JPH0324061A - 新規な被酸化性呈色試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野コ 本発明は，新規なトリアリールイミダゾール誘導体、及
びこれを発色成分として用いる酸化性物質又はペルオキ
シダーゼ様物質の定量方法に関する。

［発明の背景］ 生体成分，例えば血液や尿などの体液或分を測定するこ
とは，その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断，病態の解明，治療経過の判定を行う上で，必須
なものとなって〜νる．例えば、血液中のコレステロー
ル，トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸，モノアミンオキシダーゼ等を初め、非常に多種
類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断上
役立っていることは周知の通りである。

現在，血清或分の測定法としては，それが酵素以外のも
のである場合には、目的或分に特異的に作用する酵素を
用い、また，目的或分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行い，これによ
る生成物を測定して目的或分量を求める、所謂１１酵素
法”が一般的に広く普及している．なかでも、Ｈ２０２
生成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的或分に相
当するＨ２０２を生威させ、これをペルオキシダーゼ、
及び発色或分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に
導き、その呈色を比色定量することにより目的成分量を
求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加
しつつある．例えば、コレステロールーコレステロール
オキシダーゼ、トリグリセライドーリポプロテインリパ
ーゼーグリセロールオキシダーゼ、尿酸一ウリカーゼ等
の組み合わせで発生するＨ２０２を，ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）、被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き，
その呈色の吸光度を測定することにより目的或分量を求
める方法がそれである．この方法に於いて用いられる発
色或分である被酸化性呈色試薬の代表的なものとしては
，４−アミノアンチピリンとフェノール系化合物又はＮ
，Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを組み合わせた被酸化
性呈色試薬，３−メチル−２−ペンゾチアゾリノンヒド
ラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組み合わせ
試薬，　２．２’−アジノビス（３ーエチルベンゾチア
ゾリノン−６−スルホン酸），トリフェニルメタン系ロ
イコ色素、ジフエニルア稟ン誘導体、ベンジジン誘導体
，０−トリジン誘導体，Ｏ−フエニレンジアミン等が挙
げられる．しかしながら、これら従来から用いられてい
る被酸化性呈色試薬は、ジフエニルアミン誘導体を除い
た大部分がその呈色波長が８００ｎｓ以下であり，ビリ
ルビン，ヘモグロビン等の血清或分の影響を受け易く（
尿中成分測定時には尿中の色素体の影響を受け易い．）
，また，４−アミノアンチピリンとの組み合わせ試薬や
トリフエニルメタン系ロイコ色素の一部を除いて、何れ
も色原体の安定性が低い等の問題点を有する． 一方、比較的色原体の安定性が良く、また、呈色波長が
比較的長波長側にある色原体として、染料前駆体（ロイ
コ色素）のトリアリールイミダゾール誘導体が開示され
ている（特公昭５７−５５１９号公報，特公昭５７−２
８１１８号公報、特開昭５８−４５５７号公報、特開昭
６１−１７４２８７号公報、特開昭６１−２２７５７０
号公報，米国特許第３２９７７１０号公報等）。

しかしながら、これら既存のトリアリールイミダゾール
誘導体に於いても、これらを発色成分とする試薬を用い
て，血清等の生体試料中の微量或分の測定を行った場合
には，生体試料中の共存物質の影響により呈色感度が低
下する，言い換えれば、生体体液中の共存物質の影響に
より発色が妨げられるという問題点がある。従って、こ
れら既存のトリアリールイミダゾール誘導体にしても血
清や尿等の生体試料中の微量成分の測定に於ける発色或
分としては，未だ十分満足のいくものであるとは言えな
い。

［発明の目的コ 本発明は，上記した如き状況に鑑みなされたもので，血
清或分による呈色感度の低下が殆どなく、しかも測定感
度が高く且つ吸収極大が長波長側にある色素を生戒する
新規なトリアリールイミダゾール誘導体、及び該化合物
を発色或分として用いる酸化性物質及びペルオキシダー
ゼ様物質の精度の高い測定法を提供することにある． ［発明の構或コ 本発明は、一般式［Ｉ］ ■ Ｃ＝Ｏ ｌ ＮＨ １ Ｒ１ （式中、Ｒｌは置換基を有していてもよいアリールスル
ホニル基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニ
ル基，カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表
わし−Ｒ２　Ｒ３及びＲ４は夫々独立して置換基を有し
ていてもよいアリール基を表わす．但し，Ｒ２　Ｒ３及
びＲ４の内、少なくとも工つはイミダゾール環に対して
Ｐ位の位置にヒドロキシ基又は置換基を有していてもよ
いアミノ基を有する置換フェニル基を表わす．）で示さ
れるトリアリールイミダゾール誘導体、及び該化合物を
発色成分として用いる酸化性物質の定量方法、並びに該
化合物を発色或分として用いるペルオキシダーゼ様物質
の定量方法の発明である． 即ち，本発明者らは、所謂゛酵素法″′に於いて広く用
いられている種々の被酸化性呈色試薬が有する上記した
如き問題点を解決すべく鋭意研究の途上、２，４．５−
　トリアリールイミダゾール（但し，３つのアリール基
の内、少なくとも１つはイミダゾール環に対してｐ位の
位置にヒドロキシ基又は置換基を有していてもよいアミ
ノ基を有するＷｔ換フエニル基である．）の１位のＮ原
子に，更にアリールスルホニル基、アルキルスルホニル
基、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を有す
るカルバモイル基を導入した場合には、従来のトリアリ
ールイミダゾール誘導体に於ける問題点，即ち血清等の
生体試料中の共存物質により発色が妨げられると言う現
象を最小限度に抑え得ることを見出し、本発明を完或す
るに至った．一般式［１１で示される本発明のトリアリ
ールイミダゾール誘導体に於いて、Ｒ１として示される
置換基を有していてもよいアリールスルホニルられ，置
換基としては、例えばメトキシ基，エトキシ基，プロボ
キシ基等の低級アルキコキシ基、例えば沃素，臭素，＠
素，弗素等のハロゲン原子、アミノ基等が挙げられる．
また、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基
のアルキル基としては，例えばメチル基，エチル基，プ
ロビル基，ブチル基等の炭素数ｌ〜４の低級アルキル基
（直鎖状、分枝状の何れにても可）が挙げられ，ｒＩ１
換基としては、例えばメトキシ基，エトキシ基，プロポ
キシ基等の低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、ヒドロキ
シエトキシ基等が挙げられる。また、アルコキシカルボ
ニル基のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基，エ
トキシ基，プロボキシ基，ブトキシ基等の炭素数１〜４
の低級アルコキシ基（直鎖状、分枝状の何れにても可）
が挙げられる。

この他にＲｌとしてはカルボキシル基が挙げられる． Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で示される置換基を有していてもよ
いアリール基のアリール基としては、例えばフェニル基
，トリル基、エチルフェニル基，ナフチル基、メチルナ
フチル基等が挙げられ，置換基としては，例えばメトキ
シ基、ヱトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基等の炭素
数ｌ〜４の低級アルコキシ基（直鎖状、分枝状の何れに
ても可）、アルキルカルボニル基［アルキルカルボニル
基のアルキル基としては，例えばメチル基，エチル基，
プロビル基，ブチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル
基（直鎖状、分枝状の何れにても可）が挙げられる．コ
、置換基を有していてもよいアリールカルボニル１＆［
アリールカルボニル基のアリール基としては、例えばフ
エニル基，トリル基、エチルフェニル基、ナフチル基，
メチルナフチル碁等が挙げられ、これらアリール基への
置換基としては，例えばメトキシ基，エトキシ基，プロ
ポキシ基，ブトキシ基等の炭素数１〜４の低級アルコキ
シ基（直鎖状，分枝状の何れにても可）、例えば沃素，
臭素，＠素，弗素等のハロゲン原子、ア主ノ基等が挙げ
られる．］、置換基を有していてもよいアミノ基［ｌＩ
！換基としては、例えばメチル基，エチル基，プロビル
基，ブチル基等の炭素数ｌ〜４の低級アルキル基（直鎖
状，分校状の何れにても可），例えばヒドロキシメチル
基，ヒドロキシエチル基，ヒドロキシプロビル基等のヒ
ドロキシアルキル基、例えばカルボキシメチル基．カル
ボキシエチル基，カルボキシプロビル基等のカルボキシ
アルキル基，例えばスルホエチル基，ス挙げられる．こ
れらＲ２、Ｒ３及びＲ４は互いに同じであっても異なっ
ていてもよいが，Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の内，少なくとも
ｌつはイミダゾール環に対してＰ位の位置にヒドロキシ
基又は置換基を有していてもよいアミノ基を有する置換
プエニル基であることを要す． 一般式［Ｉ］で示される本発明のトリアリールイミダゾ
ール誘導体は例えば以下のようにして容易に合或し得る
． 即ち、例えば一般式［■コ Ｏ １１ Ｒ’−　Ｃ　Ｈ　　　　　　　［■］ （式中、Ｒ４は前記に同じ。） で示される化合物（以下、化合物■と略記する。）と，
一般式［ＩＩ１］ （式中、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。）で示される化合
物（以下，化合物■と略記する。）と、＃酸アンモニウ
ム（或はアンモニア，炭酸アンモ多ウム等）とを酸性溶
媒中で反応させる、公知の方法（Ｅ．Ｆ．Ｓｉｌｖｅｒ
ｓｍｉｔｈ，　　Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ　３，２９７，
７１０号、１９８７）により反応させて，一般式［ｒＶ
］（式中、Ｒ２．Ｒ３及びＲ４は前記に同じ．）で示さ
れるイミダゾール誘導体（以下，化合物■と略記する。

）とし、次いでこれに一般式［Ｖ］Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ　
　　　　　［Ｖ］ （式中　Ｒｌは前記に同じ．） で示されるイソシアネート誘導体（以下，化合物Ｖと略
記する．）を反応させることにより本発明のイミダゾー
ル誘導体を得ることができる．更に具体的には、化合物
■と、化合物Ｕ１モルに対して０．２〜１モル、好まし
くは０．５〜０．６モルの化合物■、及び化合物■１モ
ルに対して１〜２０モル，好ましくは２〜ｌＯモルの＃
酸アンモニウム等とを，酢酸、プロピオン酸等の酸性溶
媒中、１００〜１５０℃、要すれば還流下で，２〜５時
間反応させた後、常法によりＷＩ製して化合物■を得、
次いで化合物■と，化合物■１モルに対して１〜１０モ
ル、好ましくは１〜３モルの化合物Ｖを、例えばクロロ
ホルム，ジクロ口メタン，ジクロ口エタン，トリクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素溶媒中で、Ｏ〜３０℃で
１〜７２時間反応させた後、常法により精製することに
より本発明のトリアリールイミダゾール誘導体を得るこ
とができる。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体の製造に用い
られる化合物■としては、一般に市販されているフエニ
ルアルデヒド誘導体やナフチルアルデヒド誘導体を用い
れば足りるが、相当するフエニル誘導体或はナフチル誘
導体をフィルスマイヤー反応等の常法によりホルミル化
することによっても容易に得られるので、このようにし
て得たものを用いてもよい．化合物■は，相当するフェ
ニル誘導体又は／及びナフチル誘導体とオキサリルクロ
リドとをフリーデルクラフッ反応させることにより容易
に得られるので、そのようにして得たものを用いれば足
りる．＊た、化合物Ｖは、一般に市販されているイソシ
アネート誘導体を用いれば足りるが、相当するカルボン
酸ア粟ドを原料としてホフマン転移反応により容易に得
られるので、そのようにして得たものを用いてもよい。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は，水或は界
面活性剤の共存する緩街液中で極めて安定であるが、こ
れを酸化剤により酸化，例えばペルオキシダーゼの存在
下過酸化水素により酸化すると呈色安定性に優れた色素
を定量的に形成する。

しかも、本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、
既召，のトリアリールイミダゾール誘導体を用いて同様
の方法により発色させた場合と比較して，血清や尿等の
生体体液中の成分により発色が妨げられるという現象が
殆ど生じないと言う性質を有し，しかもその分子吸光係
数はＤＪ−のトリアリールイミダゾール誘導体から生じ
る色素と同等かそれ以上である．従って，本発明のトリ
アリールイミダゾール誘導体は、酸化性物質の定量やペ
ルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色或分として有
効に用い得るが，とりわけ酵素反応により生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、その
呈色を比色定量することにより行う生体試料中の微量或
分の定量に於ける発色或分として有効に使用し得る。

即ち、本発明の酸化性物質の定量方法は、基質，又は酵
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することにより行う、生体試料中の
微量或分の定量方法として特に効果的に使用し得る。

本発明の定量方法により測定可能な生体試料中の微量成
分としては、例えばコレステロール、グルコース、グリ
セリン，トリグリセライド，遊離脂肪酸，尿酸，リン脂
質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ，グアナーゼ、コ
リンエステラーゼ等が挙げられるが，これらに限定され
るものではなく，酵素反応により生成する過酸化水素を
定量することにより測定が可能な生体或分は全て定量が
可能である． 本発明の定量方法は、発色剤（被酸化性呈色試薬）とし
て本発明のトリアリールイミダゾール誘導体を用いる以
外は自体公知の酵素法（Ｈ２０２生成酵素を用いる）に
よる定量方法に準じてこれを行えば足りる。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体の発色剤とし
ての使用濃度としては、特に限定されないが，通常数μ
ｍｏ１／１以上、好ましくは５０〜１００μｍｏＪ／ｌ
の濃度範囲が用いられる． 本発明の定量方法による生体戊分の定量に於いて、過酸
化水素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オ
キシダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並び
に酵素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び
使用量は，被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体或
分の定量方法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて
適宜選択すればよい．また、本発明による過酸化水素の
定量に於いて用いられるペルオキシダーゼ又はペルオキ
シダーゼ様物質としては、その起源、由来に特に限定は
なく、植物，動物、微生物から得られるペルオキシダー
ゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、１種若しくは要すれ
ば２種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量
は目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。

本発明の定量方法による生体或分の定量は、通常ＰＨ４
．０〜１０．０，好ましくはＰＨ６．０〜８．０で実施
される．用いられる緩衝剤としては．リン酸塩、−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）等
のグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤等の通常この分野で用い
られる緩ｍＭが挙げられるが、特に限定されない。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、過酸化水
素，過沃素酸等の酸化性物質の定量に有効に用い得るが
，また、これと過酸化水素とを組み合わせることにより
ペルオキシダーゼ様物質の定量を行うことも可能である
。ペルオキシダーゼ様物質としては、ペルオキシダーゼ
そのものの他、ヘモグロビンその他のヘム化合物が挙げ
られる。

即ち、本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、例
えばペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測
定法にも応用が可能であり、また、血清中のヘモグロビ
ンを過酸化水素若しくは過沃素酸ナトリウムの様な酸化
性物質を用いて測定する場合等にも有効に使用し得る． また、本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、例
えば反応試薬を濾紙等の吸収性担体に含浸乾燥させた試
験紙片等により生体体液等の試料中の特定成分の測定を
行う、所謂ドライケミストリーの分野に於いても有効に
使用し得る．以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を
更に詳細に説明するが，本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない． ［実施例コ 実施例１　．　１−（ｐ−　｝ルエンスルホニルアミノ
カルボニル）−２−（３．５−ジメトキシ−４−ヒドロ
キシフエニル）−４．５−ビス（４−ジエチルアミノフ
エニル）イミダゾール（本発明化合物［２コ）の合成 （１）１．２−ヒス（４−ジエチルアミノフエニル）エ
タン−１．２−ジオンの合或 塩化アルミニウム（無水）　１１．６．に二硫化炭素６
０ＩＩ１１を加え、これに水冷下Ｎ，Ｎ−ジエチルアニ
リン３０ｇを滴下した。次いでこれにオキサリルクロリ
ドｌｏｇを５℃以下で滴下し、１時間撹拌反応させた。

反応終了後，反応液に水１　００ｍｌ及びクロロホルム
２００ｍｌを注入した後、分液して得たクロロホルム層
を２Ｎ塩酸で洗浄後、乾燥、濃縮した．残液を酢酸エチ
ルから再結晶し、黄色の１．２−ビス（４−ジエチルア
ミノフェニル）エタン−１，２−ジオン７．Ｏｇを得た
． （２）２−（３．５−ジメトキシー４−ヒドロキシフエ
ニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフエニル）
イミダゾールの合或 （１）で得た１．２−ビス（４−ジエチルアミノフエニ
ル）エタン−１，２−ジオン７．Ｏｇ、シリンガアルデ
ヒド（東京化或（株）ＩＩ）３．８ｇ及び酢酸アンモニ
ウム４ｇを＃酸１００ｇ中で還流下５時間反応させた。

反応終了後、反応液に水６００＋ａｌを注ぎ、生じた粘
性残液を分離し、この粘性残液をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィで精製して（溶出溶媒：クロロホルムとメ
タノールの混合溶媒）　，　２−（３．５−ジメトキシ
−４−ヒドロキヒフェニル）−４．５−ビス（４−ジエ
チルアミノフエニル）イミダゾール１．８ｇを得た．（
３）Ｉ−（Ｐ−　｝ルエンスルホニルアξノカルボニル
）−２−（３．５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニ
ル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イ
ミダゾール（本発明化合物［２］）の合或 （２）で得た２−（３．５−ジメトキシー４−ヒドロキ
シフェニル）−４．５−ビス（４−ジエチルアミノフエ
ニル）イミダゾール０．８ｇをクロロホルム２０＋＊ｌ
に溶解したものに、イソシアン酸Ｐ−トルエンスルホニ
ル（和光純薬工業（株）製）１ｇを加え、室温で５時間
撹拌下に反応させた。反応終了後、反応液にメタノール
５ＩＩＩ１を注入して、過剰のイソシアン酸Ｐーマトグ
ラフィにより精製し（溶出溶媒：＃酸エチルとｎ−ヘキ
サンの混合溶媒）　．　１−（ｐ−｝ルエンスルホニル
アミノカルボニル）−２−（３．５−ジメトキシ−４−
ヒドロキシフエニル）−４．５−ビス（４−ジエチルア
ミノフェニル）イよダゾールの深緑色結晶０．７ｇを得
た。

ｍｐ：８５℃。

Ｉ　Ｒ　：　３４００ｃｍ−’（ＯＨ）、２８００〜３
０００ｃｍ−’（ＣＨ）、１７２０ｃｍ−’（Ｃ＝０）
、１６００ｃｍ−’（Ａｒｏｍａｔｉｃ　ＣＨ）、１５
００ｃｍ−’（Ａｒｏ＋＊ａｔｉｃ　　Ｃｌ）。

元素分析値（ＣｉＪ４ｓＮ，０６Ｓ） 計算値（％）　：　Ｃ　　６５．７４、Ｈ　　６．３７
，　Ｎ　　９．８４、実測値（％＞：Ｃ　　８５．３４
．　Ｈ　　６．１０．　Ｎ　　９．７２．実施例２． １，２−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）エタンー
ｌ，２−ジオンとＮ，Ｎ−ジェチル−２，６−ジメトキ
シ−４−ホチルアξノフェニル）イミダゾールを合成し
鵞チを行い．　１−（ｐ−トルエンスルホニルアミノヵ
ルボニル）−２−（３．５−ジメトキシ−４−ジェチル
アミノフェニル）−４．５−ビス（４−ジェチルアミノ
フエニル）イミダゾール（本発明化合物［４］）　０．
８ｇを得た。

実施例３．１−（エトキシカルボニルアミノカルボニル
）−２−（３．５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフエニ
ル）−４．５−ビス（４−ジエチルアミノフエニル）イ
ξダゾール（本発明化合物［５］）の合成 実施例１の（２）で得られた２−（３．５−ジメトキシ
ー４−ヒドロキシフェニル）−４．５−ビス（４−ジエ
チルアミノフェニル）イミダゾールｏ．ａｇをクロロホ
ルム２０ｍｌに溶解したものに，エトキシカルボニルイ
ソシアネート（アルドリッチ社１１）０−７ｇを加え，
室温で５時間撹拌下に反応させた。反応終了後、反応液
にメタノール５ｍｌを添加して、過剰のエトキシカルボ
ニルイソシアネートを分解した後，減圧エチルとｎ−ヘ
キサンの混合溶媒）　．　１−（エトキシカルボニルア
ミノカルボニル）−２−（３．５−ジメトキシ−４−ヒ
ドロキシフエニル）−４．５−ビス（４−ジエチルアミ
ノフエニル）イミダゾールの緑色結晶０．６ｇを得た。

ｍｐ：８０℃。

Ｉ　Ｒ：　３４００ｃｍ−’（Ｏｉｌ）．２８００〜３
０００ｃｎ−’（ＣＨ）．１７３５ｃｍ−’（Ｃ−０）
、１７２０ｃ『’（Ｃ＝Ｏ）、１６００ｃｍ−’（Ａｒ
ｏｍａｔｉｃ　ＣＩＩＬ　１５００ｃ＋ａ−’（Ａｒｏ
ｍａｔｉｃ　ＣＨ）。

元素分析値（Ｃ３５１１４３ＮｓＯａ）計算値（メ）　
：　Ｃ　　６Ｂ．７５、Ｈ　　６．８８、Ｎ　　１１．
１２、実測値（％）　：　Ｃ　　６６．０９、Ｈ　　６
．６０、Ｎ　　１０．８０．実施例４． ２−（３．５−ジメトキシー４−ヒドロキシフエニル）
−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフエニル）イミダ
ゾールェニルスルホニルアミノカルボニル）−２−（３
．５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフエニル）−４．５
−ビス（４−ジエチルアミノフエニル）イミダゾール（
本発明化合物［１コ）　１．２．を得た． 実施例５．本発明の化合物の諸性質の測定（１）分子吸
光係数及び吸収極大（λｗａｘ）の測定（発色溶液） ５０鵬阿ビペラジンーＮ，Ｎ’−ビス（２−エタンスル
ホン酸）　（ＰＩＰＥＳ）一水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐ｝１７．０）に、本発明化合物を０　．　５ｍＭ及び
ペルオキシダーゼを４／ＩＪ＋ｅｌとなるように溶解し
たものを発色溶液とした．（操作法） 所定の本発明化合物を用いて調製した発色溶液３ｍｌに
、１ｍＭの過酸化水素水２０μＪを添加し良く混合した
後、３７℃で５分間加温した．この反応液の吸収曲線を
測定し、そのλ＋ｎａｘ及びλ＋ｔａｘに於ける吸光度
Ｅｓを求めた． 尚、吸収曲線及びλｗａｘを求める際の対照としては、
各々の発色溶液３ｍｌに精製水２０μ１を添加し良く混
合した後，３７℃で５分間加温したものを用いた。

また，分子吸光係数は、各発色溶液を用いて得られたＥ
ｓと，各発色溶液の代りに４−アミノアンチビリンとフ
ェノールを夫々５０ｍＭずつ及びペルオキシダーゼを４
　０／ａｌ含む５０膿阿ピペラジンーＮ，Ｎ’−ビス（
２−エタンスルホンＷ！）（ＰＩＰＥＳ）一水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、上記の操作法に
より得られる５０５ｎａに於ける吸光度ＥＯＨとを用い
て、次式により求めた。

分子吸光係数＝（Ｅｓ÷Ｅ　ｏｒ＋）　Ｘ　５　Ｘ　１
０３結果を表１に示す。

（２）血清或分の影響の測定 （１）でｍ製した発色溶液３＋＋＋１に，正常プール人
血清２０μｌを添加混合し，次いで１ｍＭの過酸化水素
水２０μ１を添加混合したものを３７℃で５分間反応さ
せた。この反応液のλｎａｘに於ける吸光度Ｅｅｆを測
定した。また，正常プール人血清の代りに精製水を用い
て、前記と同じ発色溶液を用いて同様の操作を行い、吸
光度Ｅ　ｓｔｄを得た。

これらの値を次式に代入して、血清或分の影響を調べる
指標となるａ値を求めた。

ａ　＝　（Ｅｅｆ’−　Ｅｓｔｄ）　Ｘ　ｔｏｏ尚、血
清或分の影響は、ａ値を基に以下のように表わした。

一二ａ値が０〜３。

±：ａ４ｆｌが３〜６． ＋＋：ａ４ｍが２０以上。

結果を表１に併せて示す。

尚、表１には、比較のため既存のトリアリールイ ダゾール誘導体について同様にして諸性質を測定した結
果を併せて示した。

表１の結果から明らかな如く，本発明の化合物は、分子
吸光係数に於いては既右のトリアリールイミダゾール誘
導体から生じる色素と同等かそれ以上であるが，既斗の
トリアリールイミダゾール誘導体に於ける問題点であっ
た、血清等の生体体液を試料とした場合に体液中の成分
により発色が妨げられるというｌ！象が殆ど生じないと
言う性質を有していることが判る。

実施例６．過酸化水素の定量 （測定試液） ５０ｍＭ　ビペラジンーＮ，Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルホン酸）　（ＰＩＰＥＳ）一水酸化ナトリウム緩衝液
（ＰＨ７．０）に以下の試薬を所定濃度溶解したものを
測定試液とした。

本発明化合物［２］　　　　　　　　０．５ｍＭペルオ
キシダーゼ　　　　　　　４　Ｕ／＋１（試料） 市販の過酸化水素水を蒸留水で適宜希釈して，０．５，
　１．０，　１．５，　２．０及び４．０＋ｓＭ溶液と
したものを試料とした， （操作法） 測定試液３＋ａｌに試料２０μｌを加えよく混合し、３
７℃で５分間加温後、６６０ｎｍの吸光度（Ｅｓ）を測
定した。

また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検｛＋１（ＦＢＩ）を測定した。

（結果） 測定結果を第１図に示す。

第１図から明らかな如く、横軸の各過酸化水素濃度につ
いて得られた吸光度（Ｅｓ−ＦＢＩ）を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだ検量線は良好な直線性を示し、本
発明の方法により過酸化水素を定量的に測定し得ること
が判る。

尚、本発明化合物［２コの代りに、本発明化合物［１］
．　［３］、［４コ及び［５］を用いた場合も、同様な
結果が得られた． 実施例７．血清成分共存下での過酸化水素の定量（測定
試液） 実施例６と同じ． （試料） 実施例６と同じ。

（操作法） 測定試液３ｍｌに正常ヒト血清又はイオン交換水５０μ
１を加えてよく混合した後，試料２０μ１を加えてよく
混合し、３７℃で５分間加温後．　６６０ｎｍの吸光度
（Ｅｓ）を測定した。

また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検値（ＦＢＩ）を測定した．（Ｍ果） 測定結果を表２に示す。

以下余白 表２ 表２から明らかな如く、本発明のイミダゾール誘導体か
ら生成する色素は過酸化水素濃度に拘わらず血清成分に
よる影響を殆ど受けないことがｐＪる。

実施例８．尿酸の定量 （測定試液） ５０ｍＭ　ビベラジンーＮ，Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルホン酸）　（Ｐ（ＰＥＳ）一水酸化ナトリウムｔＩＷ
液（ＰＩＩ７．０）に以下の試薬を所定濃度溶解したも
のを測定試液とした。

本発明化合物［２コ　　　　　　　０．０５ｍＭペルオ
キシダーゼ　　　　　　　４１Ｊ／ｍｌウリカーゼ　　
　　　　　　　　０．０５Ｕ／置１（試料） １０ｎ（／ｄｌの尿酸を含有する標準液及びヒト血清５
検体を試料とした． （操作法） 測定試液３ｍｌに試料２０μｌを加えよく混合し，３７
℃で５分間加温後，６６０ｎｌ１の吸光度（　Ｅｓ）を
測定した。

また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検Ｗ（ＦＢＩ）を測定した．次式に従いヒト血清
中の尿酸濃度を算出した。

尿ａ　（ＩＩｌｇ／ｄｉ　）　＝　（ヒト血清のＥｓ−
ＦＢＩ）÷（Ｉｔ準液のＥｓ−ＥＢＩ）ＸＩＯ 結果を表３に示す。

参考例１．尿酸の定量 実施例８と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット（
尿＠Ｃ−テストワコー、和光純栗工業（株）製〉を使用
して、尿酸濃度を測定した。

結果を表３に併せて示す。

表３ 表３から明らかな如く、本発明のイミダゾール（結５ｉ
！：） 誘導体を発色或分として用いた実施例８の測定法により
得られた尿酸の測定値は、市販キットを用いた従来法の
それと良い相関を示していることが判る。

［発明の効果］ 以上述べた如く，本発明のイミダゾール誘導体は，水成
は界而活性剤の共存する緩衝液中で極めて安定であり、
且つこれから生じる色素は分子吸光係数が高く、即ち測
定感度が高く、しかも血清等の生体試料中に含まれる成
分により発色が妨げられるというＪＪ！象がか殆ど生じ
ないと言う極めて優れた性質を有するものであり，斯業
に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第ｔ図は、実施例６に於いて得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（＋＊Ｍ）について得られた８
６０ｎ＋＊の吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである．

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＾１は置換基を有していてもよいアリールス
   ルホニル基、置換基を有していてもよいアルキルスルホ
   ニル基、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を
   表わし、Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は夫々独立して置換
   基を有していてもよいアリール基を表わす。但し、Ｒ＾
   ２、Ｒ＾３及びＲ＾４の内、少なくとも１つはイミダゾ
   ール環に対してｐ位の位置にヒドロキシ基又は置換基を
   有していてもよいアミノ基を有する置換フェニル基を表
   わす。） で示されるトリアリールイミダゾール誘導体。
2. （２）請求項１に記載のトリアリールイミダゾール誘導
   体を発色成分として用いることを特徴とする酸化性物質
   の定量方法。
3. （３）酸化性物質が過酸化水素である、請求項２に記載
   の定量方法。
4. （４）ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸化発色
   させてその呈色を比色定量する、請求項３に記載の定量
   方法。
5. （５）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
   素である、請求項３又は４に記載の定量方法。
6. （６）過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
   いて酵素反応により生成する過酸化水素である、請求項
   ５に記載の定量方法。
7. （７）生体試料中の微量成分の定量が、基質又は酵素反
   応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過
   酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基質又
   は酵素活性の定量である、請求項６に記載の定量方法。
8. （８）請求項１に記載のトリアリールイミダゾール誘導
   体を発色成分として用いることを特徴とするペルオキシ
   ダーゼ様物質の定量方法。
9. （９）ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダーゼであ
   る、請求項８に記載の定量方法。
10. （１０）ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン又はそ
    の他のヘム化合物である、請求項８に記載の定量方法。