JPH03168085A - 真菌検出のための核酸プローブおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は真菌生物の検出に関する。特に、本発明は臨床
、食品、環境および他の試料中の酵母菌および糸状菌の
特異的検出のための核酸プローブおよび組成物をその使
用法とともに提供する。

従来の技術 真菌は腐生植物性または寄生性の細胞壁が閉じた真核生
物の種々の集まりであり、形態的には酵４ 母菌、糸状菌きのこ、または他の名前で記述されるであ
ろう。それらは至る所に存在する生物でほとんどは無害
であるが、ときどき営利的目的に使用され、場合によっ
ては病原性である。

病原性真菌は医学真菌学（ＩＩｌｅｄｉｃａｌ　ｍｙｃ
ｏｌｏｇｙ）の範囲に含まれている。この医学分野には
表在性、皮膚、皮下および全身性感染を含む真菌病原体
の部門が認められる（例えば、Ｒｉｐｐｏｎ．　Ｊ．　
Ｗ．．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ　（医学真菌
学）　、Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ．，（サウンダース社
）　、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　（フィラデルフィア
州）　、１９８８年発行、を参照されたい）。臨床医が
直面する真閑により起こされる最も重篤な病的状態は全
身性感染である。深部組織および全身性真菌血症は、特
に免疫系が弱体化した集団において高い死亡率を示す。

全身性真菌血症を起こすことができる真閑の中で、いわ
ゆる“病原性”真菌および“日和見”真菌の間に二叉分
枝（ｄｉｃｈｏｔｏｍｙ）がある。それは人を誤解させ
るような命名法であり；日和見真菌は殺し屋（ｋｉｌｌ
ｅｒ）であり、病原性真菌はしばしば自己制限的（ｓｅ
ｌｆ−１　ｉｍｉｔｉｎｇ）である。

病原性真菌 属の一員および多少ではあるが事実上、宿主の生理的温
度で生き残れる真菌が含まれる。

全身性真薗血症（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｆｕｎｇｅｍｉａ
）の臨床診断および処置は細菌性敗血症（　ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ７ ｓｅｐｔｉｃｅＩＩｌｉａ　：　Ｌばしば同じ免疫欠損
集団中で起こる）に比較していくつかの短所を持ってい
る。第１に、抗真菌化学療法は類似の抗細菌化学療法よ
りも患者に対しより毒性が強い。その結果、臨床医は抗
真菌剤を処方する前の真菌血症のより信頼できる証拠を
望んでいる。第２に、真菌血症の患者は感染の初期に診
断されないと予後がよくない。

第３に、真菌は大部分の細菌生物体よりも一般に増殖が
遅く、その結果として試験管内の培養工程を必要とする
診断は時間がかかる。および第４に、真閑のいくつかは
（再び診断に試験管内培養を必要とする）合成培地上一
週間ではコロニーが得られず、あったとしてもわずかで
ある。これらの因子のすべてに広範囲の系統の真菌が潜
在的全身性病原体であるという事実を加えると、ほとん
どすべての真菌が包まれる真菌検出の直接的方法に対す
る必要性が指摘される。

真菌を検出できる核酸プローブを検出するのが本発明の
１つの側面（ａｓｐｅｃｔ）である。

通常の検定（ａｓｓａｙ）条件下、プローブに近づかせ
ることかできる標的領域にハイブリダイズできる核酸プ
ローブを提供するのが本発明の別の側面である。

真菌ｒＲＮＡ配列に対する核酸プローブで臨床試料中の
これらの生物体の存在を評価する迅速な診断検定の基礎
として有用なものを提供するのがさらに別の側面である
。

Ｋｏｈｎｃら（バイオフィジカルジャーナル（Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　８：　１１０４　
〜１１１８；　１９６８）はｒＲＮＡ配列に対するプロ
ーブを調製する１つの方法について議論しているが、真
菌検出のプローブを作製するために必要な教えを提供し
ていない。

ＰａｃｅおよびＣａｍｐｂｅｌｌ　（ジャーナルオブバ
クテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）　１０７：　５４３　〜５４７．　１９
７１）は種々の細菌種からのリポソームリボ核酸の相同
性およびそのような相同性水準を定量化するためのハイ
ブリダイゼーション法について議論している。同様に、
Ｓｏｇｉｎ．　ＳｏｇｉｎおよびＩＩＩｏｅｓｅ　　（
ジャーナルオブモレキュラーエボリューション（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉ
ｏｎ）　１：１７３〜１８４．　１９７２）は系統発生
論的関係の評価のため異なったリポソームＲＮＡ分子の
一次構造特性を使用する理論的および実際的な面につい
て議論している。Ｆａｘ．　ＰｅｃｈｍａｎおよびＩ／
ｏｅｓｅ　　（インターナショナルジャーナルオブシス
テマティックバクテリオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　２７：　４４　〜５７．
　１９７７）は原核動物分類への方法としての１ＢＳリ
ポソームＲＮＡの比較カタログ作りについて議論してい
る。

しかしながら、これらの参考分献は真菌に関するＫｏｈ
ｎｅの教えの不足分を補なっておらず、および特に真菌
血症またはその病因学的因子（酵母および糸状菌の広範
囲のスペクトル）を検出するための検定に有用な特異的
プローブを提供していない。

ＨｏｇＨら（国際特許出願、公開番号Ｗ　０　８８／０
３９５７）は４つの推定真菌特異的プローブについて記
述している。そのどれも真菌を広範囲に含んでいるとは
思えず、またそれらは本発明のプローブとは相関してい
ない。

リポソームは生命の主たる構造および触媒要素である細
胞タンパク質へ遺伝的情報を翻訳する唯一の既知の手段
として働いているのですべての生物体において深い重要
性を持つ。この重要性の明らかな現れは、すべての細胞
がリポソームを持っているという観察である。

細菌リポソームは異ったＲＮＡ分子（少なくとも大腸菌
において）を含んでおり、５８，１６ｓおよび２３Ｓｒ
ＲＮＡと称されている。真核生物においては一般的に５
Ｓ，　１８ｓ，　２８Ｓおよび５．８Ｓと称される４つ
の異なったｒＲＮＡ種がある。これらの名前は歴史的に
はその沈降速度により決定されたＲＮＡ分子の大きさに
関連している。しかしながら実際的にはリポソームＲＮ
Ａ分子は生物体間で大きさがかなり変動している。それ
にもかかわらず真核生物において相同するＲＮＡ分子の
遺伝子的名前として５Ｓ，１８８．２８８および５．８
８ｒＲＮＡが共通に使用されており、この伝統はここに
おいても引き継がれている。

真菌病原体の１８３リポソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）１
１ 内の独特の核酸配列と相補的な核酸プローブを提供する
のも本発明の別の側面である。

ここで使用されているように、プローブとは、設計また
は選択により、定義され、あらかじめ決められたストリ
ンジエンシー下、標的核酸配列へ特異的に（即ち、優先
的に、次節参照）それをハイブリダイズさせることを可
能にする特異的ヌクレオチド配列を含む、合成または生
物的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味し
ている。

そのハイブリダイゼーション特性に加えて、プローブは
また、特定の検定条件下、その性質または最適な機能発
現に関する構成物を含んでいてもよい。例えば、プロー
ブはヌクレアーゼ分解に対するその抵抗性を改良（例え
ば末端キャッピング）するため、検出リガンドを運搬す
るため（例えばフルオレセイン（　ｆ　ｌ　ｕｏｒｅｓ
ｃｅｉ　ｎ）、３２−Ｐビオチン等）または固体支持体
へのその捕捉を容易にするため（例えばポリデオキシア
デノシン“尾”（ｐｏｌｙｄｅｏｘｙ　ａｄｅｎｏｓｉ
ｎｅ　”ｔａｉｌｓ”））改変してもよい。

そのような改変はハイブリダイゼーション検定に１つ おける標的および非標的生物間を有効に識別するための
その能力である基本プローブ機能上の改良である。

ハイブリダイゼーションとは、あらかじめ決められた条
件下、核酸塩基が互いに対をつくることに関する明白な
規則に従って、特異的および安定な水素結合により、２
つの部分的または完全に相補的な核酸鎖が逆平行様式（
１つは５′から３′へ配向し、他は３′から５′へ配向
する）に一緒になって２重鎖核酸を形成される過程と理
解されている。プローブの高い特異性は、その個々の確
率の乗積（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｃ　ｐｒｏｄｕ
ｃｔ）により指図（ｄｉｃｔａｔｅ）されるごとく、で
たらめに存在する特異配列の低い統計的確率によってい
る。これらの概念は当業者には良く理解されている。

パイプリダイゼーション条件の特定の組のストリンジエ
ンシ−（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は２つの核酸の間の誤
対合（ＩＩｔｓｐａｉｒｉｎｇ）の水準および幾何構造
によると同様にプローブ／標的二連体（ｐｒｏｖｅ／　
ｔａｒｇｅｔｄｕｐｌｅｘ）の塩基組成により決定され
る。

ストリンジェンシーはハイブリダイゼーション溶液中に
存在するイオン秤の型の濃度、存在する変性剤（ｄｅｎ
ａｔｕｒｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）の型および濃度およびハ
イブリダイゼーション温度のごとき反応パラメータによ
ってもまた支配されている。一般に、ハイブリダイゼー
ション条件がよりストリンジエントになると、もし安定
なハイブリッドが形成されるならより長いプローブが好
適である。当然の結果として、ハイブリダイゼーション
が起きる条件のストリンジェンシー（例えば実施される
検定の型に基づいて）は用いられる好適なプローブのあ
る種の特性を指図するであろう。そのような関係はよく
理解されており当業者により容易に処理される。

一般的事項としては、（プローブ長に依存するが）スト
リンジエント条件とは約０．９モルＮａＣρの塩溶液中
約３５°Ｃ〜６５℃を意味すると理解されている。

ここでなされたすべての参照事項は出典指示により完全
に含まれている。

発明の要約 本発明の種々の原理および態様に従うと、特定の条件下
真菌のリポソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）（特に１８Ｓ
ｒＲＮＡ分子）またはｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）とハ
イブリダイズするが、同じ条件下、試験試料中に存在す
るであろう細菌または宿主または環境マトリックスのｒ
ＲＮＡまたはｒＤＮＡにはパイプリダイズしないデオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）からな
る核酸プローブおよびプローブの組が提供される。

本発明のプローブは真菌血症またはその病因因子の特異
的検出のための有用な核酸ハイブリダイゼーション検定
の開発を現在可能にしている。この検定はヒト患者また
は獣医学被験体からの血液、尿、脳脊椎液、皮膚バイオ
プシ−（ｓｋｉｎ　ｂｉｏｐｓｙ）、唾液、関節滑液、
痰、気管支洗剤、気管支洗浄液または他の組織または液
体試料などの臨床試料中の酵母菌および糸状菌の検定に
都合よく使用される。

本発明のプローブはまた、食品腐敗に伴う酵母１５ 菌および糸状菌を検出できる有用な核酸ハイブリダイゼ
ーション検定の開発の基礎も提供する。本発明の最も好
適なプローブはあらかじめ決められた条件下、肉、乳製
品、穀類、堅果ジュースおよび他の市販の食品母体と交
差反応せずに、真菌の種々の収集物とハイブリダイズで
きる。

核酸ハイブリダイゼーションに基づく検定（　ａｓｓａ
ｙ）は、試験試料中の真菌の検出のために現在利用可能
なほとんどの微生物学的または免疫学的方法よりも高い
遂行能力が与えられていることが見い出されており、一
般的に以下のことが挙げられる； ａ）高められた感度：即ち、与えられた試料中の酵母菌
または糸状菌をより頻度高く検出する能力；ｂ）安価な
試薬の使用および労力の減少による検定費用の著しい減
少の可能性： Ｃ〉生化学的に異常な標的微生物の株または劇的に異な
った抗原性を持つ単離物の正確な同定；ｄ）酵母菌また
は糸状菌の存在の直接検定およびその結果としての病因
因子定量の可能性；１６ ｅ）直接試験法は抗真菌養生法（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ
ｒｅｇｉｍｅ）の効力のモニタリングを可能にし；およ
び ｆ〉感染因子が隠れた体液標本への実験技術者の暴露を
著しく減少させる可能性。

ｒＲＮＡに対し本発明のプローブを向けることにより招
かれる他の利点には検出されたｒ　ＲＮＡは細胞質量の
かなりの戊分を構成しているという事実が見い出されて
いる。細胞リポソーム含量の見積りはバラついているが
、活発に増殖している真菌細胞は細胞当りｔｏｏ，００
０より以上のリポソームを含んでいてもよく、それ故ｒ
ＲＮＡの各々の１００，０００コピーがある（リポソー
ム中１＝１：１：１の化学量論で存在する）。反対に、
遺伝子またはそのＲＮＡ転写体のごとき他の潜在的細胞
標的分子はより少ない量でしか存在しない。

さらなる予期されなかった利点は、ｒＲＮＡ（およびそ
れらを特定する遺伝子）は同時代の生物体Ｃａｏｎｔｅ
ｍｐｏｒａｒｙ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）間の側方転移（
ｌａｔｅｒａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を受けにくいよう
であることである。それ故、ｒＲＮＡ一次構造は同時代
生物体間の側方伝達を受けやすい。例えばプラスミド運
搬性遺伝子またはその遺伝子産物の場合のごとき遺伝子
一特異的標的というよりむしろ生物体一特異的分子標的
を提供する。

動物、植物または細菌ゲノムへの交差反応を必然的に招
くことなく、ほとんどすべての真菌生物の検出に関して
本発明のプローブの異常な包含および排外特性を持つプ
ローブが発生できるという発見は予想することができず
かつ期待されていなかった。

表の簡単な説明 本発明の原理および態様のさらなる理解は表を参照して
なされるであろう、ここで： 表１，２および３は臨床および環境を代表する真菌種の
名簿に対する１５のプローブのハイブリダイゼーション
挙動を示している。追加の真菌が既知の真菌分類群の幅
を表わすために名簿に加えられている。約８０の真菌種
が表わされており、最も有力な病原体は番号株として表
わされている。さらに、比較のためにヒト、小麦、正常
ヒト便および２つの至る所に存在する細菌種からのＲＮ
Ａを含む種々の非真菌生物からの核酸が含まれている。

当業者は、細菌はここに記載されたプローブの型と一般
的に交差反応しないので、進化論的に遠くはなれている
ことを理解するであろう。脊椎動物間および高等植物間
の配列変異はかなり限られており、小麦のごとき個々の
試料は高率で予測値を持っていることもさらに認められ
るであろう。

名簿上のすべての種は１００ｎｇの精製変性ＲＮＡによ
り表わされている。プローブは３２−リンで標識されて
おり、標準条件下示されている温度で名簿のものとハイ
ブリダイズされ、オートラジオグラフィーにて評価され
た。“＋”は３時間暴露後の強いパイプリダイゼーショ
ン信号を表わし、“十一”は弱い信号であり、“十一一
”は実質的に不在であり、および“−”は標的へのプロ
ーブのハイブリダイゼーションが無いことを示している
。“ＮＴ”は指定された株に対し特定のプローブが試験
されなかっ．たことを示している。

１つ 図の簡単な説明 さらなる理解が、二重プローブ捕捉／検出検定の図解的
表現を示している付随する図を研究することによりなさ
れるであろう。

本発明のプローブの開発にとられた最初の工程は、真菌
特異性核酸プローブのための標的部位として潜在的に働
くことができる１８ＳｒＲＮＡ領域の同定である。この
ことは： １）真菌ｒＲＮＡ配列間で高度に保存されており（少し
のヌクレオチド変化、欠損または挿入）、および ２〉非真菌（細菌、ヒトまたは植物）ｒＲＮＡ配列と本
質的に異なっている部位の発見を必然的に伴なっている
。

この分析のため、入手可能な１８ＳｒＲＮＡ配列の正確
な列の並びが明らかにされた。多くの１８ＳｒＲＮＡ配
列がこの努力の一部として決定された。そのようなヌク
レオチド配列は遺伝子特定２０ ｒＲＮＡのクローニングおよび配列決定または逆転写酵
素を用いるｒＲＮＡそれ自身の直接配列決定による（　
Ｌａｎｅら，　１９８５，プロシーデインダスオブザナ
ショナルアカデミーオブサイエンスイズ（Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ
ｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）　．　Ｕ　Ｓ　Ａ８
２　：　６９５５　〜８９５９）標準的実験室プロトコ
ール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により決定された。

真菌間で最も高い類似性を示す領域を同定するため１８
ＳｒＲＮＡ配列の一例に並べた組に実施されるコンピュ
ーター互除法（ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ
）が使用された。そのような領域への核酸プローブは最
も広範囲の種々の真菌にハイブリダイズするであろう。

ヒト、ラット、マウス、コーン、大豆、米、細菌、原生
動物、藻類その他からの既知の１８ＳｒＲＮＡ配列とこ
れらの真菌保存領域を比較することにより更なる情報が
得られた。

これらの分析に基づき１５のプローブが同定された。非
真菌の特定の型との交差反応が見い出されてもプローブ
を興味のないものとする必要はない。

例えば、プローブの植物との交差反応は脊椎動物血の真
菌血症のスクリーニングにおいてはプローブの有用性を
減じるわけではない。ここに記載した他のプローブも交
差反応することが知られているが、しかし、それらは二
重プローブ検定（図および実施例２参照）において使用
されるように設計されている。

プローブの説明 示したごとく、上記プローブ選択戦略において、試料中
の真菌へのハイブリダイゼーションに有用なｌ５のプロ
ーブが得られた： プローブ１４１７　： ５’　　−ＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴ
ＣＣＣＣＧＴＧ−３’ プローブ１４１８　： ５’　　−ＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴ
ＣＣＣＣＧＴＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＡＴＴ−３′ プローブ１４１５　： ５’　　−ＴＣＣＴＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＡＡ
ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴプローブ１４１６
　： ５’　　−ＴＣＣＴＣＧＴＴＡＡＧＧＴＡＴＴＴＡＣＡ
ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴ　−３′ プローブＩＧ７０７： ５’　　−ＴＣＣＴＣＧＴＴＡＡＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡ
ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴ３′ プローブ１５４２　： ５’　　−ＡＡＣＴＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＡＴＧＣＡＣ
ＣＡＣＣＡＴ−３’ プローブ１５４５　： ５’　　−ＴＧＧＴＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＴ
ＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧ−３’ プローブ１８１４　： ５’　　−ＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣ
ＧＡＴＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＴ
ＣＡＧ−３’ ２３ プローブ１８１６　： ５’　　−ＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＴＴ
ＡＣＴＡＧＧＧＡＴＴ−　３’ プローブ１８５７　： ５’　　−ＴＣＧＧＣＡＴＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＡ
ＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＴＴ　−３′ プローブ１８１３　： ５’　　−ＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧ
ＧＴＣＴＴ　−　３’ プローブ１８６０　： ５’　　−ＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧ
ＧＴＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡ
ＣＣＴＴ−　３’ プローブ１８１２　： ５’　　−ＡＣＧＴＣＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣ
ＡＴＧＣＴＡＡＴ−３’ プローブ１８５８　： ５’　　−ＡＡＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣ
ＡＴＧＣＴＡＡＣＴ−３’ プローブ１８５９　： ５’　　−ＴＣＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＡＡＴ　−　３’ 前記のプローブの特異的挙動は、それらが使用される検
定型式の有効範囲に依存している。逆にいえば、検定型
式は特定のプローブのある種の至適な様相を指図するで
あろう。本発明のプローブの“本質（　ｅｓｓｅｎｃｅ
）“は名付けられたプローブ中のヌクレオチドの特定の
一連の列に限定されると解釈してはならない。例えば、
これらの特定のオリゴヌクレオチドの長さは以下に記載
するドットプロット検定（およびある種の他の予期され
る検定）における使用のために最適化されている。

最適プローブ長は選択されたハイブリダイゼーション条
件のストリンジェンシーの関数であろうし、およびそれ
故本プローブの長さはそれに応じて変えられるであろう
ことは当業者にはよく知られている。また、１つより多
くのプローブからなる組を考慮する場合、すべてのプロ
ーブはそれらが用いられる特定の型式中で両立できる様
式で挙，？４ 動ずることが望まれている。それ故、特定のプローブの
正確な長さは、その特定の意図される使用法をある程度
反映するであろう。

本発明のプローブはオリゴヌクレオチドプローブとして
有益であり、また、リボ核酸かまたはデオキシリボ核酸
のより長いポリヌクレオチド内へ挿入できる。ここに記
載したプローブヘ相補的な配列はｒＲＮＡ遺伝子へのプ
ローブとして使用できる。好適なプローブまたはその相
補物はまたポリメラーゼチェーン反応のための鎖伸長開
始剤、配列決定または他の応用に使用できる。

これに関連して有川な２つの追加の好適なプローブは： プローブ／プライマー９３６二 ５’　　−　　（ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ
）ＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ３′ プローブ／プライマー９３５： ５’　　−　　（ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴ）Ｔ
ＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣ　−
　３’ から成る。プローブ／プライマ−９３６は真菌１８Ｓｒ
ＲＮＡに相補的な１８ＳｒＲＮＡ遺伝子鎖にノ＼イブリ
ダイズするように設計されている。オリゴヌクレオチド
９３５および９３６は、真菌および関係物の１８ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のほとんどすべてのポリメラー
ゼチェーン反応法による増幅を用いる検定における使用
に設計され最も好適である。これら２つのプローブ／プ
ライマーの標的特異性“本質”はこれらのオリゴヌクレ
オチドの括弧内以外のところにある。括弧内のヌクレオ
チドはそれらが増幅生戊物に対する有用な制限エンドヌ
クレアーゼ認識（クローニング）部位であるので好んで
含まれている。

ハイブリダイゼーション間のプローブ挙動好適なプロー
ブの実験特異性は以下のごとく要約されるであろう（実
施例１および表１，２，および３にさらに情報が供給さ
れている）：プローブ１４１７　：試験された真菌が１
００％含まれており、ヒトＲＮＡに対し６０℃では無視
できる交２７ 差反応。６５℃（ハイブリダイゼーション温度）では１
７１真菌の２つに対し信号が減少しているが（他のすべ
てにはまだ強くハイブリダイズ）、ヒト交差反応性が除
去されている。小麦ｒＲＮＡへの強いハイブリダイゼー
ションが明白である。

プローブ１４１８　：試験された真菌が１００％含まれ
ており、ヒｌ−　Ｒ　Ｎ　Ａへの交差反応性がない。

プローブ１４１７　：　１４１８の亜配列であり、即ち
、それは同じプローブのより短いものである。

プローブ１４１５　：真閑の部分集合に対し包含的、カ
ンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）酵母菌を含まないが、重要な
病原体酵母菌、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）を含んでいる。

プローブ１４１６　：種ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ
）　　（カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）　）リポリチカ（
Ｉｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を除く属カンジダ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ）　　［　トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）
　）の試験された株のすべてを包含。ハンセヌラ（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ）　、メツニコウイア　（Ｍｅｔｓｃｈ
ｎｉｋｏｗｉａ）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）　−一すべてカンジダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）酵母菌の進化論的近縁２８ 種−一のすべて゛を含んでいる。この検定型式において
このプローブで１つのべニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ）種が弱い信号を与えた。

プローブＩＧ７０７：ヤロウィア　リポリチカ（Ｙａｒ
ｒｏｗｉａ　　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を１００％含ん
でいる。

プローブ１４１６と合わせると、これらの２つで試験さ
れたカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）が完全に含まれる。

プローブ１４１５．　１４１６およびＩＧ７０７：これ
らは相同的であり、即ち、これらはすべて１８ＳｒＲＮ
Ａの同じ領域にハイブリダイズする。

プローブ１５４２　：すべでの試験された真閑にヒトＲ
ＮＡを加えたものを１００％含む。二重プローブ（サン
ドイッチ型）ハイブリダイゼーションスキームにおける
１４■７またはｌ４１８の相手のプローブとして設計さ
れた。

プローブ１５４５　：すべでの試験された真菌にヒトＲ
ＮＡを加えたものを１００％含む。二重プローブ（サン
ドイッチ型）ハイブリダイゼーションスキームにおける
ｌ４１７または１４１８の相手のプローブとして設計さ
れた。

プローブ１８１４　：広範囲な真菌が、特に５０℃以下
のハイブリダイゼーション条件で含まれる。

プローブ１８１６　：　５０℃で広範囲な真菌が含まれ
る。

プローブ１８５７　：広範囲に含むが、５０℃で非真菌
にわずかなハイブリダイゼーション。

プローブ１８１３　：　５０℃で広範囲のものを含む。

プローブ１８６０　：　５０℃または６０℃でのハイブ
リダイゼーションで広範囲なものを含む。

プローブ１８１３　：プローブ１８６０の一部の配列で
ある。

プローブ１８１２　：　５０℃で非常に広範囲のものを
含み、ヒトまたは小麦麦芽ＲＮＡと交差反応しない。

プローブ１８５８　：ズイゴミセテス（　ＺｙｇｏＩＩ
ｌｙｅｅｔｅｓ）にハイブリダイズするように設計、そ
れ故プローブ１８１２のハイブリダイズ挙動を補って完
全にする。

プローブ１８５９　：ヤロウィア　リポリチ力（Ｙａｒ
ｒｏｗｉａ１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）にハイブリダイズす
るように設計、およびそれ故プローブ１８１２のハイブ
リダイズ挙動を補って完全とする。

プローブ１８１２，　１８５８および１８５９　：これ
らは相同的な組である一一即ち、これらはすべて１８Ｓ
ｒＲＮＡ分子上の同一の位置ヘハイブリダイズする。組
として、これらはただ２つの株のみに強くパイプリダイ
ズしない（表２および３参照）。

フローブ１８５７および１８６０のごとき非相同プロー
ブは実施例２に記載されているごとき二重プローブ検定
で一緒に使用されるように設計されている。

プローブ／プライマー９３５および９３６はアスペ（Ｂ
ｌａｓｔｏｍｙｅｅｓ）を含む試験されたすべての真菌
分頽群からの１８ＳｒＤＮＡの増幅に使用されてきた。

実施例　１　プローブハイプリダイゼーション挙動のド
ットープロット分析 よく知られている方法に従うドットープロット分析には
、特にこの目的のためのニトロセルロース、ナイロンま
たは他の誘導化膜のごときフィルター（市販のものが容
易に人千できる）上への核３１ 酸または核酸の集団の固定化が含まれている。

ＤＮＡまたはＲＮＡの両方が容易にそのようなフィルタ
ー上へ固定化され、続いて任意の組合せの条件下（即ち
ストリンジエンシー）、問題とするヌクレオチド配列ま
たはプローブでハイブリダイゼーションが証明または試
験できる。ストリンジェント条件下、そのヌクレオチド
配列が標的へより大きな相補性を持つプローブはより少
ない相補性を含むプローブよりも高い水準のハイブリダ
イゼーションを示すであろう。

本発明のプローブはドットープロット様式で試験された
。フェノール抽出およびセシウムトリフルオロアセテー
ト勾配を通しての遠心分離により精製された標的ＲＮＡ
ＩＯＯナノグラムを変性し、ナイロン膜上にスポットし
た。プローブはオリゴヌクレオチドの５′末端への３２
−リン部分の添加により同位元素で標識されている。プ
ローブのハイブリダイゼーションは１．０８Ｍ塩化ナト
リウム、６０ｍＭリン酸ナトリウムおよび６ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸存在下ｐｌ＋７．４にて示された温度
で起こ３２ した。ハイブリダイズしていないプローブはハイブリダ
イゼーション条件の３分の１の塩濃度で洗浄することに
より除去された。フィルターをＸ線フィルムに暴露し、
暴露３時間後ハイブリダイゼーション信号の強度を評価
した。

表１，２および３は上記の方法で試験されたプローブの
挙動を要約しており、前に要約された特異性の情報を提
供している。

実施例　２　二重プローブハイプリダイゼーション 実際的にはこれらのプローブの多くの応用は第１図に示
したごとき“捕捉”プローブおよび“検出”プローブの
“サンドイッチ”ハイブリダイゼーションスキームにお
いて同時に一対のプローブが使用されるであろう。捕捉
プローブ１２は理想的には高い標的特異性のプローブへ
同種重合体の３′尾を付けることにより製造される二機
能性ポリヌクレオチドであろう。尾は順に、ガラスビー
ズまたはフィルター円盤のごとき固体表面１０上の相補
的同押重合体１１ヘハイブリダイズするであろう。捕捉
プローブ１２のその標的１５（この場合真菌スピロヘー
タ１８ＳｒＲＮＡ）へのハイブリダイゼーションにより
標的　の固体支持体１０への複合１５ 体形成がおこる。検出プローブ１３（都合が良いのはあ
る程度の特異性をもっているもの）は、完全ハイブリダ
イゼーション複合体の存在を報告するであろう放射活性
、蛍光、化学発光、色その他（検出部分１４）に依存す
る好適な検出スキームの一部であろう。

実施例　３　血液、痰または脳脊椎液試料からの真菌敗
血症の臨床診断 臨床試料は全核酸含量を遊離するように、超音波処理、
ガラスビーズとの激しい撹拌、ＳＤＳのごとき試薬を用
いる界面活性剤溶菌または化学的処理により理想的に加
工される。もしくは、真菌細胞を例えばデュポンアイソ
レーターシステムにより一部精製され、続いて溶菌する
。破壊された真菌を含む試料は次に捕捉プローブ、検出
プローブおよび理想的にはオリゴーチミジンで誘導化さ
れている（実施例２も参照されたい）磁気粒子ビーズの
存在下、ＧｉｌｌｅｓｐｉｅらＵ　Ｓ　Ｓ　Ｎ　２９９
．１５０により記載されているグアニジニウムイソチオ
シアネートのごとき力オトロビック緩衝液（ｃｈａｏｔ
ｒｏｐｉｅ　ｂｕｆｆｅｒ）中でインキュベートするＯ
もし酵母菌または糸状菌１８ＳｒＲＮＡ標的分子が存在
するなら、ビーズ＋捕捉プローブ士標的十検出プローブ
ハイプリダイゼーション複合体が形成される。反応管の
底部近くの磁気の外部的存在により磁気粒子一ハイブリ
ダイゼーション複合体一の管内壁への接着が起こされ、
それにより都合よく、試料マトリックス、非結合プロー
ブその他のごとき未反応成分の除去ができる。

ビーズープローブー標的複合体の再水和および変性を繰
り返すと著しくバックグラウンドを減少させることがで
きるであろう（より詳細には、Ｃｏｌｌｉｎｓら，　　
ＵＳＳＮ９２２．ｌ５５，　　ＥＰＡ８７３０９３０８
およびＵ　Ｓ　Ｓ　Ｎ１３Ｂ．９２０，　Ｅ　Ｐ　Ａ８
ｇ３１２１３５．２に記載されている）。本実施例にお
いては、最終的検出は膜上へのビーズのスポットおよび
オートラジオグラフィーによる検出が用いられた。

只　へ そのような検定のためには、下記の捕捉および検出プロ
ーブの組合せが好適な対の例である：プローブ１４１７
＋　１５４２，プローブ１４１７＋　１５４５．プロー
ブ１４１ｇ＋１５４２．　プローブ１４１８＋１５４５
，プローブ１４１６＋　１８１２，プローブ１８１２＋
　１８６０，プローブ１８５７＋１８６０。

実施例　４　真菌ｒＤＮＡのポリメラーゼチェーン反応
増輻を用いるヒト 試料からの真菌感染の臨床診断 実施例３で提供されたごとき試料加工がＤＮＡを得るた
めに理想的に設計された。ポリメラーゼチェーン反応（
“ＰＣＲ”）増幅のための調製においては、ＤＮＡは更
に処理され一本鎖にされる（例えは融解により）。プロ
ーブ／プライマ−９３６およびプローブ／プライマー９
３５が標準ＰＣＲ法において臨床試料と連結して理想的
に用いられた。生じる物質は、ここに記載された任意の
プローブと共に実施例２の“サンドイッチ”ハイブリダ
イゼーション法を利用して都合よく検定されるであろう
。ポリメラーゼチェーン反応、それ自身もプローブ／プ
ライマー９３６を例えばプローブ１８１２と連結して用
いることにより高度に特異的にすることができる。プロ
ーブ１８１４を捕捉に、およびプローブ１４１５および
１４１６を検出に用いることにより検出が都合よく達成
される。

実施例　５　細胞学的染色としてのイン・サイチュ（ｉ
ｎ　　ｓｉｔｕ）でのノ＼イブリダイゼーション 本発明のプローブは細胞学的染色試薬としても都合よく
使用できる。例えば痰試料を顕微鏡スライドにのせる。

適当な固定化および溶菌後、本発明のプローブとのハイ
ブリダイゼーションがイン・サイチュ（ｉｎ　　ｓ１ｔ
ｕ）で実施される。この方法により、プローブｌ４１６
を蛍光標識し、蛍光顕微鏡を用いてスライドを試験する
ことにより標本中の真菌が視覚化できた。

実施例　６　培養による真菌血症の確認バクテック、ロ
ッシエ、セプチーチェックまたはデュポンアイソレータ
ーを利用する標準培養工程の後、コロニーまたは液体培
養物に真菌が存在するかどうか、実施例２に記載されて
いる方法でプローブ１４ｌ８および１５４２を用いて試
験した。結構な利点は純粋な培養が必要でないことであ
る。

ここに示した方法またはプローブの種々の変更が本発明
の精神または範囲から離れることなくなされることが当
業者には容易に理解されるであろう。特に、ハイブリダ
イゼーション条件での調節に伴われる１つまたは２つの
末端ヌクレオチドを欠損させることによるごときプロー
ブの変更は均等の範囲内にあるものと思われる。

特開平３ １６８０８５（１１） ＋＋＋十＋＋十＋＋＋＋＋十十十＋ 十＋＋＋十十＋十＋十＋＋＋十＋十 十＋十十＋＋十＋＋＋十＋十＋ 十＋ ＋十＋＋＋＋＋十＋＋＋＋＋＋＋＋ 十＋＋十＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ ＋＋十十＋＋＋十＋十十十＋十＋＋ ｑコロｑフｗｃｏｅｏｃ−．＋ｃ−．＋ｃｅＱＣＣＱＣ
９ＱやＱ−ＲやセｆｌＱへへ特開平３ １６８０８５　（１２） ＋十−１−Ｆ＋＋十＋十十十＋十＋＋十十十＋十十＋十
十笛十＋＋十十＋＋十十＋＋＋十＋十＋十十 十 ＋ 十荘十十＋ｌ　ｌ　ｌ　１＋＋十十＋＋ｌ　ｌ　＋十十
＋十十十十＋＋＋十＋＋＋十十十＋＋＋＋十＋＋＋＋十
十十＋＋＋十＋＋＋＋＋十＋＋十十十＋　十＋　＋　＋
　＋　十十十十十十十十＋　十十十＋特開平３ １６８０８５　（１３） 特開平３ １６８０８５　（１４） 十十十＋十十十十十＋十十十＋十十十＋十＋十＋＋十＋
十＋十十十＋十十十十＋十十十十十十十十十十＋十十＋
＋十十＋十＋十十十＋＋＋十＋十＋＋十＋十＋＋十＋＋
＋＋十十＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋’＋十＋十十＋十
＋十＋＋十＋十十十＋＋＋十＋十十十＋＋＋＋特開平３ １６８０８５　（１５） ＋＋十＋ 十＋十＋ 千十＋＋ ＋＋十＋ ＋＋＋＋十＋＋＋ 特開平３ １６８０８５　（１６） 十＋十十十十＋＋ 特開平３ １６８０８５　（１７） 十＋十＋十十＋＋十十＋＋＋ ＋十＋＋十＋＋＋十＋＋十＋ へ 特開平３ １６８０８５　（１８） 十＋十十 ＋＋＋十十 十十十＋十 ベ の ω Ｋ　：　＝＝　＝ 八 区 区 特開平３ １６８０８５　（１９） 特開平３ １６８０８５　（２０） 十十十十十＋十＋十十十十十十十十＋＋十十十＋＋十十
十＋十十十＋＋十＋＋十＋十十十＋＋＋　＋ ＋ 十十＋＋＋＋＋十＋＋十＋＋＋＋十＋＋十十＋十十＋十
十十＋＋＋＋十＋十＋＋十＋十十＋＋特開平３−１６８
０８５　（２１） 十十＋十＋十＋十＋＋＋十＋十＋十十十十十 十 十 十 十 十 ＋＋＋＋＋十＋＋十＋十十＋＋十＋＋十十＋＋＋＋＋十
＋十＋十＋＋＋＋＋＋十＋十＋ 十 ｔｒｙぺ　Ｉ１ １１き〈χ−（ｖ′Ｘ．ｉノ「＼）ＬＩＬＩＰＰリ”ｔ
ｒ’ｓＱｔ特開平３ １６８０８５　（２２） ？にＩ：ｎ 特開平３ １６８０８５　（２３） 千十 ＋十 千十 十＋ ＋　＋ ＋＋ 千十 ＋十 千十 十＋ ＋＋ 千十 ＋　＋ ＋＋ 十＋ Ｈ 特開平３ １６８０８５　（２４） １ ＋　＋ ＋　＋ １ 十＋ 千十 千十 十＋ ＋　＋ 十＋ 十干 十＋ 十干 ＋＋ 《 中 ０ ロ 特開平３ １６８０８５　（２５） ヲ き）ロか ｉＪＪ．リ一，り．リ 特開平３ １６８０８５　（２６） ＋十＋十＋十＋十十十＋十十十十＋＋＋十＋＋十十十十
十十十十十十十十十十十十＋十十＋＋十十十十十十十＋
＋十＋＋十十十＋＋＋＋十十＋十十＋＋＋＋＋十＋ 十 十＋＋＋＋十十 十＋十十＋＋十＋十＋十十＋＋＋＋十十十十十十 ＋＋＋＋十十十＋＋＋十＋十十＋十＋十＋＋＋：ＩＪ費 Ｒや女ＱＱＱＣＣ−ＲぐＣＣＱＣＣＱＱへへ特開平 ３ １６８０８５　（２７） 十十十十十＋十十＋＋　ｌ　＋　＋＋十十＋十＋＋＋１
　＋十＋＋　１　＋十＋＋＋＋＋十＋　十十十＋　＋　
＋　＋　．＋　十十＋　＋　＋　＋　＋＋＋＋十＋＋　
ｌ　ｌ　＋　１　＋＋＋十＋十十十十＋十十十十＋十十
十＋＋十十十十 ＋十＋十＋＋十十十＋十＋十十十＋十 １ １　；　−＜　−＜　−＜　ｌ′Ｖジさコロロ訃訃・八
ぺａ特開平３−１６８０８５　（２８） 特開平３−１６８０８５　（２９） ＋　＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ 十＋ 千十 千十 千十 十＋ 十十 ＋＋ 十干 千十 十十 十＋ 十＋ 十＋ 十＋ Ｏ ＼ Ｋ 特開平３ １６８０８５　（３０） 十＋ ＋＋ ＋＋ 千十 ＋　＋ 十＋ 十＋ 千十 ＋＋ ＋　＋ ＋＋ 千十 千十 千十 ＋　＋ 十十 ペ ■ ０ ロ 妊 モ モ 奇 特開平３ １６８０８５　（３１） 十＋十十 十十十＋＋十 ＋＋＋十 ＋＋＋＋＋＋ ＋＋十十 十＋＋＋＋＋ 千十千十 ＋＋十千十十 十＋＋＋ 十十＋十千十 り Δ′：メ；＼；＼ ＞＞＞　　へ　区　＼ ｈｈ’ｇト ．Ｕシ，り」」，リ ４．

【図面の簡単な説明】

第１図は、 二重プローブの捕捉／検出検定の方 法を示した模式図である。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズで
   きるが、ヒト、細菌および小麦のｒＲＮＡおよびｒＤＮ
   Ａにはハイブリダイズできない核酸断片。 ２、前記断片がプローブ１４１７、１４１８、１４１５
   、１４１６、１５４２、１５４５、ＩＧ７０７、１８５
   ９、１８６０、１８５８、１８５７、１８１２、１８１
   ３、１８１４、１８１６、９３６および９３５から成る
   群より選択されるプローブ内の任意の１０の連続するヌ
   クレオチドを含む配列の少なくとも９０％と相補的であ
   る特許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ３、前記断片がプローブ１４１７、１４１８、１４１５
   、１４１６、１５４２、１５４５、ＩＧ７０７、１８５
   ９、１８６０、１８５８、１８５７、１８１２、１８１
   ３、１８１４、１８１６、９３６および９３５から成る
   群より選択されるプローブ内の任意の１０の連続するヌ
   クレオチドを含む配列の少なくとも９０％と相同的であ
   る特許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ４、少なくともその１つがプローブ１４１７、１４１８
   、１４１５、１４１６、１５４２、１５４５、ＩＧ７０
   ７、１８５９、１８６０、１８５８、１８５７、１８１
   ２、１８１３、１８１４、１８１６、９３６、９３５お
   よびそれらの相補的配列から成る群より選択される、少
   なくとも２つの核酸断片からなるプローブの組。 ５、プローブ１４１７またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ６、プローブ１４１８またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ７、プローブ１４１５またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ８、プローブ１４１６またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ９、プローブＩＧ７０７またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １０、プローブ１５４２またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １１、プローブ１５４５またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １２、プローブ１８５９またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １３、プローブ１８６０またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １４、プローブ１８５８またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １５、プローブ１８５７またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １６、プローブ１８１２またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １７、プローブ１８１３またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １８、プローブ１８１４またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １９、プローブ１８１６またはその相補的配列である特
   許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ２０、プローブ９３６またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ２１、プローブ９３５またはその相補的配列である特許
   請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ２２、試料中の真菌生物体を検出する方法であって、ａ
   ）前記試料を少なくとも１つの核酸断片と、前記断片が
   前記真菌生物体のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ（もし、前記
   試料中に存在するなら）とハイブリタイズ可能な条件下
   接触させ、それにより核酸複合体を形成すること（この
   場合前記核酸断片は非真菌生物体のｒＲＮＡまたはｒＤ
   ＮＡとハイブリタイズしない）；および ｂ）前記真菌生物体の存在の指標として前記核酸複合体
   を検出すること、 からなる方法。 ２３、前記接触段階の前記核酸断片が、プローブ１４１
   ７、１４１８、１４１５、１４１６、１５４２、１５４
   ５、ＩＧ７０７、１８５９、１８６０、１８５８、１８
   ５７、１８１２、１８１３、１８１４、１８１６および
   それらの相補的配列からなるプローブの群より選択され
   る特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、前記接触段階の前記核酸断片がプローブ／プライ
   マー９３６からなり、前記検出段階がさらに前記試料を
   プローブ９３５、１４１７、１４１８、１４１５、１４
   １６、１５４２、１５４５、ＩＧ７０７、１８５９、１
   ８６０、１８５８、１８５７、１８１２、１８１３、１
   ８１４、１８１６からなる群より選択される第２の核酸
   断片と接触させることを特徴とする特許請求の範囲第２
   ２項記載の方法。 ２５、ポリメラーゼチェーン反応により前記真菌生物体
   の１８ＳｒＲＮＡまたは１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を増
   幅する段階を更に含む特許請求の範囲第２４項記載の方
   法。