーゼおよび三リン酸デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と−緒に インキュベートすることによって平滑末端とし、ｐＧｓ２０のＳｍａｒ部位に挿 入した（第１図）。適当な方向に組換えプラスミドを含有しているクローンを単 離し、これをｐｇｌと命名した。プラスミドｐ５０　：６３およびｐｇＩを用い て処理して得られた組換えワタシニアウイルスを、各々、Ｖｇｌ）５０　：６３ およびＶｇｌと命名した。

ＣＶ−を細胞を、ラブ−テックス（Ｌａｂ−ｔｅｘ）チャンバースライドしラブ ・テックス（Ｌａｂ　Ｔｅｘ）、　ナパービル、イリノイコ中で融合するまで増 殖した。該細胞を約５ＰＦＵのウィルスで感染し、３７℃で６時間テンキュベー トした。細胞質蛍光の可視化のために、該細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ） 中で洗浄し、冷アセトン中で固定化した。膜蛍光の可視化のためには、アセトン 固定化工程を省略し、該細胞を６５°Ｃで２時間加熱した。３７°Ｃで３０分間 、該細胞を、ＰＢＳにおける腹水の１：５０希釈液と一緒にインキュベートし、 その後、ＰＢＳ中で３回、毎回５分間洗浄した。ＰＢＳにおける１：５０希釈で フルオレセインコンジュゲートヒツジ−抗−マウスＩｇＧ抗血清［カペル・ラボ ラトリーズ（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　　コクランビル、 ペンシルバニア］を添加した。３７°Ｃで３０分後、細胞を上記のように洗浄し 、乾燥し、蛍光パターンを観察した。

■、免疫沈降およびポリアクリルアミド電気泳動５Ｑｘｘ皿中で増殖したＳＴ細 胞（ノーチン・ラボラトリーズ１　リンカーン、不プラス力）を、５ＰＦＵ／細 胞の多重度でワタシニアウイルス、Ｖｇｐ５０　：６３　：ｇ　ＩまたはＰＲＶ のいずれかで感染した。

１時間の吸着時間の後、接種材料を取り除き、５μＣｉ／ｘ１２［”Ｃ］グルコ サミン［アマ−ジャム・コーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｒｐ、　） ＋アーリントン・ヘイツ、イリノイコおよび２％透析ウつ胎児血清ヲ含膏してい る新しい最小必須培地（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕａ＋ ）（ＭＥＭ）２ｘＣと置き換えた。３７°Ｃて１６時間後、該細胞を２回洗浄し 、次いでＰＢＳ中に掻き集めることによって収集した。該細胞を１０００９で５ 分間、遠心分離することによってペレノ）化し、ＲＩ　ＰＡ（１％トリトンＸ− １００，１％デオキシコール酸塩、０゜１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、、 ０．ＯＩＭ）リス−ＨＣ（！５ｐ８７゜２）ｌｘＱ中に再％％　濁した。短時間 の音波処理の後、粉砕された細胞は１２．０００　ｇで１０分間の遠心分離によ って透明になった。

マウス抗体による免疫沈降は、本質的にはケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）のよって 開示されたとおりに行った。簡単には、ホルマリン処理した１００μＱを用いて 、４℃で１時間、放射標識化細胞抽出物５０〜１００μＱを予め吸着させた。該 細胞を、エッペンドルフ遠心管中で２分間遠心分離することによって除去し、水 上で１時間、透明にされた抽出液に腹水１０μｅを添加した。水上で１時間、ニ ス・アウレウス（多ユａｕｒｅ■）１００μＱを添加し、上記のように、細胞を ペレット化した。免疫沈澱物をＲＩＰＡで３回洗浄し、５分間沸騰した電気泳動 試料緩衝液（２％ＳＤＳ、０．２Ｍジチオトレイトール、１０％グリセロール、 ０．２％ブロモフェールブルー、５３ｚＭトリスーＨＣＱ、ｐＨ６，８）６０μ ρ中で再懸濁し、工・ノベンドルフ遠心管中で遠心分離した。レム’）　（Ｌａ ｅｍｍｌｉ）、　　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７：６８０（１９７０） の方法を用いて、１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で上澄み液の微量試 料を分析した。［”Ｃ］放射標識化分子量標準物［アマーンヤム・コーポレーシ ョン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　）＋　　アーリントン・ヘイツ、イリノ イ］を各ゲル上で同時電気泳動した。電気泳動の後、ゲルを固定し、蛍光間接撮 影し、乾燥し、−７０°Ｃで、コダソクス（Ｋｏｄａｘ）　Ｘ−オーマノド（Ｏ ｍａｔ）　Ａ　Ｒフィルム［コダック（Ｋｏｄａｋ）、　　ロチニスター。ニュ ーヨーク］にさらした。ｇｐ５０１こ対して特異的なモノクローナル抗体（ＭＣ Ａ　５Ｏ−１）は、ワテン（−９Ｗ、　Ｗａｔｈｅｎ）の気前のよい寄贈品であ った。このモノクローナル抗体の特徴は、先に開示されている［ワテン（Ｗａｔ ｈｅｎ）ら、ウィルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　４：１９ （１９８５）］。ｇｌに対するモノクローナル抗体は、ルジハ（Ｈ，Ｒｚｉｈａ ）の気前のよい寄贈品であった。

ｇｐ５０およびｇｐ６３遺伝子の暗号領域内に位置する固有の５ａ１１部位は、 ハーク（Ｂｅｒｋ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）の上記文献（１９７７）の方 法に従って、ｇｐ５０およびｇｐ６３転写体の５゛および３゛末端をマツピング するための基準点としての役割をした。５′末端をマツピングするために使用す るＤＮＡプローブを、Ｔ４　ポリヌクレオチドキナーゼ［ビー−エル・バイオケ ミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ）。

ミルウォーキー、ウイスコン／ン］および＞３０００　　μＣ１／ミリモル”Ｐ −ｄＡＴＰ（［三すン酸γ−３′ｐ−デオキシアジノシン］。

アマ−ジャム・コーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）＋　アーリ ントン。

ヘイツ、イリノイ）を用いて、５ａｌＩ部位で末端標識した。標識化フラグメン トを、ＢｓｔＸＩ［マサチューセッツ、ビバリーの二ニー・イングランド・バイ オラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｉａｂｇ）から人手した制限酵素］ で消化し、１．５％アガロースゲルを介して電気泳動によって適当なフラグメン トを単離した。イー・コリ（旦ヨ巴旦）ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメ ントおよびα”Ｐ−ｄＡＴＰを用いてＳａ１部位で末端標識した制限フラグメン トを用いて、３′末端をマツピングした。ＤＮＡをＢｓｔＥ　　ｌ］で消化し、 適当な標識化フラグメントを上記のように単離した。

ｇｌ［ベトロブスキスらの上記文献（１９８６）］（第１図）の暗号領域内に位 置する固有のＢｓｔＥ　　１１部位を、ｇｌ　　ｍＲＮＡの５゛末端をマ・ノピ ングするための基準点とした。ＢｓｔＥ　　Ｉ［で消化し、γ”Ｐ−ＡＴＰの存 在下、Ｔ４ポリヌクレオチドで末端標識することによってＤＮＡ５’プローブを 作製した。次いで、標識されたプローブをＳ　ｔｕ　ＩＩ　”？’消化し、１． ５％アガロースゲルを介して電気泳動によって５′プローブを単離した。フレノ ウフラグメントＤＮＡポリメラーゼおよびα３”Ｐ−ＧＴＰ（［三リン酸α−３ ！Ｐ−グアニジン］、二ニー・イングランド・バイオロジー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて、ＢａｍＨＩ部位を末端標識することによ って、ｇｌに対する３°末端プローブを作製した。次いで、Ｂａａ＋ＨＩフラグ メント１２（第１図）における第２のＳｃｉ１部位を用いて、１．７Ｋｂプロー ブを生成し、上記のように単離した。

イソチオ／アン酸グアニジン抽出［チャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ）ら。

バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８：５２９４（１９７９ ）］およびオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー［アピブ（Ａｖｉｖ）およ びレダー（Ｌｅｄｅｒ）、ブロン−ディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ− ・サブ・サイエンス・ニーニス：ｒ−−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｋ　１．＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　６９：１４０８（１９７２）］ニよッテ、ＰＲＶ感染（８時 間）ＳＴ細胞および調節ＳＴ細胞由来のポリＡ’　ＲＮＡを単離した。１ピコモ ルの放射標識プローブを、８０℃で１０分間加熱することによって、Ｑ、５Ｍ　 ＥＤＴＡ２μＱを含有する９８％ホルムアミド８０μＱ中で変性させた。変性の 後、２００１Ｍパイブス（Ｐゲスｅｓ）（ｐＨ６、４，２，０ＭＮａＣＱ、５貢 Ｍ　ＥＤＴＡ）２０μＱ中ポリＡ’　ＲＮＡ３μ９を添加し、該混合物を６５° Ｃで１６時間インキュベートした。管を水浴中に置き、水冷Ｓ１ヌクレアーゼ緩 衝液（０，２８Ｍ　ＮａＣＱ、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６，４，５ １Ｍ　Ｚｎ５Ｏ，）４５０ｔｔＱを添加した。１５ユニツトの８１ヌクレアーゼ を添加し、試料を３０°Ｃで２時間インキュベートした。試料をフェノール：ク ロロホルムで抽出し、２容量倍のエタノールの添加によって沈澱した。５′末端 マツピングのために、試料を５％ポリアクリルアミド−尿素配列決定ゲル上で画 分した。３゛末端試料は、マクド不ル（ＭｃＤｏｎｎｅｌ）らのジャーナル・サ ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１１０：１１９ （１９７７）によって開示された方法に従って調製した１、０％アルカリアガロ ースゲル上で分離した。

これらのマツピング試験は、２つのａＲＮＡ転写を示す。ｇｐ５０：ｇｐ６３は 、Ｓｃｉ１部位の０．５６Ｋｂ５’で開始し、５ａｌＩ部位の１．８Ｋｂ　３° で終了する共直線性ｍＲＮＡ暗号領域である。ｇ１ｍＲＮＡ転写は、ＢｓｔＥ　 　ＩＩ部位の０．４Ｋｂ５°で開始し、ＢａｌＨＩ部位のＱ、２Ｋｂ　３’で終 了する（第１図）。

■、王又どヱＬ工ｙ刀分封 ３ＳＳ−標識化ｄＡＴＰ［ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）ら、プロシーディンゲス・サ ブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ）　８０：３９６３（１９８３） ］を用いて、ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止反応法［サンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエン ス・ニーニスｊ−−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ ）　７４：５４６３（１９７？）　；メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　１０１：２０（１９８３）］によって配列決定を するために、制限エンドヌクレアーゼ消化またはＢａ１３１欠失（こよって生じ たＤ　Ｎ　Ａフラグメントを、Ｍ１３ベクター中（こサブクローンした。リード （Ｒｅｅｄ）らのバイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　４：３０ ６（１９８６）によって開示された方法に従って、配列決定ゲルを操作ントを配 列決定した。該フラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ”Ｐ− ｄＡＴＰを用いて５°末端標識したかまたはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮ Ａポリメラーゼ１のフレノウフラグメントおよび適当なα３″Ｐ標識化ｄＮＴＰ を用いて３′末端標識した。ＤＮＡの両鎖の配列を決定した。

結果、翻訳開始ＡＴＧコドンがＳ１マツピング試験によって画定された転写開始 部位の３゛　１６〜１９ヌクレオチド間に位置することがわかった。１２０６ヌ クレオチドの読み取り枠は、４０２アミノ酸をコードしている。ＰＲＶのファン クハウザー菌株［シュバ（Ｓｈｕｂａ）ら、ジャーナル・サブ・アメリカン・ベ テリナリー・メディカル・アソシエイション（Ｊ、　Ａｍ、　Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ 、　Ａｓ５ｏｃ、　）　１７３：　１４９０（１９７８）］に対してここで決定 されたｇｐ５０配列は、ライス（Ｒｉｃｅ）菌株［ペトロブスキスの上記文献（ １９８６）］について報告されたものと一致した。

唯一の塩基差は、位置４６８で生じるが、しかし、これによって、アミノ酸変化 は起こらない。

感染Ｖｇｐ５０　：６３細胞抽出物に対するマウス抗体を用いるＣ　”−グルコ サミン放射標識化Ｖｇｐ５０　：６３感染ＳＴ細胞抽出物の免疫沈降によって、 ｇｐ５０：６３発現を試験した。免疫沈殿物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、分子量 ６２Ｋｄから分子ｊ１５８Ｋｄまでの範囲の広がった帯を示した。ワクシニアウ ィルス感染細胞の免疫沈殿の後、タンパクは検出されなかった。ＰＲＶ感染細胞 からの免疫沈殿物の分析は、Ｖｇｐ５０：６３感染細胞のものと同一、（ターン の帯を示した。すなわち、組換えウィルス感染細胞によって合成されたｇｐ５０ ：６３は、ＰＲＶ感染細胞によって合成されたものと非常に類似していると思わ れる。

実施例５　ｒＬワクチン調製 ■、ワタシニア感染細胞の不活化 ２光性エチルイミン（ｂｉｎａｒｙ　ｅｔｈｙｌ　１ｍ１ｎｅ）（Ｂ　Ｅ　Ｉ　 ）の溶液を作るために、水酸化ナトリウムペレット０．８９を脱イオン水１００ １＆に添加し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。２−ブロモエチルアミ ン（ＢＥＡ）２．０５９を添加し、該溶液を３７°Ｃでさらに１時間インキュベ ートした。該ＢＥＩ溶液を感染ウィルス組織培養に添加して、液体の最終濃度を １％にした。色々な時点で、試料を取り出し、ＳＴまたはｃｖ−１細胞の単層上 に接種して、細胞変性効果を調べた。通常、ウィルス調製物を不活化するのに３ ７°Ｃで９６時間で充分であった。該抽出物を常法で１２０時間不活化し、間接 免疫蛍光検査法［つ゛オグト（Ｖｏｇｔ）、　　ファンダメンタル・テクニクス ・イン０バイロロジー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ 　ＶＬｒｏｌｏｇｙ）、　ｐ、３１６（１９６９）］を用いてｃｖ−１単層上で ３つのバックパッセージ（ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅｓ）において試験して、不活 化が完了したことを確認した。

■、免疫化および攻撃プロトフール 特異的な病原にかかっていない（ＳＰＦ）ブタを入手し、予めウィルスにさらさ れていないかを測定するために血清学を行うまで、隔離した。隔離後３、該ブタ にＢＥＩ不活化組換え体（ｇｐ５０　：６３）２価ワクシニア細胞抽出’ｔ（Ｈ ｘＱおよび１０％レシチン鉱油１ｊｌ１２を含有するワクチン調製物２酎で予防 接種した。ブタ（１０〜１５１ｂ、〕間）の首に筋肉内（ＩＭ）接種し、各外界 腔中にビルレント仮性狂犬病ウィルス０．５１Ｑを接種することによって攻撃し た。該攻撃ウィルスはファンクハウザ−（ＩＮＤ−Ｆ２２０８）仮性狂犬病ウィ ルスであり、力価はブタの体重に依存して１０３〜ｌ　Ｑ’　ＴＣＩ　Ｄｓｏの 間であった。

バクテリン調製物に上記調製物２ａＱを添加することによって、混合バクテリン を投与したブタを準備した。バクテリン調製物は以下のように調製した； ブタの幅広い感染防御のために７種類のバクテリア菌株が所望される。バクテリ ンは、パスツレラ・マルトサイグ（ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌＬｏｃｉｄａ ）　ＡおよびＢ型の２種類の菌株、ヘモフィルス・プルロニューモニエ（ｌ（ｅ ｍｏｐｈｉ　ｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）の３種類の菌株（菌 株１．５．７）、ボルデテラ・ブＣＩ７キセブチカ（Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ 濾過した５０％デキストロース３０ｘｆ２および無菌性ウマ血清５０Ｒ（１を含 有する培地中でＯ，０，５〜６まで増殖した。最終濃度０．３４〜０．４５％ま でホルムアミドを添加し、最終濃度０．０１％までメルチオレート（ｍｅｒｔｈ ｉｏｌａｔｅ）を添加することによって、培地を不活化した。無菌性水酸化アル ミニウムゲル（２％）を２５％（Ｖ／Ｖ）溶液に添加した。同様の方法で、パス ツレラ（Ｐ　ａｓｔｅｕｒｅｌ　ｌａ）およびポル用いてＴ４化し、５％ドラケ オール（Ｄ　ｒａｋｅｏｌＴＭ）　［ペンレコ（Ｐ　ｅｎｒｅｃｏ）、パトラ− 、ペンシルベニア］を用いてアジュ／　ｓｊントした以外は、同様の方法で増殖 した。不活化しかつアジ二ノ＜ントしたバクテリン調製物（２ＲＱ）を不活化組 換えＰＲＶサブユニ、７ト調製物１５１１２と混合することによって混合ワクチ ンを調製した。

攻撃前血清を毎週回収した。攻撃後血清を、攻撃の後、最初の３日間回収し、血 液は、７日目および１４日目に回収した。さらに、攻撃後の臨床学的測定は、温 度、体重増加、扁桃スワブ（ｔｏｎｓｉｌｓｖａｂｓ）であり、ウイルスシェデ ィング（ｖｉｒｕｓ　ｓｈｅｄｄｉｎｇ）のレベルを測定した。ウイルスシェデ ィングは、臨床学的観察期間に陽性の細胞変性効果を示す各予防接種グループに おけるブタの数で評価した。

扁桃スワブをＰＢＳ１Ｎ＋２中で渦動させ、全混合物を１１１２／１２ゲンタマ イシンを含有する１９９Ｅ培地［ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　グランド・アイランド、ニューヨークコ中でＳ Ｔ細胞の単層を含有する２４ウエルクラスタープレート上に接種した。

■、ウィルス中和抗体滴定 ９６ウエルプレートを用いて、プレートの左側の第１列目に加熱不活化ブタ血清 １００μＱを添加した。ＰＲＶウィルス中和におけるブタ試料は、２つ操作した 。ゲンタマイシン（Ｉ　ＲＱ／Ｑ）で処理した１９９Ｅ培地５０μＱを残りのウ ェルに添加した。２倍の系列希釈液を調製し、１９９Ｅ培地中のＰＲＶウィルス ［１：５００に希釈したブカレスト菌株］５０μＱを該ウェルに添加した。該プ レートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、５％ウ シ胎児血清中でｌ：３に希釈したＳＴ細胞１００μｅを添加した。該プレートを ３７℃でインキュベートし、３日後にプラーク形成を測定した。

■、ササブニットワクチンｍ１（Ｓ　Ｕ　Ｖ　Ａ）仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ ）サブユニットワクチン（ＳＵＶＡ）の調製において用いるためのＰＲＶ（Ｉ　 ＮＤ−Ｆ）菌株を、ノーチン・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｄｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）のブタセルラインＮＬ−３Ｔｌ中で増殖させた。ＮＬ−３Ｔ　　ｌ 細胞を増殖させるために用いた増殖培地は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および ０．０２５％ラクトアルブミン加水分解産物（ＬＡＨ）を補足したアーレス塩（ Ｅａｒｌｅｓ’５ａｌｔｓ）（１９９Ｅ培地）を有する培地１９９［ギブコ・キ ャット（Ｇｉｂｃｏ　Ｃａｔ、）　＃４００−１１００．グランド・アイランド 、二ニーヨーク］である。保存培地は、ＦＢＳまたはＬＡＨを有していない培地 １９９Ｅである。

培養物は回転容器中またはマイクロ担体上で増殖させてもよい。

マイクロ担体は、マイクロ担体スピナーフラスコまたは発酵型中に維持してもよ い。増殖培地の使用量は、回転容器８５０ｃｍ”当たり５００村、回転容器２２ ００ｃｉ”当たり１．０ＯＯｘＱまたはマイクロ担体培養物中サイトデックス　 ３（Ｃｙｔｏｄｅｘ　３”）［ファルマコ（Ｐｈａｒｍａｃｏ）、　　ビス力夕 つエイ、ニューシャーシー］１．５ｙ当たり１゜０００ＩＱである。

５ＵＶＡの製造用細胞は、増殖培地中で全体的に８５〜９０％まで増殖する。増 殖培地をデカントし、種ウィルスを感染の多重度（Ｍｏｌ）５まで添加する。高 いＭｏｌを用いて、単一サイクル複製を確実なものにする。次いで、回転容器培 養物を保存培地（ウィルス接種材料はデカントしない）で増殖培地の初期量の１ ７５にし、単層中の８０〜９０％の細胞が、細胞単層から取り外せないがウィル ス性感染によって膨張して丸くなるまで、３７℃でインキュベートした。マイク ロ担体培養物は、培養物を保存培地で増殖培地の初期量の半分まで充填した以外 は、同様の方法で処理した。

８０〜９０％の細胞単層が感染すると、保存培地／ウィルスシード懸濁液をデカ ントし、−７０°Ｃで細胞単層を凍結することによって、培養物を集めた。単層 を解凍し、０．０２５Ｍ）リス−トリシン（Ｔ　ｒｉｓ−Ｔ　ｒｉｃｉｎｅ）緩 衝液ｐＨ８，６を、細胞単層８５０ｃｍ”当たり緩衝液３１１Ｑの割合で添加す る。この懸濁液を４℃に維持し、軽く音波処理して細胞を分裂させる。トリトン （Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００非イオン洗剤を添加して、最終濃度を１％にし 、該懸濁液を４℃で一晩撹拌しする。５ＵＶＡをマイクロ担体培養物中で製造し た場合、懸濁液を２．０００　Ｘ９で３０分間遠心分離して、不溶の細胞デブリ スおよびマイクロ担体を除去する。上澄み液を１００，０ＯＯＸ９で１時間遠心 分離して、水性層から脂質層を分離し、液体クロマトグラフィーによって生成す るために水性層（粗５ＵＶＡ）を集めた。

粗５ＵＶＡをヒラマメ（ｌｅｎｔｉｌ　ｂｅａｎ）レクチンカラムにかけ、次い で、２８Ｏｒ＋ａ＋での吸収によって測定してタンパクが溶出しな（なるまで、 ０．０２５Ｍ）リス−トリシン緩衝液、ｐＨ８，６で洗浄する。

洗浄後、特異的に結合したタンパクを、ｏ、ｏ２５ｒｖｉトリス−トリシン緩衝 液、ｐＨ８，６中０．３Ｍメチル−Ｄ−マンノサイドで溶離する。特異的に溶離 した物質は、５ＵＶＡである。タンパク濃度を測定し、５ＵＶＡを５０μ９／ａ Ｑを含有するように希釈し、アジニμＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌性マウス（６〜 ８週齢）を、完全フロインドアジュバント中で乳化した傾斜−精製・加熱−不活 化（６０°Ｃで１時間）ＰＲＶ［インディアナーファンクハウザ−（ＩＮＤ−Ｆ ）］菌株（５０μ９タンハク）０．２ＩＱで皮下的に免疫化した。マウスを、ア ジ−バントを伴わずに生菌ウィルス（１００μ２タノバク）による腹腔内（ｉ、 　ｐ、　）接種によって４週間後に投与した。免疫化動物を、最後の抗原注射後 ３日目に殺し、肺臓細胞をＮＳＩ／Ａｇ４　　マウスプラスマーナル・アンチボ ディーズ（）ｌｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、　ｐ、３（１９８６）］と融合させた。

ＥＬＩＳＡによって培養上澄み液をスクリーニングすることによって、ＰＲＶグ リコプロティンに対する抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。培養上澄み 液を、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに添加し、ＰＲＶのＩＮ Ｄ−Ｆまたはブカレスト（ＢＵＫ）菌株からの粗ウィルス調製物を最善の濃度で 塗布した。

ＰＲＶのＢＵＫ菌株は、ノーチンの認可されたワクチン菌株であり、ｇＩグリコ プロティンを製造しない［ルムニクツィ（Ｌｕｍｎｉｃｚｉ）ら、ジャーナル・ サブ・パイロロジー（ＪＪｉｒｏｌ、）　６１ニア９６（１９８７）］。非感染 細胞による同様の調製物で塗布したウェルは、対照の役割をした。結合した抗体 を、ペルオキシダーゼ−標識化ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン（γ−鎖特異性 ）によって検出した。Ｉ　ＮＤ−Ｆと反応し、かつＢＵＫもしくは細胞対照物と あまりもしくは全く反応しないことを示す抗体を産生ずるハイブリドーマを、さ らに特徴付けのために増殖した。希釈を制限することによって陽性ハイブリドー マを２回クローンした。２−ＩＢ４と命名したハイブリドーマを、腹水の製造お よび診断ＥＬ　Ｉ　ＳＡの改良のために使用した。

組織培養中で継代を増加した後、抗体の産生のためのハイブリドーマの安定性を ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって測定した。培養上澄み液またはマスター／−ドハイブリ ドーマの製造の前もしくは後に得られた腹水の２倍系列希釈液を、先に記載され たように、ＰＲＶ−ＩＮＤ−Ｆ抗原−塗布マイクロタイターウェル中で試験した 。

液体を含有する抗体の力価は、基質と一緒に１５分間インキュベートした後、吸 光度（Ａ、。５）０．３００を与えるための希釈の逆数として算出した。結果、 培養上澄み液の抗体力価がハイブリドーマの２０継代と本質的に同じ長さのまま であることを確認した。腹水の抗体力価は、ブレマスターンードまたはマスター ンードハイブリドーマ細胞のいずれから産生されたものであってもほぼ一致した 。

■、腹水 クローニングによって得られたハイブリドーマを、腹水の製造用Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ 　／　ｃ雌性マウス（１０〜１４週齢）に注射し７た。マウスを、食塩水中ｌＸ ｌ０＠ハイブリドーマ細胞で腹腔内（ｉ、ｐ、）接種する７〜１０日前にプリス タン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５１１２で腹腔肉処理した。ハイプリドーマ細 胞の注射の１０〜１２日後に腹水を回収した。２゜５００　ＸＩＦで３０分間の 遠心分離によって細胞を除去し、液体を微量試料に分けて一７０°Ｃで凍結した 。

■、モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ診断キット競合ＥＬ［ＳＡ診断キッ トに関する全ウィルスの代わりに第１抗原として組換えｇｌタンパクを用いた。

４００μｇ〜６００μ９の最適濃度好ましくは５００μ９の、ＰＲＶ　　ＩＮＤ −Ｆ菌株に対するウィルス抗原調製物でポリスチレンマイクロタイタープレート のウェルを塗布することによって診断ｇＩ競合ＥＬＩＳＡ試験を行う。

炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６（脱イオン８．０　１１２当たり、Ｎ　ａ＝ ｃ　Ｏ３１、５９９、ＮａＨＣ○３２．９３９＞中で希釈した全ウィルス抗原１ ００μＱでウェルを塗布した。使用前に、プレートを４℃で１８時間インキュベ ートした。抗原塗布プレートを、０．０５％トゥイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０ を含有するリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ−Ｔｖ）で３回洗浄した。今後の全て の洗浄工程は、この方法で行った。ＰＢＳ−１％ウシ血清アルブミ：／（Ｐ　Ｂ 　Ｓ　−Ｂ　Ｓ　Ａ）２５０　ｕＱを各ウェルに添加することによって残存する 結合部位をブロックし、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。プレ ートを３回洗浄し、ブタ血清試料５０μＱをウェルに添加した。３７°Ｃで１時 間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡＳ上中クロー ナル抗体（Ｍａｂ）の最適な希釈液５０μＱをウェルに添加した。プレートを３ ７°Ｃで１時間インキュベートした。洗浄したプレート中の結合Ｍａｂを、ＰＢ Ｓ−ＢＳＡ中で希釈したベオキンダーゼー標識化ヤギ、抗−マウス免疫グロブリ ン（γ−鎖特異性）５０μＱの添加によって検出した。３７℃で１時間のインキ ュベーションの後、プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ（２，２°−アジノージ［３− エチル−ベンゾチアゾリンスルホナート（６）］；カークガード・アンド・ベリ ー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｇｕａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ）。

ゲイザースバーグ、メリーランド）基質１００μｇをウェルに添加した。室温で 基質と一緒に１０〜１５分間インキュベートした後に、吸光度（Ａ、。、）を測 定した。

Ｌｇｌ遺伝子プローブ単離 Ｉ　ＮＤ−ＦゲノムＤＮＡのＵ８領域を表す組換えＤＮＡクローンを、診断遺伝 子プローブの原料として用いる。遺伝子プローブのために用いる該領域は、第１ 図に示すように、Ｄｒａｌ−Ｂａ＠ＨＩ部位間でコードしているＤＮＡを含んで いる。Ｄｒａｌ　−Ｂａａ　ＨＩ部位は、ｇｌタンパクに関する主要な暗号体（ ｃｏｄｉｎｇ　ｂｏｄｙ）と一致する。

Ｂａｇ　ＨＩ　−３ａｌ　　１部位を表す第２のプローブは、ｇＩ　　ａＲＮＡ の末端領域に関する第２プローブとして作用する（第１図）。両遺伝子フラグメ ントは、ｇｌ　＋１ＲＮＡ転写を為すために用いられる暗号領域がゲノムＤＮＡ 中に存在するが否かを測定するために必要である。

放射標識化Ｄｒａ　ＨＩ−ＢａＩＩＩＨＩまたはＢａｓ＋ＨＩがら５ａｉｌまで は、仮性狂犬病ＢａｍＨ１消化ゲノムＤＮＡに対してハイブリダイズし、ｇｌ　 　ｍＲＮＡ領域の非存在または存在を確認することができる。遺伝子プローブ合 成および分析の技術は、前記［マニアティスらの上記文献（１９８２）］に従っ て行うことができる。

ｇｌ遺伝子欠失の診断試験は、ＰＲＶ由来全ウィルスＤＮＡを抽出し、その後、 単離し、ＢａｍＨＩによって全ウィルスゲノムＤＮＡ１〜２μ９を消化すること によって行われる。標準的な研究室方法を用いて、フラグメント化ＤＮＡを１％ アガロースゲル上で溶解し、分解し、ニトロセルロースに移した。次いで、ゲノ ムＤＮＡを、ＰＲＶ　Ｕｓ　ＤＮＡの選択された領域を表す酵素または放射性同 位体標識化ＤＮＡによってプローブする。個々のＤＮＡ帯、例えば、Ｄｒａｌ　 　ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ（ｇｌ）に特異的であるＤＮＡ帯を、Ｘ−線フィルムに 暴露することによって検出することができる。

実施例７：混合ワクチンの調製 バクテリンの製造に用いられる培養物を、１〜３ユニツトの光学密度（ＯＤ）ま で増殖させ、次いで、β−プロピオラクトン（Ｂ　Ｐ　Ｌ）を０．２％の最終濃 度まで添加することによって不活化する。次いで、培養物を２０°Ｃで１２時間 撹拌し、ホルマリン［ボルデテラ（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　１ｕｓ）に関する０、 １％グルタルアルデヒドコで固定した。

有効な免疫化投与に必要な量を各々から取り出し、１つのバッチ中で混合する。

通常、混合不活化調製物は、合計２〜４１１２である。調製物をアジュバントす るために、該調製物を乳化器［ローズ・エマルシファイヤー（Ｒｏｓｓ　Ｅａｕ ｌｓｉｆｉｅｒ）、　ロング・アイランド、ニューヨーク］中に置き、レシチン しエムアールケイニス・マーケラティング・サービス（ＭＲＫＳ　Ｍａｒｋｅｔ ｉｎｇ　５ｅｒｖｉｃｅ）、オマハ、ネブラスカ］を含有スル鉱油［ヘンレコ（ Ｐｅｎｒｅｃｏ）、プルター、ペンシルバニア］（モしくは他の望ましいアジュ バント）を５％まで添加する。バクテリンを、調製物が均一になるまで撹拌また は混合する。トゥイーン８０　（Ｔｖｅｅｎ　８０　ＴＭＸ　１４１＋１２／１ ２）およびスパン８０（Ｓｐａｎ　８０”）（６１１２１０［シグマ・ケミカル ・コーポレーション（ＳｉｇＩＩｌａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）＋　セント・ ルイス、ミズリー］を添加して、油相の乳化を助長する。

ワクチン組換えＢＥＩ不活化ＰＲＶサブユニット調製物（上記実施例参照）を上 記に従って単独で乳化するか、または乳化の前にバクチリンと混合して置くこと ができる。４種類またはそれ以上の病原を含有している代表的な混合物は、アジ ュバントの後に投与当たり３〜５ＲＱであり、投与当たり０．１〜１３１（２は 、個々の病原調製物の代表例である。

実施例８：伝染性胃腸炎組換えＤＮＡ遺伝子の仮性狂犬病ｇｐ５０・ｇｐ６３遺 伝子への融合 伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウィルス由来遺伝子をワクシニア−ＰＲＶ　ｇｐ５０　 ：ｇｐ６３組換えクローンに融合して、多価ワクチンを構築することができる。

ＴＧＥグリコプロティンＥ１またはヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子を、ＲＮＡポ リメラーゼの再開のために最適の距離でｇｐ５０：６３領域に組換えすることが できる。ワク／ニア７．５ＫｄプロモーターおよびＴＧＥＥＩまたはＮ遺伝子を 含有する転写カセットを、標準的なイー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ）ンヤトル ベクターにおいて構築することかできる。次いで、転写カセットを、プラスミド ｐｃ　Ｓ　２０中に存在するワク／ニア７．５Ｋｄプロモ一ターＰＲＶｇｐ５０ ：６３領域の上流または下流に転移することができる。次いで、多価プラスミド ｐ５０：６３：ＴＧＥを、上記実施例に記載したように、ＴＫ−ワタシニア内に 組換えすることができる。得られた組換えウィルスは、ブタにおけるＰＲＶまた はＴＧＥ誘発疾患に対する不活化ワクチンとして用いるための多価サブユニット 成分を含有している。

同様の方法で、ブタについて問題である病原［ブタの赤痢、マイコプラズマ０ニ ユーモニエ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｔ＋ｍｏｎｉａ）、ブタのパルボウ イルス、ブタのインフルエンザコ由来の他の遺伝子を、組織培養におけるサブユ ニット抗原の産生のための第１ベクターとしてワクシニア−ＰＲＶ　ｇｐ５０： ６３を用いて、多価ワクチンと一体化することができる。

上記記載および実施例は、好ましい具体例を含んでいる本発明を充分に説明して いる。ワクチン製造の技術分野における当業者に明白である上記方法の変形は、 以下の請求の範囲の範囲内である。

邑り咀 国際調査報告 Ｉ）Ｃ！ｒ’／ＩＦ；　ＲＱ／ｎｎＡ＋４

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）危険な副作用を伴わずに仮性狂犬病ウイルスによる感染に対する免疫性を 誘発することができる動物に投与するための組換え仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ ）ワクチンであって、有効量の組換えＰＲＶ２価サブユニット抗原、ｇｐ５０： ６３を含有することを特徴とするワクチン。
2. （２）２価サブユニット抗原が、２つの仮性狂犬病タンパクｇｐ５０およびｇｐ ６３に対して共直線性転写を発現するＰＲＶＤＮＡフラグメントから誘導される 請求項（１）記載のワクチン。
3. （３）１ｍｌ当たり組換えＰＲＶサブユニット抗原１．０〜１００μｇを含有す る請求項（１）記載のワクチン。
4. （４）１ｍｌ当たり組換えＰＲＶサブユニット抗原５μｇを含有する請求項（３ ）記載のワクチン。
5. （５）ａ）ワクシニアウイルス組織培養系中でＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ５ ０：６３を発現し； ｂ）化学的不活化剤で工程（ａ）で得られた組換えウイルスを処理し；次いで、 ｃ）ワクチン中への製剤化のために不活化組換えウイルスおよび細胞抽出物を回 収する ことを特徴とするＰＲＶ感染に対するワクチンの製造方法。
6. （６）二元性エチレンイミンで組換えワクシニアウイルスを処理することによっ て化学的不活化を行う請求項（５）記載の方法。
7. （７）サブユニット抗原、ｇｐ５０：６３を発現する不活化組換えワクシニアウ イルスと、油−レシチン、タイルＡ（ＱｕｉｌＡＴＭ）、アルヒドロゲルまたは 鉱油からなる群から選択されたアジュバントとを混合することによって、サブユ ニット抗原をワクチン中に製剤化する請求項（５）記載の方法。
8. （８）不活化組換えウイルスと油−レシチンアジュバントとを混合することによ って、サブユニット抗原をワクチン中に製剤化する請求項（７）記載の方法。
9. （９）ＰＲＶｇｐ５０：６３サブユニット抗原を発現することを特徴とする組換 えワクシニアウイルス。
10. （１０）不活化された請求項（９）記載の組換えワクシニアウイルス。
11. （１１）二元性エチレンイミンで不活化された請求項（１０）記載の組換えワク シニアウイルス。
12. （１２）ｇｐ５０：６３暗号配列を７．５Ｋｄ遺伝子ブロモ−ターに操作的に結 合させた請求項（９）、（１０）または（１１）記載の組換えワクシニアウイル ス。
13. （１３）動物に鼻腔内、筋肉内、腹腔内、皮下または経口投与するのに適してお り、組換えＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ５０：６３１．０〜１００μｇを含有 している液０．１〜５．０ｍｌからなることを特徴とするＰＲＶによる感染に対 する免疫を誘発するためのワクチン投薬ユニット。
14. （１４）組換えＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ５０：６３の有効量、および別の 病原微生物またはウイルスによる感染に対して保護的である１またはそれ以上の 他の抗原の有効量からなることを特徴とする、危険な副作用を伴わずに、ＰＲＶ および１またはそれ以上の他の病原微生物もしくはウイルスによる感染に対して 動物において免疫を誘発することができる経口、筋肉内、腹腔内、皮下または鼻 腔内投与用混合ワクチン。
15. （１５）２価サブユニット抗原が、伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルス感染に対し て保護的である抗原と、遺伝学的または化学的に融合する請求項（１４）記載の 混合ワクチン。
16. （１６）ＰＲＶサブユニット抗原、ｇｌ、およびｇｌに対する動物由来血清にお ける抗体の結合を検出するための１またはそれ以上の試薬からなることを特徴と する動物におけるＰＲＶ感染の検出用診断キット。
17. （１７）ａ）組換え宿主細胞または微生物中でＰＲＶサブユニット抗原、ｇｐ５ ０：６３を誘発し； ｂ）ワクチン中への製剤化のために抗原を回収することを特徴とするワクチンの 調製方法。
18. （１８）抗原、ｇｐ５０：６３。
19. （１９）ワクチン薬として使用する請求項（１８）記載の抗原。
20. （２０）動物における仮性狂犬病ウイルスによる感染に対する免疫を誘発するの に使用する請求項（１８）記載の抗原。
21. （２１）動物における仮性狂犬病ウイルスによる感染に対する免疫を誘発するた めのワクチンの製造における請求項（１８）記載の抗原の使用。