JPH0319687A

JPH0319687A - 固定化酵素の製造法

Info

Publication number: JPH0319687A
Application number: JP15221489A
Authority: JP
Inventors: Reizo Fukushima; 福嶋　礼造; Tomonori Nakamura; 中村　智法; Shigeharu Tsuchiya; 土屋　重陽; Norio Sato; 佐藤　憲郎; Akira Hirose; 明広瀬
Original assignee: Kyoritsu Yuki Co Ltd; Mitsubishi Corp
Current assignee: Kyoritsu Yuki Co Ltd; Mitsubishi Corp
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1989-06-16
Publication date: 1991-01-28
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: JP2781990B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産栗±坐剋里公塾本発明は、酵素活性が高く、且つ担体としての強度が大
きく、ハイオリアクタ−として有利に利用し得る固定化
酵素の製造法に関する。

藍来狡生酵素反応を工業的規模で実施する場合、従来は、回分式
で行い、酵素は一度だけしか利用されず、その不経済性
から、水不溶性媒体に酵素を固定した固定化酵素が数多
く提言されている。

特に、食品工業分野では、安全性の面から天然物である
キチンを脱アセチル化して得られるキトサンを利用した
固定化方法の検討がなされている。

例えば、特開昭５９−２１３３９０号公報には、多孔質
固体とキトサン誘導体から或る担体に酵素を吸着固定さ
せる方法が開示されており、特公昭５３−１０１５０号
公報には、キトサンを担体とし、これに吸着またはペプ
タイド結合により酵素を附加する方法が記載されている
。また、特公昭６２−１６６３７号公報には、無機質粒
子をキトサンで被覆し、これをグルクルアルデヒドで活
性化あるいは安定化させた後、酵素を固定化する方法が
示されている。

しかし、特公昭５３−１０１５０号公報に記載の方法は
、キトサンゲルを担体とするものであるため、得られた
固定化酵素の機械的強度が弱く、変形による圧損増加あ
るいは損壊が起り易いという問題がある。また、特公昭
６２−１６６３７号公報に開示された方法では、予め架
橋させたキトザンゲルを利用するものであり、該ゲル内
には酵素が浸透し難いため、固定化酵素の活性が低いと
いう問題がある。

因に、機械的強度が高く、水不熔性である多孔質固体は
、酵素と結合する反応基を有しないので酵素を固定する
ことができない。

又盟匹脛迭１さ主豊題本発明は、如上の従来技術にみられる問題点を解決する
ためになされたものであって、機械的強度が高く、高活
性であり、かつ食品工業分野に安全に利用し得る固定化
酵素を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段本発明は、多孔質固体を担体として用い、これに酵素溶
液とキトサン類溶液とを含浸させ、次いてこの含浸させ
た多孔質固体をジアルデヒドと反応させて架橋すること
を特徴とする。

本発明で用いる多孔質固体は、水に不溶性かつ不活性な
物質であれば特に限定はなく、珊瑚、セライト、珪藻土
、バーライ１−、シラスハル−ン、木炭、コルク等を例
示することができる。これら多孔質固体は、通常粒径０
．２〜３ｍｍ程度の粒状物としてカラムに充填し使用す
るが、同程度の比表面積を有することができるならば管
状あるいは板状等の任意の形状で使用することができる
。なお、ここに言う多孔質固体とは、少くとも０．２ｍ
Ｒ／Ｂ以」二、望ましくは０．５ｒａ／ｇ以上の孔容積
を有する固体物質を意味する。

また、本発明に用いられるキ１・サン類とは、キチンの
脱アセチル化物の総称であり、酢酸、塩酸等の一塩基酸
の存在によりカチオンに解離して水溶性になるものを意
味する。なお、上記キ１・ザン類を再度アセチル化を行
ったもの、あるいは低分子量化を行ったものであっても
、上記の水溶性を呈するかぎり、本発明で用いるキｌ・
サン類に包含される。

本発明では、上述の多孔質固体に、上記キ］・→ノ゛ン
類熔液と酵素溶液とを含浸させる。その際、キトザン類
溶液と酵素溶液は多孔質固体に逐次含浸させてもよく、
また、両溶液を予め混合して含浸させてもよい。含浸は
、減圧により固体空隙内の空気を除去した後、液に浸漬
させて行うと効率的である。

含浸液は低粘度であることが望まし＜　、１００ｃｐ以
下であることが好ましい。含浸液のｐＨは、酵素が失活
せず、キトサンが析出しない範囲に制限される。

酵素は等電点以上のｐＨにおいてアニオンに解離してい
るため、キトサンのカチオンとイオンコンプレックスを
つくり白濁する場合もあるが、通常は多孔質固体の孔径
より微小であるため、含漫の妨げとはならないばかりで
なく、適度の上記白濁による析出は、ジアルデヒドによ
る含浸多孔質固体の架橋反応に好ましい影響を与えて、
酵素の固定化に好結果をもたらす。

菌体等の懸濁質が酵素溶液中に存在する場合に於いても
、該懸濁質が多孔質固体の孔径より微小であれば本発明
の実施を妨害しない。

上記架橋反応は、酵素溶液とキ１・ザン類溶液を含浸さ
せた多孔質固体をジアルデヒド溶液に浸漬させて行うと
よく、その際、酵素が失活しない条件、すなわち、ｐＨ
と温度で反応を行う必要がある。

ここで用いるジアルデヒドとしては、グルタルアルデヒ
ド、グリオキザ−ル、マロンアルデヒド、スクシンアル
デヒド、アジボアルデヒド等を例示でき、特にグルタル
アルデヒドが一般的に用いられる。

本発明に従って固定化し得る酵素については、特に限定
されることなく、ほとんど全ての酵素に適応することが
できる。

例えば、アミラーゼ、グルコアごラーゼ、トリプシン、
キモトリブシン、ペプシン、パパイン、バンクレアチン
、アミノアシラーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ
、ＡＴＰデア呉ナーゼ、ホスファク−ゼ、ストレプトキ
ナーゼ、アピラーゼ（ＡＴＰ−ジキスファターゼ）、Ａ
ＴＰクレアチンリン酸転移酵素、ペクチナーゼ、マルタ
ーゼ、ラククーゼ、ウレアーゼ、タンナ−ゼ、リパーゼ
、グルコースイソメラ−ゼ、メリビア−ゼ、アルドラ−
ゼ、セルラーゼ、アン１・シナーゼ、ナリンジナ−ゼ、
グルコースオキシダ−ゼ、アスパラキシダーセ等を挙げ
ることができ、これらはいずれも本発明の方法に従って
簡易に固定し得る。

発明の作用効果以」一述べたとおり、本発明では酵素およびヰトザン類
を水溶液状態で、浸透性の良好な多孔質固体内に含浸さ
せ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデヒドと反応さ
せて架橋するため、酵素は効率的にキトザン分子の網状
構造内に固定されて不溶化するとともに、機械的強度の
高められた多孔質固体に担持される。

したがって、本発明によると高活性および高強度の固定
化酵素を得ることができる。

因に、多孔質固体に酵素溶液のみを含浸させたのでは酵
素は固定化されずに容易に流出し、一方多孔質固体を使
用せずにキトザンを架橋させた場合にはキトサンゲルは
機械的強度が小さく、変形による圧損増加あるいは損壊
等が生し易い。また多孔質固体にキｌ・サン溶液のみを
含浸させ、ジアルデヒドにより架橋させたものに酵素溶
液を含浸させた場合には、キ１・ザン分子の網状構造中
への酵素の浸透が困難となるので、活性の高い固定化酵
素は得られない。

実施例以下に本発明を実施例により更に詳しく説明するが、本
発明の範囲はその要旨を変更しない限り、以下の実施例
に制限されるものではない。

実施例１低分子量キトサン〔１％溶液粘度（１％酢酸中）＝８．
Ｏｃｐ　、脱アセチル化度８３％）　５．０ｇを１０％
酢酸４５ｍｌに溶解した後、２Ｎ−ＮａＯＨにてｐＨ調
整し、全量を１００ｍｆｆｉとし、５％低分子量キトサ
ン溶液（ｐｌｌ＝６．１）を調製した。

この５％キトサン冫容冫＆　１０　ｍＲ及びグノレコ−
スイソメラーゼ溶液（ナガセ産業社製、１，４００　Ｇ
ＩＵ／ｍ０Ｉ　Ｑ　ｍＲを混合し、乳濁した混合液を得
た。

セライト（Ｍａｎｖｉｌｌｅ社製Ｒ−６４７、粒径：　
１４〜３０Ｍｅｓｈ、孔容積０．９７ｍＪ！／ｇ）５．
０ｇを減圧下に置き、酵素−キトザン混合液を含浸後、
濾過して、１）．３ｇの含浸セライ１・を得た。

この含浸セライトに２．５％グルタルアルデヒド４　．
　２　ｍｌを混合し、４　’Ｃにて１時間反応後、０．
０５−リン酸緩衝液（ｐｌ＋＝６．５）にて充分洗浄し
て９．３ｇの固定化酵素を得た。その活性は１６２ＧＩ
Ｕ／ｇであり、１０％ＮａＣ］溶液５０ｍｌで４回洗浄
後の活性は１６２ＧＩＵ／ｇであり、酵素はキ［・ザン
と共有結合され、離脱しないことが判った。このように
して、高活性、高強度の固定化酵素が得られた。

なお、固定化酵素の活性の測定は、ｐｌ１　７．２の０
．１Ｍ’Ｊン酸緩衝液に溶解したグルコースの４０％溶
液１００ｇ中に固定化酵素の適量を添加して、６０℃で
１時間反応させ、その結果生威したフラクＩ・−ス量を
Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法により求め、固定化酵素１ｇ当り、■
時間当りの転換フラクトース量を計算により求めた。

実施例２実施例ｌに記載したと同様な方法に従って、インベルダ
−ゼ溶液（酵素活性１５．９ｇ−ＳＵＣ／ｍｊ！）　ニ
ツいて固体化を行い、９．６ｇの固定化インベルク−ゼ
を得た。その酵素活性は２．９３ｇＳＵＣ／ｇであり、
１ｏ％ＮａＣｌ洗浄後も２．　８５ｇＳＵＣ／ｇで酵素
の離脱はほとんどみられなかった。

なお、グルタルアルデヒド処理後の洗浄はｐｌ１４．２
の０．０５Ｍ　リン酸・クエン酸緩衝液で行い、固定化
後の活性の測定は、固定化酵素の適量をｐｌ＋４．２　
ノ０．０５Ｍ　リン酸・クエン酸緩衝液に溶解したサソ
カロースの１０％溶液１ｌ中に添加して４０’Ｃにおい
て１時間反応させ、生戒した還元糖量をメチレンフルー
法により求め、固定化酵素１ｇ当り、１時間当りのサン
力ロース分解量を算出した。

実施例３実施例１で用いたと同様の低分子量キトサン５．０ｇを
１０％酢酸４５ｍ２に熔解後、無水酢酸３，Ｏｇを添加
し、３５“Ｃにて１８時間反応し、脱アセチル化度４３
％のキトサンを得た。これをＮａＯＩＩで中和後希釈し
て、ｐｌ＋６．５の５％溶液とした。

シラスバルーン（粒径：１４〜３０　Ｍｅｓｈ　、孔容
積０．９８ｍｆｆｉ／ｇ）５．０ｇを減圧下に置き、グ
ルコース・イソメラーゼ熔液５ｍｆを含浸後、上記の５
％アセチル化キｌ・サン溶液５ｍｌを添加し、１時間放
置後、残液を濾別した。

この含浸シラスバルーンを、３％グルタルアルデヒド５
Ｑｍｆｆｉ中に添加し、攪拌下、室温にて１時間反応さ
せ、濾過後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．５）
にて充分洗浄して、９．７５ｇの固定化酵素を得た。

その活性は１４１ＧＴＵ／ｇであり、１０％ＮａＣ］？
−３液洗浄後の活性は１２７ＧＩＵ／ｇであった。

比較例１５．０ｇのセライトに減圧下、５％低分子量キトサン溶
液ｌ　Ｑ　ｍＲを添加し含浸後濾別した。これに２．５
％グルタルアルデヒド４．２ｍｌを添加し、４゜Ｃにて
１時間反応後、グルコース・イソメラーゼ溶液ＩＱｍＥ
を添加し、１晩反応させた。０．０５Ｍリン酸緩衝液に
て充分洗浄して９．５ｇの固定化酵素を得たが、その活
性は２１．３ＧＴＵ／ｇと低いものであった。

尚、使用したセライ１・、低分子量キｌ−　’Ｊン熔液
、及びグルコ−スイソメラーゼ溶液は実施例１と同様の
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）多孔質固体に酵素溶液およびキトサン類溶液を含
浸させ、次いでこの含浸させた多孔質固体をジアルデヒ
ドと反応させて架橋することを特徴とする固定化酵素の
製造法。
（２）キトサン類は、キチンの脱アセチル化物、その低
分子量化物、それらの再アセチル化物およびそれらの混
合物から成る群から選択されるものである請求項（１）
に記載の固定化酵素の製造法。