JPH02257891A - 組換え動物細胞による蛋白質の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白質産生能を有する組換え動物細胞を用い
て蛋白質を生産するに際し、該動物細胞を含む培地中に
サイトカインを存在せしめ蛋白質を生産する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

動物細胞を宿主として、ホルモン、サイトカイン、酵素
などを工業的に生産する際に、本来その蛋白質を生産し
ている細胞を大量に培養し、目的蛋白質を得ることも行
われているが、−量的には、生産性が低く十分な量を得
ることは容易ではない。

生産性を向上させ、より効率的に目的蒼白質を得るため
、遺伝子操作技術を用いた組換え動物細胞が育種されて
いる。

これらの組換え動物細胞の生産性をさらに増強するため
、培地添加物が生産性に与える影響が検。

討されている。このような培地添加物の中で、醋酸ナト
リウムがよく研究されており、培地に適量添加すること
により組換えヒト成長ホルモン生産細胞の生産性を、増
大させることが提案されている（特開昭６３−５０３２
７３号）が、一方、これまでに、培地添加物としてサイ
トカインを用いて組換え動物細胞の生産性をさらに増強
した例はない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、組換え動物細胞による有用蛋白質の生産性を
従来法に比べてさらに増強するための製造方法を提供す
ることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明では、かかる課題を解決するために、組換え動物
細胞の培養液にサイトカインを添加して生産性に与える
効果について検討したところ、サイトカイン添加により
顕著に目的蛋白質の生産性が向上することを見い出し、
本発明を完成するに°至ったものである。

本発明は、 （１）蛋白質産生能を有する組換え動物細胞を用いて蛋
白質を生産するに際し、該組換え動物細胞を含む培地中
にサイトカインを存在せしめることを特徴とする蛋白質
の生産方法。

（２）サイトカインが腫瘍壊死因子（以下、ＴＮＦと略
記する）、リンホトキシン（以下、ＬＴと略記する）あ
るいはＬＴの誘導体である上記（１）記載の生産方法。

（３）ＴＮＦＳＬＴがヒト由来のものである上記（２）
記載の生産方法。

（４）ＬＴの誘導体が成熟ヒトＬＴのＮ末端から１１ア
ミノ酸あるいは、２２アミノ酸欠失した誘導体である上
記（２）記載の生産方法。

（５）　　サイトカインを、　１０ｕｎｉｔｓ／　ｍ１
〜１０７ｕｎｉｔｓ／−１好ましくは、１０”ｕｎｆｔ
ｓ／　ｄ〜１０’ｕｎｉ　ｔｓ／　ａｌｌの濃度で存在
させる上記（１）から（４）に記載の生産方法。

（６）生産される蛋白質がホルモン、酵素、酵素阻害剤
、サイトカインまたは免疫グロブリンである上記（１）
記載の生産方法。

（７）該動物細胞が、ヒｌ−Ｎａｍａｌｗａ　ａｌｌ胞
あるいは、ＣＩＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　
０ｖａｒｙ）細胞であることを特徴とする上記（１）記
載の生産方法。

（８）生産される蛋白質がヒト顆粒球コロニー刺激因子
（以下、ｈＧ−ＣＳＦと略記する）あるいは、ヒトプロ
ウロキナーゼ（以下、Ｐｒｏ−ＵＫと略記する）である
上記（１）記載の生産方法。

（９）生産される蛋白質が粗製物あるいは単離された形
態である上記（１）記載の生産方法。

０１１　　該組換え動物細胞で蛋白質を発現するために
用いる発現プラスミドのプロモーターとして、ＳＶ４０
初期プＯモー　ター、ＳＶ４０後期フロモーター、Ｍｏ
１ｏｎｅｙ　ｍａｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒ
ｕｓ　ＬＴＲプロモーター、　Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍ
ａ　ｖｉｒｕｓ　ＬＴＲプロモーター、Ｈｕｓａｎ　Ｔ
−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ−Ｉ　ＬＴ
Ｒの一部を含むＳＶ４０初期プロモーター、好ましくは
ＳＶ４０初期プロモーターあるいはＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴ
Ｒの一部を含むＳＶ４０初期プロモーターを用いる上記
（１）記載の生産方法。

ａＯ蛋白質産生能を有する組換え動物細胞をサイトカイ
ンを含有する培地に培養増殖せしめ、培養を蛋白質が蓄
積するまで続ける上記（１）記載の生産方法。

０り　サイトカインを含有する培地中において、蛋白質
産生能を有する組換え動物細胞をサイトカインと接触維
持させる上記（１）記載の生産方法。

０３１　　第１段階において、蛋白質産生能を有する組
換え動物細胞を定められた細胞密度に達するまで生育培
地で生育せしめた後、第２段階において、サイトカイン
を存在せしめて、該組換え動物細胞と接触維持する上記
０２）記載の生産方法。

に関するものである。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明によれば、ホルモン、酵素、酵素阻害剤、サイト
カインまた免疫グロブリンなどを生産する組換え動物細
胞の生産性を従来法に比べてさらに増強するための製造
方法が提供される。

本発明に用いるヒトＬＴ（以下ｈＬＴと略記する）とし
ては、天然由来の標品、組換え技術により生産された標
品いずれでも用いることができる。

ｈＬＴ誘導体としては、ＬＴ活性を存するものであれば
、いかなるものでも用いることができるが、好適には、
本発明者らにより造成された（特開昭６２−１８１２９
８）成熟ｈＬＴのＮ末端から１１番目までのアミノ酸を
欠失した誘導体〔以下、ｈＬＴ（△１−１１）と略記す
る〕、成熟ｈＬＴのＮ末端から２２番目までのアミノ酸
を欠失した誘導体〔以下、ｈＬＴ（Δ１−２２）と略記
する〕を用いることができる（第１表）。

第１表　成熟ｈＬＴのアミノ酸配列 Ｐｒｏｐｅｒτｈｒマ１１１ＰＭＰＭＧ１７ＡｌａＦｈ
＠１Ａ１ａＬａｕ中！−本発明に用いるヒトＴＮＦ　（
以下ｈＴＮＦと略記する）としては、天然由来の標品、
組換え技術により生産された標品いずれでも用いること
ができる。また、ＴＮＦ活性を有するものであれば、い
かなる誘導体も用いることができる０例えば、カルリノ
らにより報告されている成熟ｈＴＮＦのＮ末端を欠失し
た誘導体〔ジエイ・ニー・カルリノ（Ｊ、Ａ、Ｃａｒｌ
ｉｎｏ）ら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）％招、９５
Ｂ（１９Ｂ？）　）も用いることができる。

宿主として用いる動物細胞としては、いかなる細胞でも
用いることができるが、好適には、ヒトＮａｔｓａｌｖ
ａ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３２）　、ジヒドロ葉酸還
元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略記する）が欠損した
ＣＨＯ細胞〔ジー・ウルラウブ＆エル・ニー・チェイシ
ン（Ｇ、Ｕｒｌａｕｂ　＆　Ｌ、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ）：
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７７．４２１６（１９８
０）　）などがあげられる。

生産させる蛋白質としては、ホルモン、酵素、酵素阻害
剤、サイトカインまた免疫グロブリンなどいかなる蛋白
質でも良いが、ここでは、ｐｒｏ−ＵＫ。

ｈＧ−ＣＳＦを例として示す。

発現プラスミドとしては、目的蛋白質の遺伝子を組込み
発現できるものであれば、いかなるものでも用いること
ができる。このとき用いるプロモーターとしては、ＳＶ
４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、Ｍ
ｏ１ｏｎｅｙ　ｎ＋ｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉ
ｒｕｓ　ＬＴＲプロモーター　Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍ
ａ　ｖｉｒｕｓＬＴＲプロモーター、ＨＴＬＶ４　ＬＴ
Ｈの一部を含むＳＶ４０初期プロモーター、好ましくは
ＳＶ４０初期プロー［：−ターアルイはＨＴＬＶ−Ｉ　
ＬＴＲ（７）一部を含むＳＶ４０初期プロモーターを用
いることができる。ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲの一部を含むＳ
Ｖ４０初期プロモーターは、多くの細胞で、ＳＶ４０初
期プロモーターよりも強いプロモーター活性を有するこ
とが報告されている〔代部ら：モレキユラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、）、　８　、４６６（１９８Ｂ）　）　。

動物細胞で有用蛍白質を生産する際、ｄｈｆｒの遺伝子
増幅系が繁用されている０本発明者らにより開発された
方法は、これらの遺伝子増幅を行った組換え細胞に対し
ても有効である。

ｐｒｏ−ＵＫ発現プラスミドとしては、参考例１３に示
したＰＳＥＩＵＫｐｒｏｌ−１および、参考例１６に示
したｐｓＥｔＵＫＩＳＥｄｌ−３を、ｈＧ−ＣＳＦ発現
プラスミドとしては参考例１７に示したｐＡＳＬＢ３−
３を、ｄｈｆｒを選択マーカーとして有するプラスミド
としては、ｐｓｖ　２−ｄｈｆｒ　（ニス・サプラマ；
　（Ｓ、Ｓａｂｒａｍａｎｉ）ら：モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、上、８５４（１９８１）　）
を用い、宿主の動物細胞としてはＮａｍａｌｉｍａ細胞
および、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞を用いてｈＬＴ、ｈＬ
Ｔ　（Δ１−１１）　、ｈＬＴ（Δ１−２２）　、ｈＴ
ＮＦの添加効果を検討した例を以下に述べる。

まず、ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産０１１０株を育種
する例を述べる。

ｐｓＥＩＵＫｐｒｏｌ−１およびｐＳＶ　２−ｄｈｆｒ
を例えばリン酸カルシウム法〔グラハム＆ファン・デル
・ニブ（Ｇｒａｈａｍ　＆　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）：
ヴイロロジイ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２、５４６（１９
７８）　）によりｄｈｆｒ欠損ＣＩＯ細胞に導入する。

ｐｓＥＩＵＫｐｒｏｌ−１およびｐＳＶ　２−ｄｈｆｒ
を有する形質転換株は例えば、０４１８および透析ウシ
胎児血清を含むＭＥＭ　　ＡＬＰＨＡ培地（リボ核酸お
よびデオキシリボ核酸不含有：ＧＩＢＣＯ社製）により
選択することができる。得られた形質転換株を培地に培
養することにより培養液中にｐｒｏ−ＵＫポリペプチド
を生成させることができる。

ウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記する）の活性はフィブ
リン・プレート・アッセイ法（ＧｒａｎｅｌｌｉＰｉｐ
ｅｒｎｏとＲｅ１ｃｈ　　：ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　
１４８．２２３（１９７Ｂ）　）によって測定すること
ができる。

次に、ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｎａｍａｌｗａ株
を育種する例を述べる。

ｐｓＥＩＵＫｌｓＥｄｌ−３を例えばエレクトロポレー
ション法〔ニューマン（Ｎｅｕｓ＋ａｎｎ）　　ら：エ
ンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）１．８４１（１９８
２）　）によりＮａｍａｌｗａ細胞に導入する。ｐｓＥ
ＩＵＫｌｓＥｄｌ−３を有する形質転換株は例えば、Ｇ
４１８およびウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培
地（日永製薬社製）により選択することができる。得ら
れた形質転換株を培地に培養することにより培養液中に
ｐｒｏ−ＵＫポリペプチドを生成させることができる。

さらに形質転換株の中からメトトレキセート（以下、Ｍ
ＴＸと略記する）を用いてｐｒｏ−ＵＫポリペプチド遺
伝子が増幅された形質転換株を得ることもできる。得ら
れた形質転換株を培地に培養することにより培養液中に
ｐｒｏ−ＵＫポリペプチドを生成させることができる。

ＵＫの活性は１．フィブリン・プレート・アッセイ法に
よって測定することができる。

次に、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド生産Ｎａｍａ　１ｗａ
株を育種する例を述べる。

ｐＡＳＬＢ３−３を例えばエレクトロポレーション法に
よりＮａｍａｌｓｍａ細胞に導入する。ｐＡＳＬＢ３−
３を有する形質転換株は例えば、０４１８およびウシ胎
児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地により選択するこ
とができる。得られた形質転換株を培地に培養すること
により培養液中にｈＧ−ＣＳＦポリペプチドを生成させ
ることができる。さらに形質転換株の中からＭＴＸを用
いてｈＧ−ＣＳＦポリペプチド遺伝子が増幅された形質
転換株を得ることもできる。得られた形質転換株を培地
に培養することにより培養液中にｈＧ−ＣＳＦポリペプ
チドを生成させることができる。

ｈＧ−ＣＳＦの蛋白質量は、抗ｈＧ−ＣＳＦ単クローン
抗体を用いたエンザイム・リンクド・イムノ・ソルベン
ト・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって求める。なお、こ
のときの標準物質としては、大腸菌で生産、精製し、ロ
ーリ−法によって定量したｈＧ−ＣＳＦ標品を用いる。

また抗ｈｃ−ｃＳＦ単クローン抗体は、花卉らの方法〔
花卉ら：キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
、）、４６，４４３８（１９８６））に従って調製した
ものを用いる。

次に、ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産ＣＨＯ株にｈＬＴ
を添加し効果を調べた例を述べる。

ｈＬＴは、本発明者らが開示した方法（特開昭６２−１
８１２９８）で調製するか、あるいは、コスモ・バイオ
社などから購入することができる＊　ｐｒｏ−ＵＫポリ
ペプチド生産Ｃ■０株にｈＬＴを例えばｌＸｌ０’ｕｎ
ｉｔｓ　／Ｉｌｄ！添加し、培養する。経時的にサンプ
リングして培養液中のＵＫ活性をフィブリン・プレート
・アッセイ法によって測定することができる。

ｈＬＴ添加により明らかにｐｒｏ−ＵＫ産生の増強効果
が認められ、本発明の有効性が示されている。

次に、ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｎａ＋ｗａ１ｗａ
株にｈＬＴ、、ｈＬＴ　（Δ１−１１）　、ｈＬＴ　（
Δ１−２２）、ｈＴＮＦを添加して効果を調べた例を述
べる。

ｈＬＴＳｈＬＴ　（Δｌ−１１）　、ｈＬＴ　（Δ１−
２２）は、本発明者らが開示した方法（特開昭６２−１
８１２９８）で調製することができる。ｈＴＮＦは、コ
スモ・バイオ社などから購入することができる。

ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｎａｍａｌｗａ株にｈＬ
Ｔ、ｈＬＴ　（Δ１−１１）　、ｈＬＴ　（Δ１−２２
）あるいは、ｈＴＮＦを例えば、Ｉ　Ｘ１０”ｕｎｉｔ
ｓ／　ｒｄあるいは、Ｉ　Ｘ　１０’ｕｎｉ　ｔｓ　／
　ａｄ！添加し、培養す６０例エバ、培養３日後にサン
プリングして培養液中のＵＫ活性をフィブリン・プレー
ト・アッセイ法によって測定することができる。あるい
は、経時的にサンプリングして培養液中のＵＫ活性をフ
ィブリン・プレート・アッセイ法によって測定すること
ができる。

ｈＬＴ、ｈＬＴ　　（Δ１−１１）　、ｈＬＴ　　（Δ
ｌ−２２）あるいは、ｈＴＮＦ添加により明らかにｐｒ
ｏ−ＵＫ産生の増強効果が認められ、本発明の有効性が
示されている。

次に、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド生産ＮａｍａＬｗａ株
にｈＬＴを添加し効果を調べた例を述べる。

ｈ’Ｇ−Ｃ’Ｓ　Ｆポリペプチド生産Ｎａｍａｌｗａ株
にｈＬＴを例えばＩ　Ｘ１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｅあるい
は、ｌＸｌ０’ｕｎｉｔｓ／ｒｄ添加し、培養する。例
えば、培養４日後にサンプリングして培養液中のｈＧ−
ＣＳＦ蛋白量をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって測定すること
ができる。

ｈＬＴ添加により明らかにｈＧ−Ｃ５Ｆ産生の増強効果
が認められ、本発明の有効性が示されている。

本発明で用いる培地および培養方法は以下の通°りであ
る。

培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血清）を加え
たハムＦＩＯ培地、ハムＦ１２培地（以上フローラボ社
）、ダルベツコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（
以上日永製薬社製）、ＭＥＭ　　ＡＬＰＨＡ培地および
これらの混合培地が用いられる。培地には必要により、
グルタミン０．５〜５ｍＭ、抗生物質〔ペニシリン（２
５Ｕ／ｍ１）、ストレプトマイシン（２５μｇ／ａｄｌ
）　、０４１Ｂ　（０，３ｍｇ／ｍ）など〕、重曹（０
，０１％）などを適量加えてもよい。

培養には、種々の培養ビン、デイツシュ、ローラーボト
ル、ス、ピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−など
を用いることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１
０’〜ｌＸｌ０’細胞／　ｍｌとし、３０〜４０°Ｃ１
２〜１０日間行うと、各細胞密度に応じ、ｐｒｏ−ＵＫ
あるいはｈＧ−ＣＳＦが主に細胞外に分泌される。また
、本発明において、蛋白質産生能を有する組換え動物細
胞を用いて蛋白質を生産する際には、該細胞とサイトカ
インを含有する培地に直接培養、増殖せしめ、蛋白質が
蓄積するまで培養し続けてもよいが、あらかじめ第１段
階において他の生育培地に、蛋白質産生能を有する組換
え動物細胞を一定の細胞密度になるまで培養した後、第
２段階においてサイトカインを存在せしめて、該動物細
胞と接触維持しておいてもよい。

次に本発明の組換え動物細胞に挿入される発現プラスミ
ドの調製手段を参考例に示す。なお、以下の参考例にお
ける組換え技法における反応の条件は、−船釣に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０μ
ｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍ
Ｍ）のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ６，０〜９．５好ま
しくはｐＨ７，０〜８．０）、Ｏ〜２００ｍＭのＮａＣ
１，２〜２０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ
Ｃ１ｇを含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単位
（好ましくは１ｇｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用
い、２０〜７０°Ｃ（至適温度は用いる制限酵素により
異なる）において、１５分間〜２４時間行う０反応の停
止は、通常５５〜７５℃で５〜３０分間加熱することに
よるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネートな
どの試薬により制限酵素を失活させる方法も用いること
ができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片あるいはギャッ
プト・デュプレックスＤＮＡの精製は、低融点アガロー
スゲル電気泳動法（以下、ＬＧＴ法と略記する）〔エル
・ライスラング−（Ｌ、Ｗｉｅｓ−１ａｎｄｅｒ）　　
：アナリティカル・バイオケミストリイー（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　９８，３０
５（１９７９））あるいはアガロースゲル・凍結融解法
（以下、ＡＦＴ法と略記する）を用いて行うことができ
る。このＡＦＴ法とは、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲ
ル（０，７〜１．５％）のスライスに対して、等量のＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ７，
５）、１ｍＭＥＤＴＡ）および二倍量のフェノール（Ｔ
Ｅ緩衝液で飽和したもの）を加え、混合した後、−７０
°Ｃと６５°Ｃでの凍結−融解を２回繰り返し、さらに
遠心分離によって生じる上層の水溶液を分取し、エタノ
ール沈澱によってＤＮＡ断片を回収する方法である。Ｄ
ＮＡ断片回収機・マックスイールドＡＥ−３２４１型（
アト−株式会社製）を用いて、アガロースゲルやポリア
クリルアミドゲルからＤＮＡ断片を電気泳動によって溶
出し、精製できる〔以下、この方法を電気泳動的溶出法
（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）と略称する〕。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ　（好ましく
は１０〜４０ＩＩＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ６
，１〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜
２０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｈ　、
０．１〜１０ｍＭ　（好ましくは０．５〜２゜ＯｍＭ）
のＡＴＰ、１〜５０１ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）
のジチオスレイトール（以下ＤＴＴともいう）を含む反
応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１〜１．０００単位を用
い、１〜３７°Ｃ（好ましくは３〜２０℃）で１５分間
〜７２時間（好ましくは２〜２０時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ）　ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ
、６９゜２１１０　（１９７２）　）あるいはハナハン
の形質転換法（Ｈａｎａｈａｎ　　：ジャーナル・オプ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、）　１ｆｉｆｉ、５５７　（１９８３））を用いて、
大腸菌に導入する。

結合反応によって生じた組み換え体Ｍ１３ファージＲＦ
ＤＮＡは、必要により公知のトランスフェクション法〔
日野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素皿、　２９４（１９８
４）　）によって、大腸菌ＪＭ１０５株〔ジエイ・メシ
ング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）刹
、　１０３（１９８５）　）に導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡおよび組換え体Ｍ１３ファー
ジＲＦＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、バー
ンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ，
Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・
リサＴチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　
７　＋１５１３（１９７９）　）などを用いて行う。

組み換え体Ｍ１３ファージからの一本鎖ＤＮＡの単離は
公知の方法〔口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素益、　２
９４（１９８４））に従って行う。

本発明で使用するデオキシオリゴヌクレオチドは、リン
酸アミダイト法による固相合成法（Ｓ、Ｌ。

Ｂｅａｕｃａｇｅら：テトラヘドロンＱレターズ（Ｔｅ
ｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、）　２２．１８５９
（１９８１））　、およびり、Ｊ。

ＢｃＢｒｉｅら：同２４．２４５（１９８３）　）に従
い、アプライド・バイオシステムズ社３８０＾・Ｄ　Ｎ
　Ａ合成＄１　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　Ｉｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　ＣＡ　９４４０
４）を用いて合成することができる。合成されたデオキ
シオリボヌクレオチドを他のＤＮＡ断片と結合させる反
応に用いる場合には、約２０ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）
のデオキシオリゴヌクレオチドを２０μ２のＴ４キナー
ゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６
）、ｌＱｍＭＭｇＣｌｇ、５ＩＩＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ、　０．５ｍＭ　ＡＴ　Ｐ
　）中で、５単位の７４ＤＮＡキナーゼを加えることに
より、５′−リン酸化する。

ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いる場合
には、上記のＴ４キナーゼ緩衝液の中の０．５ｍＭ　Ａ
ＴＰの代わりに２０〜５０μＣ１の５’−Ｃｒ−”　Ｐ
　）　Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００Ｃｉ／ｍｎ＋ｏＬアマ−
ジャム（Ａｍｅｒ−ｓｈａｎ＋、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　
Ｉｌｅｉｇｈｔｓ、　Ｉｆ）を用いて、その５′末端を
放射能標識する。

プラスミドＤＮＡの構造解析については、プラスミドＤ
ＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後アガロースゲル
電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定す
る必要があるときはＭ１３ファージを用いたデイデオキ
シ・シーフェンス（ｄｉｄｅｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
）法によって決定する。

参考例１゜ ヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｔｐ＾７の造
成： （１）　　Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞よりのポリ（Ａ）
ＲＮＡの調製：ヒト咽頭ガン細胞株Ｄｅ　ｔｒｏ　ｉ　
ｔ５６２より、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム
法〔カサラ（Ｃａｔｈａｌａ）ら：ディーエヌエイ（Ｄ
ＮＡ）２゜３２９　（１９８３））に従い、ポリ（Ａ）
を有するＲＮＡを下記のごとく調製した。

ヒト咽頭ガンＤｅｔｒｏｉｔ５６２　（ピーターメン・
ダブリュ・デイ・ジュニア（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｗ、
　Ｄ、。

Ｊｒ、）ら：プロシーデインダス・オブ・ザ・ソサイア
ティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオロジー・ア
ンド・メディシン（Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ。

Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、）　１３６　、１１８７
（１９７１））を、１０％牛脂児血清、１００×非必須
アミノ酸溶液（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
）を１／１００量、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．
１％ラクトアルブミン水化物（ギブコ・オリエンタル）
を含む５０１ｄのＭＥＭ培地（日永製薬社製）を用い、
ティシ亙・カルチャー・フラスコ（コーニング社製、１
５０ｃｆｆｌ）　内で生育させた。３７°Ｃでコンフル
エント（ｃｏｎｆｌｕ−ｅｎ　ｔ）になるまで培養した
後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１１００ｎ／ｄのフォルボ
ール・ミリステート・アセテート、　（Ｐ　ＭＡ　：　
Ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅａｃｅ　ｔａ　ｔ
ｅ）を添加し、牛胎児血清を除いた上記培地３０ｍ　ｌ
を加え、さらに３７°Ｃで２４時間培養した。

続いて細胞を０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴ
Ａを含む溶液１０＋＋＋１で処理し、細胞懸濁液を取得
した。６本の上記ティッシュ・カルチャー・フラスコか
ら総計１×１Ｏ１ｌの細胞を取得した。

細胞懸濁液から、１，１１００Ｘ、４°Ｃ１１０分間の
遠心によって細胞を集め、８０ｄのリン酸塩バッファー
で洗浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！　　（
ｐＨ７）および８％（Ｖ／Ｖ）　　２−メルカプトエタ
ノールからなる溶液１０ｍ１中でポルテックス・ミキサ
ーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管に移し、４
Ｍ　ＬｉＣｌ１溶液８０ｄを加えて攪拌した後、４°Ｃ
ｌ２Ｏ時間静置した。旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯロータ
ーにて９、ＯＯＯｒｐｍ＋　９０分間遠心後、ＲＮＡを
沈澱として回収した。ＲＮＡの沈澱を４Ｍ尿素および２
Ｍ塩化リチウムからなる溶液５０ｒｎ１に懸濁し、Ｈｉ
ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯＣ１’；’−ニテ９．ＯＯＯｒ
ｐｍ、　６０分間遠心後、再びＲＮＡを沈澱として回収
した。ＲＮＡの沈澱を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム
、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
／！　（ｐＨ７，５）からなる溶液１０Ｉｎ１に溶解し
、フェノール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈澱
により回収した。得られたＲＮＡ約２．５■を１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ８，０）および１　ａ＋Ｍ
　ＥＤＴＡからなる溶液１戚に溶がした。

６５℃、５分間インキエヘートし、０．１ｄの５ＭＮａ
Ｃ１を加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・カ
ラム〔ピー・エル・バイオケミカル（ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）社製〕クロマトグラフィー（カラム体
積０．５ｄ）にかけた。吸着したポリ（Ａ）を有するｍ
ＲＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ　（ｐＨ７，
５）および１　ｍＭ　）ｉＤＴＡからなる溶液で溶出し
、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約９０■を得た。

（２）　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成と該ＤＮＡのベクターへ
の挿入：オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）の方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジイ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　、２．１
６Ｈ１９８２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を第３図に示す。

ｐｃＤＶｌ　（オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ
ｓ＋ａ＆　Ｂｅｒｇ）　：モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジ４　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｌ、）、３．２８０（１９８３）　）　　４００ａｇを
１０ｏ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、６
ａＭＭｇＣｆｇおよび１０ｍ１’ｌ　ＮａＣｌ！、から
なる溶液３００ＩＩＩ！に加え、さらに５００単位のＫ
ｐｎ　Ｉを加えて、３７°Ｃ１６時間反応させ、プラス
ミド中のＫｐｎ１部位で切断した。フェノール−クロロ
ホルム抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
。　Ｋｐｎ■切断した該ＤＮＡ約２００可を４０ｍＭカ
コジル酸ナトリウム、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
（ｐＨ６，８）　、１　ｍＭＣａＣｊ！＊および０．Ｉ
ｎ＋Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）か
らなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する〕にｄＴＴ
Ｐを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００濯に加え
、さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）（Ｐ’Ｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃、
１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶ　ｌのＫｐｎｌ
切断部位の３′末端にポリ（ｄＴ）鎖が約６７個付加さ
れた。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐｃＤＶ
ＩＤＮＡ約１００■を回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）　、６ｍＭＭｇＣ１ｔ
、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！からなる緩衝液１５０産に加
え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時
間反応させた。該反応液をＬＧＴ法で処理後、約３．１
ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、約６ＯＮのポリ（ｄＴ）鎖
付加ｐｃｏｖ　１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩｔ　（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　ＥＤＴＡか
らなる溶液５００産に溶解し、６５℃５分間インキュベ
ート後、水冷して５０産の５ＭＮａＣｌ！、を加えた。

混合物をオリゴ（ｄＡ）セルロースカラム（コラボレイ
ティプリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポ
リ（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）および
１ｍＭＥＤＴ＾からなる溶液で溶出し、ポリ（ｄＴ）鎖
の付加したｐｃＤＶｌ（以下ベクタープライマーと略記
する）２７躍を得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐｔ、１（オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ＋ｗ
ａ　＆。

Ｂｅｒｇ）　：モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジイ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）、３　
、２８０（１９８３）　）約１４ｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！　（ｐ）１７．５）　、６ｍＭ　ＭｇＣｊ
！　ｚおよび５０ｍＭ　ＮａＣｊ！からなる緩衝液２０
０産に加え、さらに５０単位のＰｓｔＩを加え、３７’
Ｃ４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰｓｔ１部位で切
断させた。

該反応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノー
ル沈澱を行い、ＰｓｔＩで切断したｐＬＩＤＮＡ約１３
ｔｒｇを回収した。該ＤＮＡ約１３．ｑをＴｄＴ緩衝液
に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０顧に加
え、さらにＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｌｓ社製）５４単位を加えて３７°Ｃ１３分間イン
キュベートし、ｐＬｌのＰｓｔｌ切断部位３′末端に（
ｄＧ）鎖を約１４個付加した。フェノール−クロロホル
ム抽出後エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。該ＤＮ
ＡをｌＯｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）、
６ｄＭｇＣｊ！ｚおよび６０ｍＭ　ＮａＣｊ！からなる
緩衝液１００誦に加え、さらに８０単位のＨｉｎｄｎｌ
を加えて３７°Ｃ３時間インキエベートし、ｐＬＩＤＮ
ＡのＨｉｎｄＩ［１部位で切断した。該反応物をアガロ
ースゲル電気泳動にて分画し、約０．５　ｋｂのＤＮＡ
断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツ、エン（Ｄｒｅｔｚ
ｅｎ）　　ら：アナリティカル・バイオケミストリイ（
ＡＨｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１２　、２９５（１９
８１）　）にて回収し、オリゴ（ｄＧ）鎖付きのリンカ
−ＤＮＡ　（以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を得
た。

上記で調製したポリ（Ａ）　ＲＮ　Ａ約４ｎ、ベクター
プライマー約１．４■を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　
　（ｐＨ８，３）、８ｍＭ　ＭｇＣｊ２□、３０ｍＭ　
ＭＣＩ、　０．３ｍＭ　ＤＴＴ。

２ｄ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ
およびｄＣＴＰ）およびｌＯ単位のりボヌクレアーゼイ
ンヒビター（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌｓ社製）
からなる溶液２２．３Ｉ４１に溶解し、１０単位の逆転
写酵素（生化学工業社製）を加え、４１″Ｃ９０分間イ
ンキュベートし、ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させ
た。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノ
ール沈澱を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベク
タープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭ
　ｄＣＴＰおよび０．２■ポリ　（Ａ）を含むＴｄＴ緩
衝液２０産に溶かし、１４単位のＴｄＴ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉ
。

ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７°Ｃ２分間イン
キュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に２０個の（ｄＣ）鎖
を付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈澱により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮ
Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５）、６ｍ
ＭＭｇＣｊ！ｚおよび６０ｍＭ　ＮａＣｌ１からなる液
４００にに溶かし、２０単位のＨｉｎｄＩ［を加え、３
７°Ｃ２時間インキュベートし、Ｈｉｎｄ１１１部位で
切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈澱して０．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃ
ＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮ　Ａ
　０．２ピコモルおよび前記のリンカ−ＤＮＡ０．４ピ
コモルを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５
）、０．１ＭＮａＣ４２および１ｆｆ１ＭＥＤＴ八から
なる溶液１００誦に溶かし、６５°Ｃ２４２°Ｃ１０°
Ｃでそれぞれ１０分、２５分、３０分間インキュベート
した。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）、
４ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ　、ＩＯＩＩＩＭ　（Ｎ１１４）
　ｚｓＯａ、０．１ＭＫＣ！および０．１ｍＭβ−ＮＡ
Ｄの組成で、全量１０００にとなるよう反応液を調製し
た。該反応液に２５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー
イングランド・バイオラプズ社製）を加え、１１℃１８
時間インキエベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮ
ＴＰ、　０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤとなるよう成分を
追加調製し、１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２０単
位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社製）および１０単位の大腸菌リボヌク
レアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
を加え、１２°Ｃ１２５°Ｃで順次１時間ずつインキエ
ベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
の環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮ
Ａに置換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミ
ドが生成した。

（３）　　ヒトｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
の選択： 次ニ、コロニー・ハイブリダイゼーションヲ用い、ヒト
ｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡ　（ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａら：ネ
イチ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１．２１４（１９８
３）　）のｔ−ＰＡシグナルペプチド領域の一部の塩基
配列と一致する塩基の合成りＮＡ ５’　−ＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧ
ＣＴＣＴＧＣＴＧＴ　−３’を３ｔｐで標識したプロー
ブと会合するクローンとして、ｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡを以
下のようにして選択した。

まず、（２）で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌
Ｃ６００ＳＦ　８株〔カメロン（Ｇａｍｅｒｏｎ）　　
：プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　７２．３４１６（１９７５））を
ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ　：ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジーＵ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏ
ｌ、）、皿、５５７（１９８３）　）に従い形質転換し
た。得られた約１０，０００個のコロニーをハナハンと
メセルソンの方法（Ｈａｎａｈａｎａｎｄ　Ｍｅｓｅｌ
ｓｏｎ　：メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　　１００　
、３３３（１９８３）　）に従い、ニトロセルロース・
フィルター上に固定した。次に、フィルターのプレハイ
ブリダイゼーションは、６　ＸＮＥＴ　（Ｉ　ＸＮＥＴ
・１５０ｍＭ　ＮａＣｊ！、１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、１０×デ
ンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液、および１００ｇ／−
の断片化した大腸菌染色体ＤＮＡを含む溶液中、６５°
Ｃ１４時１間またはそれ以上の時間行った。

このプレハイブリダイゼーション溶液に上述の！ｐで標
識したプローブを加え、フィルター上のＤＮＡと会合さ
せた（６５°Ｃ１１６時間以上）。次に、フィルターを
６ＸＳＳＣ（Ｉ　ＸＳＳＣ＝１５０ｍＭ　ＮａＣｊ！、
１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で２回洗浄しく室温、５
分間ずつ）、６５°Ｃの２ｘｓｓｃと０．１％ＳＤＳを
含む液で３０分間洗浄した。さらに６５°Ｃの２ＸＳＳ
Ｃと０．１％ＳＯＳを含む液で１５分間洗浄した後、６
ＸＳＳＣで室温で２回洗浄した（５分間ずつ）。

フィルターを空気乾燥した後、オートラジオグラフィー
により陽性クローン１個を同定した。

この陽性クローンが持つプラスミドｐｔＰＡ７のｃＤＮ
Ａの塩基配列を、Ｍ１３ファージを用いたデイデオキシ
・シーフェンス法により決定した。

その結果、ｐｔＰＡ　７のｃＤＮＡは、ペニカらが報告
したｔ−ＰＡのアミノ酸配列（Ｐｅｎｎｉｃａら：ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１．２１４（１９８３）
　）と完全に一致するｔ−ＰＡをコードしていることが
判明した。ただし、成熟型ｔ−ＰＡの９５番目のアスパ
ラギン酸のコドン（ＧＡＣ）と５１２１２番目レオニン
のコドン（ＡＣＡ）がそれぞれＧＡＴ、　ＡＣＣになっ
ていることがわかった。

この苗株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｅｔ
ＰＡ７　ＦＦ！ＲＭＢＰ−１４６７として、微工研に寄
託されている。

参考例２゜ ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを運ぶプラスミドｐ
ＵＫｌの造成： 参考例１で作成したＤｅｔｒｏｉｔ　５６２細胞のｃ［
ｌＮＡライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーショ
ン法によりスクリーニングし、ヒトｐｒｏ−ＵＫｃＤＮ
Ａクローンを単離した。すなわち、まず、参考例１で得
た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６００ＳＦ　８
株〔カメロン（Ｇａｍｅｒｏｍ）　Ｈプロシーディング
・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）［Ｉ
ＳＡ　７２．３４１６（１９７５））をハナハンの方法
（Ｈａｎａｈａｎ　　：ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）、１６
６　、５５７　（１９８３））に従い形質転換した。得
られた約３０，０００個のコロニーをハナハンとメセル
ソンの方法（Ｈａｎａｈａｎａｎｄ　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ
　：メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ）　１００．３３３（
１９８３））に従い、ニトロセルロース・フィルター上
に固定した。次に、フィルターのプレハイブリダイゼー
ションは、６　ＸＮＥＴ　、　ＩＯＸデンハルト（Ｄｅ
ｎｈａｒｄ　ｔ）液、および１００ｘ／ｍｌの断片化し
た大腸菌染色体ＤＮＡを含む溶液中、６５℃、４時間ま
たはそれ以上の時間行った。

次に、ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ホルムズ
（Ｈｏｌｍｅｓ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３　。

９２３（１９８５）　）のクリングル領域の一部の塩基
配列と一致する４１塩基の合成りＮＡ ５’−ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＧＡＧ
ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣ−３’（本発
明者らが単離したヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに
ついていえば、第５表中の下線を付した塩基配列に相当
する）を３ｔＰで標識したプローブを、上のプレハイブ
リダイゼーション溶液に加え、フィルター上のＤＮＡと
会合させた（６５°Ｃ１１６時間以上）。次に、フィル
ターをぢ×ＳＳＣで２回洗浄した（室温、５分間ずつ）
後、ｌＸ５ＳＣと０．１％ＳＤＳを含む５７°Ｃの液で
３０分間洗浄した。さらにｌＸ５ＳＣと０．１％ＳＤＳ
を含む５７℃の液で１５分間洗浄した後、６ＸＳＳＣで
２回洗浄した（室温、５分間ずつ）。フィルターを空気
乾燥した後、オートラジオグラフィーにより陽性クロー
ン１個を同定した。この陽性クローンが持つプラスミド
ｐＵＫ１のｃＤＮＡ（本頁以下余白） の塩基配列を、Ｍ１３ファージを用いたデイデオキシ・
シーフェンス法により決定した（第２表）。

その結果、ｐＵに１のｃＤＮＡは第２表のｐｒｏ−ＵＫ
のアミノ酸残基の番号付けに従った場合、ｐｒｏ−〇に
の４１番目のＣｙｓ残基より下流のｐｒｏ−ＵＫの翻訳
領域および３′非翻訳領域をコードしていることが明ら
かになった。ｐＵＫ　１のｃＤＮＡがコードしているｐ
ｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列は、ホルムズら（Ｈｏｌｍｅ
ｓら：バイオテクノロジー（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ−
ｇｙ）　　３．９２３（１９８５）　）の報告したもの
と一致していたが、以下に示す４つのアミノ酸のコドン
の３番目の塩基が異なっていた。

２５４番目のアミノ酸Ａｓｎ　　：ＡＡＣ４ＡＡＴ３４
０番目のアミノ酸Ｌｅｕ　　：　ＣＴＡ４ＣＴＧ３４５
番目のアミノ酸Ｐｒｏ　　：　ＣＣＣ４ＣＣＡ３４６番
目のアミノ酸Ｇｌｎ　　：　ＣＡＡ４ＣＡＧこの菌株は
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＥＵＫ　Ｉ　Ｆ
ＨＲＭ　ＢＰ−１４６３）として、微工研に寄託されて
いる。

参考例３゜ ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを運ぶプラスミドｐ
ＵＫ１１の造成： 参考例２で得られたプラスミドＰＵＫ　１がコードして
いるｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはｐｒｏ−ＵＫのシ
グナル領域と成長因子メトイン領域を含んでいないので
、以下に示す手順を用いて、これらの領域を含むｃＤＮ
Ａのクローン化を行った。

まず、ｃＤＮＡのクローン化に用いるベクターｐＣＣＫ
　２の造成を以下のようにして行った。

（１）　　組換えプラスミドｐＣＣＫ　１の造成：桑野
らが造成した、ラット脳コレシストキニン（ＣＣＫ、前
駆体のｃＤＮＡを有するプラスミドｐＲｃ１９　（桑野
ら：ジャーナル・オプ・バイオケミストリ＝（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）　９６．９２３−９２６（１９８４）
）を持つ大腸菌Ｈ８１０１株を培養し、培養菌体がら常
法によりｐＲｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。得られた
ｐＲｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ約３１！Ｉｌを３０．ｃｃｊｉ
（Ｄ１０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）　
、７ｍＭ　ＨｇＣｌ１ｔ、　６＋＊Ｍ　２−）　ＪＬ／
カプトエタノールおよび５抛ＭＮａ（／！を含む緩衝液
（以下“Ｙ−５０緩衝液°”と略記する）に溶がし、１
単位のＰｖｕＩＩを加え、３７℃で１時間消化反応を行
った。この反応により、ＤＮＡはＰｖ、ｕＩ［により部
分的に消化された。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦ
Ｔ法を用い、約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。一
方、ノルランダーらが造成したプラスミドＤＮＡ　ｐＵ
ｃ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、ら：ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）２６．１０１（１９８３）　：　ｐＵｃ１９プ
ラスミドＤＮＡは宝酒造社より入手できる〕約ｌｔｒｇ
を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　７
ｍＭ　ＭｇＣｌ！、ｚ、６ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ールを含む緩衝液（以下、“Ｙ−０緩衝液”と略記する
）３０にに溶かし、１６単位のＳｍａｌを加え、３０℃
で２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用い、約２．７　ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。

このようにして得られたｐＵｃ１９由来の約５３０ｂｐ
のＤＮＡ断片（約０．０１．ｗ）とｐＵｃ１９由来の約
２．７ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５ｇ）とを２０犀の
２０１Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，６）、　１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｊ！ｘ＋　１０ｍＭ　ＤＴＴおよび１ａＭ　
ＡＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４リガーゼ
緩衝液”と略記する）に溶かし、２００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４　’Ｃで１８時間結合反応を行っ
た。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、アンピシリン（以下Ａｐと
略記する）耐性株を得た。この形質転換株からプラスミ
ドＤＮＡ、ｐｃｃＫｌを単離し、制限酵素による構造解
析を行ったところ、目的の構造を有することを確認した
（第４図参照）。

（２）組換え体プラスミドｐＣＣＫ　２の造成：上で得
られたｐＣＣＫ　１プラスミドＤＮＡ約２鱈を３０産の
Ｙ−０緩衝液に溶かし、１２単位の５ａｃＩを加え、３
７°Ｃで２時間消化反応を行った。さらに、１．５犀の
２ＭＮａＣｊｌ！と１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７
°Ｃで２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．５５ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。一方、後述の参考例５で得られたｐＴｒＳ
３３プラスミドＤＮＡ約２躍を上と同じ反応に供し、生
じた約２．８５ｋｂの５ａｃｌ　−Ｂａｎ＋ＨＩ断片を
ＡＦＴ法を用いて精製した。

このようにして得られたｐＣＣＫ　１由来の約０．５５
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０２ｇ）とｐＴｒＳ３３由来
の約２、８５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１ｇ）とを２０
戒のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡｐＣＣＫ２を単離し、制
限酵素による構造解析を行ったところ、目的の構造を有
することを確認した（第５図参照）。

（３）　　ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを運ぶプ
ラスミドｐＵＫ１１の単離： 参考例１で調製したＤｅｔｒｏｉｔ　５６２細胞のポリ
（Ａ）ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）約Ｂａｔ（７Ｉｊ１の１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）−０，５ｍＭ　Ｈ
ＤＴＡに溶解されている〕を６５°Ｃで１０分間加熱し
た後、水中で急冷した。

この溶液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ
８，３）　、８　ｍＭＨｚＣｌｔ、　３０ｍＭ　ＫＣｊ
！、　５＋ａＭ　ＤＴＴ、　　１ｍＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）　、１
０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、および５　ｐｇ　／　ａ
ｌｌオリゴ（ｄＴ）　＋　２−　ｔ　ｓ　（コラボレー
ティブ社製）（全量８０戚）となるように調整した後、
４１°Ｃで１５分間保温した。次いで、２０単位の逆転
写酵素（生化学工業社製）を加え、４１℃で９０分間保
温し、ｍ　ＲＮ　Ａに相補的なｃＤＮＡを合成した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、工・タノール
沈澱を行った後、４０ｄの０．３　Ｍ　　ＮａＯＨに溶
かし、３７°Ｃに１５時間放置することによって、ｍＲ
ＮＡを加水分解した。次に、１０濯のＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）と４０ｆｉの０．３ＮＨ
Ｃｆを加えて中和した後、１重鎖ｃＤＮＡをエタノール
沈澱によって回収し、２８．５ｄのＨｚＯに溶解した。

この溶液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ８，
３）、８ｎ＋ＭＭｇＣｆｇ、３０ｇＭ　ＭＣβ、５ｍＭ
　ＤＴＴ。

１ｍＭ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰ）　、および２．５ｎ／ｄ合成りＮＡ
プラー（７−ＣＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧ　（
ヒトｐｒｏ−ＵＫのシグナル・ペプチド領域の一部の塩
基配列と一致する）（全量４ｏに）となるように調整し
た後、６５℃で１ｏ分間、続いて４１”Ｃで３０分間保
温した０次いで１０単位の逆転写酵素を加え、４１°Ｃ
で６０分間保温することにより、１重鎖ｃＤＮＡを２本
領ｃＤＮＡに変換した。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、２５ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ！を含むＹ−０緩衝液３０ｉｔＩＩに溶かし、２
５単位のＢｓ５ＨＩＩにニーイングランドバイオ５１１
社製）を加え、５０℃で２時間消化反応を行った。さら
に、１．２５Ｉ４！の２ＭＮａＣ１と１２単位のＢａｌ
１ｌＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、１０分間の加熱後、ＡＦＴ法を用いて約１．１〜
１．４ｋｂのｃＤＮＡ断片を精製した。

一方、上で得られたｐＣＣＫ　２プラスミドＤＮＡ約２
Ｎを上と同様にＢｓ５ＨＩ［とＢａ５ＨＩで切断した後
、ＡＦＴ法を用いて約２．９ｋｂのＢｓ５ＨＩ［−Ｂａ
ｓ＋ＨＩ断片を精製した。

このようにして得られた約１．１〜１．４ｋｂのｃＤＮ
Ａ断片（約０．０２ｇ）とｐＣＣＫ　２由来の約２．９
ｋｂのＤＨＡ断片（約０．０５■）とを２０Ｉ１１のＴ
４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、２００単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換えプラスミド混合物を用いて、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ　９株を形質転換することにより、約２５．０
００個のＡｐ耐性株を取得し、これらのＡＰ耐性株の中
から、参考例２に述べたコロニーハイブリダイゼーショ
ン法を用いて、参考例２でｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａの単離に用いたプローブと同一のプローブと会合する
陽性クローンを約１゜００個取得した。なお、ハイブリ
ダイゼーションおよびフィルターの洗浄条件は参考例２
と同様であった。このようにして得られた陽性クローン
１株が持つプラスミドｐＵＫＩＩ　（第６図参照）を単
離し、ｐｒｏ−ＵＫのシグナル・ペプチド、成長因子ド
メイン、クリングル・ドメイン領域の塩基配列をＭ１３
ファージを用いたデイデオキシ・シーフェンス法により
決定した。その結果、その塩基配列は、ホルムズ（Ｈｏ
ｌ＋ａｅｓら：バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）　３　、９２３　（１９８５）　）の報
告したものと一致していた。

この菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＥＵ
ＫＩＩ　ＦＥＲＭＢＰ−１４６４として、微工研に寄託
されている。

参考例４゜ ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｃｓＦｌ−２
およびｐＣＳＦ２の造成 （１）正常人末梢血マクロファージからのポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡの調製： 正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球をプラスチ
ックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄・除去する
ことにより、接着性の細胞であるマクロファージを単離
した。このマクロファージより、チオシアン酸グアニジ
ン−塩化リチウム法〔カサラ（Ｃａ　ｔｈａ　ｌａ）　
ら：ディーエヌエイ（Ｄ　Ｎ　Ａ　）　ｋ　３２９　（
１９８３）　）に従い、ポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下
記のごとく調製した。

正常人の末梢血４００ｍを旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯロ
ーターにて１８００ｒｐＩｌｌ、２０分間遠心して血球
を沈殿させ、これを５０１１１リン酸緩衝食塩水（Ｎａ
Ｃｊ！８　ｇ／Ｉｔ、　ＫＣｊ２０．２ｇ／Ｉｔ、無水
ＮａｔＨＰＯａ　１．１５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０，２
ｇ＃！　（ｐＨ７，２）　；以下ＰＢＳと略記する〕に
懸濁した。この懸濁液２５ｍ１をリンパ球分離液〔ピオ
ネティクス（ＢＩＯＮＩＩ！ＴｌＣ５）社製〕２５−に
重層し、Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯローターにて１８
００ｒｐｍ　、３０分間遠心した。中間層の白血球を分
取し、等量のＰｕｓで洗浄（旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯ
ローターにて１５００ｒｐ＋ｗ　、１０分間）した後、
５％の牛胎児血清を含む２０ｄのＲＰＭＩ　１６４０培
地（日永製薬社製）に＼懸濁し培養した。培養には組織
培養用フラスコ（コーニング社製）を用いた。

３７℃で１．５時間培養した後、培養上清を非接着性の
細胞とともに除去した。新たに２０１ｄの同培地と大腸
菌リボ多ｔＪ！　（ＬＰＳ）を０．３■／−となるよう
に加え、さらに３７°Ｃで４時間培養した。

次いで、培養液より１．１１００Ｘ、４°Ｃ１１０分間
の遠心によって細胞を集め、８０１ｄのＰＢＳで洗浄し
た後、５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍ１’ＩＥＤ
ＴＡ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７）お
よび８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールからなる
溶液１０ｄ中でポルテックス・ミキサーを用い可溶化し
た。

この可溶化物を遠心管に移し４ＭＬｉＣｌ１溶液８０−
を加えて撹拌した後、４℃、２０時間静置した。

Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯローターにて９．ＯＯＯｒ
ｐｍ、　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した
。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウムから
なる溶液５０１１ｄ！に懸濁し、旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲ
ＩＯローターにて９，０ＯＯｒｐｓ＋、６０分間遠心後
、再びＲＮＡを沈殿として回収した。

ＲＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（
ｐＨ７，５）からなる溶液１０ｄに溶解し、フェノール
−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収し
た。得られたＲＮＡ約０．８　ｍｇを１０ａ＋Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＩＣｆ（ｐＨ８，０）および１　ｍＷ　ｔ！ＤＴ
Ａからなる溶液ＩＩｄに溶かした。６５°Ｃ，５分間イ
ンキエベートし、０．１ａ＋１の５ＭＮａＣｌ！を加え
た。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・カラム〔ビー
・エル・バイオケミカル（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積０．５
ｍ１）にかけた。

吸着したポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを１抛ＨＴｒｉｓ
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１　ｍＭ　ＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍ　ＲＮ　Ａ
約３０ｔｔｇを得た。

（２）　　ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入
：オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方
法（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　　２．１６１　（
１９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込ん
だ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略
を第３図に示す。

上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約３ｔｒｇ、ベクター
プライマー約１．４　ｌｒｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｆ（ｐＨ８，３）、８＋ａＭＭｇＣｊ！ｚ、３０ｍＭ
　ＫＣｌ　、　０．３　ｍＭＤＴＴ、　２ｓＭ　ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰＳｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）
およびｌＯ単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２
．３犀に溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業社
製）を加え、４１’Ｃ９０分間インキュベートし、ｍＲ
ＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを６６μＭ　ｄＣＴＰおよび０．
２■ポリ（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０Ｉ１１に溶かし
、１４単位のＴｄＴ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｃａ
ｌｓ社製）を加えて３７℃２分間インキュベートし、ｃ
ＤＮＡ３’末端に２０個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反
応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈
殿により（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇＣｊ！ｚおよび
６０ｔｓＭ　ＮａＣｊ！からなる液４００ハに溶かし、
２０単位のＨｉｎｄＩ［Ｉを加え、３７°Ｃ２時間イン
キエベートし、ＢｉｎｄＩ［部位で切断した。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して
０．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープ
ライマーＤＮＡを得た。該Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２ピコモル
および前記のリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　０．４ピコモルを１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、　０．
１　Ｍ　ＮａＣ１および１　ｍＭ　ＥＤＴＡからなる溶
液１００ＩＩＩ！に溶かし、６５℃、４２℃、０°Ｃで
それぞれ１０分、２５分、　３０分間インキュベートし
た。２抛Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）＋　
　４　ｍＭ　ＭｇＣｊ２　ｚ。

１０ｍＭ　（ＮＨ，）ｚｓＯ４，０，１Ｍ　　ＫＣｊ！
およびＱ、１ｍＭβ−ＮＡＤの組成で、全景１０００Ｉ
ｔ１となるよう反応液を調製した。該反応液に２５単位
の大腸菌ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バイオラ
ブズ社製）を加え、１１°Ｃ１８時間インキュベートし
た。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、　　０．１５ｍ
Ｍ　　β−ＮＡＤとな４よう成分を追加調製し、１０単
位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）および１０単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−
ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、２
５℃で順次１時間ずつインキエベートした。上記反応で
、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され、完全な二
重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミドが生成した。

（３）　　ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの
選択： （２）で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ
６００５Ｆ　８株をスコツト（Ｓｃｏ　ｔ　ｔ）らの方
法〔重定勝哉：細胞工学２．６１６（１９８３））に従
い形質転換した。得られた約９２００個のコロニーをニ
トロセルロース・フィルター上に固定１．、ｆ、＝。

長田ら〔長田（Ｎａｇａｔａ）ら：ネイチー１−−　（
Ｎａ　ｔｕｒｅ）３１９　、４１５（１９８６））が単
離したｈＧ−ＣＳＦの成熟タンパク質のＮ末端９アミノ
酸に相当する２７塩基の合成りＮＡ ５’−ＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴ
ＣＣＣＴＧ　−３’を３寞Ｐで標識したプローブに６０
℃で強く会合した２菌株を選んだ〔グルンステイン・ホ
グネス（Ｇｒｕｎｓ　ｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方
法、プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　？２＋３９６０１９７５））
　、これらの菌株がもつプラスミドｐｃｓｐ　１−２お
よびｐＣＳＦ　２が有するｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ
１３ファージを用いたデイデオキシ・シーフェンス法に
より決定した。その結果、ｐＣＳＦ　１−２およびｐＣ
ＳＦ　２が有するｃＤＮＡは、ＫＧ−ＣＳＦをコードし
ていることが判明した。

プラスミドｐｃｓＦ　１−２を含む微生物はＥｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＥＣ５ＦＩ−２［ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１２２０）として、またプラスミドｐＣ５Ｆ　
２を含む微生物はＥｓｃｈｅｒｆ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＨＣＳＦ２　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０７３）として微
工研に寄託しである。

参考例５゜ 組換え体プラスミドｐＴｒＳ３３の造成：（１）ＡＴＧ
ベクターｐＴｒｓ２０の造成：第７図に示した手順に従
い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンの間の距離が１４塩基
で、かつＡＴＧコドンの直後に５ａｃｌサイトを有する
ＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０を造成した。

まず、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　３ｔｒｇを１０ｄ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！　（ｐＨ７，５）。

７ｍＭ　ＭｇＣｊ！□、　６ｍＭ　２−メルカプトエタ
ノールよび１００ｍＭ　ＮａＣＩｌを含む緩衝液（以下
“Ｙ−１００緩衝液”と略記する）３０にに溶かし、制
限酵素ＢａｎＩ［［と制限酵素ＮｒｕＩにューイングラ
ンド・バイオラブズ社製）をそれぞれ６単位ずつ加え、
３７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＯ
Ｔ法によりＰｔｒｐを含む約３。

断片（Ｂａｎｌｌ［−Ｎｒｕｌ断片）約Ｏ。

一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コ るために下記のＤＮＡリンカ−を 法により合成した。

８ｋｂのＤＮＡ ５ｎを得た。

トンを付与す トリエステル １９−＋ｓｅｔと１７−ａｖｅｒの合成りＮＡ　（各々
１０ピコモルずつ）を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／！　
（ｐＨ７．５）、１０＋ｓＭ　ＭｇＣ　ｊ！　ｚ５ｗＭ
ジチオスレイトール、０．　Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび
１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量２０ハの溶液に溶かし、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（全酒造社製）を加
えて、３７°Ｃで６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＫＹＰ１０由来のＢａｎｌ［−Ｎｒｕ
ｌ断片（約３．８ｋｂ）０．１ａｒと上記のＤＮＡリン
カ−約０．５ピコモルをＴ４リガーゼ緩衝液２０にに溶
かし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４°Ｃ
で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
８１０１株〔ポリバー（Ｂｏｌ　ｉｖｅｒ）ら：ジーン
（Ｇｅｎｅ）　２　、　７５（１９７７）　）を形質転
換し、ＡＰ耐性のコロニーを得た。このコロニーの培養
菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラス
ミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲ　ｌ，　Ｂａｎ■、Ｈ　
ｉｎｄ　ｍ、Ｓａｃｌ，Ｎｒｕｌで切断後、アガロース
ゲル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐＴｒ
ｓ２０と名付けた（第７図）。ｐＴｒｓ２０のＢａｎｌ
Ｉ［、旧ｎｄｌＩ［サイト付近の塩基配列は下記のとお
りであることをＭ１３ファージを用いたデイデオキシ・
シーフェンス法を用い確認した。

（２）　　ｐ　Ｔ　ｒ　Ｓ　３　３の造成：上で得られ
たｐＴｒｓ２０プラスミドＤＮＡ約３■を３０減のＹ−
０緩衝液に溶かし、１２単位のＳａｃｌを加え、３７°
Ｃで２時間消化反応を行った。さらに１．５Ｉｔａの２
ＭＮａＣｆと１０単位のＰｓｔＩを加え、３７°Ｃで２
時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後
、ＡＦＴ法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片を精製し
た。一方、特開昭６２−４８６９９号公報記載の方法で
調製したｐＫＹＰ２６　（ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌は
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＩＫＹＰ２６　　
（ＦＥＲＮＢＰ−８６３）として微工研に寄託されてい
る〕２ｇｇを３０にのＹ−１００緩衝液に溶かし、８単
位のＰｓｔＩと１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７°Ｃ
で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製し
た。

また、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｎｏｒｒａ
ｎｄｅｒ、Ｊ、ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）」Ｌ、　１０１
（１９８３）　　：　Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡは宝酒
造社より入手した）２ｇを３０犀のＹ−［１衝液に溶か
し、１０単位の５ａｃｌを加え、３７°Ｃで２時間消化
反応を行った。さらに１．５戒のＩＭＮａＣｊ！と１０
単位のＣｊ！ａ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法により
約０．６５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。これらとは別
に、第１９図に示す２種の合成りＮＡ（４３塩基と４５
塩基）をアプライド・バイオシステムズ社３ＢＯＡ　−
ＤＮＡ合成機を用いて合成し、それぞれ別々に上に述べ
た方法と同じ方法を用いて５′−リン酸化した。

このようにして得られたｐＴｒ５２０由来の約１．１５
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１　ｇ）　、ｐＫＹＰ２６由
来の約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　Ｉ　Ｊ！ＩＩ
）　、Ｍ１３＋ｐ１８由来の約０．６５ｋｂのＤＮＡ断
片（約０．０５ｇ）、および５′−リン酸化された上記
２種の合成りＮＡ（それぞれＩ　Ｐｌｌｏｌｅずつ）を
２０ｆｉのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を
行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドの混合物を
用いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株
を得た。この形質転換株からプラスミドｐＴｒＳ３３を
単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ファ
ージを用いたデイデオキシ・シーフェンス法により、ｐ
ＴｒＳ３３が目的の構造を有することを確認した（第８
図参照）。

参考例６゜ 組換えプラスミドｐＴｅｒｓ　２の造成：ｐＫＹＰ２６
プラスミドＤＮＡ　（特開昭６２−４８６９９号公報〕
約２Ｊ！ｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃｊ！　（ｐ）１８
．０）、７５＋ｍＭ　ＮａＣ１。

７ｍＭ　ＨｇＣ１ｔ、　６ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ールを含む溶液３０にに溶かし、１６単位のＡｓｐ７１
Ｂ　（ベーリンガー・マンハイム社製）と１０単位のＰ
ｓｔｌを加工、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．７
ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例５め（１）
で得られたｐＴｒｓ２０プラスミドＤＮＡ約２ｎを３０
ＩＩＩｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、８単位のＰｓｔ
ｌと１０単位のＮｒｕＩ　（ベーリンガー・マンハイム
社製）を加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。６
５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．
５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、第２０図に示す
２種の合成りＮＡ（１９塩基と２３塩基）をアプライド
・バイオシステムズ社３８０Ａ−ＤＮＡ合成機を用いて
合成し、それぞれを別々に上で述べた方法と同様の方法
を用いて５′−リン酸化した。このようにして得られた
ｐＫＹＰ２６由来の約１．７　ｋｂのＤＮＡ断片（約０
．１■）、ｐＴｒｓ２０由来の約１．１５ｋｂのＤＮＡ
断片および５′−リン酸化された２種の合成りＮＡ（そ
れぞれｌｐｍｏｌｅずつ）を２０犀の・Ｔ４リガーゼ緩
衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　、　ｐＴｅｒｍ２
を単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３フ
ァージを用いたデイデオキシ・シーフェンス法により、
ｐＴｅｒｍ　２が目的の構造を有することを確認した（
第９図参照）。

参考例７゜ 組換え体プラスミドｐ’ｒｓｐｔｏの造成：参考例１で
得られたヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｔＰ
Ａ７を持つ大腸菌Ｃ６０ＱＳＦ　８株の培養菌体から常
法によりｐｔＰＡ７　　ＤＮＡを調製した。

得られたｐｔＰＡ７　　ＤＮＡ約２ｎをＹ−１００緩衝
液３０産に溶かし、制限酵素Ｂｇｊ２　Ｉ［８単位を加
え３７℃で２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０分
間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約２．ＯＫｂのＤＮＡ
断片を精製した０次にｐＴｒＳ３３　　Ｄ　Ｎ　Ａ　（
参考例５）約２鱈を３０贋のＹ−１００緩衝液中で１０
単位の制限酵素Ｂａ＋＊ＨＩを加え、３７°Ｃで２時間
消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約２．
８ｋｂの　ＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｔＰＡ７由来の約２．ＯＫｂ
のＤＮＡ断片（約０．１　ｇ　）とｐＴｒＳ３３由来の
約２．８ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１　ｔｒｇ　）を、
全量２０順のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ５０単位を加え、４°Ｃで１８時間結合反応を
行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た、この形
質転換株からプラスミドＤ　Ｎ　ＡｐＴＳＦｌｏを単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的
の構造を存することを確認した（第１０図参照）。

参考例８゜ 組換え体プラスミドｐＴＡ４の造成： 実施例７より得られたｐＴｓＦ１０プラスミドＤＮＡ約
３ｎをＹ−０緩衝液３０ハに溶かし、１２単位の制限酵
素ＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った後
、１．５屑の３ＭＮａＣｊ！と１２単位の制限酵素Ｂｓ
ｔＥＩ［にューイングランドバイオラブス（ＮｅｉｖＥ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）社製〕を加え、さらに
６０″Ｃで２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を
用い、約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

これとは別に、大腸菌ＩＧＨＡ２　（微工研ＦＥＲＭ　
ＢＰ−４００）を培養し、培養菌体から常法によりｐＧ
Ｉ（Ａ　２プラスミドＤＮＡ　（特開昭６０−２２１０
９１号）を調製した。得られたｐＧＨＡ２ＤＮＡ約２罐
を３０Ｉ１１のＹ−１００緩衝液に溶かし、８単位のＰ
ｓｔ　Ｉと８単位のＢｇｆＩＩを加え、３７°Ｃで２時
間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約０．
７５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、ｐｔｐＡ７　ＤＮＡ　（参考例１）約３■を３０
蕨の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃｆ　（ｐＨ７，５）、
　７ｍＭ　ＭｇＣｆ　＊、　６ｍＭ　２−メルカプトエ
タノールおよび１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む緩衝液（以
下“Ｙ−１５０緩衝液′”と略記する）に溶かし、１０
単位のＢｓｔＥ　Ｉｔを加え、３７°Ｃで２時間消化反
応を行った後、１２単位のＢｓｔＥ［を加え、さらに６
０℃で２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を用い
、約１．５５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、参考例６で得られたｐＴｅｒｍ　２　Ｄ　Ｎ　Ａ
約２Ｋを３０Ｉｔ１のＹ−０緩衝液中で１２単位のＫｐ
ｎｌを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った後、１
．５ハの２ＭＮａＣＪ！、と８単位のＰｓｔｌを加え、
さらに３７°Ｃで２時間消化反応を行った。続いてＡＦ
Ｔ法を用い、約１．７　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られた４種類のＤＮＡ断片（ｐＴｓＦ
１０由来の断片０．０３ｇ、　ｐＧＨＡ２由来の断片０
．０５ｘＳｐｔＰＡ　７由来の断片０．１　ｔｒｇ　、
およびｐＴｅｒｍ　２由来の断片０．１　ｎ　）を２０
Ｉ４１のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、２００単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を
行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、−Ａｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＴＡ４を単離し、制
限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的の構造
を有することを確認した（第１１図参照）。

参考例９゜ ｔ−ＰＡ発現プ、ラスミドｐｓＥＩＰＡ　Ｉ　５Ｅ１ｄ
ｈｆｒｌ−９Ａの造成： （１）組換え体プラスミドｐＡＧＥ１０５Ｍの造成：本
発明者らによって造成されたプラスミドＥ）ＡＧＥ２Ｂ
　（水上ら：ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０１　、　１３０７−１
３１０（１９８７）　）を持つ大腸菌Ｈ８１０１株を培
養し、培養菌体から常法によりｐＡＧＥ２８　Ｄ　Ｎ　
Ａを調製した。

得られたｐＡＧＩｌ！２Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ約２Ｎを３０産
のｙ−ｉｏ。

緩衝液に溶かし、８単位のＸｈｏｌと１２単位の５ｃａ
ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約２．
８ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、本発明者らによ
って造成されたプラスミドｐＡＧＥ１０３を含む大腸菌
はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉｃ　ｃｏｌｔ　ＥＡＧＥ　１０
３（１０３（ＦＥＲ１３１２）として微工研に寄託され
ている。

〔水上ら：ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１０１．１３０７　１３１０（
１９８７））を持つ大腸菌Ｈ８１０１株を培養し、培養
菌体から常法によりｐＡＧＥ１０３　ＤＮＡを調製した
。得られたｐＡＧＥ１０３　Ｄ　Ｎ　Ａ約３Ｒを３０／
４Ｉのｙ−ｉｏｏ緩衝液に溶かし、１０単位のＥｃｏＲ
Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。フェノ
ール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈澱によ
ってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を全量４０
Ａの５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，８）
、　　５ｓ＋Ｍ　　ＭｇＣｊ！　ｚ、７ｍＭ　　２−メ
ルカプトエタノールおよびｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄ
ＧＴＰ。

ｄＣＴＰをそれぞれ１００μＨずつ含む緩衝液（以下“
ポリメラーゼ緩衝液”と略記する）に溶かし、６単位の
クレノー断片を加え、１５℃で１時間反応させることに
より、ＥＣ０ＲＩ突出末端を平坦末端に変えた。反応を
フェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出を行っ
た後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を３０７ＪのＹ−１００緩衝液に溶かし
、１２単位のＸｈｏｌを加え、３７°Ｃで２時間消化反
応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法
を用いて約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、
Ｏ’Ｈａｒａらによって造成されたプラスミドｐＫＣＲ
（０’Ｈａｒａら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　　７８．１５
２７（１９８１）　）を持つ大腸菌Ｈ８１０１株を培養
し、培養菌体から常法によりｐＫＣＲ−ＤＮＡを調製し
た。得られたｐＫＣＲ−ＤＮＡ約２Ｋを３０産のＹ−１
５０緩衝液に溶かし、１２単位のＢａｍ旧と１６単位の
Ｓａｆ　Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った
。フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール
沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を
全量４０ＩｔＩｌのポリメラーゼ緩衝液に溶かし、６単
位のクレノー断片を加え、１５℃で１時間反応させるこ
とにより、Ｂａｎ＋ＨＩ突出末端とＳａｆ　Ｉ突出末端
を平坦末端に変えた。６５℃、１０分間の熱処理の後、
ＡＦＴ法を用いて約１．８５ｋｂのＤＮＡ断片を精製し
た。このようにして得られたｐＡＧＥ２Ｂ由来の約２．
８ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５ｑ）　、ｐＡＧＥ１０
３由来の約０．４ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０３Ｒ）、
およびｐＫＣＲ由来の約１．８５ｋｂの・ＤＮＡ断片（
約０．２■）を２０／４１のＴ４リガーゼ緩衝液に溶か
し、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１
８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドの混合物を
用いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、カナマイシ
ン（以下、Ｋｍと略記する）耐性株を得た。この形質転
換株からプラスミドｐＡＧＥ１０５Ｍを単離し、制限酵
素消化による構造解析を行ったところ、目的の構造を有
することを確認した（第１２図参照）。

（２）組換え体プラスミドｐＡＧＥ１０６の造成：上で
得られたｐＡＧＢ１０５Ｍ　−Ｄ　Ｎ　Ａ約２ｎを３０
ｄのＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位の５ｃａｌを
加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１
１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．Ｏｋｂの
ＤＮＡ断片を精製した。一方、実施例１と同様の方法で
、５′−リン酸化されたＥｃｏＲ１リンカ−を調製した
。

このようにして得られたｐＡＧＥ１０５Ｍ由来の約５．
０ｋｂのＤＮＡ断片（約０．ｌ１１ｇ）と１ピコモルの
５′−リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ−を２０減のＴ
４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ　２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＡＧＥ１０６を単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＡ
ＧＥ１０６は目的の構造を有することを確認した（第１
３図参照）。

（３）　　ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐｓＥＩＰＡＩ−５
の造成二上で得られたｐＡＧＥ１０６　ＤＮＡ約２ｎを
３０．ｃＪのＹ−０緩衝液に溶かし、１２単位のＫｐｎ
ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。さらに、
１．５産の２ＭＮａＣｆｆ１と１０単位のＢａｍＨＩを
加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１
１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．０ｋｂの
ＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例１で得られたｐｔ
ＰＡ７プラスミドＤＮＡ約３Ｎを７５ｍＭ　ＮａＣｊ！
を含むＹ−Ｑ緩衝液３０産に溶かし、１２単位のＦｏｋ
ｌと、１２単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦ
Ｔ法を用いて約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、第１４図に示す２種の合成りＮＡ（２１塩基と２
１塩基） をアプライド・バイオシステムズ社３ＢＯＡ　−ＤＮＡ
合成機を用いて合成し、それぞれ別々に実施例１で述べ
た方法と同様の方法を用いて５′−リン酸化した。

このようにして得られたｐＡＧＥ１０６由来の約５．Ｏ
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　Ｉ　ｎ　）とｐ　ｔＰＡ７
由来の約０．７ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　Ｉ　Ｉ！ｇ
）　％参考例８で調製されたｐＴＡ　４由来の約１．４
　ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎｌ断片（約０．０５ｇ）、
および上で得られた５′−リン酸化された２種の合成り
ＮＡ　（それぞれｌ　ｐｍｏｌｅずつ）を２０減のＴ４
リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ　２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を°得た。こ
の形質転換株からプラスミドＤＮＡＰＳＥＩＰＡ　１−
５を単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３
ファージを用いたデイデオキシ・シーフェンス法により
、ｐｓＥＩＰＡｌ−５が目的の構造を有することを確認
した（第１４図参照）。

（４）　　ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９
の造成二上で得られたｐｓｉ！ＩＰＡ　Ｉ−５ＤＮＡ約
２Ｎを３０Ｉ！１のＹ−〇緩衝液に溶かし、１２単位の
ＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。さ
らに、１．５産の２ＭＮａＣｊ！と８単位のＢｉｎｄｌ
［Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。６５
°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．Ｏ
ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、ｐｓＥＩＰＡ　１
−５ＤＮＡ約２躍を３０１１Ｉのｙ−ｏ緩衝液に溶かし
、１２単位のＫｐｎＩを加え、３７°Ｃで２時間消化反
応を行った。さらに、１．０にの２ＭＮａＣｊｌ！とｉ
ｏ単位のＮｃｏｌを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を
行った。６５°Ｃ５１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用
いて約４．９　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また第１
５図に示す４種の合成りＮＡ（４７塩基、４９塩基、４
９塩基および４７塩基：これらの合成りＮＡはｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡの５′非翻訳領域の一部を構成する） をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ　−ＤＮＡ
合成機を用いて合成し、それぞれ別々に実施例１で述べ
た方法と同様の方法を用いて５′−リン酸化した。

このようにして得られたｐｓＥＩＰＡ　１−５由来の約
５．０ｋｂ（７）ＤＮＡ断片（約０．１　ｔｔｇ　）と
ｐｓＥＩＰＡ　１−５由来の約４．９ｋｂ（７）ＤＮＡ
断片（約０．　Ｉ　ｎ　）と５′−リン酸化された４種
の合成りＮＡ　（それぞれｌ　ｐａｒｏｌｅずつ）を２
０犀のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行っ
た。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
懇２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この形質
転換株からプラスミドＤＮＡｐｓＥＩＰＡ　１−９を単
離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ファー
ジを用いたデイデオキシ・シーフェンス法により、ｐｓ
ＥＩＰＡ　１−９が目的の構造を有することを確認した
（第１５図参照）。

（５）組換えプラ°スミドｐＵｃ１９　Ｈの造成（Ａｐ
耐性遺伝子のポータプル化）： ノルランダーらが造成したプラスミドＤＮＡｐＵｃ１９
　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ＋　Ｊ、　　ら：ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）２６゜１００１９８３）　　；　　ｐＵｃ１９７
’−ｙスミＦＤＮＡハ宝酒造社より入手できる〕を持つ
大腸菌Ｈ８１０１株を培養し、培養菌体から常法により
ｐＬｌｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。得られたｐｌＪ
ｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ約２１ｎＩを３０・腫のＹ−５０緩
衝液に溶かし、１０単位のＨｉｎｄｎｌと１単位のＤｒ
ａｌを加え、３７°Ｃで１時間消化反応を行った。この
反応により、ＤＮＡはＨｉｎｄ■で完全に、Ｄｒａｌで
部分的に消化された。６５℃、１０分間の熱処理後、Ａ
ＦＴ法を用い、約１．５５ｋｂのＨｉｎｄＩ［［−Ｄｒ
ａｌ断片と約１．１ｋｂのＤｒａｌ−ＨｌｎｄｌＩ［断
片の２種のＤＮＡ断片を精製した。別に、２０ピコモル
（ｐｍｏｌｅｓ）のＨｉｎｄｌｌｌリンカ−（ＣＡＡＧ
ＣＴＴＧ　；コラボレイテイフ゛・リサーチ社製）を実
施例１で述べた方法と同様の方法を用いて５′−リン酸
化した。

このようにして得られたｐＵｃ１９由来の約１．５５ｋ
ｂのＤＮＡ断片（０，０３ｇ）と約１．１　ｋｂのＤＮ
Ａ断片（０，０３ｘ）および１ピコモルの５′−リン酸
化されたＨｉｎｄｌ［［リンカ−を２０産のＴ４リガー
ゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ　２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＵｃ１９　Ｈを単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的
の構造を有することを確認した（第１６図参照）。

（６）　　組換え体プラスミドｐｓＨＩＰＡ１−９Ａの
造成（ｐｓＢＩＰＡｌ−９へのＡｐ耐性遺伝子の挿入）
８上で得られたｐＵｃ１９　ＨプラスミドＤＮＡ約２犀
を３０ＩＩｔｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、８単位のＨ
ｉｎｄｌ［と８単位のＰｖｕＩＩを加え、３７°Ｃで２
時間消化反応を行った。フェノール抽出とクロロホルム
抽出の後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を全量４０産のポリメラーゼ緩衝液
に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５°Ｃで１
時間反応させることにより、Ｈｉｎｄｌ［［突出末端を
平坦末端に変えた。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１、
４　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得られた
ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐｓＩｌ！ＩＰＡ　Ｉ　−９約
２Ｎを３０度のＹ−１５０緩衝液に溶かし、８単位のＸ
ｈｏＩと８単位のＥｃｏＲＶを加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ
法を用いて約５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また
、上で調製したｐＡＧＥ２ＢプラスミドＤＮＡ約３■を
３０ｐｔＩのＹ−１５０緩衝液に溶かし、１０単位のＸ
ｈｏｌとｌＯ単位のＥｃｏＲＶを加え、３７°Ｃで２時
間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、Ａ
ＦＴ法を用いて約０．８５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した
。

このようにして得られたｐＵｃ１９　Ｈ由来の約１．４
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）とｐｓＥＩＰＡ　Ｉ−
９由来の約５．９　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）と
ｐＡＧＥ２Ｂ由来の約０．８５ｋｂのＤＮＡ断片（約０
．０５ｇ）を２０犀のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１
００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時
間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ　２９４株を形質転換し、ＡｐとＫｍの両方に耐性
になった株を得た。この形質転換株からプラスミドＤＮ
Ａ　ｐｓＥＩＰＡ　１−９＾を単離し、制限酵素消化に
よる構造解析を行ったところ、目的の構造を有すること
を確認した（第１７図参照）。

プラスミドＤ　Ｎ　ＡｐＳＥＩＰＡｌ−９八を含む微生
物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＥｈＰＡｌ−
９Ａ　　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４６０として昭和６２年９
月３日付で微工研に寄託しである。

（７）組換え体プラスミドｐｓＨ１ｄｈｆｒｌＡの造成
８上で得られ、たｐＡＧＥ１０６プラスミドＤＮＡ約２
可を３０産のＹ−５０緩衝液に溶かし、１２単位のＡｓ
ｐ７１Ｂ（ベーリンガー・マンハイム社製）　ヲ加え、
３７°Ｃで２時間消化反応を行った。フェノール抽出と
クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿によってＤＮＡ
断片を回収した。このＤＮＡ断片を全量４０産のポリメ
ラーゼ緩衝液に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、
１５°Ｃで１時間反応させることにより、Ａｓｐ７１Ｂ
突出末端を平坦末端に変えた。続いてフェノール抽出と
クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿によって回収し
たＤＮＡ断片を全量３０／ＩＪのＹ−１５０緩衝液に溶
かし、１０単位のＭｆｕＩを加え、３７°Ｃで２時間消
化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦ
Ｔ法を用いて約３．３ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

これとは別に、ｄｈｆｒ遺伝子を選ぶｐＳＶ　２　ｄｈ
ｆｒプラスミドＤＮＡ　（スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉ）ら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー（ｔ’Ｉｏｌｌ　、Ｃｅｌ　１　、Ｂｉｏｌ、）上
、８５４　（１９８１））約３Ｋを３０踵のＹ−１００
緩衝液に溶かし、１２単位のＢｇｆｎを加え、３７°Ｃ
で２時間消化反応を行った。フェノール抽出とクロロホ
ルム抽出の後、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を回
収した。このＤＮＡ断片を全量４０産のポリメラーゼ緩
衝液に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５°Ｃ
で１時間反応させることにより、８ｇ２■突出末端を平
坦末端に変えた。続いて、フェノール抽出とクロロホル
ム抽出の後、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡ断
片を全量３０産のＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位
のＨｉｎｄｌｌ［を加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて
約０．７５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。また、上で得
られたｐｓｇｔｐａ　１−９ＡプラスミドＤＮＡ約３Ｎ
を３０ハのＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位のＨｉ
ｎｄ　ＩＩＩを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行っ
た。さらに、１、５　ｐＩのＩＭＮａＣＩ！、と１２単
位のＭＩｌｕｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約
２．９ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＡＧＥ１０６由来のＤＮＡ断
片（約０．　Ｉ　ｎ　）とｐＳＶ　２　ｄｈｆｒ由来の
ＤＮＡ断片（約０．０３ｇ）とｐｓＥＩＰＡ　１−９Ａ
由来のＤＮＡ断片（約０．１ｇ）を２０ｐｔ！のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った
。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡｐＳＥ１ｄｈｆｒｌＡを
単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、
目的の構造を有することを確認した（第１８図参照）。

（８）組換え体プラスミドｐｓＨＩＰＡ１ｓＢ１ｄｈｆ
ｒｌ−９Ａの造成： 上で得られたｐｓ！！１ｄｈｆｒｌＡプラスミドＤＮＡ
約３可を３０雇のＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位
のＸｈｏｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈
殿によってＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を全量４０戚のポリメラーゼ緩衝液に溶
かし、６単位のクレノー断片を加え、１５℃で１時間反
応させることにより、ＸｈｏＩ突出末端を平坦末端に変
えた。続いて、フェノール抽出とクロロホルム抽出の後
、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡ断片を全量３
０Ｉ４ＩのＹ−１５０緩衝液に溶かし、１２単位のＭＩ
ｌｕＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約４．４
　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

これとは別に、上で得られたｐｓＥＩＰＡ　１−９Ａプ
ラスミドＤＮＡ約３ｎを３０Ｉ１１のＹ−５０１１衝液
に溶かし、１２単位のＣＩ！、ａＩを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。フェノール抽出とクロロホルム
抽出の後、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を全量４０産のポリメラーゼ緩衝液
に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５°Ｃで１
時間反応させることにより、Ｃ１ａｌ突出末端を平坦末
端に変えた。

続いて、フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタ
ノール仕殿によって回収したＤＮＡ断片を全量３０Ｉｌ
ａのＹ−１５０緩衝液に溶かし、１２単位のＭＩｌ、ｕ
Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５°Ｃ
１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約６．７５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＢ１ｄｈｆｒｌＡ由来のＤ
ＮＡ断片（約０．ＩＪｌｇ）とｐｓＥＩＰＡ　１−９Ａ
由来のＤＮＡ断片（約０．１鱈）を２０産のＴ４リガー
ゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ　ｐｓＥＩＰＡ　ｌ５Ｅ
１ｄｈｆｒｌ−９八を単離し、制限酵素消化による構造
解析を行ったところ、目的の構造を有することを確認し
た（第１８図参照）。

参考例１０゜ ｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＡＳ３−３の造成：（第
１９および２０図参照）。

（１）　　組換え体プラスミドｐＣ５Ｆ３−３の造成：
参考例４で得たｐＣＳＦ　２．２河を２０Ｐ１のＹ−１
５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＳａＩ！、■を１０単位
加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。その後、制
限酵素ＡｐａＬＩを５単位加え、３７°Ｃでさらに１０
分間部分切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法に
より、約４．ＯＫｂのＤＮＡ断片Ｃ３ａｌ　Ｉ　−Ａｐ
ａＬ　Ｉ断片）約１．５４を得た。

一方、ｈＧ−ＣＳＦの翻訳領域を完全に含むｃＤＮＡを
得るために、下記に示した３つのＤＮＡリンカ−を合成
した。

（本頁以下余白） 上に示した２９ａ＋ｅｒ、　３１ｍｅｒ、　３２ｍｅｒ
、　３０ｍｅｒおよび３９ｓ＋ｅｒ（２種）の−末鎖Ｄ
ＮＡは、アプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ−Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成した。

互いに相補的な２９ｍｅｒと３１ｍａｒは各々２０ピコ
モルずつを４０Ｉｌｔ！の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ
　（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭＭｇＣｌ１ｔ、　５ｍＭ
　ＤＴＴ、　０．ｉｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　Ａ
ＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４キナーゼ緩
衝液”と略記する）に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ６単位を加えて、３７°Ｃで６０分間リン酸化反
応を行った。互いに相補的な３２ｍａｒと３０＋＋＋ｅ
ｒおよび３９ｎ＋ｅｒ同志についても同様にしてリン酸
化反応を行った。

上記で得られたｐｃｓＰ　２由来の５ａｆｆｉｌ　−Ａ
ｐａＬｌ断片（約４．０Ｋｂ）　０．１ＭをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液３０産に溶かした後、上記３組のＤＮＡ
リンカ−を２ピコモルずつ加えた。さらにＴ４ＤＮＡ４
ＤＮＡリガーゼ４００単、４℃で１８時間結合反応を行
った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐ耐性株を取得した。該形質転換株よりプラスミドＤＮ
Ａを単離し、制限酵素切断による構造解析を行った結果
、目的とするプラスミドＤＮＡ５ｐＣ５Ｆ３−３である
ことを確認した。

（２）　　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ発現プラスミドルｓ［！
ＩＧＣ３−３の造成： 前項で得たｐＣＳＦ３−３．３Ｎを４０戚のｙ−ｏ緩衝
液に溶かし制限酵素Ｄｒａ１１０単位を加えて、３７°
Ｃで２時間消化反応を行った。ＮａＣｌ濃度が１５ＯＲ
ＩＭになるようにＮａＣ１２を添加し、制限酵素５ａｆ
ｆｉｌを１０単位加えて、３７°Ｃでさらに２時間切断
反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により約０．７
ＫｂのＤＮＡ断片（ＤｒａＩ−３ａｆＩ断片）約０．６
　ｎを得た。これとは別に、参考例９で得たｐＡＧＥ１
０６．２題を３０産のＹ−０緩衝液に溶かし制限酵素Ｓ
ｍａｉｌＯ単位を加え、３７°Ｃで２時間切断反応を行
った。その後、ＮａＣｊ！濃度が１５０ｍＭになるよう
にＮａＣｊ！を添加し、制限酵素Ｓａｊ！Ｉを・１０単
位加えて、３７°Ｃでさらに２時間切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により約５．ＯＫｂのＤＮＡ断
片（Ｓｍａ　Ｉ　−５ａｌＩ断片）約１．５　ｎを得た
。

次に上記で得た、ｐｃｓＦ　３−３由来のＤｒａｌ　−
３ａｆ断片（約０．ｌｂ）約０．６ｎとｐＡＧＥ１０６
由来のＳｍａＩ−３ａｆｌ断片（約５．ＯＫｂ）約１．
０■をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５産に溶かし、４０
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃ１８時間結
合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Ａ
ｐ耐性株を取得した。該形質転換株よりプラスミドを単
離し、制限酵素切断による構造解析を行った結果、目的
とするプラスミドＤＮＡ、　ｐｓＥＩＧｃ　３−３であ
ることを確認した。

（３）　　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ発現プラスミドｐＡＳ３
−３の造成：ｐｃｆＴＡＬ　（参考例１５参照）５ｇを
５０犀のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌｌおよびＢａｍＨＩを各々１０単位加え、３７°Ｃ
で２時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法に
より約１．６にｂのＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄｌ［Ｉ−Ｂａ
ｍＨＩ断片）１■を得た。この約１．６　ＫｂのＤＮＡ
断片ｌ遁を５０産のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵
素ｐｄｅＩ（東洋紡績社製）を１０単位加え３７℃で２
時間消化反応を行った。フェノール・クロロホルム抽出
およびエタノール沈殿でＤＮＡを回収し、３０産のクレ
ノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼ■・クレノー
断片を２単位加えて３７℃で１時間反応を行った。６８
℃で１０分間処理しＤＮＡポリメラーゼ■・クレノー断
片を失活させた後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した
。

回収したＤＮＡは２０顧のに一５０緩衝液に溶かし制限
酵素Ａａｔｎ　（東洋紡績社製）１０単位を加えて３７
°Ｃ２時間切断反応を行った。この反応液よりＬＯＴ法
により約０．２ＫｂのＤＮＡ断片（ＤｄｅＩ（平坦末端
）−ＡａｔＩＩ断片）約０．１　ｇを得た。

別に前項で得たｐｓＥＩＧｃ　３−３の２Ｎを２０ＩＩ
ｉのに一５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＡａｔＩ［（東
洋紡績社製）１０単位を加え、３７°Ｃで２時間消化反
応を行った。その後、制限酵素Ｘｈｏｌを１０単位加え
、３７℃でさらに２時間消化反応を行った。この反応液
よりＬＧＴ法により約０．８ＫｂのＤＮＡ断片（Ａａｔ
　ＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片）約０．１ｎを得た。

一方、参考例９で得たｐｓＥＩＰＡｌｓＥｌｄｈｆｒｔ
−９Ａの２１℃ｇを２０ｐａのＹ−０緩衝液に溶かし、
制限酵素Ｓｍａｌを１０単位加え、３７°Ｃで２時間消
化反応を行った。その後、ＮａＣ１Ａ濃度が１００ｍＭ
になるようにＮａＣＩｌを添加し、制限酵素Ｘｈｏｌを
１０単位加え、３７℃でさらに２時間消化反応を行った
。

この反応液からＬＧＴ法により約８．７ＫｂのＤＮＡ断
片（Ｓｅａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片）約１河を得た。

上記のようにして得たｐＣｆＴＡ　１由来のＤｄｅｌ（
平坦末端）、Ａａｔｎ断片（約０．２　Ｋｂ）約０．１
．５ｐｓＥＩＧｃ　３−３由来のＡａｔ　Ｕ　−Ｘｈｏ
　Ｉ断片（約０．８Ｋｂ）約０．１　ｇ、、ｐｓＩＥＩ
ＰＡ　ｌ５Ｅ１ｄｈｆｒｌ−９Ａ由来のＳａｇａ　Ｉ　
−Ｘｈｏ　Ｉ断片（約８．７Ｋｂ）約１ｇを３０腫のＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶かし４００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った
。該反応液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、
Ａｐ耐性株を得た。該形質転換株よりプラスミドを単離
し、制限酵素切断による構造解析を行った結果、目的の
構造を有するプラスミドＤ　Ｎ　ＡＳｐＡＳ３−３であ
ることを確認した。

参考例１１゜ 組換え体プラスミドｐＵＫＡ　２の造成：参考例２で得
られたヒトｐｒｏ−υＫｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＵ
Ｋ１を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株から常法によりｐＵ
ＫＩ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。得られたｐＵＫＩＤＮＡ
約２ＩｆｇをＹ−１００緩衝液３０Ｉｌ＆に溶かし、８
単位の制限酵素Ｎｃｏ　Ｉと８単位の５ｔｕＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．２　ｋｂのＤＮＡ断
片を精製した。一方、参考例５で得られたｐＴｒｓ３３
プラスミドＤＮＡ約２眉を１０＋ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ２　（ｐＨ７，５）、２５ｍＭ　ＭＣＩ、　７ｍＭ　
ＭｇＣｊ！ｚ、　６ｍＭ　２−メルカプトエタノールを
含む溶液（以下、“Ｋ−２５緩衝液“と略称する）　３
０Ｉｌ＆に溶かし、１６単位の制限酵素Ｓｍａ　Ｉを加
え、３０℃で２時間消化反応を行った。続いて１．５踵
のＩＭＮａＣ／：と１０単位のＮｃｏ　Ｉを加え、さら
に３７℃で２降間消化反応を行った。６５℃、１０分間
の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約２．８５ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した。

このようにして得られたｐＵＫ　１由来の約１．２ｋｂ
のＤＮＡ断片（約０．０５ｇ）とｐＴｒＳ３３由来の約
２．８５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１Ｎ）を、全量２０
／１１のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１００単位を加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行
った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ、ｐＵＫＡ２を単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的の構
造を有することを確認した（第２１図参照）。

参考例１２゜ 組換え体プラスミドｐＵＫＢ１０１の造成：上で得られ
たｐＵＫＡ　２プラスミドＤＮＡ約２ｎをＹ−０緩衝液
３０ｐ＆に溶かし、１２単位の制限酵素Ｋｐｎｌを加え
、３７°Ｃで２時間消化反応を行った。

続いて１，５にの２ＭＮａＣｊ！と１０単位のＮｃｏ　
Ｉを加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例５で得られ
たｐＴｒＳ３３プラスミドＤＮＡ約２Ｋを３０産のに一
２５緩衝液に溶かし、１６単位のＳｎ＋ａｌを加え、３
０℃で２時間消化反応を行った。続いて１．５ｐＩＩの
２ＭＮａＣｆと１０単位のＰｓｔｌを加え、さらに３７
°Ｃで２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。

また、参考例６で得られたｐＴｅｒ＋ｗ２プラスミドＤ
ＮＡ約２罐を３０犀のＹ−０緩衝液に溶かし、１２単位
のＫｐｎｌを加え、３７で２時間消化反応を行った。

続いて１．５戚の２ＭＮａＣｊ！と１０単位のＰｓｔｌ
を加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６５
°Ｃ１１Ｏ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．７
　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、下記２種の合成
りＮＡ　（４１ｍｅｒと４５ｎ＋ｅｒ）をアプライド・
バイオシステムズ社３８０Ａ−ＤＮＡ合成機を用いて合
成した。

５’−ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＧＡＧ
ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣ−３’　　（
４１ｍｅｒ）３’　−ＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡ
＾↑ＧＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＴ
ＧＧＴＡＣ−５’　（４５ｍｅｒ）これらの合成りＮＡ
を２０ピコモル（ｐｍｒｏｌｅｓ）ずつ別々に、２０減
のＴ４キナーゼ緩衝液中で５単位のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加え、３７°Ｃで３０分間反応させること
により、合成りＮＡの５′末端をリン酸化した。

このようにして得られたｐＵＫＡ　２由来の約１．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．０５ｇ）　、ｐＴｒＳ３３由来
の約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５ｇ）　、ｐ
Ｔｅｒｎ＋　２由来の約１、７　ｋｂのＤＮＡ断片（約
０．０５ｇ）、および５′リン酸化された２種の合成り
ＮＡ　（１ピコモルずつ）を全量２０ハのＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ、ｐｔｌＫＢｌｏｌを単
離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３デイデ
オキシ・シーフェンス法による塩基配列決定を行ったと
ころ、ｐＵＫＢ　１０１は目的の構造を有することを確
認した（第２２図参照）。

参考例１３゜ ヒトｐｒｏ−ＬＩＫ発現プラスミドｐｓＥＩＵＫｐｒｏ
ｌ−ＩＡの造成＝（１）　　組換えプラスミドｐＵＫＦ
　２の造成：参考例３で得られたｐＵＫ１１プラスミド
ＤＮＡ約３ｎを３０産のＹ−１００緩衝液に溶かし、１
２単位のＮｅｏ　Ｉと１２単位のＨｉｎｄｌｕを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１−１０分
間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．４５ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。

一方、実施例１１の（１）で得られたｐＵＫＡ　２プラ
スミドＤＮＡ約２４を３０ＩＩ＆のＹ−０緩衝液に溶か
し、１０単位のＫｐｎｌを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。続いて１．５　戒の２ＭＮａＣ／！とｉｏ
単位のＮｃ。

Ｉを加え、さらに３７°Ｃで２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．
２ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、参考例６で得ら
れたｐＴｅｒｔａ　２プラスミドＤＮＡ約２■を３０戚
のＹ−０緩衝液に溶かし、１０単位のＫｐｎＩを加え、
３７°Ｃで２時間消化反応を行った。続いて１．５犀の
２ＭＮａＣｊ！と８単位のＨｉｎｄＩ［Ｉを加え、さら
に３７°Ｃで２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０
分間の熱処理後、Ａ、、ＦＴ法を用いて約２．８５ｋｂ
のＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得ら−れたｐＵＫ１１由来の約０．４５
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０２．ａｖ）　、ｐＵＫＡ２
由来の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５／／ｇ）
　、およびｐＴｅｒｍ　２由来の２．８５ｋｂのＤＮＡ
断片（約０．０５■）を全量２０戚のＴ４リガーゼ緩衝
液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４
°Ｃで１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、ＡＰ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ、　ｐＵＫＦ２を単離し
、制限酵素消化による構造解析を行っタトころ、ｐＵＫ
Ｆ　２は目的の構造を有することを確認した（第２３図
参照）。

（２）組換えプラスミドｐＵＫＦｐｒｏの造成：上で得
られたｐＵＫＦ　２プラスミドＤＮＡ約２Ａｒを３０犀
の２５ｍＭ　ＮａＣｌ１を含むｙ−ｏ緩衝液に溶かし、
ｌＯ単位のＢｓ５Ｈｎ　にューイングランド・バイオラ
ブズ社製）を加え、５０°Ｃで２時間消化反応を行った
。続いて１．０産の２Ｍ　ＮａＣｌ！とｌＯ単位のＨｉ
ｎｄｌ［Ｉを加え、さらに３７°Ｃで２時間消化反応を
行った。、６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を
用いて約４．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、下
記６種の合成ｐ　Ｎ　Ａ　（３９ｍｅｒ、４１ｍｅｒ、
　４１ｍｅｒ、３９ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１７ｍｅｒ）
を上で述べた方法に従い、合成および５′−末端のリン
酸化を行った。

５’−ＡＧＣＴＴＧＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣ
ＧＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧ−３’（３９ｍａ
ｒ）３’　−ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＡＣＧＡ（：　ＣＧＣ
ＧＣ−５’　　（１７ａ＋ｅｒ）このようにして得られ
たｐＵＫＦ　２由来の約４．３ｋｂのＤＮＡ断片（約０
．１　ｔｒｇ　）と５′−リン酸化された６種の合成り
ＮＡ　（１ピコモルずつ）を全量２０度のＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、、４°Ｃで１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐｍ耐性株得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ％ｐＵＫＦｐｒｏを単離
し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３デイデオ
キシ・シーフェンス法による塩基配列決定を行ったとこ
ろ、ｐＵＫＰｐｒｏは目的の構造を有することを確認し
た（第２４図参照）。

（３）組換え体プラスミドｐＳｔ！ＩＵＫｐｒｏｌ−Ｉ
Ａの造成：参考例９で得られたｐｓＥＩＰＡｌ−９Ａプ
ラスミドＤＮＡ約２ｎを３０Ｉ４ＩのＹ−０緩衝液に溶
かし、１０単位のＫｐｎｌを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。

続いて１．５犀の２ＭＮａＣｊ！と１０単位のＨｉｎｄ
　Ｉ［Ｉを加え、さらに３７°Ｃで２時間消化反応を行
った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い
て約６．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得
られたｐｌＪＫＦｐｒｏプラスミドＤＮＡ約３Ｎを３０
産のｙ−。

緩衝液に溶かし、１５単位のＫｐｎｌを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。続いてｔ、ＳＩｌ＆の２Ｍ　
ＮａＣ１と１０単位のＨｉｎｄＩ［［を加え、さらに３
７°Ｃで２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間
の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．５５ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＥＩＰＡｌ−９Ａ由来の約
６．３ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１　ｎ　）とｐＵＫＦ
ｐｒｏ由来の１．５５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５１
！ｇ）を全量２０〜のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１
００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時
間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ　ｐｓＥＩＵＫｐｒｏｌ
−ＩＡを単離し、制限酵素消化による構造解析を行った
ところ、ｐｓＥｌｌｌＫｐｒｏｌ−ＩＡは目的の構造を
有することを確認した（第２５図参照）。

参考例１４゜ １）ヒトＬＴｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｔ、ｔ　１の
単離： （１）　　ＬｕｋＩ［細胞よりのポリ（Ａ）ＲＮＡの調
製：ヒトリンパ芽球様細胞株Ｌｕｋｎより、チオシアン
酸グアニジン−塩化リチウム法〔カサラ（Ｃａｔｈａｌ
ａ）ら：ディーエヌエイ（ＤＮＡ）２゜３２９　（１９
８３））に従い、ポリ（Ａｏ）を有するＲＮＡを下記の
ごとく調製した。

ヒトリンパ芽球様細胞株Ｌｕｋｌｌ（ベリッシュ・ワイ
・ルピン（Ｂｅｒｉｓｈ　Ｙ、Ｒｕｂｉｎ）ら：プロシ
ーディング・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、）ＵＳＡ井、　６６３７　（１９８５）　）を、５％
の牛胎児血清と１ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−Ｎ′−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）を
含む１１．のＲＰＭ１１６４０培地（田水製薬社製）に
、８　ＸＩＯ’　／ｄとなるように接種し、増殖させた
。培養にはスピンナー・カルチャー・ボトルを用いた。

３７℃で４８時間培養した後、遠心によって細胞を集め
、ｌｏｎｇ／Ｉｎ１のフオルボ−ル・ミリステート・ア
セテート（ＰＭＡ；Ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔ
ｅ　ａｃｅｔａｔｅ）と５％の牛胎児血清とｌ　ｍＭ　
　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓを含む、新しい１１のＲＰＭ１１６
４０培地に移し、さらに３７°Ｃで４８時間培養した。

続いて、この細胞懸濁液の一部（２５０ＩＩＩｉ）から
１，１１００Ｘ、４°Ｃ，１０分間の遠心によって細胞
を集め、８０ｄのリン酸塩バッファーで洗浄した後、５
Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　、
５０．ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／！　（ｐＨ７）および８
％（Ｖ／Ｖ）　　２−メルカプトエタノールからなる溶
液１０ｄ中でポルテックス・ミキサーを用い可溶化した
。この可溶化物を遠心管に移し、４Ｍ　　ＬｉＣｌ溶液
８０戚を加えて撹拌した後、４°Ｃｌ２Ｏ時間静置した
。Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰ　ＲＩＯローターにて９．００
Ｏｒｐｍ、　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収
した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウム
からなる溶液５０＃！１！に懸濁し、旧ｔａｃｈｉＲＰ
Ｒ１０ローターにて９．０００ｒｐａ＋、　６０分間遠
心後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿
を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ７，５）
からなる溶？［０ｔｒｄｌに溶解し、フェノール−クロ
ロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得
られたＲＮＡ約２．５ｍｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ８，０）およびＩ　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡからな
る溶液１ｒｎ１に溶かした。

６５°Ｃ，５分間インキュベートし、０．１　ｍの５Ｍ
ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース
・カラム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−ＬＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製〕クロマトグラフィー（カラム
体積０．５ｍ）にかけた。吸着したポリ（Ａ）を有する
ｍＲＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ７，
５）および１ｅ＋ＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
リ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１００ｎを得た。

（２）　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成と該ＤＮＡのベクターへ
の挿入： オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法
〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ４　（
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　　２．１６１　（
１９８２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込
んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概
略を第３図に示す。

上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２ｎ、ベクターブラ
イマー約１．４■を５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ｆ！　（ｐ
Ｈ８，３）、　　８ｍＭ　ＦＩｇＣｆｌｔ、　３０ｍＭ
　ＫＣｊ！、　０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、　　２ｍＭ　ｄ
ＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣ
ＴＰ）および１０単位のりボヌ　クレアーゼインヒ　ビ
ター（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からな
る溶液２２．３にに溶解し、ｌＯ単位の逆転写酵素（生
化学工業社製）を加え、４１°Ｃ９０分間インキエベー
トし、ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。

該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクター
プライマーＤＮＡを回収した。

該ＤＮＡを６６、ｍ　　ｄＣＴＰおよび０．２Ｎポリ（
Ａ）を含むＴｄＴＩｌ衝液２０ｐ１に溶かし、１４単位
のＴｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）を加えて３７°Ｃ２分間インキエベートし、ｃ、ＤＮ
Ａ３’末端に２０個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿に
より（ｄＣ）鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマ
ーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１Ｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、６　ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ
および６０ｍＭ　ＮａＣｊ！からなる液４００Ｉ１１に
溶かし、２０単位のＨｉｎｄｌ［Ｉを加え、３７℃２時
間インキュベートし、Ｈｉｎｄｌ［部位で切断した。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿して０．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベク
ターブライマーＤＮＡを得た。・該ＤＮＡ０．２ピコモ
ルおよび前記のリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　０．４ピコモルを
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　０．
１　Ｍ　ＮａＣｊ！および１　ｒａ　ＭＥＤＴＡからな
る溶液１００産に溶かし、６５°Ｃ１４２°Ｃ，Ｏ゛Ｃ
でそれぞれ１０分、２５分、３０分間インキュベートし
た。　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、
　　４ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ＋１０ｍＭ　（ＮＨａ）ｚｓＯ
４，０，１Ｍ　　ＭＣＩおよび０．１ｍＭβ−ＮＡＤの
組成で、全量１０ＯＩＩ＆となるよう反応液を調製した
。該反応液に２５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼにューイ
ングランド・バイオラプズ社製）を加え、１１°Ｃ１８
時間インキュベートした。該反応液を各４０ｕＭのｄＮ
ＴＰ、　０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤとなるよう成分を
追加調製し、１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、　２０
単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および１０単位の大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨ（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）を加え、１２°Ｃ１２５℃で順次１時間ずつインキエ
ベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
の環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮ
Ａに置換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミ
ドが生成した。

（３）　　ヒトＬＴｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択
： （２）で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６０
０ＳＦ８株〔カメロン（Ｇａｍｅｒｏｎ）　：プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
）ＵＳＡ７２．３４１６　（１９７５）　）を５ｃｏｔ
ｔう（７）方法〔重定勝哉：細胞工学２．６１６　（１
９８３））に従い形質転換した。得られた約３０．００
０個のコロニーをニトロセルロース・フィルター上に固
定した。ジェネンテク（Ｇｅｎｅｎ　ｔｅｃｈ　）社が
単離したヒトＬＴｃＤＮＡ（バトリック・ダブリュー・
グレイ（Ｐａｔｒｉｃｋ　Ｗ、Ｇｒａｙ）ら：ネイチ＋
　−（Ｎａｔｕｒｅ）３１２　７２１　（１９８４）　
）の５′非翻訳領域の一部の塩基配列と一部する１７ｓ
＋ｅｒの合成りＮＡ５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧ
ＣＣＴＧ−３’を′Ｐで標識したプローブに５２°Ｃで
強く会合した１菌株を選んだ〔グルンステイン・ホグネ
ス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、
プロシーディングφオプ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　　？２＋３９６１　（１９７５）
　）。この菌株が持つプラスミドｐＬＴ１のｃＤＮＡの
全塩基配列を、Ｍ１３ファージを用いたデイデオキシ・
シーフェンス法により決定した。その結果、ｐＬＴ　１
のｃＤＮＡはヒトＬＴをコードしていることが判明した
。

２）組換え体プラスミドｐＬＡ　１の造成（第２６図参
照）： 前項の方法によって得たｐＬＴ　１　（４，７ｋｂ）　
　５硝を全量５０犀のＹ−０緩衝液に溶かし、制限酵素
ＸｈｏＩＩ（ベーリンガーマンハイム社製）１０単位を
加えて、３７°Ｃで２時間切断反応を行った。次イテ、
ＮａＣｌを終濃度１５０ｍＭとなるように加え、制限酵
素Ｎ５ｉＩにューイングランド・バイオラブズ社製）１
０単位を加え、３７°Ｃでさらに３時間切断反応を行っ
た。反応液からＬＧＴ法によりヒトＬＴＤＮＡの大部分
を含む約７５０ｂｐのＤＮＡ断片（ＸｈｏＩＩ−Ｎｓｉ
　Ｉ断片）約０．３可を得た。

別に、ｐＬＴ　１２０Ｊ！ｇを２００７４！のＹ−５０
緩衝液に溶かし、制限酵素Ｈａｅ　ｍ　４０単位を加え
て、３７°Ｃで２時間切断反応を行った。

次いで、ＮａＣｌを終濃度１５０ｍＭとなるように加え
、Ｎ５ｉ１４０単位を加え、３７°Ｃでさらに３時間切
断反応を行った。反応液からポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により、ヒトＬＴのＮ末端部分を含む約５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＨａｅＩ［Ｎａｔｌ断片）約４０ｎｇ
を得た。

一方、ｐＧＥＬ　１　（３，４ｋｂ）　　３　ｔｒｇを
全量３０濯のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素５ｔ
ｕＩと制限酵素ＢｇｆＩＩそれぞれ６単位ずつを加え３
７°Ｃで３時間切断反応を行った。

この反応液からＬＣ，Ｔ法によりＡｐ耐性遺伝子を含む
約２．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｓｔｕｌ−Ｂｇｚｎ断片）
約１．０河を得た。

次に上記で得りｐＬＴ１由来（７）Ｘｈｏｌ［−Ｎｓｉ
　Ｉ断片（約７５０ｂｐ）　０．２　ｇおよびＨａｅｍ
　−Ｎｓｉ　１断片（約５０ｂｐ）　２０ｎｇとｐＧＥ
Ｌ　１由来の５ｔｕＩ　　Ｂｇｉｍ断片（約４．３　ｋ
ｂ）　０．６　Ａｒを全量２０にのＴ４リガーゼ緩衝液
に溶かし、この混合溶液にさらに２単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（全酒造社製）を加え４°Ｃ１８時間反応を行っ
た。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｍ　４３０株
をコーエンらの方法により形質転換し、Ａｐ耐性コロニ
ーを得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知
の方法に従って分離精製し、該プラスミドＤＮＡを５ｔ
ｕＩ等の制限酵素で切断することによりプラスミドの構
造解析を行った。

その結果、目的のプラスミドが得られたことを確認した
。この組換え体プラスミドをｐＬＡ　１と呼ぶ。

３）ＬＴ発現プラスミドｐＬＳＡ　１の造成（第２７図
参照）： 前項により得られたｐＬＡ　１　（３，１ｋｂ）をもつ
大腸菌ＫＭ４３０株を培養し、培養菌体から常法により
ｐＬＡＩＤＮＡを調製した。得られたｐＬＡＩＤＮＡ　
　３鱈をＹ−１０１緩衝液３０パに溶かし、Ｓ　ｔｕ　
ＩとＢｇｆＩＩそれぞれ３単位ずつを加え３７°Ｃで３
時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
ヒトＬＴ遺伝子の大部分を含む約７９０ｂｐのＤＮＡ断
片（Ｓｔｕｌ−ＢｇｆＩ［断片）約０．５　ｇを得た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　３〜をＹ−１００緩衝液３０雇に
溶かし、制限酵素Ｂａｎｎ［と制限酵素ＰｓｔＩをそれ
ぞれ６単位ずつを加え　３７°Ｃで３時間切断反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法によりトリプトファンプ
ロモーター（Ｐ　ｔｒｐ）を含む約１．１　ｋｂのＤＮ
Ａ断片（ＢａｎｌｌＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片）約０．６　
ｔｓを得た。

また、ｐＧＥＬｌ　（３，４ｋｂ）　２．ｇをＹ−１０
０緩衝液２０ハに溶かし、制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉ、　
ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３
７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法によりリポプロティン由来ターミネータ−を含む約１
．７　ｋｂのＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ　−ＢａｍＨＩ断片
）約０．７　ｐｇを得た。

一方、成熟ヒトＬＴポリペプチドのＮ末端であるＬｅｕ
　（ＣＴＡ）から、５番目のアミノ酸であるＧｌｙ（Ｇ
ｃｃ）の２番目の塩基（ＧＯ）までと、発現に必要な開
始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰ
　ｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１
８ｂρの間の適当な長さにする必要があることなどの理
由から、下記のＤＮＡリンカ−を合成した。

まず、−本積ＤＮＡ、２７−ｍａｒと２５−ｍａｒを通
常のトリエステル法により合成した。２７−ｍａｒおよ
び２５−ｍａｒの各々２０ピコモルを全量４０／４７の
Ｔ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造社製）６単位を加えて、３７℃で６０分
間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐｔ、＾１由来のＳｔｕｌ−Ｂｇｆ■断
片（約７９０ｂｐ）　０．３　ｎと発現ベクターｐＫＹ
Ｐ１０のＢａｎｍ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片（約１．１ｋｂ）
０．４ＪｔｇおよびｐＧＥＬ　１由来のＰｓｔｌ　−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約１．７ｋｂ）０．６ｘをＴ４リガーゼ
緩衝液２５Ｉ１１に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリ
ンカ−を約１ピコモル加えた。この混合溶液にさらにＴ
４ＤＮ　Ａ　ＩＪガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｋ
　Ｍ　４３０株を形質転換し、Ａｐ耐性のコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体がらプラスミドＤＮＡを回
収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲ
１，Ｂａｎ１ｌ［、ＰｓｔＩ、　Ｈｉｎｄｌ［、ＢｇＪ
！　Ｉ［で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認
した。このプラスミドをｐＬＳＡ　１とよぶ。ｐＬＳＡ
　ｌのＢａｎＩ［［、ＨｉｎｄＩ［［付近の塩基配列は
下記のとおりであることをマキサム・ギルバートの方法
〔エイ・エム・マキサム（Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍ）ら
：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　５ｃｉ−）＋　ＵＳＡ　？４．５６０（１９７
７）　）で確認した。

参考例１５゜ ｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣｆＴＡ　１の造成（第
２８図参照）： 参考例４により得られたｐｃｓＦ　１−２Ｄ　Ｎ　Ａ　
２河を全量２０１１１のＹ−１００緩衝液に溶かし、制
限酵素ＡｐａＩ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎ−ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）とＢａｍＨ
Ｉそれぞれ１０単位を加え、３７℃で４時間反応を行っ
た。この反応液からＬＧＴ法により１．５ｋｂのＤＮＡ
断片０．４４を精製、回収した。

別に参考例１４の方法で調製したプラスミドｐＬｓＡ１
２ｘをＹ−１００緩衝液２０戚に溶かし、制限酵素Ｂａ
ｎ１［Ｉ（東洋紡績社製）とＢａｍＨＩそれぞれ１０単
位を加え、３７℃で４時間反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により２．８ｋｂのＤＮＡ断片
０．８　ｇを精製、回収した。

一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端１番目か
ら５番目までのアミノ酸〔スレオニン’　　（ＡＣＡま
たはＡＣＴ）　、プロリンｔ（ＯＣＡまたは０ＣＴ）、
ロイシン３（ＣＴＡ）　、グリシン’　　（ＧＧＣ）、
プロリン’（ＣＣＣ））をコードするコドンと発現に必
要な開始コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、
また、トリプトファンプロモーター（Ｐ　ｔｒｐ）の下
流のＳＤ−配列とＡＴＧとの距離を、６〜１ａｂｐＯ間
の適当な長さにする必要があることなどの理由から、下
記のＤＮＡリンカ−を合成した。

（重置以下余白） まず−重鎖ＤＮＡ、２６ａ＋ｅｒと２０ｓｅｒを通常の
トリエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ）ら：
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ　７５．５７６５　（１９７８）　
）により合成した。２６ｓｅｒ、２０ｓｅｒのそれぞれ
２題をＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ３０単位を加えて、３７℃６０分間リン酸
化反応を行った。

上記で得たｐＣＳＦ　１−２由来のＡｐａ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩ断片（１，５ｋｂ）　０．４　ｎとｐＬＳＡ　１
由来のＢａｎ１ｌ［−Ｂａ＋ｓＨＩ断片（２，８ｋｂ）
　０．２　ｔｒｇとを２５ｄのＴ４リガーゼ緩衝液に溶
かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を０．１　ｐｇ
加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単
位を加え、４℃１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌１
８１０１株〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら：ジーン（
Ｇｅｎｅ）　　２．７５　（１９７７）　）をコーエン
らの方法〔ニス・エヌ・コーエン（Ｓ、Ｎ、　Ｃｏｈｅ
ｎ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　６９．２１１０　（１
９７２）　）により形質転換し、ＡＰ耐性のコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを
回収した。得られたプラスミドの構造は、ＢａｎＩ［Ｉ
、Ｒｓａｌ、、Ｐｓ口、ＨｉｎｄｌＩ［、ＢｇｌＩＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。この
プラスミドをｐＣｆＴＡ　１とよぶ。ｐＣｆＴＡ　１の
Ｂａｎ■、Ｈｉｎｄｌ［［付近の塩基配列は下記のとお
りであることを、Ｍ１３ファージを用いたデイデオキシ
・シーフェンス法で確認した。

参考例１６ ヒトｐｒｏ−ＵＫ発現プラスミドｐｓＥＩＵＫ１ｓＥｄ
ｌ−３の造成： （１）組換えプラスミドｐＵＫＧｐｒｏｌの造成：ｐＵ
ｃ１９プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌１８１０１株を培
養し、培養菌体から常法によりｐＵｃ１９　ＤＮＡを調
製した。得られたｐＵｃ１９　ＤＮＡ約２μｇを３０μ
ｌのＹ−〇緩、衝液に溶かし、１０単位の５ｔｓａ　ｌ
を加えて、３７℃で２時間消化反応を行った後１．０μ
！の３ＭＮａＣ１と１０単位の旧ｎｄＩＩＩを加え、３
７°Ｃで２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を用
い、約２．７ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

一方、参考例１３で得られたｐ［ＩＫＦｐｒｏ約２μｇ
を３０ｕｉのＹ−１００緩衝液に溶かし、１０単位のＢ
ａｍｆｌｌと１０単位の旧ｎｄｌｌＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約１．３ＫｂのＤＮＡ断片を精製
した。また、ｐＵＫＦｐｒｏ約８μｇを５０にのＹ−１
００緩衝液に溶かし、２０単位のＢａｍｔｌ　Ｉと２０
単位のＰｖｕｌｌを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を
行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動
的溶出法により約１２０ｂρのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＵｃ１９由来の約２．７Ｋｂ
のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＵＫＦｐｒｏ由来の
約１．３ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１．ｕｇ）とｐＵＫ
Ｆｐｒｏ由来の約１２０ｂｐのＤＮＡ断片（約０．０１
ｕｇ　）を２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１
００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時
間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤ　Ｎ　ＡｐＵＫＧｐｒｏｌを
単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、
目的の構造を有することを確認した（第２９図参照）。

（２）組換えプラスミドｐＵｃ１９ＵＫｄ３の造成：ｐ
Ｕｃ１９プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌８８１０１株を
培養し、培養菌体から常法によりｐＵｃ１９　ＤＮＡを
調製した。得られたｐＵｃ１９　ＤＮＡ約２μｇを３０
μｌのＹ−Ｏ緩衝液に溶かし、１０単位のＳｅａ　１を
加えて、３７°Ｃで２時間消化反応を行った後、１．Ｏ
ｕｆの３ＭＮａＣ１と１０単位の旧ｎｄｌＩＩを加え、
さらに３７℃で２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ
法を用い、約２．７ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

一方、上で得られたｐＵＫＧｐｒｏｌプラスミドＤＮＡ
約２０　、　ｇを２００ｕｊ！のＹ−０緩衝液に溶かし
、５０単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。この反応液５０μｆ　（ＤＮＡとして５μ
ｇを含む）に５倍濃度のＢＡＬ３１１！を衝液（１００
ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　＜９　Ｈ８，１）、３ＭＮａ
Ｃ１，６０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、６０ｍＭＭｇＣ１ｚ　５
１１Ｍ　ＥＤＴＡ）を２０μ！、水を３０ｕｌ加え、さ
らにヌクレアーゼＢＡＬ３１を０．４単位加えて、３７
℃で１分間反応を行った。この反応液をフェノール抽出
、クロロホルム抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収した０回収したＤＮＡ全量を５０ａｎのＹ−１００
緩衝液に溶かし、２０単位の旧ｎｄＩＩＩを加え、さら
に３７°Ｃで２時間消化反応を行った。

続いてＡＦＴ法を用い、約１．４ＫｂのＤＮＡ断片を精
製した。

このようにして得られたｐＵｃ１９由来の約２．７Ｋｂ
のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＬＩＫＧｐｒｏｌ由
来の約１．４ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）を２０
μｉのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行
った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、
大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。

この形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＵＣ１９ＵＫｄ
３を単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったとこ
ろ、目的の構造を有することを確認した（第３０図参照
）。

ｐＵｃ１９ＵＫｄ３は、ｐｒｏ−ＵＫの３１−非翻訳領
域を約３０ｂｐ含む。

（３）ヒトｐｒｏ−ＵＫ発現プラスミドｐｓＥＩＵＫ１
ｓＥｄｌ−３の造成： 上で得られたｐＵｃ１９ＵＫｄ３ブー）ＸミドＤＮＡ約
２μｇを３０μｌのＹ−〇緩衝液に溶かし、１０単位の
Ｋｐｎ　Ｉを加えて、３７°Ｃで２時間消化反応を行っ
た後、１．　Ｏｕ　ｊ！の３ＭＮａＣ１と１０単位の旧
ｎｄｌＩＩを加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行
った。続いてＡＦＴ法を用い、約１．４ＫｂのＤＮＡ断
片を精製した。

一方、参考例９で得られたｐｓＥＩＰＡｌｓＥｌｄｈｆ
ｒｌ−９ＡＡｇ２Ｓを３０μ２のＹ−０緩衝液に溶かし
、１０単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消化
反応を行った後、１．　Ｏｔｔ　７！の３ＭＮａＣ１と
１０単位のＸｈｏ　Ｉを加え、さらに３７°Ｃで２時間
反応を行った。続いてＡＦＴ法を用い、約８．８Ｋｂの
ＤＮＡ断片を精製した。

別に参考例９で得られたｐＡＧＥ１０６約２μｇを３０
μ２のＹ−１００緩衝液に溶かし、１０単位のＸｈｏ　
１と１０単位の旧ｎｄｌｌｌを加え、３７°Ｃで２時間
消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦ
Ｔ法を用いて約３７０ｂρのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＵＣ１９ＵＫｄ３由来の約１
、４　ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）　とｐｓＥＩ
ＰＡｌｓＥｌｄｈｆｒｌ−９Ａ由来の約８．８ＫｂのＤ
ＮＡ断片（約０．１μｇ）および、ｐＡＧＥ１０６由来
の約３７０ｂｐのＤＮＡ断片（０，０３μｇ）を２０μ
ｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１８時間結合反応を行っ
た。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大
腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。こ
の形質転換株からプラスミドＤ　Ｎ　ＡｐＳＥＩＵＫＩ
ＳＩＥｄｌ−３を単離し、制限酵素消化による構造解析
を行ったところ、目的とする構造を有することを確認し
た（第３１図参照）。

参考例１７ ヒトｃ−ｃｓｐ発現プラスミドｐＡＳＬＢ３−３の造成
：（１）組換えプラスミドｐＡＧＥＬ１０６の造成：清
水らが造成したＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ？＋１域を含むプ
ラスミドｐＡＴＫＯ３（清水ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　８
０．３６１８−３６２２（１９８３））を持つ大腸菌１
８１０１株を培養し、培養菌体から常法によりｐＡＴＫ
Ｏ３Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。得られたｐＡＴＫ０３ＤＮ
Ａ約２０μｇを２００μ！のＹ−０緩衝液に溶かし、６
０単位のＢａｎＩＩを加え、３７°Ｃで２時間消化反応
を行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳
動的溶出法により約４１０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した
。このＤＮＡ断片０．１μｇを２０μｌのＹ−１００緩
衝液に溶かし、１０単位の５ａｕ３ＡＩを加え、３７°
Ｃで２時間消化反応を行った。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動後、電気泳動的溶出法により約２７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を精製した。

一方、参考例９で得られたｐＡＧＥ１０６約２μｇを３
０μ！のｙ−ｉｏｏ緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍ
Ｈ。

■と１０単位のＢｇｌ　Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消
化反応を行った。６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦ
Ｔ法を用いて約４．９ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。ま
た、下記２種の合成りＮＡ　（６−ｍｅｒと５−ｍａｒ
）をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ−ＤＮＡ
合成機を用いて合成した。

５’　−ＣＧＧＧＣＴ−３’　（６−ｍａｒ）３’　−
ＧＧＡＧＣ−５’　　　（５−ｍａｒ）これらの合成り
ＮＡを２０ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）ずつ別々に、２０
減のＴ４キナーゼ緩衝液中で５単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを加え、３７°Ｃで３０分間反応させるこ
とにより、合成りＮＡの５゛末端をリン酸化した。

このようにして得られたｐＡＴＫＯ３由来の約２７０ｂ
ＰのＤＮＡ断片（約０．０１μｇ）とｐＡＧＥ１０６由
来の約４、９　ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）、お
よび５”リン酸化された２種の合成りＮＡ　（１ピコモ
ルずつ）を全量２０ｔｔｆｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶
かし、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。得られた組換え体プラスミ
ドの混合物を用いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し
、Ａｐ耐性株を得た。この形質転換株からプラスミドＤ
　Ｎ　ＡｐＡＧＥＬ１０６を単離し、制限酵素消化によ
る構造解析を行ったところ、目的の構造を有することを
確認した（第３２図参照）。

（２）組換えプラスミドＩ）ＡＳＬＢ３−３Ｓの造成：
上で得られたｐＡＧＥＬ１０６ブラスミドＤＮＡ約１０
μｇを１００μ２のＹ−０緩衝液に溶かし、３０単位の
Ｓ＋ｓａ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５、
ＩＫｂのＤＮＡ断片を精製した。別に、２０ピコモルの
Ｓａｌ　Ｉリンカ−（ＧＧＴＣＧＡＣＣ：宝酒造社製）
を参考例１で述べた方法と同様の方法を用いて５”−リ
ン酸化した。　ｐＡＧＥＬ１０６由来の約５．ＩＫｂの
ＤＮＡ断片５μｇおよび５゛−リン酸化されたと５ａｌ
Ｉリンカ−１０ピコモルを全量２０μｌのＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４°Ｃで１８時間結合反応を行った。６５℃、１０
分間の熱処理後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。この様にして得られたＤＮＡ断片を、４０μ２のＹ
−１５０緩衝液に溶かし、２０単位の５ａｌｔと２０単
位のＭｌｕ　Ｉを加え、３７°Ｃで２時間消化反応を行
った。６５°ｃ（１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い
て約１．７　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

一方、参考例１０で得られたｐＡＳ３−３約２μｇを３
０ａＸのＹ−１５０緩衝液に溶かし、１０単位の５ａｉ
ｌと１０単位のＭｌｕＩを加え、３７°Ｃで２時間消化
反応を行った、６５°Ｃ１１０分間の熱処理後、ＡＦＴ
法を用いて約６．７ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＡＧＥＬ１０６由来の約１．
７ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＡＳ３−３由
来の約６．７ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）を２０
μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行っ
た。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大
腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。こ
の形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＡＳＬＢ３−３Ｓ
を単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ
、目的の構造を有することを確認した（第３３図参照）
。

（３）ヒトＧ−Ｃ５Ｆ発現プラスミドｐＡＳＬＢ３−３
の造成：上で得られたｐＡＳＬＢ３−３ＳプラスミドＤ
ＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ−１５０緩衝液に溶かし、
１０単位のＸｈｏ　Ｉと１０単位のＭｌｕ　Ｉを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約７．：３ＫｂのＤＮＡ断
片を精製した。

一方、参考例１０で得られたｐＡＳ３−３約２μｇを３
０９１！、０）Ｙ−１５０緩衝液に溶かし、１０単位（
７）ＸｈｏＩと１０単位のＭｌｕ　Ｉを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った、６５°Ｃ１１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約２．６ＫｂのＤＮＡ断片を精製
した。

このようにして得られたｐＡＳＬＢ３−３Ｓ由来の約７
．３ＫｂのＤＮＡ断片（約ｏ、　ｉμｇ）とｐＡＳ３−
３由来の約２．６ＫｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）を
２０μｉのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位の
７４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を
行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて
、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た
。この形質転換株からプラスミドＤＮＡｐＡＳＬＢ３−
３を単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったとこ
ろ、目的の構造を有することを確認した（第３４図参照
）。

プラスミドｐＡＳＬＢ　３−３を含む微生物はＥｓｃｈ
ｅｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＥＡＳＬＢ　３−３　（
ＦＥＲＭ　０Ｐ−２３５８）として平成１年３月２８日
付で微工研に寄託しである。

以下に発明の実施例を示す。

実施例１ （１）ｐｒｏ−ｔｌＫポリペプチド生産生産ＣＯＯ前種
ｐｓＥＩＵＫｐｒｏｌ−１およびｐＳＶ　２−ｄｈｆｒ
のｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株への導入はリン酸カルシウム法
に準じて行った。すなわち、ウシ胎児血清（以下ＦＣ３
と略記する）を１０％、７．５％ＮａＨＣＯ３溶液（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１７５０
量、１００×非必須アミノ酸溶液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１／１００量加えたＭＥＭ　
ＡＬＰＨＡ培地（リボ核酸およびデオキシリボ核酸含有
；ギブコ・オリエンタル社製）〔以下、この培地をＭＥ
Ｍα（非選択培地）と略記する１５ｄに１×１ＯＳ細胞
／ＩＲ１，になるように細胞を接種し〔培養には直径６
ｃｍのデイツシュを使用した。ＬＵＸ社製（以下、培養
にはＬＵ、Ｘ社のデイツシュを用いた）Ｌ３７°Ｃ，Ｃ
Ｏ，インキュベーターにて１日間培養した。一方、ｐｓ
ＥｌｌＪＫｐｒｏｌ−Ｉ　Ｄ　ＮＡ　１０／ｌ／ｇおよ
びｐｓＶ２−ｄｈｆｒ　Ｄ　ＮＡ　１　ｕｇを４５０μ
！の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）溶液
に溶解し、この溶液に５００μｆｆｉの２８０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１＋　　１．５ｎ＋Ｍ　ＮａＪＰＯ４゜５０ｍＭ　
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
′−２−エタンスルフォン酸）（ｐＨ７，１）を含む溶
液を加えて混合した。さらに、５０μｌの（２，５Ｍ）
　ＣａＣ１を溶液を加えて混合し、室温で５分間静置し
た。このＤＮＡ溶液全量を、培地を除き新しいＭＥＭα
（非選択培地’）１０ｄを加えてさらに１時間培養した
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株に添加し、８時間インキエベート
した。ＰＢＳで細胞を洗浄し、５！ｄのＭＥＭα（非選
択培地）を加えて１６時間培養した。

細胞をＰ　Ｂ　Ｓ　（ＮａＣ１８ｇ／　４１！、　ＫＣ
ｌ　０．２ｇ／　Ｉ！、Ｎａ２ＨＰＯａ　（無水＞　１
．１５ｇ／ｌ　ＫＨ，ＨＰｏ、　０．２ｇ／ｆ　）で洗
浄し、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸）を含む溶液３−を加え、余分の
溶液を除いた後、３７°Ｃに５分間インキュベートした
　（トリプシン処理）。透析Ｆ−Ｃ３（ギブコ・オリエ
ンタル社製）を１０％、７．５％ＮａＨＣＯｓ溶液を１
／Ｊ５０！、　　１００Ｘ非必須アミノ酸溶液を１／１
００！、　Ｇ４１８（ギプコ・オリエンタル社製）を０
．３■／ＩＩｄｌになるように加えたＭＥＭ　　ＡＬＰ
ＨＡ培地（リボ核酸およびデオキシリボ核酸不含有）〔
以下、この培地をＭＥＭα（選択培地）と略記する〕を
加えてよく細胞を懸濁し、直径１０ｃｍのデイツシュを
用い、３７℃、Ｃ０２インキエベーターにて５日間培養
した。ＰＢＳで細胞を洗浄し、ＭＥＭα（選択培地）を
加えて５日間培養した。

同様の操作をして、さらに５日間培養した。ＰＢＳで細
胞を洗浄した後、トリプシン処理し、５１ｎ１０ＭＥＭ
α（選択培地）を加えて細胞を懸濁し、直径６ｃ１１の
デイツシュを用い、３７°Ｃ，ｃｏ２インキュベーター
にて３〜７日間培養した。出現してきたコロニーをトリ
プシン処理した後、５−のＭＥＭα（選択培地）を用い
て細胞濃度ｌＸｌ０’／ｍｆになるように直径６ｃｍの
デイツシュ１枚に植え込み、コンフルーエンドになるま
で培養した。５戚のＭＥＭα（選択培地）に交換し、１
日後培養液中のＵＫの活性をフィブリン・プレート・ア
ッセイ法（Ｇｒａｎｅｌ　１１−ＰｉｐｅｒｎｏとＲｅ
１ｃｈ　　；ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）暉佃、　２３３　
（１９７８）　）を用いて調べた。その結果、ｐｒ。

−ＵＫの生産量は、約５０ｕｎｉｔｓ／Ｉｎ１・日であ
った。この株を０７１６Ｎａ７と命名した。

（２）ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産ＣＨＯ株に対する
ｈＬＴの効果 上記（１）で得られたｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｃ
ＨＯ株、０７１６　Ｎα７株を直径６ｃｍのデイツシュ
４枚に２　ＸＩＯ’／ｄの濃度で植込み、３７°Ｃ５Ｃ
（ｈインキュベーターでコンフルーエンドになるまでＭ
ＥＭα（選択培地）で培養した。培地を除き、ＰＢＳで
洗浄した後、ＭＥＭα（選択培地）を５１ｄ加えた。こ
の時、デイツシュ２枚にｈＬＴをＩ　Ｘ１０’ｕｎｉｔ
ｓ／ｄになるように加えた。３７°Ｃ，ＣＯ，インキュ
ベーターで培養し、培養液を経時的にサンプリングした
。培養液中のＵＫ活性をフィブリン・プレート・アッセ
イ法により調べた結果を第１図に示す。

実施例２ （１）ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｎａｍａｌｗａ株
の育種ｐｓＥＩＵＫ１ｓＥｄｌ−３のＮａｍａｌｗａ細
胞への導入は、エレクトロポレーション法に準じて行っ
た。すなわち、細胞を４　Ｘ　１０’／ｄになるように
に−ＰＢＳ（１３７ｍＭ　ＫＣＩ、　２．７ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，８，１ｍＭ　ＮａＪＰＯａ、１．５ｍＭ　ＫＨｚ
ＰＯ４，４１１Ｍ　ＭｇＣ１ｇ）に懸濁し、５ＳＨ−Ｃ
１３チエンバー（島津製作所製）に４０量１分注した。

これに、ｐｓＥＩＵＫｌｓＥｄｌ−３Ｄ　Ｎ　Ａ溶液（
１ｇｇ／μｌ）を４μ！加えて良く混合した。細胞融合
装置５ＳＨ−１（島津製作所製）を用いて電圧３．ＯＫ
Ｖ／■、パルス幅１００ｕＳｅＣ、パルス回数２回の条
件で遺伝子導入を行った。１０分静置してＤＮＡを細胞
に取込ませた後、生細胞数をトリパンブルー染色により
測定した。生細胞数が、Ｉ　ＸＩＯ’／ｄになるように
ＦＣＳを１０％、７．５％ＮａＨＣＯ１溶液をｌ／４０
量、２００ｐｌ１ＭＬ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社
製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Ｇ
ＩＢＣＯ社製、５，０００ｕｎｉｔｓ／Ｉ１１ペニシリ
ン、５．ＯＯＯａｇ／ｍ２ストレプトマイシン）を０．
５％含むＲＰＭＩ　１６４０培地（日永製薬社製）〔以
下、ＲＰＭＩ　１６４０．　ＦＣＳ（１０）培地と略記
する〕で調製し、９６穴マイクロタイタープレ）　（Ｎ
ｕｎｃ社製）に２００μｌずつ分注した。

３７℃、ＣＯｚインキュベーターで２４時間培養した後
、６４１８を０．５■／ｒｄになるように添加して２週
間培養した。出現したコロニーを０４１８を０．３■／
ｄ含むＲＰＭＩ　１６４０．　ＦＣＳ（１０）培地を５
０ｕｌ加えてさラニ培養し、コンフルーエンドになった
時点で培養液中のＵＫの活性をフィブリン・プレート・
アッセイ法を用いて調べた。高い活性を示したクローン
について、１５ｃｉ組織培養用フラスコ　（コーニング
社製）で培養した。・細胞を遠心して回収し、０４１８
を０．３ｍｇ／ｒｔｒｆｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰ
ＭＩ　１６４０・ＦＣＳ（１０）培地にＩ　ＸＩＯ’／
１１１１！または、２　ＸＩＯ’／ｄになるように懸濁
し、９６穴マイクロタイタープレートに２００ｐｌずつ
分注した。３７°Ｃ，ＣＯ□インキュベーターで２〜３
週間培養して５０ｎＭ　　ＭＴＸ耐性株を誘導した。コ
ンフルーエンドになった時点で培養液中のＵＫの活性を
フィブリン・プレート・アッセイ法を用いて調べた。こ
の様にして得た５０ｎＭ　　ＭＴＸ耐性クローンの中で
、最も高い活性を示したクローン３１　（１０）　１５
の培養液中のＵＫの活性は、約５０ｕｎｉｔＪＳ／Ｉｌ
！ｉ！・日であった。

（２）ｐｒｏ−ＵＫポリペプチド生産Ｎａｍａｌｗａ株
に対するｈＬＴ、ｈＬＴ　（Δ１−１１）、ｈＬＴ　（
Δ１−２２）、ｈＴＮＦの効果 上記（１）で得られたｐｒｏ−Ｕにポリペプチド生産Ｎ
ａｍａｌｗａ株、３１（１０）１５株をＧ４１８を０．
３＋ｎｇ／ｍｌｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ　１
６４０・ＦＣＳ（１０）培地に５×１０’ｕｎｉｔｓ／
Ｉｄの濃度で懸濁し、３ｒｄずつ６穴ブレ）　（Ｇｒｅ
ｉｎｅｒ社製）に分注した。、これに、発明者らにより
調製されたｈＬＴ、ｈＬＴ（Δ１−１１）、ｈＬＴ（Δ
１−２２）をそれぞれ、Ｉ　Ｘ１０”ｕｎｆｔｓ／ｍ２
あるいは、Ｉ　Ｘ１０３ｕｎｉｔｓ／戒になるように加
えて３７°Ｃ，ＣＯ□インキュベーターで３日間培養し
た。

同様に、ｈＴＮＦ　（コスモ・バイオ社製）を１×１０
２ｕｎｉｔｓ／ｄになるように加えて３７℃、ＣＯ２イ
ンキュベーターで３日間培養した。実験は２連で行った
。培養３日後の培養液をサンプリングし、培養液中のＵ
Ｋ活性をフィブリン・プレート・アッセイ法により調べ
た結果を第３表および第４表に示す。

また、同様に、ｈＬＴをＩ　Ｘ１０’ｕｎｉｔｓ／　ｍ
ｌになるように加えて３７°Ｃ，ＣＯｚインキュベータ
ーで培養し、培養液を経時的にサンプリングした。培養
液中のＵＫ活性をフィブリン・プレート・アッセイ法に
より調べた結果を第２図に示す。

（重責以下余白） 第３表 ｈＬＴ（インダクト） ｌＸｌ０’ １Ｘ１０” ｈＬＴ（△１−１１）　　０ １Ｘ１０” １Ｘ１０” １．００ ３．０５ ３．０５ １．００ １．７４ １．９８ Ｘ１０３ １Ｘ１０” １．９５ ２．２０ 第４表 １　Ｘ　１０”　　　　　　３７０　　　　　　３７０
　　　　　　４．３５実施例３ （１）　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチド生産Ｎａｎ＋
ａ１ｗｅ株の育種 ｐＡｓＬＢ３−３のＮａｍａｌｗａ細胞への導入は、エ
レクトロポレーション法に準じて行った。すなわち、細
胞を４Ｘ１０’／−になるようにに−ＰＢＳに懸濁し、
５ＳＩ（−Ｃ１３チエンバーに４０ｔｔ１分注した。こ
れに、ｐＡＳＬＢ３−３　Ｄ　Ｎ　Ａ溶液（１μｇ／μ
ｌ）を４μｌ加えて良く混合した。細胞融合装置５ＳＨ
−１を用いて電圧３．ＯＫＶ／ｃ＋ｍ、パルス幅１００
μｓｅＣ、パルス回数２回の条件で遺伝子導入を行った
。　１０分静置してＤＮＡを細胞に取込ませた後、生細
胞数をトリパンブルー染色により測定した。生細胞数が
、１×１０５／ｄになるようにＲＰＭＩ　１６４０・Ｆ
ＣＳ（１０）培地で調製し、９６六マイクロタイタープ
レート　（Ｎｕｎｃ社製）に２００ｕＲずつ分注した。

３７°Ｃ，ＣＯ□インキュベーターで２４時間培養した
後、０４１８を０．５■／　ｍＡになるように添加して
２週間培養した。出現したコロニーを０４１８を０．３
■／戚含むＲＰＭＩ　１６４０・ＦＣＳ（１０）培地を
５０μｌ加えてさらに培養し、コンフルーエンドになっ
た時点で培養液中のｈｃ−ｃｓＦの蛋白量を抗ｈＧ−Ｃ
５Ｆ単クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡによって求めた
。ｈｃ；−ＣＳＦの生産量の高いクローンを混合し、７
５ｃ＋ｌ＆ｌｌ織培養用フラスコで培養した。細胞を遠
心して回収し、６４１８を０．３ｍｇ／ｄ、ＭＴＸを５
０ｎＭ含むＲＰＭｒ　１６４０・ＦＣＳ　（１０）培地
に１×１０Ｓ／ｒ１ｔ１．または、２Ｘ１０’／ｄにな
るように懸濁し、９６六マイクロタイタープレートに２
００μ！ずつ分注した。３７°Ｃ，Ｃ（ｈインキュベー
ターで２〜３週間培養して５０ｎＭ　　ＭＴＸ耐性株を
誘導した。コンフルーエンドになった時点で培養液中ｈ
Ｇ−Ｃ５Ｆの蛋白量を抗ｈＧ−ＣＳＦ単クーロン抗体を
用いたＥＬＩＳＡによって求めた。この様にして得た５
０ｎＭ、　ＭＴＸ耐性クローンの中で、最も高い生産性
を示したクローン６−２８の培養液中のｈＧ−ＣＳＦの
生産量は、約１．０Ｆｇ／ｄ・日であった。

（２）　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆポリペプチド生産Ｎａｍａ
ｌｗａ株に対するｈＬＴの効果 上記（１）で得られたｈＧ−ＣＳＦポリペプチド生産Ｎ
ａｍａｌｖａ株、６−２８株を０４１８を０．３ｍｇ／
ｄ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ　１６４０．　ＦＣ
Ｓ（１０）培地に５×１０’／ｄの濃度で懸濁し、３Ｉ
ＩＩｌずつ６穴プレートに分注した０、これに、ｈＬＴ
をそれぞれ、ｌＸｌ０’ｕｎｉｔｓ／−あるいは、Ｉ　
Ｘ１０’ｕｎｉｔｓ／ｍ１になるように加えて３７°Ｃ
，ＣＯｚインキュベーターで４日間培養した。実験は２
連で行った。培養４日後の培養液をサンプリングし、Ｅ
ＬＩＳＡによりｈｃ−ＣＳＦの生産量を比較した。結果
を第５表に示す。

（重責以下余白） 第５表 ０　　　　　３．１　　　　　　２．９　　　　　１．
００２．７ １　Ｘ　１０３６．７　　　　　　６．０　　　　　２
．０？５．３ １　Ｘ　１０’　　　　　１０．１　　　　　　９．８
　　　　３．３８〔発明の効果〕 本発明によれば、サイトカインの使用により組換え動物
細胞における有用蛋白質の生産性の向上が顕著であり、
組換え動物細胞による極めて有利な有用蛋白質の製造方
法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐｒｏ−ＵＫ生産ＣＨＯ株のｐｒｏ−ＵＫ生
産に対するｈＬＴの効果を示す図、 第２図は、ｐｒｏ−υに生産Ｎａａｎａ１ｗａ株のｐｒ
ｏ−ＵＫ生産に対するｈＬＴの効果を示す図、 第３図（１）と（２）は、オカヤマ・バーブ法によるＣ
ＤＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成
工程を示す図、 第４図は、プラスミドｐｃｃＫ１の造成工程を示す図、
第５図は、プラスミドｐＣＣＫ２の造成工程を示す図、
第６図は、プラスミドｐＵＫ１１の造成工程を示す図、
第７図は、プラスミドｐＴｒｓ２０の造成工程を示す図
、第８図は、プラスミドｐＴｒＳ３３の造成工程を示す
図、第９図は、プラスミドｐＴｅｒａ＋２の造成工程を
示す図、第１Ｏ図は、プラスミドｐＴｓＦ１０の造成工
程を示す図、第１１図は、プラスミドｐＴＡ４の造成工
程を示す図、第１２図は、プラスミドｐＡＧＥ１０５Ｍ
の造成工程を示す図、 第１３図は、プラスミドｐＡＧＥ１０６の造成工程を示
す図、 第１４図は、プラスミドｐｓＥＩＰＡ１−５の造成工程
を示す図、 第１５図は、プラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９の造成工程
を示す図、 第１６図は、プラスミドｐｃ０１９Ｈの造成工程を示す
図、第１７図は、プラスミ す図、 第１８図は、プラスミ 工程を示す図、 第１９図は、プラスミ す図、 第２０図は、プラスミ 第２１図は、ブラ、スミ 第２２図は、プラスミ 図、 第２３図は、プラスミ 第２４図は、プラスミ 図、 第２５図は、ブラスミ 示す図、 第２６図は、プラスミ 第２７図は、プラスミ 第２８図は、プラスミ 第２９図は、プラスミ 図、 ドｐｓＥＩＰＡ１−９への造成工程を示ドｐｓＥＩＰＡ
１ｓＥ１ｄｈｆｒｌ−９への造成ドｐｓＥＩＧｃ３−３
の造成工程を示 ドｐＡＳ３−３の造成工程を示す図、 ドｐＵＫＡ２の造成工程を示す図、 ドｐＵＫＢ１０１の造成工程を示す ドｐＵＫＦ２の造成工程を示す。 ドｐＵＫＦｐｒｏの造成工程を示す ドｐｓＥＩＵＫｐｒｏｌ−１の造成工程をドｐＬＡ１の
造成工程を示す図、 ドｐｔｓ＾１の造成工程を示す図、 ドｐＣｆＴ＾１の造成工程を示す図、 ドｐＵＫＧｐｒｏｌの造成工程を示す 第３０図は、プラスミドｐＵｃ１９ＵＫｄ３の造成工程
を示す図、 第３１図は、プラスミドｐｓＥＩＵＫ１ｓＥｄｌ−３の
造成工程を示す図、 第３２図は、プラスミドｐＡＧＥＬ１０６の造成工程を
示す図（Ｓａｕ３ＡＩ切断部位は造成に関与するものの
み示した。）、 第３３図は、プラスミドｐＡＳＬＢ３−３３の造成工程
を示す図、 第３４図は、プラスミドｐＡＳＬＢ３−３の造成工程を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白質産生能を有する組換え動物細胞を用いて蛋白
   質を生産するに際し、該組換え動物細胞を含む培地中に
   サイトカインを存在せしめることを特徴とする蛋白質の
   生産方法。 ２、サイトカインが腫瘍壊死因子（以下、ＴＮＦと略記
   する）、リンホトキシン（以下、ＬＴと略記する）ある
   いはＬＴの誘導体である請求項１記載の生産方法。 ３、ＴＮＦ、ＬＴがヒト由来のものである請求項２記載
   の生産方法。 ４、ＬＴの誘導体が成熟ヒトＬＴのＮ末端から１１アミ
   ノ酸あるいは、２２アミノ酸欠失した誘導体である請求
   項２記載の生産方法。 ５、サイトカインを、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ〜１０＾７
   ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、好ましくは、１０＾２ｕｎｉｔｓ／
   ｍｌ〜１０＾４ｕｎｉｔｓ／ｍｌの濃度で存在させる請
   求項１から４に記載の生産方法。 ６、生産される蛋白質がホルモン、酵素、酵素阻害剤、
   サイトカインまたは免疫グロブリンである請求項１記載
   の生産方法。 ７、該動物細胞が、ヒトＮａｍａｌｗａ細胞あるいは、
   ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）細
   胞であることを特徴とする請求項１記載の生産方法。 ８、生産される蛋白質がヒト顆粒球コロニー刺激因子（
   以下、ｈＧ−ＣＳＦと略記する）あるいは、ヒトプロウ
   ロキナーゼである請求項１記載の生産方法。 ９、生産される蛋白質が粗製物あるいは単離された形態
   である請求項１記載の生産方法。 １０、該組換え動物細胞で蛋白質を発現するために用い
   る発現プラスミドのプロモーターとして、ＳＶ４０初期
   プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、Ｍｏｌｏｎ
   ｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓＬＴＲプ
   ロモーター、ＲｏｕｓｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓＬＴＲ
   プロモーター、ＨｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉ
   ａｖｉｒｕｓ− I ＬＴＲの一部を含むＳＶ４０初期プ
   ロモーター、好ましくはＳＶ４０初期プロモーターある
   いはＨＴＬＶ− I ＬＴＲの一部を含むＳＶ４０初期プ
   ロモーターを用いる請求項１記載の生産方法。 １１、蛋白質産生能を有する組換え動物細胞をサイトカ
   インを含有する培地に培養増殖せしめ、培養を蛋白質が
   蓄積するまで続ける請求項１記載の生産方法。 １２、サイトカインを含有する培地中において、蛋白質
   産生能を有する組換え動物細胞をサイトカインと接触維
   持させる請求項１記載の生産方法。 １３、第１段階において、蛋白質産生能を有する組換え
   動物細胞を定められた細胞密度に達するまで生育培地で
   生育せしめた後、第２段階において、サイトカインを存
   在せしめて、該組換え動物細胞と接触維持する請求項１
   ２記載の生産方法。