JPH02100687A - プロトカテキュ酸およびその塩の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、種々のポリマーの原料モノマーや食品用抗酸
化剤や医薬品類の原料として有用なプロトカテキュ酸お
よびその塩の製造方法に関する。

［従来の技術］ プロトカテキュ酸は、種々のポリマーの原料モノマーや
食品用抗酸化剤や医薬品の原料として有用である。

従来、このプロトカテキュ酸の製造方法としては、バニ
リンのアルカリ融解方法、バニリン酸の脱メチル化方法
、ｍ−クロル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸を水酸化カリウ
ムと共に加圧下で加熱する方法、カテコールを炭酸アン
モニウムと共に加熱する方法などの各種方法が知られて
いる。

［発明が解決すべき課題］ しかしながら、従来のプロトカテキュ酸の製造方法は、
いずれも反応効率が充分ではないという問題があった。

［課題を解決するための手段］ かかる実状において、本発明者らはプロトカテキュ酸お
よび／またはその塩を効率よくフタル酸および／または
その塩から製造する方法を開発すべく研究した結果、フ
タル酸および／またはその塩を炭素源として生育できる
シュードモナス属に属する菌体の変異株がフタル酸を分
解し、プロトカテキュ酸および／またはその塩を効率よ
く製造することを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、プロトカテキュ酸および／またはそ
の塩の分解活性が消失もしくは低下しているシュードモ
ナス属に属する微生物を用いて、フタル酸および／また
はその塩からプロトカテキュ酸および／またはその塩を
製造することを特徴とするプロトカテキュ酸および／ま
たはその塩の製造方法を提供するものである。

なお、本発明において塩とは、ナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを示すものであ
る。

本発明に用いられる微生物はシュードモナス属に属し、
プロトカテキュ酸および／またはその塩（以下、これら
を「プロトカテキュ酸」と総称する）の分解活性が消失
もしくは低下しているものであり、例えばフタル酸およ
び／またはその塩（以下、これらを「フタル酸」と総称
する）を増殖のための炭素源として利用し得る能力を有
するシュードモナス属に属する微生物を親株として、プ
ロトカテキュ酸の分解活性が消失もしくは低下するよう
に変異せられたものが挙げられる。

ここで親株の例としては、例えばシュードモナスφアシ
トポランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏ
ｒａｎａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・テストス
テロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｉ）　、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）などが挙げられ、これらの
うちではシュードモナス・テストステロニが好ましく、
最も好ましい親株の例として、シュードモナス・テスト
ステロニＭ４−１（微工研菌寄第１０１７６号）が挙げ
られる。Ｍ４−１は本発明者らが新たに見出した菌株で
あり、フタル酸のほかに４．５−ジヒドロキシフタル酸
またはプロトカテキュ酸を炭素源として生育でき、また
フタル酸で培養した菌体は、４，５−ジヒドロキシフタ
ル酸またはプロトカテキュ酸をすみやかに代謝すること
ができる。

Ｍ４−１の菌学的性質を示すと次のとおりである。

ａ）形態的性質 （１）形、大きさ　　　桿菌ＣＬ５Ｘ１〜０，５×２μ
ｍ （２）運動性 鞭　　　　毛 （３）胞　子 （４）ダラム染色 ｂ）培養的性質 （１）肉汁寒天平板 （２）肉汁寒天斜面 （３）肉汁液体 あり 極鞭毛　１本 なし 陰性 Ｃ） 生育良好、円形、金縁、 淡黄褐色 生育良好、糸状 生育良好、白濁、被膜形 成、沈渣あり 生育良好、液化せず アルカリ性 肉汁ゼラチン穿刺 リドマスミルク 生理的性質 脱窒反応　　陰性 好塩性　なし メタノールの資化性　　　なし エタノールから酢酸の生産 ペプトン培地の生育　　　陽性 ３−ケトラクトースの生産 ゼラチン加水分解能　　　なし 陰性 なし ＹＭＡ培地　　　あり（白） 色素の生成　　　なし オキシダーゼ　　　陽性 カタラーゼ　　　陽性 リパーゼ　　　陽性 アルギニンジヒドロラーゼ プロトカテキュ酸の開裂 ４１℃での生育　　　陰性 ｐＨ３，６での生育　　　陰性 栄養要求性　　　なし 酸素に対する態度　　　好気的 資化性（＋；陽性、−；陰性） ｐ−ヒドロキシ安息香酸；＋ ラクトース；− プロピオン酸；十 グルコース；− クエン酸；十 Ｌ−アラビノース；− Ｄ−フラクトース；− Ｄ−マンニトール；− 陰性 メタ開裂 シュクロース；− フタル酸；＋ なお、以上の菌学的性質はバージイーズ・マニュアル・
オブ・システマチック・バクテリオロジー第１巻（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１）記載の
シュードモナス拳テストステロニの菌学的性質とよく一
致するものである。

本発明では、このような菌学的性質を有する菌株を親株
として変異誘導処理して得たプロトカテキュ酸の分解活
性が消失もしくは低下している変異株（以下、単に「特
定変異株」という）が用いられる。

親株の変異誘導処理は、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、
γ線などの放射線照射、突然変異誘起剤による処理、ま
たはトランスポゾンによる処理を適用することができる
。ここで突然変異誘起剤としては、エチルメタンスルホ
ネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン、ジメチルサルフェート、２−アミノプリン、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、４−
ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マンガンなどが挙
げられる。

また放射線を照射する場合、例えば紫外線の場合、１〜
９ｍＪ／ｃＪ程度の量の紫外線を照射する。

また変異株の確認は、例えば変異処理を行った細胞を培
養し、形成されたコロニーについて変異の有無を検討す
る直接的な方法のほか、この方法を改良したレプリカ法
、さらにはペニシリンなどの抗生物質を使用する濃縮法
、特殊な基質を用いる自殺基質処理法ならびにこれらを
適宜組合せた方法などが挙げられる。

また、これらの変異株の中から特定変異株を見出す方法
としては、増殖菌体または休止菌体にフタル酸を適当な
条件下で接触させ、そのときの蓄積物を適当な分析手段
を用いて分析する方法を挙げることができる。ここで分
析手段としては、紫外線吸収スペクトルを測定する方法
、ＴＬＣ，ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーによる方
法、および蓄積物のフェノール性水酸基を検出する方法
が例示でき、特定変異株か否かの判定は、これらの分析
結果から総合的に判断される。

かくして得られる特定変異株の例として、親株としてＭ
４−１を用いた紫外線処理による変異株であるシュード
モナス・テストステロニＭ４−ＩＡ−１３（微工研菌寄
第１０３１Ｓ号）が挙げられる。この特定変異株の増殖
菌体または休止菌体はフタル酸からプロトカテキュ酸を
製造し、蓄積させることができるものである。

このＭ４−ＩＡ−１３の菌学的性質は、親株であるＭ４
−１のそれと極めて近似しているが、フタル酸の資化能
を失っている点で親株と相違する。

なお、本発明では増殖菌体または休止菌体がプロトカテ
キュ酸を製造し、蓄積することのできる特性を有する菌
株であれば任意に使用でき、シュードモナス属に属する
他の親株を用い、各種の変異誘導処理を行って得られる
変異株も同様に使用することができる。さらに、上記特
性を有する菌株であれば自然界から分離された菌体であ
ってもよい。

本発明ではこのような特定変異株を用い、液体培養法、
休止菌体法、固定化菌体法などによりフタル酸からプロ
トカテキュ酸を製造する。

液体培養法は、フタル酸の存在下に特定変異株を培養し
ながらプロトカテキュ酸を生成させる方法である。この
方法で用いられる培地には、炭素源として酢酸、コハク
酸、クエン酸などの有機酸、安息香酸、ｍ−ヒドロキシ
安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの芳香族化合物
、グルコースなどの糖類が用いられ、窒素源としてアン
モニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、尿素などの有機窒素源などが用
いられ、無機塩類としてリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カリウム、塩化第二鉄、塩化カルシウムなど
が用いられる。

フタル酸の培地への添加は、−括添加または逐次添加が
採用されるが、その合計添加量は、通常、培地の５重量
％以下である。また、逐次添加する場合にその添加周期
は、プロトカテキュ酸が十分生成し培地中に蓄積される
範囲内で適宜選定され、１回の添加量は、通常、培地の
０．０１〜０．５重量％である。

また培養温度は、通常、２５〜３７℃、ｐＨは５〜９で
あり、好気的条件下で培養が行われる。

休止菌体法は、予め培養しておいた特定変異株を用いて
、フタル酸をプロトカテキュ酸に変換させる方法である
。

この方法では、特定変異株の培養は液体培養法と同様に
して行うことができるが、培養時にフタル酸を添加しな
くてもよい。すなわち、特定変異株の培養後、特定変異
株は遠心分離または凝集法によって集められ、適当な緩
衝液、例えばリン酸緩衝液あるいはトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液中に再懸濁される。再懸濁
された液中でのプロトカテキュ酸の産生反応（以下、単
に「産生反応」という）はフタル酸の添加により開始さ
れ、温度２５〜３７℃、ｐＨ５〜９の範囲で好気的に行
われる。なお、産生反応前に特定変異株を産生反応に用
いる緩衝液で集菌し、再懸濁を繰り返し、洗浄してから
用いても良い。

また固定化菌体法の場合、特定変異株の担体への固定化
方法としては、包括法、吸着法、マイクロカプセル法な
どいずれも適用することができる。

包括用担体としてはカラギーナンなどの多糖類、ポリア
クリルアミドなどの合成高分子があり、吸着用担体とし
てはＤＥＡＥセルロースなどがある。

固定化菌体法の場合の培養または産生反応の条件は、液
体培養法または休止菌体法の場合と同様である。

上記の各方法などによる培養または産生反応終了後、プ
ロトカテキュ酸は溶媒による抽出または晶析により、培
養液または産生反応液から回収される。なお抽出の際、
培養液または産生反応液は、好ましくはｐＨ２以下に調
整される。

ここで、抽出の際に使用しうる溶媒としては、テトラヒ
ドロフラン、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、ジエ
チルエーテル、メチルエチルケトンなどの極性溶媒が挙
げられる。この抽出液を濃縮乾固することにより、プロ
トカテキュ酸の粗結晶が得られる。この粗結晶は、さら
に適当な溶媒、例えば水、酢酸エチル、ジエチルエーテ
ル、トルエン、クロロホルム、ヘキサンなどにより再結
晶させて精製してもよい。

［実　施　例］ 次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら制限されるものではない。

参考例１ 菌体の変異誘導処理と特定変異株の分離（１）下記組成
のｐＨ７の培地（以下、「培地Ａ」という）にフタル酸
ナトリウム１０ｍＭを添加した培地１０ｍ１にシュード
モナス・テストステロニＭ４−１を１白菌耳接種し、３
０℃で１２時間振とう培養を行った。

ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　　　　１．０　　ｇＫＨ２Ｐ
Ｏ４２，Ｏｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　０．５ｇＦｅＣｌ３　
・６Ｈ２００，０１ｇ ＣａＣｌ２　　　　　　　　　０．１　　ｇＥＤＴＡ　
　　　　　　　　　Ｏ，１ｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２０５μ
ｇ Ｈ３ＢＯ２１μｇ ＭｎＣ１２１μｇ 蒸留水　　　　１Ｎ （２）工程（１）で得られた培養液０．１ｍｌを培地Ａ
１０ｍ１に添加し、３０℃で６時間振とう培養を行った
。

（３）工程（２）の培養液の遠心分離によりＭ４−１を
集菌し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後
、菌体密度が２Ｘ１０９個／ｍｌとなるように０．８５
重量％塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。

（４）上記懸濁液に紫外線ランプ（波長２５３７人）を
用いて３．０ｍＪ／ｃ♂の照射量の紫外線を照射した。

（５）紫外線を照射した懸濁液０．１ｍｌを１０ｍ１の
ブイヨン液体培地に接種し、３０℃で一夜振とう培養を
行った。

（６）工程（５）の培養液の遠心分離により放射線を照
射したＭ４−１を集菌し、０．８５重量％塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄後、菌体密度が２×１０９個／ｍｌにな
るようにフタル酸ナトリウム１０ｍＭを添加した培地Ａ
に接種した。

（７）３０°Ｃで１時間培養を行った後、ベンジルペニ
シリンカリウムを７　ｍｇ　／　ｍｌの濃度になるよう
に添加し、さらに４時間培養を行った。

（８）工程（７）の培養液を培地Ａで１００００倍に希
釈し、直径９０ｍｍのブイヨン寒天平板に０６１ｍｌ塗
布し、３０℃で一夜培養を行った。

（９）工程（８）の培養で生じたコロニーを、コハク酸
ナトリウム含有寒天平板およびフタル酸ナトリウム含有
寒天平板に移植して、３０℃で２日間培養を行った後、
コハク酸ナトリウム寒天平板には生育し、フタル酸ナト
リウム寒天平板上には生育しないＭ４−１の変異株から
なるコロニー１００個を拾い上げ、別々のブイヨンスラ
ントに移植した。

００）工程（９）でブイヨンスラントに移植されたＭ４
−１の変異株をブイヨンスラントから、フタル酸ナトリ
ウム１ｍＭおよびコハク酸ナトリウム１０ｍＭを含む培
地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間振どう培養を
行った。

（１１）工程００）の培養中にＭ４−１の変異株から産
生された蓄積物を紫外線吸収スペクトル、薄層クロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより分
析し、プロトカテキュ酸と性質が一致した蓄積物を与え
るＭ４−１の変異株を選別した。

以上のようにして得られた特定変異株の中から、最もプ
ロトカテキュ酸の生産能が高い特定変異株のひとつとし
て、シュードモナス・テストステロニＭ４−ＩＡ−１３
が得られた。

実施例Ｉ Ｍ４−ＩＡ−１３を１白金耳、ブイヨン液体培地５０ｍ
１で培養した培養液を、５ｍＭのフタル酸ナトリウムを
含むブイヨン液体培地２ｆ！、に添加し、３０℃で２０
時間振とう培養を行った。次いで遠心分離によりＭ４−
ＩＡ−１３を集菌し、５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）２００ｍｌで２回洗浄を行った後、２０ｍＭ
のフタル酸ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−酢酸緩衝
液１２に再懸濁した。その後、回転振とうを行いながら
、３０℃で２４時間産生反応を行い、遠心分離によりＭ
４−ＩＡ−１３を除去した。

得られた上澄液を４８℃で回転蒸発法により５０ｍ１に
濃縮し、硫酸アンモニウムを飽和に達するまで加え、濃
塩酸でｐＨ２に調整した。続いて酢酸エチル１００ｍ１
による抽出を５回行い、得られた抽出液を集め、４０℃
で回転蒸発法により濃縮乾固し、プロトカテキュ酸の粗
結晶２．５ｇを得た。得られた粗結晶は水により再結晶
させて精製して、プロトカテキュ酸の精製結晶２ｇを得
た。

［発明の効果コ 本発明の方法によれば、フタル酸から効率良くプロトカ
テキュ酸を製造することができる。

特許出願人　　日本合成ゴム株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロトカテキュ酸および／またはその塩の分解活
   性が消失もしくは低下しているシュードモナス属に属す
   る微生物を用いて、フタル酸および／またはその塩から
   プロトカテキュ酸および／またはその塩を製造すること
   を特徴とする、プロトカテキュ酸および／またはその塩
   の製造方法。