JPH0253737A - 多機能特異的抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は感染性下痢症を予防することを目的とする多機
能特異的抗体に関しより詳しくは感染性下痢症の病原ウ
ィルスの１種以上及び病原細菌の１種以上からなる混合
物を抗原として産卵鶏を免疫し、それぞれに対応する抗
体を鶏卵卵黄中の水可溶性蛋白質画分に同時に生産せし
めることを特徴とする多機能特異的抗体の製造方法に関
する。

〔従来の技術〕

感染性下痢症は日常遭遇する比較的ありふれた疾患で、
病原ウィルスあるいは病原細菌が消化管内に感染するこ
とにより発生する。しかし免疫力が充分に発達していな
い乳幼児、乳幼若期の家畜及び免疫機能の低下した老人
にとって、消化管感染による下痢症はしばしば深刻な疾
患として問題となる。現在、主として発展途上国で年間
的５゜Ｏ万人の乳幼児が感染性下痢症で死亡しており、
その制圧が緊急な課題として世界保健機構（ＷＨＯ）等
の世界的プロジェクトになっている。

我々人間を含む動物は体内に侵入してきた異物（細菌、
ウィルス、異種タンパク質等）抗原に対して特異的抗体
を産生じ、異物抗原を不活性化あるいは解毒する。特異
的抗体のほとんどは自己体液、特に血液中に産生される
。これに対し、感染性下痢症はいわば我々の体外である
消化管内の壁面細胞へ経口的に侵入してきた病原ウィル
ス及び病原細菌が付着感染することで発病する。そのた
め、感染性下痢症には体内の特異的抗体が有効に利用さ
れ難いといわれている。特に自己免疫力の低い乳幼児や
老人、また乳幼若期の家畜では、特異的抗体の産生も不
充分であるため、感染性下痢症を自己の産する特異的抗
体で予防することは困難である。

しかし最近、この種の感染性下痢症の予防に異種動物に
産生させた特異的抗体の経口的投与が有効であることが
指摘されている［ＣｕｒｔｉｓＲ，Ｂａｒｔｚら：Ｔｈ
ｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ’　　Ｉｎｆ’ｅｃｔｉｏｕ
ｓ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓｖｏｌ、　　　１４２，４３９
（１９８０）、Ｒ。

ｂｅｒｔ　　Ｈ，Ｙｏｌｋｅｎら：Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ
ｓ　　ｖｏｌ、　　８１，２９１（１９８Ｂ）コ。

感染性下痢症の病原ウィルス及び病原細菌に対する特異
的抗体を経口的に投与して、該病の感染予防を行うため
には、先ず随時にしかも計画的に該特異的抗体を生産す
ることが可能でなければならない。

通常、特異的抗体は免疫哺乳動物（ウサギ、ヤギ、ウマ
等）を殺し、その血液より分雛する。従って該抗体の大
量生産には必然的に多数の動物を犠牲にしなければなら
ない。免疫に用いる哺乳動物は高価であるのみならず、
その血液中にはウィルス存在の可能性もあって衛生学的
に必ずしも清潔ではなく、その取り扱いに繁雑な操作と
注意を必要とし、また抗体収量も必ずしも良好でない。

一方、鶏も侵入異物抗原に対し、自己血液中に特異的抗
体を産生じ対応する。しかも上述のように、次凹代生命
を異物抗原の攻撃から防御するため、その鶏卵卵黄中に
は該特異的抗体が親鶏血液から移行して存在する。この
事実は、１９６２年にバターソンらによりはじめて見い
出された［Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｒ，ら：Ｊ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　　　８９，２７２．（１９６２）コ。

これ以来、鶏を用いてその卵の卵黄中に種々の抗原に対
する特異的抗体が得られることが報告されている。しか
し、従来の研究報告はいずれも屯−抗原を用いて、これ
に対して特異的に結合する抗体（単機能抗体）を鶏卵卵
黄中に生成させ、それを例えば臨床検査試薬に用いるこ
とを目的としているにすぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

種々の感染性下痢症は病原ウィルス及び病原細菌の複数
因子によって発症する。従って特異的抗体を用いた経口
的受動免疫により感染性下痢症を予防するには、種々の
病原ウィルス及び病原細菌に対してそれぞれの感染力を
中和する特異的抗体の混合物、即ち、多機能特異的抗体
を調製し利用することが実用的である。しかし現在、こ
のような感染性下痢症の予防を目的とした多機能特異的
抗体を積極的に調製し応用しようとする試みは、少なく
とも課題分野に関するかぎり、全く行われていない。

鶏の場合、一般的に抗原としてのウィルスの株を増すと
それぞれの株に対する抗体価が上昇し難いことが知られ
ている。このことは、感染性下痢症の予防を目的として
の多機能特異的抗体を鶏卵を通じて製造する場合の障害
となっている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者の基礎研究により、１）産卵鶏は哺乳動物と異
なり、多種、多量の抗原の免疫注射に耐え、２）しかも
体液に産せられる抗体はかなり急速に鶏卵卵黄中に濃縮
移行し、３）これらの機能は抗原の反復投与で半年以上
もの長期間、同一レベルに維持されることを確認し、か
つ明らかにした。換言すれば、胎生哺乳動物と異なり卵
生鳥類は卵生の次世代生命を保護するため、著量の抗体
を卵に付与する特徴を有し、この原理に基すいて本発明
は成功したということができる。

本発明者は、感染性下痢症の病因となるウィルス及び細
菌のそれぞれに対して特異的に結合し、それぞれの感染
力を中和する高い抗体価の多機能特異的抗体を工業的に
生産することを目的として鋭意研究を重ねた結巣、以下
の事実を見い出し、本発明を完成諮せた。

１）感染性下痢症の病因となる抗原で産卵鶏を免疫し、
その鶏卵卵黄より得た特異的抗体は、同様にウサギを免
疫しその血液から得た特異的抗体とほぼ同等の抗体価を
示した。

２）追加免疫によるショック死はウサギでは多かったが
、産卵鶏では全くなかった。

３）１羽のウサギの全血液から得た特異的抗体量は、約
１０個の鶏卵卵黄から得られるそれとほぼ同量であった
。

４）感染性下痢症の病因となる抗原で産卵鶏を免疫して
も、その産卵率には何ら影響なく免疫量１羽当り平均、
年間２５４個の卵を産んだ。

５）追加免疫を、ある一定間隔で繰り返せば、鶏卵卵黄
中の特異的抗体の抗体価は、その鶏の産卵期間を通じて
高いレベルで維持された。

６）感染性下痢症ウィルスの１種以上と血液寒天培地を
用い溶血環を指標にして分離した病原性腸内細菌を同時
に含有する下痢症複合抗原で産卵鶏を免疫すれば、単に
感染性下痢症ウィルスのみを用いて免疫したものよりそ
れぞれのウィルスに対し、より高い抗体価の特異的抗体
がその鶏卵卵黄中に得られた。また同時に、用いた病原
性腸内細菌に対する特異的抗体も該卵黄中に得られた。

本発明者は、上述のごとく産卵鶏の抗体生成に対する生
物学的特性を詳細に研究した結果、本発明を完成するに
至った。即ち、本発明は感染性下痢症の病原ウィルスの
１種以上及び病原性腸内細菌の１種以上からなる、感染
性下痢症複合抗原で産卵鶏を免疫し、該免疫量の産する
卵の卵黄中に該複合抗原それぞれに対応する特異的抗体
を同時に生成せしめることを特徴とする多機能特異的抗
体の製造方法に関する。

本発明に言う、感染性下痢症の病原ウィルスとはロタウ
ィルス、腸性アデノウィルス、ノルオウクウイルス、カ
リシウィルス、アストロウイルス、コロナウィルス、プ
レダウィルス等、人及び家畜に下痢をおこすウィルスで
ある。他方、病原性腸内細菌とは、血液寒天培地での溶
血環を指標にして下痢症患者の下痢側から分離される細
菌を指し、通常そのほとんどは、人及び家畜に下痢症を
おこす病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ウェルシュ菌、
カンピロバクタ−、ブドウ球菌、サルモネラ菌、ボツリ
ヌス菌、セレウス菌等である。

これら感染性下痢症の病原ウィルス及び病原性腸内細菌
をそれぞれ適当な動物細胞及び培地で増殖培養し、常法
によりホルマリン等を用いるそれぞれを不活化した後、
混合して本発明の感染性下痢症複合抗原とする。

該複合抗原を用いた産卵鶏の免疫は常法により行われる
。即ち、筋肉注射、皮下注射、静脈注射等いずれの方法
でもよいが、本発明の多機能特異的抗体の生産には、好
ましくはそれら方法の併用によるのがよい。

免疫量は、１羽、１回当りウィルスの場合はタンパク量
として最大５０μｇ、また病原性腸内細菌の場合は細胞
数で最高ｌＸｌ０”個が可能であるが、産卵率に影響な
く免疫するのにはそれぞれの１／２量とするのが望まし
い。しかし、ウィルスの場合タンパク量で１０μｇ以下
、また細菌の場合ｌＸｌ０’個以下では高い抗体価が得
られ難い場合があるので、免疫量はこれら以上にするこ
とが望ましい。

免疫は１週あるいは２週に１回の間隔で合計３回または
それ以上行う。鶏卵卵黄中の抗体価は通常免疫２回目か
ら上昇し、３回目の免疫の約１週間後に最高値に達する
。この最高値はその後約３ケ月間持続する。その後抗体
価が低下すれば、再度１回免疫すれば、その約１週間後
に抗体価はほぼ前回の最高値まで回復し、さらに約３ケ
月間その最高値が持続する。即ち、鶏を用いることによ
り、鶏の産卵期間中継続的に高い抗体価を有する多機能
特異的抗体をその鶏卵卵黄中に生成させることができる
。

本発明の感染性下痢症複合抗原を用いて生成される多機
能特異的抗体は、病原性腸内細菌を併用せずに、単に感
染性下痢症の病原ウィルスのみを用いて鶏を免疫して得
られた抗体に比べ、抗体価が高い。これは注目すべき事
実で、同時に使用される病原性腸内細菌がウィルス抗体
生成に対し、何らかの増強作用を有するためであると考
えられる。

本発明により生産される感染性下痢症予防に有効な多機
能特異的抗体の実際の応用に際しては、該多機能特異的
抗体を含む鶏卵をそのまま食したり、またはその全卵粉
末あるいは卵黄粉末を食用素材として用いたり、また必
要に応じては該多機能特異的抗体を鶏卵卵黄より精製し
、経口的投与に用いることができる。卵黄から該多機能
特異的抗体の調製は、ラムダーカラギナン等の天然多糖
類を卵黄リポタンパク質沈殿剤として用い、その遠心上
清液（卵黄水溶性タンパク質両分）より鶏卵卵黄抗体を
精製する方法（特許出願番号６２−１９４０８３）がＭ
Ｒ単で工業的であるが、製法について特に限定するもの
ではない。

以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明する。

〔実施例〕

実施例１．胎生動物（ウサギ）と卵生動物（産卵鶏）の
粗感染性下痢症複合抗原に対する免疫耐性及び、得られ
る総抗体量の比較 ヒトロタウィルスＷａ株が病因と推定された小児水溶性
下痢側に１％ホルマリン生理食塩水を等量加え一夜放置
後、遠心分離（１，ＯＯＯｒｐｍ、５分間）した上清を
ポアーザイズ５μｍの膜で濾過し、感染性下痢症複合抗
原溶液とした。該複合抗原は、その１ｍ！当りにヒト「
１タウイルスＷａ株を５．２Ｘ１０’　ＦＣＦＵ（螢光
抗体陽性フォーカス単位）及び血液寒天培地上で溶血環
を指標に分離される病原性腸内細菌２．３Ｘ１０’個を
含有した。該複合抗原溶液をウサギ及び産卵鶏のそれぞ
れ１０羽づつに、１羽当り１回、　２ｍｆｆ１を筋肉注
射し免疫区とした。また、それぞれの２羽づつに０．５
％ホルマリン生理食塩液の２ｍρづつを同様に筋肉注射
し、コンｌ−ｏ−ルとした。

免疫は２週間毎に行い、合計４回免疫した。ウサギにつ
いては採血を２週間毎に、そして、最終免疫の２週間後
に全採血を行い、常法に従い血清を分離し、それぞれを
同量づつ混合した混合血清を中和抗体価ｉｌｊ定用ナン
ブルとした。一方、産卵鶏については２週間毎に産した
卵の卵黄を全て集め均質化後、その一部をラムダーカラ
ギナン水溶液（１ｍｇ／ｍρ）で１０倍希釈し、それを
遠心分′ａ（３，００Ｏｒｐｍ、１０分間）し、その上
清を卵黄１０倍希釈相当液とした。得られたウサギ混合
血清及び卵黄１０倍希釈相当液を用いて、以下の方法で
ヒトロタウィルスＷａ株に対する中和抗体価を測定した
。

（中和抗体価の測定） 調製したウサギ混合血清及び卵黄１０倍希釈相当液につ
いて、生理食塩水を用いそれぞれの希釈系列を作製した
。その５０μ！をヒトロタウィルスＷａ株の１００ＦＣ
ＦＵ（螢光抗体陽性フォーカス！１１位）を含むウィル
ス液５０μりと混合し、３７°Ｃ，１時間インキュベー
トした後、ＭＡＩＯ４細胞（１ル腎臓細胞）ＩＸｌｏ”
細胞／ウェルへ感染さけた。３７°Ｃｌ２Ｏ時間培養し
た後、それぞれのＦＣＦＵを測定し、ウィルス１００Ｆ
ＣＦＵの感染力を５０％阻害するに充分な最大希釈倍率
を求めて、血清中及び鶏卵卵黄中の中和抗体価とした。

またウサギ混合血清中の抗体量を抗ウサギ抗体ヤギ血清
を用いて、鶏卵卵黄中の抗体量を技部抗体ウサギ血清を
用いて定量的免疫拡散法により、常法通り測定した。

（結果） 祖感染性下痢症複合抗原に対するウナＶ′及び産卵鶏の
免疫耐性の比較 免疫に用いたウサギ１０羽の内、１羽が２回目の免疫後
に、３羽が３回目の免疫後にショック死した。一方、免
疫に用いた産卵鶏については本実験の免疫期間中、ショ
ック死は見られなか−）た。

胎生動物（ウサギ）に比較し、卵生動物（産卵鶏）はそ
の血中抗体を速やかに卵黄中へ移行することにより、人
為的追加免疫に対する優れた耐性分獲得していると推／
１ＩＩＩされる。

ヒトロタウィルスＷａ株に対する中和抗体価の推移 ウサギ混合血清中及び鶏卵卵黄中の中和抗体価の推移を
表１に示した。

鶏卵卵黄中の中和抗体価はウサギ血清中のそれに比較し
、同等であることがわかった。また産卵鶏については、
その中和抗体価の低下してきた時点で（約３ケ月毎）再
免疫をした結果、その−週間後には鶏卵卵黄中の中和抗
体価が回復することが示された。

表１．ヒトロタウィルスＷａ株に対するウサギ血清中及
び鶏卵卵黄中の中和抗体価の推移 （１印は免疫実施週を示す 総抗体量の比較 ウサギ血清１ｍｊ２当り１５．６ｍｇの抗体が含まれた
。本実験では、ウサギ全採血において１羽平均５６　ｍ
　ｌの血清が得られた（ｎ＝６）。従ってウサギ１羽よ
り得られる抗体量は平均８７３゜６ｍｇとなる。一方、
鶏卵卵黄は１個当り平均１０２ｍｇの抗体を含有した。

本実験で免疫鶏の産卵数は平均２５４個／年（ｎ＝１０
）、コントロール鶏のそれは平均２４５個／年（ｎ＝２
）であった。従って免疫鶏１羽より得られる抗体量は平
均２５．９０８ｇとなり、これは実にウサギ２９７羽か
ら得られる抗体量に相当した。

前述の如く、ヒトロタウィルスＷａ株に対する中和抗体
価は、ウサギ血清と鶏卵卵黄で大差なかったこと、また
、感染性下痢症複合抗原に対する産卵鶏の優れた免疫耐
性、また１羽の産卵鶏よりウサギ約３０羽に相当する抗
体量が得られることから、感染性下痢症の病原ウィルス
、病原細菌に対する多機能特異的抗体の調製に、産卵鶏
を用いその鶏卵卵黄を利用する方がウサギの血液を利用
するより優れたものであることが示された。

実施例２．鶏卵卵黄中に生産される下痢症病原ウィルス
抗体の抗体価におよぼす免疫条件としての単及び複合抗
原投与の影響 ＭＡ１０４細胞（サル腎臓細胞）で培養したヒトロタウ
ィルスＷａ株及び２９３細胞（胎児腎。

形質転換細胞）で培養した腸性アデノウィルス４１を、
ウィルスタンパク付とし工それぞれ２０μｇづつ、及び
小児水溶性下痢便より分離した病原性大腸菌の細胞２Ｘ
１０’個を含有する感染性下痢症複合抗原液の１ｍ２を
産卵鶏１羽毎に筋肉注射して免疫した。初回免疫後、２
週間毎に同量の該複合抗原を追加免疫し合計３回免疫し
た。最終免疫後３ケ月間に免疫鶏が産した卵より卵黄を
分離して均質化後、この卵黄液をラムグー力ラギナン水
溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で１０倍希釈し、それを遠心分離
（３，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間）し、その上清を卵黄１
０倍希釈相当液として抗体価を測定した。

なお、比較試験として、それぞれのウィルスをタンパク
量として２０μｇ、同時に含む溶液及び別々に含む溶液
のそれぞれ１ｍｊ２で産卵鶏を上述同一の条件で免疫し
、同様の方法により最終免疫後３ケ月間に得られた卵の
卵黄より卵黄１０倍希釈相当液を調製した。

対照としては、産卵鶏１羽当り、１ｍｆｆ１の生理食塩
水を同様条件で投与し、同様の方法で卵黄１０倍希釈相
当液を調製した。

（ウィルスに対する中和抗体価の測定）実施例１に示さ
れる中和抗体価の測定方法に従う。ただし腸性アデノウ
ィルス４１に対しては、その感染細胞として２９３細胞
を用いた。

（病原性大腸菌に対する凝集抗体価の測定）免疫に用い
た菌液を生理食塩水で希釈し６００ｎｍの吸光度（濁度
）１．０の懸濁液を調製したこの菌懸濁液５０μりと同
じく生理食塩水で種々の倍率に希釈した卵黄１０倍希釈
相当液の５０μ！とを混合し一夜放置した後、マイクロ
ウェル底面の菌の凝集の有無を調べた。凝集抗体価は菌
を凝集させる鶏卵卵黄の最大希釈倍率で表した。

表２．鶏卵卵黄中に生産される下痢症病原ウィルス抗体
の抗体価に及ぼす免疫条件としての即及び複合抗原投与
の影響（結果） 表２に示すように、ヒトロタウィルスＷａ株、腸性アデ
ノウィルス４１及び病原性大腸菌の混合物を抗原として
免疫して得られる鶏卵の抗体は、それぞれのウィルスの
みを同時に、またはそれらを個別的に抗原として免疫し
て得られる鶏卵の抗体よりも、各ウィルスに対する中和
抗体価においてかなり大であることが見い出された。も
ちろん、同効果をもたらすに使用した抗原には病原性大
腸菌が含有されたので同細菌に対する凝集抗体価も充分
認められた。従って、同抗体は、感染性下痢症の特異的
抗体として、ウィルス性下痢症のｆ・防はもちろん病原
性細菌による下痢症の予防にも有効と考えられる。

〔発明の効果〕

本発明により産卵鶏を用いて鶏卵中に抗ウイルス抗体を
生成させるに際して、抗原として全く起源の異なる病原
性腸内細菌を混合して免疫することにより、ウィルスに
対する中和抗体価を明らかに上昇せしめることが可能と
なった。

この事実は鶏卵を利用する他の、種々の抗原に対する特
異的抗体の生産にも当然適用できる有効な方法と考えら
れる。

また本発明により、感染性下痢症をおこす種々の病原ウ
ィルスのみならず種々の病原細菌を混合ないしは物理的
に固定化して免疫すれば、それらの感染力を中和する特
異的抗体の混合物、即ち、多機能特異的抗体を鶏卵卵黄
中に生成せしめ得ることが明かとなった。また鶏卵を利
用することにより、併せて工業的スケールでこの種の感
染性下痢症予防を目的とした該下痢症病原ウィルス及び
病原細菌に対する特異的抗体の製造が可能と考えられる
。

また鶏卵は我々人類が有史以前から食してきた食品で、
特にその蛋白栄養学的価値は牛乳のそれにも勝ることが
知られている。特に日本では卵の生食も一般化しており
、この場合は卵黄中の抗体はそのまま食品として食され
る。

本発明は鶏卵中に感染性下痢症の予防に有効な多機能特
異的抗体を生産し、それを卵黄のまま、あるいは必要に
応じて分離精製して経口投与１−ることにより、簡便か
つ安全に該下痢症の予防か可能となる利点を有する。

本発明は感染性下痢症を経口的受動免疫で予防すること
を目的として行われた研究成果の一部であるが、現在広
く世界的に問題となっている感染性下痢症の証正に貢献
できる一手段を提供するものであると考えられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 感染性下痢症の病原ウィルスの１種以上及び病原性腸内
   細菌の１種以上からなる、感染性下痢症複合抗原で産卵
   鶏を免疫し、該免疫鶏の産する卵の卵黄中に該複合抗原
   それぞれに対応する特異的抗体を同時に生成せしめるこ
   とを特徴とする多機能特異的抗体の製造方法。