JPH03112483A

JPH03112483A - バチルス・リケニホルミス

Info

Publication number: JPH03112483A
Application number: JP25161089A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Emura; 江村　達男; Kiyoshi Oba; 大庭　潔
Original assignee: HOKKAIDO NISSEI KK
Current assignee: HOKKAIDO NISSEI KK
Priority date: 1989-09-27
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1991-05-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は大豆蛋白凝固酵素を生産するバチルス・リケニ
ホルミスに関する。

【技術的背景】

牛乳からチーズを作るように、動物性蛋白質を凝固酵素
によって凝固させて食品を作ることは。従来からよく知られている。一方、近年、健康上及び経
済的な理由から、大豆蛋白を凝固させることにより、安
価かつ豊富にある大豆を利用して大豆加工食品を製造す
ることが希望されていた。

【従来技術】

このような背景に鑑み、本発明者は、自然界に生存する
細菌の中から、大豆蛋白凝固酵素を菌体外に生産するバ
チルス・リケニホルミスを発見するとともに、これを単
離することに成功し、該菌株をｒＢ−６−４ＪＪと命名
して工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８
６２６号（ＦＥＲＭＰ−８６２６）として寄託するとと
もに、蒜菌株を利用して生産される大豆蛋白凝固酵素及
びその製造方法について特許出願している（特開昭６２
−１７９３８６号公報参照）。なお、得られた大豆蛋白
凝固酵素は苦みがなくて食料素材に適している。

【発明が解決しようとする課題】

しかるに、上記バチルス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊ
　（微工研菌寄第８６２６号）にあっては、大豆蛋白凝
固酵素を生産するものの、その量はあまり多くなく、大
豆蛋白を凝固させることにより大豆加工食品を工業的に
大量に生産するためには、充分な量の大豆蛋白凝固酵素
を得ることが難しかった。また、このバチルス・リケニ
ホルミスＢ−６−４Ｊは胞子形成頻度が高く、生産され
た大豆蛋白凝固酵素を菌体と分離して抽出する際に胞子
が混入し易く、該胞子から生育した前記Ｂ−６−４５が
前記酵素とともに大豆蛋白に作用して、でき上がった大
豆蛋白食品に意図しない味が付与されるという問題があ
る。本発明は上記問題に対処するためになされたもので、そ
の目的は、大量の大豆蛋白凝固酵素を生産するとともに
、該酵素のみを菌体から容易に分離して抽出することが
可能な新規なバチルス・リケニホルミスを提供すること
にある。

【課題を解決するための手段】

本発明はバチルス・リケニホルミスに関し、その第１の
発明は胞子形成能が低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いバチルス・リケニホルミスにある。また、本発明の第２の発明は大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いバチルス・リケニホルミス微工研条寄第１７７８
号にある。しかして、本発明に係るバチルス・リケニホルミスはバ
チルス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊを親株とする変異
株であり、本発明において胞子形成能が低いとは、後述
する規定された条件下で測定した胞子形成頻度が親株の
バチルス・リケニホルミスに比較して１１５００倍また
はそれ以下であることを意味し、かつ大豆蛋白凝固酵素
の生産能が高いとは同様に大豆蛋白凝固活性が親株のバ
チルス・リケニホルミスに比較して５倍またはそれ以上
であることを意味する。

【発明の作用・効果】

本発明に係るバチルス・リケニホルミスにおいては、胞
子形成能がきわめて低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いことから、大豆蛋白凝固酵素の生成系から該酵素
を菌体と分離して胞子を混入させることなく大量に抽出
することができ、かつ得られた酵素は苦みのない滑らか
な口当りの大豆蛋白凝固物を形成する。従って、本発明
に係るバチルス・リケニホルミスによれば、大豆蛋白加
工食品の製造に適した大豆蛋白凝固酵素を大量に得るこ
とができる。

【実施例】

本発明に係るバチルス・リケニホルミスは上記したバチ
リス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊ　（野生株）の中間
変異株を経て取得した変異株であり、これらの菌株につ
いて分離、ｍ製、培養、突然変異の発生、有用性等の実
験を行うとともに、それらの特性を測定した。ａ、大豆蛋白凝固酵素生産菌のスクリーニング（ａｌ）
分離源静岡県三島市にある国立遺伝学研究所内及び箱根の山の
ふもとの植物、土壌及び豚、牛等家畜の排せつ物から試
料を広く採取した。（ａｌ）分離方法（大豆蛋白凝固酵素）採取した各資料
（植物、土壌、排せつ物等をそれぞれ粉砕した耳かき一
杯程度の資料）を、滅菌した豆乳が各３ｍ７ずつ分注さ
れている試験管にそれぞれ入れて、１２〜１６時間、３
７℃にて振とう培養する（１次スクリーニング）、これ
らの中でカードを形成している（凝固した物を含む）試
験管内の豆乳のｐ　ＩＩを測定し、Ｐ　Ｈが５．５以上
の試験管内の資料について、前記と同様のスクリーニン
グを繰り返し行なった。なお、凝固した試料の中からｐ
Ｈ５，５未満のものを除く理由は、酸によりカード形成
された資料を除外するためである。目的とする微生物の純化のために豆乳によるスクリーニ
ングを５次まで行った。かかる５次までのスクリーニン
グにより、豆乳凝固能を有する微生物を、カード形成し
た豆乳から滅菌した豆乳へ植え継ぎできることが確認さ
れた。その結果、■前記スクリーニングした資料中に、
大豆蛋白凝固能を有する微生物が存在すること、■この
微生物が豆乳の中で繁殖していることが確認できた。その後、５次スクリーニングにより得た微生物を、下記
表１に示す組成でｐＨ６，０に調製された増殖培地で、
　１２〜１６時間、３７℃にて振どう培養することによ
り、植え継いだ。１硫酸アンモニウム　　　　　　　０．１％リン酸塩　　
　　　　　　　　　　１．０％硫酸マグネシウム　　　
　　　　０．０１％クエン酸ナトリウム　　　　　　０
．０５％カザミノ酸　　　　　　　　　　０．０２％酵
母エキス　　　　　　　　　　０．１％グルコース　　
　　　　　　　　　０．５％ｂ、大豆蛋白凝固酵素生産
菌の純化５次スクリーニングを行ったサンプルから平板希釈法に
より、大豆蛋白凝固能が最も高い菌株を単一菌株として
得た。この菌株をｒＢ−６−４ＪＪと命名し、同菌株を
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号
は徹工研菌寄８６２６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８６２６）
である。この菌株は竹の葉および竹の根に集中して分布
していた。次に、得られた菌株（Ｂ−６−４Ｊ）において、大豆蛋
白凝固能を有する物質が菌体内あるいは菌体外に存在す
るのかを確認した。まず、この菌株を上記表２に示す組
成でｐＨ６，０に調製された生産培地で、　２４時間、
　３７℃にて振とう培養した。硫酸アンモニウムリン酸二水素カリウム硫酸マグネシウムクエン酸ナトリウムカザミノ酸酵母エキスグルコース１１．１％の塩化カルシウム溶液地０．１％１．０％０．０１％０．０５％０．０２％０．１％０．５％０．０１％豆乳（大豆蛋白濃度１０％）　　５％このようにして培養したものを、０℃、６０００　ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離を行い、上澄液と菌体とに分離し
てそれぞれの活性を調べた。上澄液に関しては、該上澄
液を平均細孔径０．２２μｍのフィルタを通すことによ
って除菌し、同波に含まれるものの豆乳凝固活性を調べ
た。また、菌体に関しては、該菌体を乳ばちにおいて石
英砂と共によく磨砕し、そこにｐＨ７，０のリン酸緩衝
液を加えて、上記と同様に０．２２μｍのフィルタを通
して得た菌体抽出液に含まれるものの豆乳凝固活性を調
べた。なお、かかる場合に、　リン酸緩衝液を入れるのは、菌
体の粉砕によって変化したｐＨを元に戻して酸による豆
乳凝固の影響をなくすためであり、また。フィルタを通すのは、不要な成分を除去するためである
。その結果、上澄液には豆乳を凝固させる活性能が存在し
、菌体抽出液には豆乳を凝固させる活性は全く存在して
いないことが確認できた。さらに、前記上澄液を８０℃で３０分間加熱して、該加
熱した上澄液に豆乳凝固活性能が存在するかを調べた結
果、前記活性能がなくなることから、加熱によって豆乳
凝固活性能が消失することが確認された。これらの実験により、豆乳凝固活性能を有する物質は無
機物ではなく、前記微生物が生産する菌体外酵素である
ことを確認できた。Ｃ０酵素生産性を増加させる培養条件の検討（ｃｌ）こ
の菌株（Ｂ−６−４Ｊ）を各種条件で培養を行うことに
より、大豆蛋白凝固酵素生産能を増加させる培養条件の
検討を行なった。かかる場合、基本的培地として、上記
表２の組成のものを用いた。なお、この培地組成は、資
化しうる（菌株が栄養素として培地に接種できるととも
に、その培地で増殖できる）炭素源、窒素源、栄養源等
を含有するものであり、かつ大豆蛋白凝固酵素を分泌す
るものであれば、いかなる培地でもかまわない。前記実験の結果、大豆蛋白凝固酵素の生産を増加させる
菌株の培養条件に関し、次のことを知得した。なお、説
明の便宜上、上記表２の組成を有する培地を例に取り説
明する。 ■無機塩（（Ｎｌ１４ｈｓＯａ、　　ＫＩ１２ＰＯ４，
Ｍｇ５Ｏａ・７＋１２０）、クエン酸ナトリウム、グル
コース、酵母エキス及びカザミノ酸は、菌体を増殖させ
るものであって、大豆蛋白凝固酵素の生産性を高める上
ではあまり関係ない。換言すれば、これらの化合物は大
豆蛋白凝固活性能を引き出す上ではあまり関係ない。 ■豆乳（蛋白質濃度＝１０％）を添加するかしないかは
、大豆蛋白凝固酵素生産能を引き出すことに大きく影響
する。第１図は表２に示す生産培地への豆乳添加量と大
豆蛋白凝固活性との関係を示すもので、温度４５℃で２
４時間振とう培養シた場合の結果であり、凝固活性は後
述する定義に基づいて算出した。第１図によれば、豆乳
（大豆蛋白１０％）を培地に２．５〜７．５％程度添加
すると、菌体の大豆蛋白凝固活性能を有効に引き出せる
こと、及び豆乳を培地に５％程度添加すると、菌体の大
豆蛋白凝固活性能を最も有効に引き出せることが解る。　また、この場合、豆乳がこの菌株に対して大豆蛋白凝
固酵素の生産能を高めるインデューサとして働いている
ものと考えられる。 ■第２図は４５℃、ｐＩ（６，０で振とう培養した場合
の培養時間に対する菌数（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉＢ
ｕｎｉｔ／＋ｊ）及び大豆蛋白凝固活性の関係を示して
いる。この結果によれば、培養時間は２０時間以上必要
であり、５０時間までは前記凝固活性が残っていること
が解る。また、上記培養条件において最適時間で温度を
変化させ、かつ最適時間および最適温度でｐ　Ｈを変化
させて振とう培養を行った結果、培養温度は４５℃前後
が適当であり、かつ培養地のｐ　Ｈは６〜７で安定であ
った。（Ｃ２）大豆蛋白凝固活性ＳＣＡの定義豆乳（蛋白質濃
度：１０％）に培養液を加え６５℃でカードを形成する
基準時間を１時間とし、下記式にて算出する。Ｓ　ＣＡ　＝　Ｓｏｙｍｉｌｋ　　Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　
　Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ｕｎｉｔ）＝　（Ｓ／Ｅ）ｘ　（
３６００／ｌ）Ｓ：基質（豆乳）のｆｆｉ（ｍ））Ｅ：培養液を遠心し菌体を取り除いた上澄液の量（ｍ）
）を二　カードの生じる時間（秒）ｄ１分泌酵素量を増大させるための菌体の改良（突然変
異株の取得）前記菌株（Ｂ−６−４Ｊ）の菌体外酵素の分泌量を増大
させるために、以下の方法で突然変異株を取得した。な
お、この菌株を、表３に示す市販の栄養増殖培地により
４５℃、ｐＨ６，０で振とう培養した後、菌体だけを遠
心分離により採取し、採取した菌体を長く生存させるた
め壜こ、同菌体にリン酸緩衝液を入れることにより懸濁
して以下の実験に供した。３゜Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ肉エキス酵母エキスペプトンデキストローゼ塩化ナトリウムリン酸水素二カリウムリン酸二水素カリウム地　　　　　１２（デイフコ社製商品名）０６１５％０．１５％０．５％０．１％０．３５％０．３８８％０．１３２％Ｍｅｄｉｕ園（ｄｌ）紫外線（ＵＶ）処理上記の処理で得られた懸濁状態にある菌体を１００倍に
希釈して、表３の組成を培地とする栄養増殖平板プレー
トに塗抹し、紫外線を種々条件を変えて照射した。かか
る照射後、前記プレート上で３７℃、１昼夜培養した。該培養後、胞子形成能が低い変異株を取り出したところ
、９株の変異株が得られた。この得られた変異株の大豆
蛋白凝固活性能を調べたが、この中には大豆蛋白凝固活
性能を持つ菌株は見い出されなかった。（ｄ２）γ線照射処理上記１００倍に希釈したものと同じ菌株にγ線を２０に
レントゲン照射後、菌体を表３の組成を培地とする栄養
増殖平板プレートにまき、４５℃で３日間培養した。プ
レート上に増殖した菌株より、胞子形成能が低い株を捜
したが、一つも見い出されなかった。また、大豆蛋白凝
固活性能を有する菌株も見い出されなかった。（ｄ３）ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理ＮＴＧ５ｍ
ｚをリン酸ＩＩ！ＩＷＪ液４．５ｄに溶解し、この溶液
の中に前記１００倍に希釈した菌体液を０．５ｍｔ添加
して、　３７℃で６０分捏上うさせた。次に、この菌体
をリン酸緩衝液で３回洗浄を行なった後上記した栄養増
殖平板プレートにまき、４５℃で１昼夜培養した。その
結果、胞子形成能が低いと思われる菌株は２２株得られ
た。この２２株のうち、大豆蛋白凝固活性能を有する菌株が
３株見い出された。この中で、最も凝固活性が高いもの
を中間変異株２６Ｄとし、以後の実験に供した。この中間変異株２６Ｄの野生株Ｂ−６−４Ｊに対する性
質を以下に記す。 ■胞子形成頻度野性株Ｂ−６−４Ｊの１／１０００〜１／１００００倍 ■大豆蛋白凝固活性の比較野性株の約２倍これらの性質は、野性株Ｂ−４−６Ｊを培養するときよ
り、エアレーション（通気量）が低い培養条件時に観察
される。なお、他の培養条件は上記（ｃｌ）で述べた菌
株Ｂ−６，−４Ｊの場合と同様である。また、胞子形成
頻度は下記の方法により菌株を処理し、測定して算出し
た。ａ：菌株のコロニーを１つ１つプレートに移す。この同じプレートを２枚作る。ｂ：底部にクロロホルムを１満々下したシャーレの　　
蓋に上記プレートの１枚を被せるとともに、他のプレー
トをクロロホルムの滴下してないシャーレの蓋に被せ（
コントロール）、これらのプレート上の菌株を４５℃、
１６時間培養する。胞子形成能が弱い菌株、胞子形成の
少ない菌株はクロロホルムの影響で生えない。Ｃ：生えていない菌株（クロロホルム側）に対応するコ
ントロール側の菌株の凝固活性を調べ凝固活性を持つ菌
株を表３に示す栄養増殖培地で増殖する。ｄ：菌体を８０℃で１５分間熱処理し、熱処理前後の菌
数を測定して下記式により胞子形成頻度を算出する。胞子形成頻度＝（熱処理後の菌数）／（熱処理前の菌数）増殖した菌体が１００％胞子を形成している場合胞子形
成頻度は１となる。（ｄ４）中間変異株２６ＤのＮＴＧ処理中間変異株２６
Ｄから、さらに変異株を取得するために次のような処理
を行なった。 ■中間変異株２６Ｄを表３に示す栄養増殖培地３ｍ［中
で、４５℃にて１晩培養する。 ■前記■の培養液０．１ｍＪ２を上記栄養増殖培地３ｍ
ｇ中に添加し、４５℃で対数増殖期（ログフェーズ）ま
で振とう培養する。なお、対数増殖期まで培養する理由
は、該増殖期における菌株が最も突然変異する傾向が強
いためである。 ■前記■の培養液を０．５ｎ＋／ずつ５つの試験管に分
注し、それぞれにｌｌ１ｇ／ａｆのＮＴＧを０．０．　
２．５．　５．０゜１０．０．　２５．０μｌずつ入れ
る。これにより、各試験管内のＮＴＧｍ度は、それぞれ
０．　５．　１０．　２０．５０μｇ／ｍノとなる。 ■前記■の各試験管を４５℃で３０分分間上うする。 ■前記■の処理後、各試験管内の菌体を１＋ｎｅの上記
栄養増殖培地で３回ずつ洗浄する。 ■前記■の処理後、菌体にそれぞれ０．５ｍｌの上記栄
養増殖培地を添加してＪｌ！ＴＩ濁する。 ■前記■の懸濁液の、各３０μノを３Ｉｌｌｌの上記栄
養増殖培地に加えて、４５℃で１晩振とう培養する。前記■の処理後、各培養液を一８０℃に保存して以後の
実験に供する。次に、細菌は通常カナマイシン（抗生物′Ｉｉ”）に対
して感受性であるが（今回得た中間突然変異株２６Ｄも
カナマイシンに対して感受性である）、突然変異によっ
て得られた細菌はカナマイシンに対して耐性となる場合
があることに鑑み、前記保存しである菌株を０．２μｇ
ノＩＩＩ／！のカナマイシンを含む栄養増殖平板プレー
トにまき、ミューチージョン頻度の高いＮＴＧ１度群を
選別した。その結果、ＮＴＧ２１度が２０Ｐｇ／ｍノで
ある場合に、　ミューテーシ目ン頻度が最も高く、その
頻度は３．５２ｘ　１０−３であった。ＮＴＧ濃度２０
μｇ／ｍｌの群を、上記表１の培地にプロテアーゼ活性
測定試薬（シグマ製のハイドパウダー　商品名）０．５
％と、寒天とを加えて平板培地としたものにまき、ハロ
ーを形成した菌株を採取する。菌数は１．３ｘｌＯ５と
なり、その中から１株の目的とする菌株（蛋白凝固活性
能が最も高い菌株）が得られた。この菌株を変異株２６
Ｄ＝７と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に国
際寄託した。寄託番号は微工研条寄第１７７８号（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１７７８）である。野性株（Ｂ−６−４Ｊ）、　　中間変異株（２６Ｄ）お
よび変異株２６Ｄ−７の胞子形成頻度及び大豆蛋白凝固
活性の比較を下記表４に示す。（以下余白）表４゜び大豆ｅ、　　Ｂ−６−４Ｊ、　　２６Ｄ−７の菌学的性質上
記表５に示したＢ−２培地を用いて、両菌株Ｂ−６−４
Ｊ、　　２６Ｄ−７を培養し、　　ｒＴｈｅ　Ｇｅｎｕ
ｓＢａｃｉｌｌｕｓＪ及びｒＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎ
ｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ。ｉｖｅ　Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌｏｇｙＪ　　に基づいて
、それらの菌学的性質を調べた。（以下余白）表５゜旦二二又」Ｌ墳」「威なお、上記組成の培地をプレートにする場合は１．５％
の寒天粉末を加える。下記表５に、Ｂ−６−４Ｊ、２６Ｄ−７の菌学的性質を
示した。（以下余白）表６゜苗ご１葡１質表６に示す菌学的性質から野生株Ｂ−６−４Ｊ及び変異
株２６Ｄ−７は共にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属で
あると考えられ、さらにバチルス属の中では、寒天に固
く張り付いたコロニーを作ること、成育温度が高いこと
、嫌気下での成育が見られることなどから、前記両画は
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種であると同定した。また、こ九らの野生株Ｂ　＝　６−４　Ｊ、中間変異株
２６Ｄ及び変異株２６Ｄ−７の大豆蛋白凝固酵素生産能
及び胞子形成頻度に関しては表４に示したとおりである
。さらに、前記ＮＴＧ処理の過程にて、野生株Ｂ−６−
４Ｊ及び中間変異株２６Ｄは抗生物質としてのカナマシ
ンに感受性であるが、変異株２６Ｄ−７は前記カナマイ
シンに耐性であることも確認された。ｆ、大豆蛋白凝固酵素の単離及び精製２を容量のジャーファーメンタ−に１．５１の培地（上
記式２の培地）を入れて殺菌を行った後、変異株２６Ｄ
−７を植えて、４５℃で４８時間通気攪伴培養を行った
。培養液は、珪藻±（ＳＳＣ）で濾過して菌体を除去し
た後、５５％の飽和硫酸アンモニウムを用いて硫安分画
を行い、ゲル濾適用充填剤（ファーマシア社製５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ　−１００、商品名）を用いて脱塩した。１’ｌ　Ｉｉ；Ｘ後の培養液をカルボキシメチルセルロ
ースカラム（ＣＭ−５２カラム）に透し、塩化ナトリウ
ム直線濃度勾配法で経時的にフラクションを採取した。この場合の培養液の溶出パターン（分光光度針による波
長２８０Ｉの吸光度）を第３図に破線で示すとともに、
大豆蛋白凝固酵素の凝固活性を実線で示した。これらの各フラクションのうち、第３図に実線で示すビ
ーク■に対応する酵素とビークＨに対応する酵素とに大
豆蛋白凝固活性が見られた。更に、酵素の溶出量が多か
ったビーク■を前記ゲル濾適用充填剤のカラムを用いて
、ビーク■を単一な物質に精製した。第４図にはかかる
精製物の上記した塩化ナトリウム直線濃度勾配法での溶
出パターンを示しであるが、かかる場合も、破線のよう
な溶出パターンのうちで、実線で示す部分の酵素に大豆
蛋白凝固活性能が認めら九た。これにより、所望とする大豆蛋白凝固酵素が単離及び精
製される。ｇ、大豆蛋白１１１固酵素の性質前記ビークＩ、　　ＩＩに対応する酵素（以下、単に酵
素ピークＩ、　　ＩＩという）の理化学的性質は、各種
実験の結果、次のとおりであることを確認した。 ■酵素ビークＩ、　　ＩＩは共に、豆乳に作用させると
大豆蛋白を凝固させる。 ■酵素ピークＩ、■は共に、苦みがなく、毒性もなく食
品加工用に適する。 ■酵素ビーク■は５ＤＳｔ気泳動的に単一なバンドとな
り、分子量は３０，０００前後である。酵素ビーク■は
その生産量が少ないために、前記測定が不能である。 ■第５図のグラフは下記条件（１）により測定された酵
素の大豆蛋白凝固活性と温度との関係、第６図のグラ°
フは下記条件（ＩＩ）により測定した酵素の熱安定性、
第７図のグラフは下記条件（ＩＩＩ）により測定した酵
素の同凝固活性とｐＨとの関係、第８図のグラフは下記
条件（ｒＶ）により測定した酵素のｐＨ安定性をそれぞ
れ示している。これらのグラフの結果から、凝固活性を
示す最適温度は酵素ピーク！では約８０℃、酵素ピーク
■では約６５℃であり、かつこれら両酵素共３０〜４０
℃の下では１時間安定である。また、これら両酵素は共
に酸性側で高い凝固活性を示し、ｐ　Ｈ＞　７では凝固
活性をほとんど消失するが、４°Ｃの下では両酵素共に
ｐＨ４〜９ではほぼ安定であり、少なくとも７０％の活
性が残存する。条件（■）：酵素ピーク■、■の各２００μノを１８０
０μｌの豆乳にそれぞれ添加するとともにｐ　Ｈを６．５に調整し、各温度での凝固活性を測
定。条件（■）：酵素ピークｒ、　　ｒｒを１時間各温度に
保持した後、酵素ピーク■は８０℃ にて酵素ピーク■は６５℃にて、かつ他の条件は条件（１）と同様にして凝固活性を測定。条件（■）：豆乳を各ｐ　Ｈに調整するとともにこれら
の凝固活性測定温度を８０°Ｃ１６５℃とした点を除き条件（１）と同様にして凝固活性を測定。条件（■）：酵素ピーク！、■を各ｐ　Ｈに調整すると
ともに４℃で１６１Ｉ４Ｊ間冷蔵し、凝固活性測定温度
を８０℃、６５℃ とした点を除き条件（１）と同様にして凝固活性を測定。 ■表７は下記条件により測定した酵素の大豆蛋白凝固活
性に対する各化合物の影響を示しており、同表に示すよ
うに、酵素ピーク！、　■は、共に金属イオンによる影
響が認められない。酵素ピーク■は、ＰＭＳＦ（フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド）及びＴＳＦ　（）
ルエンスルフオニルフルオライド）によって１００％阻
害され、酵素ピーク■はＥＤＴＡ　（エチレンジアミン
四＃酸）によって１００％阻害された。これらにより、
酵素ピーク■はセリンプロテアーゼの一種と考えられ、
酵素ピーク■は金属酵素の一種であると考えられる。表７゜大豆蛋白凝固酵素に対する各化合物の影響り、酵素の有
用性上記ピークＩに対応する酵素を用いて豆乳を凝固させて
、大豆加工食品を￥Ａ造できる。例えば、豆乳、乳糖、
油脂及び乳化剤の混合物に、乳酸菌及び前記酵素を添加
して発酵させ、該発酵物からホエー（乳しよう）を排除
してプレスすることにより離水すると、固形物が得られ
る。かかる場合、乳酸菌を添加するのは、大豆特有の臭
味を消すためである。この固形物に、水、安定剤、チー
ズ用の呈味、チーズ用フレーバ等を加えて殺菌を行うと
、乳製品としてのチーズに近いものが製造される。なお
、この場合、水及び安定剤の添加量を種々変えることに
より、ハードタイプ、クリームタイプ等のチーズが製造
される。また、前記チーズ用の呈味及びチーズ用フレー
バに変えて、他の食品に適した呈味及びフレーバを添加
すれば、チーズとは異なる大豆加工食品も製造できる。このようにして製造された食品はコレステロールが少な
く、健康食品として優れている。また、原料としての大
豆は豊富にあり、安価に乳製品と類似した大豆加工食品
を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス・ケニホルミスの野生株が生産する酵
素の大豆蛋白凝固活性と豆乳添加量の関係を示すグラフ
、第２図は培養時間と菌数及び同凝固活性の関係を示す
グラフ、第３図は本発明に係るバチルス・リケニホルミ
スが生産する酵素の溶出パターン図、第４図は第３図の
ピークＩに対応する酵素の再溶出パターン図、第５図は
第３図のピークＩ、　　ＩＩに対応する酵素の大豆蛋白
凝固活性と温度の関係を示すグラフ、第６図は同酵素の
温度に対する安定性を示すグラフ、第７図は同酵素の同
凝固活性とＰＨの関係を示すグラフ、第８図は同酵素の
ｐ　Ｈに対する安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）胞子形成能が低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いバチルス・リケニホルミス。
（２）大豆蛋白凝固酵素の生産能が高いバチルス・リケ
ニホルミス微工研条寄第１７７８号。