JPH0248235B2

JPH0248235B2 -

Info

Publication number: JPH0248235B2
Application number: JP59253951A
Authority: JP
Inventors: Emu Kuroru Robaato
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1982-07-12
Filing date: 1984-11-30
Publication date: 1990-10-24
Also published as: US4582800A; JPH0141312B2; KR900005776B1; JPS5928479A; KR840005490A; EP0099084B1; ATE43635T1; EP0099084A3; EP0099084A2; JPS60149397A; DE3379959D1

Description

【発明の詳細な説明】現在、形質転換微生物による、真核生物蛋白の
発現効率は、種々の要因によつて影響を受けるこ
とが知られている。蛋白発現を規定し、支配して
いる、最も重要な要因の中の２つとして、
mRNAに挿入された遺伝子を細菌細胞が転写す
る正確さ、と、細菌のリボゾームにより、この
mRNAが翻訳される効率を挙げることができる。
一般に発現という言葉で知られている、転写と翻
訳の効率は、ベクターDNA上の、クローン化さ
れた遺伝子の前に、定型的に位置する、ヌクレオ
チド配列に依存していると信じられている。これ
らの発現制御配列には、大部分、RNAポリメラ
ーゼと相互作用して、転写を開始するプロモータ
ー／オペレーター部位と、リボゾームが結合し、
nRNAと相互作用のもとに、蛋白への翻訳を開
始する、リボゾーム結合部位（RBS）とが含ま
れている。プラズミド上に自然に存在するものとは異なつ
た、各種の発現制御配列を用いて、先行技術で真
核生物の蛋白及び細菌宿主中でのポリペプチド類
の発現の制御方法が改良されてきた。これらの例
としては、大腸菌の乳糖オペロンの、オペレータ
ー、プロモーター、リボゾーム結合並びに相互作
用配列の利用、大腸菌のトリプトフアン合成酵素
系の相当する配列及び、バクテリオフアージλ
（ラムダ）の主要オペレーター及びプロモーター
領域〔H.Bernard et al.，Gene５、59―76
（1979）〕の利用を挙げることができる。ラムダフアージのプロモーターを、原核生物
中にクローン化した真核生物及び原核生物蛋白の
発現に利用してきた。R_Lのプロモーター活性が
温度感受性リプレツサーを規定する温度感受性遺
伝子の存在下で低温で抑制されるが、原核生物の
蛋白を発現する際には熱誘導で活性化できること
がわかつた。このプロモーター系を利用する、先
行技術の例は、1981年４月１日提出のヨーロツパ
特許出願81301413.1及び、Derynck等のNature
287、193―197（1980）の論文である。これらの参
考資料では、P_Lプロモーター系を、繊維芽細胞
インターフエロンの如き真核生物蛋白の発現に、
全細菌リボゾーム結合部位と共に利用した。大腸
菌で真核生物の遺伝子を発現するために、真核細
胞遺伝子上の適当な調節信号が欠除していること
を克服する目的で、２つの研究方法が組み換え
DNA技術を利用して用いられてきた。即ち(1)細
菌遺伝子のードしている部位、即ち、β―ラクタ
マーゼ遺伝子、内に、真核細胞遺伝子のコードす
る配列を挿入し、大腸菌遺伝子の全RBSを利用
する方法、或いは、(2)Shine―Dalgarns（SD）配
列、SD配列に近接する（5′―方向に上流側）配
列およびAUG開始コドンと真核細胞DNAに由来
する残りのコード配列より成るいわゆるハイブリ
ドRBSを構築することである。SD配列は塩基
が、真核生物遺伝子のためのプロモーターと、翻
訳開始暗号の間に位置していて、16Sリボゾーム
RNAの3′―末端にある塩基に対し相補的である
ような、３から９塩基より成る配列のことであ
る。初めの方法の主な欠点は、融合ポリペプチド
の生産を来たすこと、即ち、遺伝子生成物の一部
が、大腸菌DNAそして一部が真核生物DNAによ
りコードされるということである。第二の方法
で、真正で成熟した（プリ配列の付加されていな
い、完全で生物学的に活性な）、天然に生産され
る、即ち、真核細胞で生産されるものと同一の遺
伝子生産物を作ることに成功した〔Deron et
al.，Gene17、54―55（1982）；及びGheysen et
al.，Gene、17、55―63（1982）〕。現在まで、両方法を使つて、白血球、繊維芽細
胞、及び免疫、の如き種々のヒト、インターフエ
ロン種の発現が試みられてきた。繊維芽細胞イン
ターフエロン（IFN―β）を発現させる研究で、
上述のGheysen等はP_Lプロモーター系と共に第一
の方法（全細胞RBS）を利用した。この文献に
は生物学的に活性で、非融合蛋白が得られたとあ
るが、そのIFN―β遺伝子が、適当な翻訳開始配
列を持つていない以上、融合IFN―β蛋白が、細
胞内で未知の非効率的機構による細胞の処理工程
の結果得られたものであることは明白である。更
にこの文献から明らかなことは、真核生物遺伝子
産物が、真核生物遺伝子の信号部分によりコード
されたアミノ酸配列を含んでいたことである。従
つて成熟形インターフエロンは発現されていな
い。以下の文献、Gray et al.，Natufe295、503―
508（1982）、及びShepard et al.，DNA１、125
―131（1982）、では、第二の方法“ハイブリド
RBS”が用いられている。しかしながら、これ
らの文献からも解るように、発現は大腸菌のtrp
プロモーターの支配下にあり、ハイブリツド
RBSは真核生物遺伝子のATGとSD及びtrpリー
ダーのリンカー配列由来であつた。更に、この両
文献では、SD配列とSD配列に近接（5′―方位で
上流）の配列は、未変化のまゝ残つた。唯一の変
化は、リンカー領域にあつた。即ち、SD配列と
ATGコドン間のヌクレオチドの数と組成の変化
である。先行技術では、クローン化した真核生物遺伝子
の発現を選択的に増加させるに必要な融通性のあ
るハイブリツドリボゾーム結合部位をデザイン
し組上げる方法が欠けていた。更に先行技術で
は、温度感受性プロモーター系を使い、融合蛋白
の独立した細胞処理工程を使わずに、クローン化
した真核生物遺伝子蛋白を、成熟した形で発現さ
れる制御法が欠けていた。本発明は、前述のような従来技術の欠点を克服
するものであり、広義に述べれば、原核生物に、
ラムダバクテリオフアージより分離したプロモー
ターとオペレーター遺伝子、温度感受性（ts）リ
プレツサー蛋白をコードする、ラムダフアージ
から分離した他の遺伝子cI、ラムダフアージの
プロモーター１オペレーターの両配列と関連す
る、ハイブリドリボゾーム結合部位、及び、ヒト
免疫インターフエロンをコードする真核生物の遺
伝子を供給することを特徴とする、ヒト免疫イン
ターフエロン蛋白の製造方法に関する。より詳細には、本発明は(a)バクテリオフアージ
λに由来するP_LプロモーターおよびO_Lオペレー
ター、ヒト免疫インタフエロンをコードする
DNA配列および前記プロモータの下流域にあり、
かつ前記インタフエロンをコードするDNA配列
の上流域に結合したハイブリツドリボゾーム結
合部位を含み、このハイブリツドリボゾーム結
合部位が次式 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG；
または TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCAT
Ｇにより示されるDNA配列を含有する、発現ベ
クターを用いて大腸菌（E.coli）を形質転換し、
(b)形質転換した大腸菌を培養液中で生育させ、前
記発現ベクターのインタフエロン遺伝子によりコ
ードされるインタフエロンを産生させ、(c)形成転
換大腸菌を溶菌し、そして(d)得られる溶菌液から
インタフエロンを採取することを特徴とするヒト
免疫インタフエロンの製造方法に関する。本発明の好ましい実施態様では、発現ベクター
か或いは、宿主が、染色体上に、λバクテリオフ
アージ由来の、変異cIリプレツサー遺伝子を含
み、その変異遺伝子は、温度感受性リプレツサー
蛋白をコードしている。また、上記で規定した如
きインターフエロンの生産工程では、宿主を、変
異リプレツサー遺伝子を発現させることとがで
き、又、ステツプ(a)の現ベクターと充分に共存で
きる、別の複製可能なベクターで形質転換するこ
とにより、該変異リプレツサー遺伝子をその宿主
に供給することができる。上記操作のステツプ(b)の後、細胞の衆知の方法
で集め、緩衝液にけん濁した後溶菌する。こゝで
用いられる溶菌という言葉は、宿主の細胞壁を開
くための操作を示すもので、好ましくは酵素的に
行なわれるが超音波的、機械的或いは同業者に知
られ、又用いられている他のいかなる方法によつ
ても行われる。インターフエロンは、同業者によ
り知られるたん白精製の手法、例えば電気泳動或
いはクロマトグラフイー（たとえば抗体アフイニ
テイクロマトグラフイー）、により溶菌液より
回収される。本発明で好ましい遺伝子はヒト免疫
インタフエロンの成熟型をコードし、即ちプレ配
列を有していないものである。本明細書および特許請求の範囲に用いられる略
語および用語は特に説明のない限り、同業者に一
般に用いられ、知られているものである。本発明に係るヒト免疫インターフエロンは次の
DNA配列によりコードされる。（5′）TGT TAT TGT CAG GAC CCA
TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC
CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA
GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT
AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC
ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG
GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG
CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT
TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC
TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC
CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC
AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG
TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG
AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG
CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT
GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA
GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA
GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA
GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA
AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA
GGT CGA AGA GCA TCC CAG―Ｘ（3′）
() 但し、ＸはTAA，TGA或いはTAGである。上記DNA配列の5′未満には5′ATG AAA
TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT
TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG
GGT TCT CTT GGC3′（）或いはメチオニン
をコードするATGトリプレツトが存在してもよ
く、その場合もＮ未満にそれぞれMet―Lys―
Tyr―Thr―Ser―Tyr―Ile―Leu―Ala―Phe―
Gln―Leu―Cys―Ile―Val―Leu―Gly―Ser―
Leu―Glyのプレ配列或いはメチオニンが結合し
た免疫インターフエロンを発現する。発現ベクタ
ー上で免疫インターフエロンをコードするDNA
配列は適当なプロモーターオペレーター配列の下
流域にSD配列を介して結合している。 ATG開始シグナルを含む前述のDNA配列Ｉに
よりコードされるヒト免疫インターフエロンたん
白は次のアミノ酸配列を有する。 H₂N―Met―Cys―Tyr―Cys―Gln―Asp―Pro
―Tyr―Val―Lys―Glu―Ala―Glu―Asn―Leu
―Lys―Lys―Tyr―Phe―Asn―Ala―Gly―His
―Ser―Asp―Val―Ala―Asp―Asn―Gly―Thr
―Leu―Phe―Leu―Gly―Ile―Leu―Lys―Asn
―Trp―Lys―Glu―Glu―Ser―Asp―Arg―Lys
―Ile―Met―Gln―Ser―Gln―Ile―Val―Ser―
Phe―Tyr―Phe―Lys―Leu―Phe―Lys―Aen
―Phe―Lys―Asp―Asp―Gln―Ser―Ile―Gln
―Lys―Ser―Val―Glu―Thr―Ile―Lys―Glu―
Asp―Met―Asn―Val―Lys―Phe―Phe―Asn
―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys―Arg―Asp―Asp
―Phe―Glu―Lys―Leu―Thr―Asn―Tyr―Ser
―Val―Thr―Asp―Leu―Asn―Val―Gln―
Arg―Lys―Ala―Ile―His―Glu―Leu―Ile―
Gln―Val―Met―Ala―Glu―Leu―Ser―Pro―
Ala―Ala―Lys―Thr―Gly―Lys―Arg―Lys―
Arg―Ser―Gln―Met―Leu―Phe―Arg―Gly―
Arg―Arg―Ala―Ser―Gin―OH () 又、本発明の実施に於いてはATG開始シグナ
ルでコードされる第一のアミノ酸であるメチオニ
ンは発現した後微生物により切断されることも考
えられる。ヒトインターフエロンβおよびインターフエ
ロンα（いろいろの種）を限定するアミノ酸配列
はそれらをコードする対応DNA配列と共に既に
報告されており、同業者によく知られている。本発明によれば、インターフエロンをコードす
るDNA配列はプラズミド或いはクローニングベ
クターのDNAに挿入され、組み換えDNA配列を
形成し、それを用いて、通常の方法により宿主を
形質転換する。本発明によると、形質転換した宿
主は、好ましくは試験管内実験で、クローン化さ
れる。本発明で用いる発現ベクターはさらにハイブリ
ツドRBSをコードするDNA配列を含む。宿主細
胞において翻訳を開始するために必要なRBSは、
(1)アミノ酸メチオニンに対する翻訳開始コード
ATG（E.coliの遺伝子生成物で知られるものは全
て、アミノ酸メチオニンで始まり、これは後に切
断されることもされないこともある。）、(2)16Sリ
ボゾームRNAの3′未端に相補的な塩基で、SD配
列として知られる３個から９個の塩基の配列、お
よび(3)リンカー部位として知られるこれらの２つ
の間の塩基配列とから成る。例えば、E.coliのlacZ遺伝子の最初の配列は
ACAGGAAACAGCT〔ATG〕―。下線を引いた
配列がSD配列で、これはATGトリプレツトから
７塩基離れている。SD配列とATGトリプレツト
との間のリンカー部位の長さは遺伝子により５か
ら16塩基と異なり、この距離とたん白発現の程度
との間に相関関係があるようである。さらに、リ
ンカー部位の配列も又発現の程度に大きく影響す
ることが生来る。その上、SD配列自体の性質だ
けでなくそれに接するDNA配列およびATG開始
コードもmRNAの効率よい翻訳にとつて重要で
あることがわかつている。本発明で用いるハイブリツドRBSは天然に存
在するRBSとDNA配列の長さおよび／又は配列
内の塩基の順序の点で異なる。異なるのは、リン
カー部位、SD配列中、或いはSD配列に接する配
列中（5′―側に上流）である。以下に示すハイブ
リツドRBSが特にすぐれた効果を示す。 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG、 TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCA TG。本発明の好ましい実施態様では形質転換の手法
で受容菌として用いられる微生物は英国特許No.
2055382Aに記載されているE.coliK―12 294株で
ある。本微生物は1978年10月28日にAmerican
Type Culture CollectionにATCC―31446とし
て寄託されており、入手可能である。さらに、
こゝに記載の全ての組み換えDNA実験は
National Institute of Health（NIH）の適用ガ
イドラインに従つて行なわれた。最も好ましい実施態様として本発明は公知菌株
であるE.coliK12株RRI（ATCC31344）（たとえ
ば、Bolivar等、Gene２、95頁（1977）参照）に
関して記載されているが、同じE.coliK12株294の
ような公知のE.coli株或いはAmerican Type
Culture Collectionのような公認の微生物寄託機
関に寄託され、入手可能な他の微生物菌株も本発
明の実施に用いることが出来る。本発明で用いる発現ベクターはプラズミド
pBR322に由来し（第２図、５図、６図および７
図参照）、バクテリオフアージラムダDNAから
単離されたP_Lプロモーターを含み、tet^Rおよび
amp^R遺伝子の間に両方向に向け挿入されている
（即ち、転写がamp^R遺伝子方向に又はtet^R遺伝子
方向に進む。）。P_LはλcIリプレツサーにより効率
よく又便利に調節される非常に強いプロモーター
であるため好まれるプロモーターである。リプレ
ツサーをコードする遺伝子はcIts2又はcIts857の
変異を有し、これらはリプレツサーに温度感受性
を与える。30℃に於いてはリプレツサーは正常に
作用し、約37℃から約42℃では不活化される。従
つてP_Lプロモーターは30℃で抑制され（スイツ
チオフされ）、42℃で抑制解除（スイツチオン）
される。この特徴は興味ある遺伝子生成物が細胞
に毒性を有する場合、或いは多量に存在すると細
胞生育に有害である場合に望ましい。P_Lプロモ
ーターを調節できるということは菌を約30℃から
約36℃の間で遺伝子生成物を発現することなく生
育させることが出来、適当な時期に望む遺伝子生
成物を生産させるために温度を約37℃から約42℃
に上昇させることが出来る。本開示発明のベクターは全てまたEco RI切断
部位をSD配列の3′方向（末端）に０、１或いは
４塩基の距離を含有し、このため異なるハイブリ
ツドRBSを構成する手段を提供する。Eco RI部
位を用いてハイブリツドRBSを構成してP_L―SD
配列とインターフエロンをコードする遺伝子の
ATGコード配列と結合すると、さらにEco RI制
限切断し、末端をクレナウポリメラーゼＩをつ
なげ、得られる２つの未端をT4DNAリガーゼで
平滑末端結合することで修飾することが出来る。本発明をさらに以下の実施例１および５〜８お
よび参考列２〜４により具体的に説明する。実施例１ラムダのP_LプロモーターO_Lオペレーターを含
む350塩基対（bp）断片を単離するために250μg
のλ cI857Sam⁷DNA（マイルズラボラトリー
ズ）を制限エンドヌクレアーゼBam HIおよび
Bgl IIで消化し、アガロースゲルの電気泳動で
生成物を分離した。P_LプロモーターO_Lオペレー
ターを含む1200bp断片をゲルから単離した（第
１図参照）。この1200bp断片をHpaで完全に消化し、
450bp断片を得、これを再びHinf で部分消化
する。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）により、P_LプロモーターおよびO_Lオペ
レーター部位（O_L1，O_L2，O_L3）を含み、これに
λ cIリプレツサーが結合している350bp断片を
単離した。ラムダＮ遺伝子のSD配列とＮ遺伝子
の開始コドンの間にHinf Ｉ部位があるため（第
１図および第２図参照）、外来遺伝子をE.coli中
で発現する目的でハイブリツドリボゾーム―結
合部位の構成が可能である。このHinf Ｉ部位は
Eco RI部位にも変えられ得る。 350bpのBg1II―Hinf Ｉ部片を前もつてEco
RIとBgl IIで消化したプラズミドpRC1にクロー
ニングした。pRClはEco RI部位に隣接してBgl
部を有するpBR322（ATCC31344）の誘導体
である（第２図参照）。第２図はまた、結合末端
の配列を示し、ベクターのEco RI末端が断片の
Hinf Ｉ末端にどのように結合でき、Eco RI部
位を再構成するかを示している。（第２図の丸印
をしたＡは細胞のin vivo機構により修復され
た。）得られた組換えプラズミドはpRC14と名づ
けた。 P_Lプロモーターを用いて数多くの他の発現ベ
クターも構成された（第４図、５図、６図および
７図）。pRC15は上述の350bpのBgl II―Hinf Ｉ
断片に加えて、λ int遺伝子のSD配列を含む
55bp断片（Hinf Ｉ―Mbo Ｉ）を含有している
（第４図および５図参照）。pRC21およびpRC22は
それぞれpRC14およびpRC15に同類のものであ
る。これらのプラズミドの主要な違いはP_L含有
断片の挿入の方向であり、従つて転写の方向の違
いである（第５図参照）。pRC23は“consensus”
RBS（リボゾーム結合部位）〔Scherer et al.，
Nucleic Acids Research8巻3895頁：1980年〕を
含む合成オリゴヌクレオチドをP_Lプロモーター
を含む250bpのBgl ―Hae断片に結合し、
結合生成物を第７図に示すようにpRC2に挿入す
ることにより構成された。参考例２白血球インターフエロンＡ（以後LeIF―Ａ又は
LIFAとも呼ばれる）の遺伝子は以下の方法に従
つていろいろのプラズミドに挿入され、宿主中で
発現する。LeIF遺伝子の出所として、pLeIFA25
〔Goedde1ら、Nature287巻411頁（1980年）〕か
らのPst Ｉ―Eco RI断片を単離し、pRC14から
単離されたEco RI―Pst の大きい断片と結合
する。結合部位の配列を第３図に示す。SD配列
はATG開始コドンから５塩基の距離にある。こ
の距離を９塩基とするためにpRC14／LIFAを
Eco RIで消化し、付着末端をポリメラーゼＩの
クレナウ断片（＋dTTP、dATP）でうめ、平滑
末端を再び結合する。このようにして得られる結
合部分の配列を第３図に示す（pRC1410／
LIFA）。本実施例で利用される新規ハイブリツ
ドリボゾーム結合部位の配列は、PRC14／
LIFAでAATTC、PRC1410／
LIFAでAATTAATTCである
（いずれも第３図に示してある）。前述のP_L発現プラスミドを、2400bpBgl II挿
入物上の温度感受性cIリプレツサー遺伝子を含有
する低コピー数プラスミドpRK248cIts
（ATCC33766）を有するE.coliの菌株（菌株294）
中に移入する。即ち、リプレツサーは約30℃から
約360℃で作用し、約37℃から約42℃で失活する。
この特質はP_Lプロモーターの調節に便利な機構
を提供する。この場合、細胞はM9―グルコース
培地中、30℃で１ml当り２―３×10⁸細胞となる
まで生育され、それから42℃に上げて２時間お
く。培養液中の細胞は次に7Mグアニジン塩酸で
溶菌し、溶菌液を測定する。pRC1410／LIFAを
用いてこの方法を行なうと細菌出液或いは溶菌液
中に１リツトル当り10⁷〜10⁸ユニツトの収率のイ
ンターフエロン活性が検出される。pRC14／
LIFAの発現の程度はpRC1410／LIFAで得られ
るもののおよそ10％である。pRC15／LIFAは
pRC1410／LIFAと匹敵するLIFAの発現の程度
が得られる。参考例３人繊維芽細胞インターフエロン遺伝子（FIF）
を以下の如く（第８図）ベクターpRC21及び
pRC22に挿入した。別の反応で、pRC21及び
pRC22をEco RIで消化し、末端をクレナウポ
リメラーゼで充てんし、Bam HIで消化し、大
きな断片を分離した（4.3Kb）。 FIF遺伝子の供給源である。pFIF trp69
〔Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.８、4057
（1980）〕をXba Ｉで消化し、末端をクレナウ
ポリメラーゼで充てんして平滑末端に変え、
BamHIで消化し、FIF遺伝子を含む、小断片
（850bp）を分離した。FIF850bp断片を4.3Kb P_L
含有断片に結合し、生成する構造を、制限解析で
確認した。 P_L―FIFプラスミドのFIF発現能力を検討する
ために、pRC21／FIF及びpRC22／FIFで形質転
換した大腸菌をM9―グルコース培地で30℃下、
菌濃度、２〜３×10⁸菌数／mlになるまで生育さ
せ、42℃で誘導し、１mlのサンプルを取り、遠心
で集菌し、溶菌させる目的で、7Mグアニジン―
HCl（５×10⁹菌数／ml）中に再懸濁した。菌体残
渣を遠沈で除去し、抗ウイルス活性検定に先立つ
て、上澄を50培に稀釈した。結果を第２表に示す。【表】参考例４ FIF発現に関して、新規ハイブリツドリボゾ
ーム結合部位の効果を決めるために、pRC21／
FIFとpRC22／FIFの誘導体を作成した。
pRC21／FIF及びpRC22／FIFのリンカー域中の
２つの制限部位を組合わせると、ハイブリド
RBS中に幾つかの修飾を施こす方法が生まれた。
Eco RI又はXba Ｉをリンカー域内での切断に用
い、クレナウポリメラーゼを生ずる末端の充
てんに用い、平滑末端は再結合し、かくて、第３
表に示す如き各種の配列を生成した。これら構成
物が、形質転換大腸菌株RRI（pRK248cIts）中で
FIFを発現するか否かをテストした。これらP_L―
FIFプラスミドのFIF発現能をテストするために、
pRC21／FIF、pRC22／FIF、pRC211／FIF、
pRC221／FIF、pRC212／FIF、及びpRC222／
FIFより撰んだ単一のプラスミド変種で形質転換
した菌の各培養について以下の操作を行なつた。
菌体を30℃下、M9―グルコース培地で菌濃度が
２〜３×10⁸菌数／mlになるまで生育させ、42℃
で約120分間誘導し、１mlサンプルを採り、遠沈
により集菌し、溶菌させるために7Mグアニジン
―HCl（５×10⁹菌体／ml）に再懸濁した。菌体残
渣を遠心で除去し上澄を抗―ウイルス活性の検定
に先立つて50倍に稀釈した。結果を第３表に示
す。【表】【表】実施例５ヒト免疫インターフエロン（IFI）遺伝子を含
む、P_L―発現ベクターも作成した。IFI遺伝子の
供給源はPst1部位に挿入した、IFI，mRNAの
1100bp cDNAコピーを有するpBR322の誘導体
の、pHIT3709である。該挿入物上に存在する
IFIをコードする配列は式により表わされる。
IFI遺伝子を含むプラスミドpHIT3709を、以下
の方法により作成した。 (i) IFIをコードするmRNAの分離ヒト末梢血より調製したリンパ球を、IFI誘
導のため、15ng／mlの12―Ｏ―テトラデカノ
イル―フオルボル―13―酢酸（TPA）と、
40μg／mlのコンカナバリンＡを含むRPMI―
1640培地（10％牛胎児血清含有）中で37℃で培
養した。培養24時間後、この様にして誘導した
ヒトリンパ球（１×10¹⁰細胞）をテフロン
ホモゲナイザー中の、チオグアニジン溶液
（5Mグアニジンチオシアン酸、５％メルカプ
トエタノール、50mMトリス―HCl（PH7.6）、
10mMEDTA）中で破壊し、変性させた。次い
でナトリウムＮ―ラウロイルサルコシネー
トを４％濃度になるように加え、均質化後の混
合溶を６mlの塩化セシウム溶液（5.7M塩化セ
シウム、0.1MEDTA）上に層状にのせ、ベツ
クマンSW27ローターを用いて24000rpmで30時
間15℃で遠心して、RNA沈殿物を得た。このRNA沈殿物を0.25％Ｎ―ラウロイル
サルコシネートに溶解し、次いでエタノールで
沈殿して8.3mgのRNAを得た。このRNAを高
塩濃度の溶液中（0.5M NaCl、10mMトリス
―HCl（PH7.6）、1mM EDTA、0.3％SDS）で
オリゴ（dT）セルロースカラムに吸着させ、
低塩濃度溶液（10mMトリス―HCl（PH7.6）、
1mM EDTA、0.3％SDS）を用いてポリ(A)含
有mRNAを溶出した。700μgのmRNAを集め
た。このmRNAをエタノールで再沈殿し、次い
で10mMトリス―HCl（PH7.6）、2mM EDTA及
び0.3％SDSを含む溶液0.2mlに溶解し、65℃で
２分間処理し、ベツクマンSW27ローターを用
い、20℃で25000rpm、21時間、10―35％蔗糖
密度勾配遠心により、22部分に分画した。各画
分の一部づつをXenopus laevis（南アフリカ産
有爪雌蛙）の卵母細胞に注射し、合成された蛋
白のインターフエロン活性を検定した。このよ
うな方法により、画分12（沈降恒数が12―14s）
が、mRAN1ミクログラム当たり、195国際イ
ンターフエロン単位の活性を示すことを認め
た。このようにして取得した画分12中の
mRNAは約20μgであつた。 (ii) 一重鎖DNAの合成上記mRNA5μg、オリゴ（dT）50μg、リバ
ーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）
100単位、各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP
を1mMづつ、MgCl₂8mM、KCl50mM ジチ
オスレイトール10M及びトリス―HCl（PH8.3）
50mMを含む、100μlの反応混合液を42℃で１
時間インキユーベートし、次いで、フエノール
で除蛋白し、RNAの変性を目的として、0.1N
NaOHで70℃、20分間処理した。 (iii) 二重鎖DNAの合成このようにして合成した単鎖相補DNAを、
逆転写酵素100単位、各dATP dCTP、dGTP
及びdTTPを1mMづつ、MgCl₂8mM、
KCl50mM、ジチオスレイトール10mM及びト
リス―HCl（PH8.3）50mMを含む、50μlの反応
混合液中で、42℃、２時間反応させて二重鎖
（dS）DNAを合成した。 (iv) dCテイルの付加上記二重鎖DNAを0.1M酢酸ナトリウム（PH
4.5）、0.25M NaCl、1.5mM ZnSO₄を含む、
50μの反応混合液中、60ユニツトのヌクレア
ーゼＳ―１で室温下、30分間処理した。反応混
液をフエノールで除蛋白し、DNAをエタノー
ルで沈殿させ、0.14Mカコジル酸カリウム、
0.3Mトリス（PH7.6）、2mMジチオスレイトー
ル、1mMCoCl₂、0.15mM dCTP及び末端トラ
ンスフエラーゼ30単位を含む混合液中で、37
℃、３分間、ds DNAの各3′末端に約20のデオ
キシシチジン残基を付加するため、末端トラン
スフエラーゼ反応に供した。この一連の反応で二重鎖デオキシシチジン鎖
含有DNAを約300ng取得した。 (v) 大腸菌プラスミドpBR322の分割と、dGテイ
ルの付加別に、10μgの大腸菌プラスミド
pBR322DNAを50mM NaCl、6mMトリス―
HCl（PH7.4）、6mM MgCl₂、6mM2―メルカプ
トエタノール及び100μg／mlの牛血清アルブミ
ンを含む、50μlの反応混液中で、制限酵素
PstI20単位で37℃、３時間処理した。反応混液
を次いでフエノールで除蛋白し、DNAを、さ
らに、0.14Mカコデイル酸カリウム、0.3Mト
リス（PH7.6）2mMジチオスレイトール、
1mM CoCl₂及び0.15mM dGTPを含む反応混
液50μ中で、30単位の末端トランスフエラー
ゼで、プラスミドpBR322DNAの各3′―末端に
約８デオキシグアニジン残基を付加するため
に、37℃で３分間処理した。 (vi) cDNAのアニーリング及び大腸菌の形質転換このようにして取得したdC―テール付き合
成dsDNA0.1μgと上記dG―テール付きプラス
ミドpBR322DNA0.5μgを0.1M NaCl、50mM
トリス―HCl（PH7.6）及び1mM EDTA含有液
中で、65℃２分間、次いで45℃で２時間加熱し
てアニーリングを行い、次第に冷却した。大腸
菌×1776の形質転換は、Enea等の方法〔J.
Mol.Biol.96、495（1975）〕によつて行つた。 (vii) プラスミド含有cDNAの分離このようにして、約8500のテトラサイクリン
耐性コロニーを分離し、各コロニーのDNAを、
ニトロセルロースフイルターに固定した
〔M.Grunsteun and D.S.Hogness，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，72、3961（1975）〕。別にGray等により〔Nature295、503
（1982）〕報告されている如く、IFIのアミノ酸
配列に基づき、アミノ酸配列Cys―Tyr―Cys
―Gln―Asp（１―５）及びLys―Gln―Asp―
Met―Asn―Val（77―82）に相当する二つの塩
基配列5′TCCTGGCA^A _GTA^A _GC3′及び5′AC^G _A
TTCAT^G _ATC^T _CTC^T _CT3′をトリエステル法〔R.
Crea等．，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75、
5765（1978）〕により、化学的に合成した。
0.2μgのこれらオリゴヌクレオチドを、50mM
トリス―HCl（PH8.0）、10mM MgCl₂、10mM
メルカプトエタノール及び50μCiγ― ³²P―
ATPを含む反応混液50μ中で３単位のT₄ポ
リヌクレオチドキナーゼで37℃１時間処理し
た。5′―末端に ³²Pで標識した、これらオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして利用し、上述の
ニトロセルロースフイルター上のDNAとLaun
等の方法〔NnCleic Acids Res..9、6103
（1981）〕でアニールした。オートラジオグラ
フイーで、上記二つのオリゴヌクレオチドプ
ローブと反応する４つのコロニーを同定した。これら、それぞれのコロニーの細菌細胞中より
Birn boim and Doly〔Nucleic Acids Res.１、
1513（1979）〕の方法に従つて、プラスミドDNA
を分離した。プラスミドDNA中の挿入部をPstI
制限酵素で切り出した。分離したプラスミドよ
り、最長のcDNA挿入部を含むものを選び、
pHIT3709と命名した。第９図に、このプラスミ
ドの制限酵素地図を示す。 pHIT3709プラスミドに挿入されたmRNA配列
の１次構造（塩基配列）を、次いで、Sanger等
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、5463（1977）〕の方
法及びMaxam―Gilbertの方法により決定した。
第１０図にこの一次構造を示した。この一次構造は、140位のアミノ酸がCAA
（Gln）の代りにCGA（Arg）でコードされている
事を除き、Gray等の報告したIFI cDNAの一次
構造と一致している。一次構造より、このプラスミドはIFI蛋白の全
コード域を含んでいることは明白である。この事
実は、このプラスミドに挿入されたDNAを他の
発現プラスミドに移すことにより、例えば大腸菌
の如き宿主に免疫インターフエロンを生産させる
可能性を示している。実施例６ pHIT3709よりIFIをコードする配列の430bpお
よび470bpの3′側非コード領域を含む900bpの
BstNI断片を単離した。（制限酵素BstNIはNew
England Biolabs.社、Beverly.Massachusettsか
ら市販されており、その酵素により認識される塩
基配列は本願出願前公知であつた。）本断片上に
存在しないのはIFIのシグナルの部分および成熟
たん白の最初の３個のアミノ酸のコドンである。
欠けている３個のコドンを回復し、開始のメチオ
ニンコドンを供給するため合成オリゴヌクレオ
チドを調製し、900bd断片に結合した（第１１図
参照）。合成断片は両側のBst NI末端をEco RI
末端に変えた。得られた断片を、Eco RIで制限
切断したpRC22ベクター中にクローン化した。挿
入部分の方向性は3′側の非コード領域中を切断す
るBgl Ｉでの制限切断分析により決定した。全ての結合操作が期待通りに行なわれた事を確
認するためにIFI遣伝子を含有するpRC22ベクタ
ー（pRC22／IFI―900と命令）をプロモーターと
遺伝子の結合部位の周辺で配列決定した（第１１
図参照）。 IFI遺伝子の発現を試験するためにE.coli RRI
株（pRK248cI ts、pRC22／IFI―900）をM9―
グルコース培地中、30℃にて１ml当り３―４×
10⁸細胞となるまで生育し、その後42℃で１時間
誘発する。誘発の前にさらにグルコースおよびカ
ザミノ酸をそれぞれ1.0％、0.5％となるよう添加
した。10mlのサンプルを取り、遠心分離により集
菌し、0.1mlの50mMトリス（PH7.4）、10％蔗糖中
にけん濁し、けん濁液をドライアイス／エタノー
ル浴で急凍結した。細胞を20℃で融解し、氷槽に
入れた。NaClを100mM、EDTA10mM、スペル
ミジン20mMとなるよう、又リゾチームを１ml当
り200μg添加した。混合物を氷槽中45分間放置し
た後37℃で２分間置いた。細胞残渣を遠心分離に
より除去し、上澄液のWISH細胞を用いたIFI抗
ウイルス活性を測定した。この最初の実験で１ml
の細服抽出液当り1280ユニツトのIFI活性が得ら
れた。誘発のキネテイツクスを決定するために上記操
作をくり返えした。対照として１検体を30℃で保
存し、他の検体を42℃での誘発後30分、60分、90
分、120分および180分で取つた。サンプルは上述
のとおり処理した。第４表に示す結果によると、
30℃では活性は見られず、42℃で誘発後検出され
る活性は約90分後で最大となり、その後次第に低
下することを示している。【表】実施例７ pRC22／IFI―900DNAをさらにEco RIで制限
切断し、IFIを含む900bp断片を単離し、前もつ
てEcoRIで制限切断してあるpRC23に挿入した
（第１２図参照）。得られる構造、pRC23／IFI―
900、はpRC22／IFI中と有意に異なるRBSを含
んでいる（第１１図と第１２図を比較のこと）。
IFI遣伝子の発現を試験するためにRRI
（pRK248cIts，pRC23／IFI―900）株をM9―グ
ルコース培地中30℃で１ml当り３−４×10⁸細胞
となるまで生育し、42℃で１時間誘発をした。誘
発の前にさらにグルコースおよびカザミノ酸をそ
れぞ1.0および0.5％となるよう添加した。10mlの
サンプルをとり、遠心分離により集菌し、0.1ml
の50mMトリス（PH7.4）、蔗糖10％中けん濁し、
けん濁液をドライアイス／エタノール浴で急凍結
した。細胞を20℃で融解し、氷槽中に置く。
NaClを100mMに、EDTA10mM、スペルミジン
20mMとなるよう、又リゾチーム１ml当り200μm
を添加し、この混合物を氷槽中45分間、次いで37
℃で２分間放置した。遠心分離により細胞残渣を
除去し、上澄液につき、IFI抗ウイルス活性を
WISH細胞上で測定した。第５表に示すように、【表】 RC23／IFIをE.coli RRI株の形質転換に用いる
と、pRC22／IFIより約４倍高いIFI活性を生産し
た。さらに、E.coli K12株RRIの代りにE.coli 12株
294を用いて上記と同様の結果を得ることができ
る。実施例８ pRC23／IFIをさらにEcoRIで２個の切断部位
の片方のみが切断されるような条件下で制限切断
する。得られる分子をクレナウポリメラーゼＩ
で処理してEcoRI末端を充填した。平滑末端を
T₄DNAリガーゼで結合し、そのDNAでRRI
（pRK248cIts）を形質転換した。IFI遺伝子の最
初のEcoRI部位を欠損した形質転換株を検索し、
２株が得られた。 pRC231／IFI―900と命名されたその１つを用
い、IFIを発現させるためE.coli RRI株を形質転
換した。IFI遺伝子を発現を試験するためこの
RRI（pRK248cIts，pRC231／IFI−900）株をM9
―グルコース培地中30℃でml当り３−４×10⁸細
胞となるまで培養し、その後42℃で１時間誘発し
た。誘発の前にさらにグルコースおよびカザミノ
酸をそれぞれ1.0および0.5％となるよう添加し
た。10mlのサンプルを取り、遠心分離により集菌
し、0.1mlの50mMトリス（PH7.4）、10％蔗糖にけ
ん濁し、けん濁液をドライアイス／エタノール浴
で急凍結した。細胞を20℃で融解し氷槽中に置い
た。NaClを100mM、EDTA10mM、スペルミジ
ン20mMとなるように、又リゾチームを１ml当り
200μg添加した。混合物を氷浴で45分放置した
後、37℃で２分置いた。遠心分離により細胞残渣
を除去し、上澄液につきIFI抗ウイルス活性を
WISH細胞で測定した。その結果は第５表に示
す。記載のpRC23／IFIの修飾はリンカー部位を
6bpから10bpに伸ばすために計画した。このよう
な修飾でLeIF―Ａ発現ベクターでは発現が10〜
20培増加した。IFIの場合にはその発現に10bpよ
り6bpの距離の方がよいようである。要約以下の方法より成るインターフエロンの生産方
法。 (a) 宿主微生物を、インターフエロンを発現する
ことが出来、バクテリオフアージラムダに由
来するプロモーターおよびオペレーターDNA
配列、ハイブリツドリボゾーム結合部をコー
ドする配列およびインターフエロンをコードす
るDNA配列を含む発現ベクターで形質転換し、 (b) 形質転換した微生物を培地中で生育させ、そ
れによつて上記発現ベクターのインターフエロ
ン遺伝子によりコードされるインターフエロン
を生産させ、 (c) 形質転換微生物を溶菌し、そして (d) 得られる溶菌液からインターフエロンを回収
する。

【図面の簡単な説明】

第１図はP_Lプロモーターを含む1200bpのBgl
―BamHI断片の部分制限切断図を示す。第２
図は、350bp挿入部分にラムダP_Lプロモーターを
含む発現ベクターpRC14の構成につき説明してい
る。第３図は、発現ベクターpRC14に挿入した、
白血球インターフエロン遺伝子を説明している。
第４図は、発現ベクターpRC15の組立用のバクテ
リオフアージラムダのint遺伝子のためのSD配
列を含む82bp断片を分離するために用いた概要
を説明したものである。第５図は発現ベクター
pRC15の構造につき説明。第６図は、それぞれ、
プラスミドpRC14及びpRC15由来の発現ベクター
pRC21及びpRC22の構成につき説明。第７図は、
P_Lプロモーターおよび合成RBSを用いるpRC2プ
ラスミドからの発現ベクターpRC23の構成を示
す。第８図は、繊維芽細胞インターフエロンをコ
ードしている遺伝子を、プラスミドpRC21及び
pRC22に挿入するため用いた方法の概要と、得ら
れたプロモーターと遣伝子の接合点の配列を示し
ている。第９図は、実施例５(vii)で得られたプラス
ミドpHIT3709の制限酵素切断地図を示し、〓〓
部分はシグナルペプチドとなるべきペプチドをコ
ードする配列を示し、〓〓部分は、IFIポリペプ
チドをコードする配列を示す。第１０図は、実施
例５(vii)で得られたプラスミドpHIT3709の塩基配
列を示す。第１１図は、免疫インターフエロンを
コードしている遺伝子を、発現ベクターpRC22に
挿入するため用いた方法の概要と、プロモーター
と遺伝子の接合点の配列を示している。第１２図
は、免疫インターフエロン遺伝子を発現ベクター
pRC23に挿入する方法と、プロモーターと遺伝子
間の接合点の配列並びにその修飾を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１ａ）バクテリオフアージλに由来するP_L
プロモーターおよびO_Lオペレーター、ヒト免
疫インタフエロンをコードするDNA配列およ
び前記プロモーターの下流域にあり、かつ前記
インタフエロンをコードするDNA配列の上流
域に結合したハイブリツドリボゾーム結合部
位を含み、このハイブリツドリボゾーム結合
部位が次式
TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG ；または TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCA
ＴＧにより示されるDNA配列を含有する、発
現ベクターを用いて大腸菌（E.coli）を形質転換し、ｂ）形質転換した大腸菌を培養液中で生育さ
せ、前記発現ベクターのインタフエロン遺伝子
によりコードされるインタフエロンを産生さ
せ、ｃ）形質転換大腸菌を溶菌し、そしてｄ）得られる溶菌液からインタフエロンを採取
することを特徴とするヒト免疫インタフエロンの製造
方法。２大腸菌が、染色体上に温度感受性リプレツサ
ータンパク質をコードするバクテリオフアージλ
由来の変異cIリプレツサー遺伝子を含む特許請求
の範囲第１項記載の方法。３工程(a)で用いる発現ベクターが、温度感受性
リプレツサータンパク質をコードするバクテリオ
フアージλ由来の変異cIリプレツサー遺伝子を含
む、特許請求の範囲第１項記載の方法。４大腸菌を、工程(a)の後に、あるいは工程(a)と
同時に、温度感受性リプレツサータンパク質をコ
ードし、かつ工程(a)の発現ベクターと十分に適合
する、バクテリオフアージλ由来の変異cIリプレ
ツサー遺伝子を有する別の複製しうる発現ベクタ
ーで形質転換することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。５大腸菌を培地中約30℃から約36℃の温度で生
育させる特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
か一つに記載の方法。６工程(b)の直前に培地の温度を温度感受性リプ
レツサータンパク質が失活するような温度まで上
げる特許請求の範囲第５項記載の方法。７温度感受性リプレツサータンパク質が完全に
失活する温度が約37℃から約42℃である特許請求
の範囲第６項記載の方法。８工程(c)の溶菌を酵素により行なう特許請求の
範囲第１項〜第７項のいずれか一つに記載の方
法。９インタフエロンをクロマトグラフイーにより
採取する特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれ
か一つに記載の方法。１０クロマトグラフイーが抗体アフイニテイー
クロマトグラフイーである特許請求の範囲第１項
〜第９項のいずれか一つに記載の方法。