JPH01265022A - 哺乳動物の組織を再潅流損傷から守る組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえば血塊又は臓器ｆｌ復或いは移植手術
によって生じる虚血に続く再灌流の際に起ることが一般
に認められている組織損傷の抑制又は低減に関する。

虚血並びに再灌流後の組織に生じる損傷については、多
くの原因及び機構が提案されている。種々の原因並びに
機構がおそらくこの損傷に関与しているであろうが、実
験的根拠によって支持されている一服的な現在の理論は
再灌流の際の遊離基の生成を包含している。Ｓ　ｃ　ｉ
　ｅｎｃｅ　、　ＲｅｓｅａｒｃｈＮｅｗｓ（１９８７
年１月３０日）５２９−５３１頁所載Ｊ、Ｌ。

Ｍａｒｘ著’Ｏｘｙｇｅｎ　　Ｆ　ｒｅｅ　　Ｒａｄｉ
ｃａｌｓｌｉｎｋｅｄｔ。

Ｍａｎｙ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓ」を参照されたい。

心筋組織に関しては、最近の文献’Ｅｖｉｄｅｎｃｅｏ
ｆ　　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　　ｆｒｅｅ　　ｒａｄｉ
ｃａｌ　　ｉｎｊｕｒｙｄｕｒｉｎｇ　　ｅｌｅｃｔｉ
ｖｅ　　ｒｅｐａｉｒ　　ｏｆ　　ｔｅｔｒａｌｏｇｙ
　　ｏｆＦａｌｌｏＪ［Ｄｅｌ　　Ｎｌｄｏ等著、Ｃ１
ｒｃｕｌａｔｏｎ、ヱ６．！。

補１．−二■Ａ亘−（１９８７年）］は（恐らく酸素の
介在する遊離基機構によってひき起されると思われる）
脂質過酸化がファロー四徴候を治療する手術の間に小児
患者の場合に起ることを示している。心臓内の再灌流損
傷における遊離基の役割に関する現在の統一見解が１４
６の引例を挙げた’　Ｆ　ｒｅｅｒａｃ（１ｃａｌｓ　
　ａｎｄ　　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　　１ｓｃｈｅ＋ｓ
ｉａ　ａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　　１ｎｊｕｒｙ
」（Ｓ　ｉ＋＊ｐｓｏｎ及びＬ　ｕｃｃｈｅｓ　ｉ　。

Ｌ　見痣　９月１１組、１９８７年７月）と題する最近
の論証記事で論じられている。

Ｈａｎｓｓｏｎ等は’Ｋ　１ｄｎｅｙ　　ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｏｎ　　ｂｙｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ
　　ｆｒｅｅ　　ｒａｄｉｃａｌ　　ｓｃａｖｅｎｇｅ
ｒｓａｎｄ　　ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ：　　ｒｅｎａ
ｌ　　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　　ａｔ　　ｒｅｃ−ｉｒｃｕ
ｌａｔｉｏｎ　　　ａｆｔｅｒ　　　ｗａｒｍ　　　ｉ
ｓｃｈｅｍｉａ　　　１ｎｒａｂｂｉｔｓ」［ｃ月ｎ　
　Ｓｃｉ　　７１　２４５−２５１頁（１９８６年）１
と題する論文において、腎臓虚血は過酸化性損傷をもた
らすと結論した。同様に、Ｂ１１ｅｎｋｏ等［Ｂ　　ｕ
ｌｌ、　　Ｅｋｓ　　、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｍｅｄ、　
　９６゜９頁（１９８３年）］は腎臓再清流時の２，６
−ジーｔ−ブチル−４−メチルフェノールの抗虚血効果
はその脂質過酸化反応と抑制する能力に関係があると報
告した。

遊離基生成によるポリ不飽和脂肪酸の過酸化は、大脳の
虚血及び続く再灌流によってひき起される不可逆的細胞
損傷の主要因［Ｆｌａ＋＋＋＋ｎ等、Ｓ　ｔｒｏｋｅ９
．４４５−４４７頁（１９７８年）］及び外傷後のを髄
虚血の主要因［Ｈａｌｌ及びＷｏｌｆ　、　Ｊ　、　黒
止竺註１６４，９５１−９６１頁（１９８６年）］とし
て注目されている。

虚血皮膚弁の再？ＩＩ？ｆＬの間の生体外におけるビタ
ミンＥ、ビタミンＣ又は他の酸化防止剤による脂質過酸
化に対する遊離基除去及び細胞膜保護の役割がＨａｙｄ
ｅｎ等によって述べられている［ｋ払■Ｌ師Ａ」猛−９
７，１１７６ｉ１７９頁（１９８７年）コ。

肝臓虚血及び再灌流によってひき起される細胞損傷が遊
離基過酸化に基づいて説明されている［　Ｍａｒｕｂａ
ｙａｓｂｉ等、旦エコ且段−９９，１８４−１９２頁＜
１９８６年）］。

極めて親油性のビタミンＥ（α−トコフェロール）も、
幾分さらに水溶性の誘導体６−ヒドロキシ−２，５，７
，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏ
ｌｏｘ−Ｃとも云う、以後便宜上ＴＸ−Ｃと呼ぶことも
ある）もいずれも腐敗を遅らせる食品添加物として用い
られている公知の酸化防止剤である。ＴＸ−Ｃとアスコ
ルビ〉・酸の混合物も食品防腐剤として公知である［Ｃ
ｏｒｔ、米国特許第３，９０３，３１７号（１９７５年
９月２日）］。

ビタミンＥもＴｒｏｌｏｘ　Ｃも共にクマロン類であり
、その構造は下記に示す通りである。

ビタミンＥ Ｌ ｕｎ　　　　ｌ 虚血組織の再灌流時の組織の損傷程度を軽減させるため
のビタミンＥの予防的使用が腎臓について［Ｔ　ａｋｅ
ｎａｋａ等、工Ｈ１３１ａｎｔａｔ山ｔｎ　　３２，１
３７−１４１頁（１９８１年）］、脳について［Ｆｕｊ
ｉｍｏｔｏ等、旦μｍ。

Ｎｅｕｒｏｌ　２２，４４９−４５４頁（１９８４年）
コ、及び肝臓について［Ｍ　ａｒｕｂａｙａｓｈ　ｉ等
前掲書］述べられている。心臓については、ビタミンＥ
の予防的使用が二三の例では成功したように報告されて
いる［　Ｃａｖａｒｏｃｃｈ　ｉ等、Ｊ　、　ｊ狙工、
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　４０，５１９−５２７頁（１９
８６年）及びＳ　ａｒｒｅｔｔ等、Ｃａｒｄｉｏｌｏ　
ｉａ　　３１，５３９−５４４頁（１９８６年）；旦ユ
垣−１■巨、８４０６３８２３（１９８７年）］けれど
も、他の例では成功していない［Ｆ　ｅｒｒａｒｉ等、
Ａ　ｅｔａ　　Ｖ　ｉｔａｍｉｎｏｌ　　旦ユ■！垣−
−影呼吐、　６１−７０頁（１９８５年）コ、肺臓の場
合には、ビタミンＥは再灌流損傷に対して効果がなかっ
た［Ｂ１５ｈｏｐ等、ム。

Ｒｅｖ、　４．　Ｄｉｓ、　１３３　　ｐａｒｔ　２．
Ａ２７５頁（１９８６年）］。

Ｔｒｏｌｏｘ　Ｃを、過剰のアスピリンチミン又はフェ
ニルアラニンの存在下で用いるとき、アルコールデヒド
ロゲナーゼを放射線損傷から守ると報告されている［Ｇ
ｅｅ等、旦ｂ±、　　Ｊ　、　Ｒａｄｉｏｌ、　５８゜
２５１−２５６頁（１９８５年）］、Ｔｒｏｌｏｘ　Ｃ
が存在したときに試験した組成物中にエチレンジアミン
四酢酸が存在したかどうかはこの報告からは明かでない
。

報告された実験の中には供試アルコールデヒドロゲナー
ゼに対して少量のエチレンジアミン四酢酸−リン酸塩緩
衝液を用いたものもあった。

ズロビレングリコールに溶解させたＴｒｏｌｏｘ　Ｃが
ハロベンゼンの毒作用によって生じる過酸化性損傷から
ネズミの肝臓を守った［Ｃａ５ｉｎｉ等、Δｙ。

Ｊ　、　　Ｐａｔｈｏｌ、　１１８，２２５−２３７頁
（１９８５年）］けれども単離した肝細胞を除草剤の毒
作用から守らなかった［５ａｎｄｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　　Ｐｈｅｒｍａｃｏｌ、　３５．３０９５−３１０
１頁（１９８６年）］こともここに報告されている。こ
の場合、肝細胞は、予めアルブミンを添加したクレブス
ーヘンゼライト緩衝液に懸濁させた。また、Ｔｒｏｌｏ
ｘＣはカルシウムイオノホアによる潅流によって誘起さ
れた肺動脈圧力反応から単離したウサギの潅流肺臓を守
るとも報告された。この効果は酸化防止剤によるシクロ
オキシゲナーゼ及びリボオキシゲナーゼの活性の抑制に
帰せられるものであった。［Ｗ　ｏ　ｌ　ｆ及びＳｅｅ
ｇｅｒ、Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ。

Δμ但、斗廷、γ１３，３９２−４１０頁（１９８２年
）］。我々は、任意の組織内の再灌流損傷の処置又は防
止にＴｒｏｌｏｘ　Ｃを使用するといういかなる報告に
も接していない。

Ｋａｔｏ等［Ｊ　、　Ｍｅｄ、　Ｃ恒：ｍ、　３１，７
９３−７９８頁（１９８８年）］はネズミの心筋虚血の
ＬＡＤモデルの再灌流損傷を防ぐのに予防的に投与する
場合に、アスコルビン酸の若干のアシル化２．３−エン
ジオール同族体が有効であることを報告した。　Ｋａｔ
ｏ等は、さらに、ビタミンＥもアスコルビン酸もこのモ
デルには効果がなかったことを報告し、Ｗｏｏｄｗａｒ
ｄ及びＺａｋａｒｉａ［Ｊ　、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１
１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、　１７゜４８５−４９３頁（１
９３５年）〕は拘束後で再灌流前に加えたアスコルビン
酸は単離した潅流ネズミ心臓の不整脈を生じた再灌流モ
デルの心室細動の発生率及び持続期間を低減させたと報
告した。Ｋ　ｈｕｚｈａｍｂｅｒ−ｄｉｅｖ［旦１月−
，Ｅｘｐ、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１００．１１７
９−１１８１頁（１９８５年）］は慢慢性虚血性心疾患
者を治療する場合に予備的投与のビタミンＥの治療効果
を高めるためのビタミンＥ及びビタミンＣの併用投与を
提案した。

再灌流損傷を制限するためにビタミンＥを使用するとい
う文献中の報告は、１つの例外を除きすべて虚血現象の
若干時間前にビタミンＥを予防的に投与することを述べ
ている。通常の当業者は、発作前に治療薬を投与する効
果は急性損傷時に同じ薬を投与する効果を予示するのに
少しも役立つものではないことを知っている。脳の虚血
現象後にビタミンＥを投与した１つの報告事例では、ビ
タミンＥはフルオロカーボンビヒクル中の酸化防止剤の
複雑な混合物中の１成分であって、試験結果を任意の個
々の成分に帰することはできない［Ｏｂａ等、Ｎｏ　５
ｈｉｎｋｅｉ　Ｇｅｋａ（Ｎｅｕｒｏ±ユ」シシェリー
１３．１０５９−１０６５頁（１９８５年）　；　ミ■
ｙ且■ＰＡ　ｅ　ｄ　ｉ　ｃ　ａ８５２４０９８８コ。

今日までのところ、再灌流損傷を防止するために報告さ
れたもっとも効果のある虚血後の処置法はスーパーオキ
シドジムスターゼ（ＳＯＤ）によって得られている。こ
のように、たとえば、Ａｍｂｒ−ｏｓｉｏ等［Ｃ１ｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ　７４，１４２４−１４３３頁（１９８
６年）］は虚血イイヌ風の再灌流と同時に行うＳＯＤ潅
流（単独又はカタラーゼと共に）は対照イヌの梗塞の大
きさが危険領域の５２．２＄に対して、梗塞の太きさが
危険領域の侃か３３．６＄Ｆ著な３６％の改善）となっ
たことを報告している。

後述するように、驚くべきことだが、心筋虚血において
、本発明の処置法はＳＯＤに対して報告された保護作用
よりもさらに優れた保護作用を与える［梗塞が対照の場
き危険領域の２７．４ｇに対して、危険領域の８．２１
（約８０％の改善）］ことを知った。

従って、本発明人は、好ましくはアスコルビン酸ととも
に、好ましくは塩水に溶解し、突貫的に虚血組織の再灌
流と同時に、Ｔｒｏｌｏｘ　Ｃを投与することは、再灌
流損傷の防止又は軽減に極めて効果的な方法であること
を発見した。

より詳細には、本発明によれば、虚血に続く再灌流に関
連する組織損傷から哺乳動物分守り、該哺乳動物の血液
循環流動中に再灌流損傷を抑制するのに有効な量のクロ
マン化合物６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメ
チルクロマン−２−力ルボン酸、又は該クロマンとアス
コルビン酸との混合物を加えることを含んでなる方法が
提供される。

別の態様においては、本発明は虚血後の再灌流に関連が
ある組織損傷から哺乳動物を守るための組成物で、薬剤
として許容しうるビヒクル中に効果的な量の６−ヒドロ
キシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カ
ルボン酸又は該クロマンとアスコルビン酸の温き物を含
んでなる組成物を提供する。Ｔｒｏｌｏｘ　Ｃの酸化の
危険性をできるだけ少なくするために、該組成物はＴｒ
ｏｌｏにＣの酸化の触媒作用をする恐れがある任意の金
属イオン（たとえば鉄）を除くために薬剤として許容し
うるキレート化剤（たとえばエチレンジアミン四酢酸）
を含むべきである。同様の理由で、使用する薬剤として
許容しうるビヒクルは使用前にできるだけ酸素の存在を
なくすように処理すべきである。

このことは、たとえば長時間窒素でパージすることによ
って達成することができる。組成物は蛋白質を含まない
ものであるべきである。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の処理を行
うのに好適な組成物を調製する方法を提供し、この方法
は下記よりなる。すなわち、（１）生理的食塩水中の酸
素含量を低減させるために約１乃至約３時間該液中に窒
素をバブルさせること。

（２）前記窒素のバブルを続けながら該食塩水１リット
ル当り約２５乃至約５０ｍｙのエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）を加えること。

（３）窒素バブルを続けながら該食塩水１リットル当り
約４−６ｍｇのアスコルビン酸を加えること。

（４）撹拌及び窒素バブルを行いながら該食塩水１リッ
トル当り約３乃至約６「＃りのＴＸ−Ｃを加えること。

（５）　　Ｔ　Ｘ−Ｃの溶解度を高めるように水酸化ナ
トリウムを徐々に（約２乃至１０分かけて）加えて得ら
れた溶液のｐＨを約１２に調整すること。

（６）ｐＨを約６．５乃至約８．０の範囲内の値より低
いか又は等しくするように食塩水１リットル当り約２乃
至約６ｍｇのアスコルビン酸又は十分な塩酸を加えるこ
と、及び （７）ｐＨを約６．５乃至約８．０の範囲内の値に調整
する必要がある場合には、必要な程度まで徐々に（約２
乃至１０分かけて）水酸化ナトリウムを加えること。

本発明の処置に用いる好適な組成物においては、ＴＸ−
Ｃ又はアスコルビン酸を伴うＴＸ−Ｃは液体溶液として
提供される。より好ましくは、該溶液は、水、塩化ナト
リウム、ＴＸ−Ｃ、アスコルビン酸及びエチレンジアミ
ン四酢酸よりなる生理的食塩水である。好ましくは、該
溶液は約６．５乃至約８．０の範囲のｐＨを有する。よ
り好ましくは、そのｐＨは約７．２乃至約７．８の範囲
にあり、もっとも好ましく、約７．４である。本発明に
よる好適な組成物は、生理的食塩水１リットル当り、約
３乃至約６グラムのＴＸ−Ｃ１同１リットル当り約４乃
至約１０グラムのアスコルビン酸、同１リットル当り約
２５乃至約５０彌９のエチレンジアミン四酢酸、及び所
望のｐＨとするのに必要な量の水酸化ナトリウノ、及び
塩酸が加えられた生理的食塩水よりなる。心筋層保護用
として現在特に好ましい組成物は、１リットル当り約３
．５乃至約４．５グラム、もっとも好ましくは約４グラ
ムのＴＸ−Ｃ１１リッ１ヘル当り約５乃至約８グラム、
もつとも好ましくは約６グラムのアスコルビン酸、及び
１リットル当り約３０乃至４０ｍｇ、もっとも好ましく
は約３６ｍｇのエチレンジアミン四酢酸を含んでいる。

肝臓保護用としての現在好適な組成物は、１リットル当
り約６グラムのＴＸ−Ｃ１１リットル当り約６グラムの
アスコルビン酸、及び１リットル当り約４０１１１ｆＦ
のエチレンジアミン四酢酸を含んでなる。

上記の現在好適なビヒクルの代りに薬剤として許容しう
る他のビヒクルを用いることができる。

従って、たとえば、生理的食塩水を約２乃至約５％（重
量／容量）デキストロース溶液、又は乳酸添加リンゲル
液、又は有効成分と相溶性がある任意の他の通常用いら
れる静脈注射用溶液で置換えることができる。同様に、
筋肉内又は腹腔的投与の必要に応じて、上記ビヒクル又
は許容しうる変形を適用させることができよう。さらに
、ＴＸ−Ｃ又はＴＸ−Ｃ／アスコルバートは心臓血管手
術の間心筋保護のために心停止液、たとえばロー民情（
Ｒｏｅｓ’５ｏｌｕｔｉｏｎＪ中に投与することができ
る０本発明による組成物を作るためにＴｒｏｌｏｘ　Ｃ
を加えることができる他の組成物には等張デキストロー
ス、リンゲルのＢ　ｒｅｔｓｃｂｅｉｄｅｒ心停止液、
５ｔＴｌ＋ｏｍａｓ　　ｎｏ、　１　、２　、及び３、
Ｓ　ｔａｎｆｏｒｅｌ＋ｎｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｃｏｆｆ
１ｎｓ、ライスコンシン大学（Ｂ　ｅ　１ｚｅｒ’　ｓ
）、クレブスーヘンゼライト又はジトリアゼノ・、ベル
パミール、ニフェジピン、或いはカルシウムブロッカ−
を含むような池の心停止液がある。さらに、薬剤として
許容しうる任意のＴＸ−Ｃと相溶性のある経口ビヒクル
を経口投与用、たとえばビタミンＥの経口投与に用いら
れるようなゲル或いはカプセルとして用いることができ
よう。

本発明の組成物中にアスコルビン酸をＴＸ−Ｃの強化剤
として使用することは好ましいけれども、ＴＸ−Ｃと相
溶性があり、かつＴＸ−Ｃの酸化を阻止すると思われる
有効量の他の、薬剤として許容しうる物置でアスコルビ
ン酸の全部又は一部を置換えることもできよう。これら
のものには、たとえば、メルカプトエタノール、ジチオ
トレイトール、グルタチオン、システィン等がある。非
経口的、たとえば静脈内又は動脈内で使いたい場合には
、用いる組成物は滅菌されていることが重要である。

本発明による現在のところ好ましい組成物を調製する現
在のところ好適な方法は下記の工程よりなる。すなわち
、 （１）生理的食塩水中の酸素含量を低減させるために、
約１乃至約３時間の間該生理的食塩水中に窒素をバブル
させる工程。

り２）窒素のバブルを続けながら、前記食塩水１リット
ル当り約３０乃至約４０＋ｎｆのＥＤＴＡを加える工程
。

（３）窒素バブルを続けながら、前記食塩水の１リット
ル当り約４乃至６グラムのアスコルビン酸を加える工程
。

（４）撹拌及び窒素バブルを行いながら、前記食塩水１
リットル当り約４グラム乃至約６グラムのＴＸ−Ｃを加
える工程。

（５）ＴＸ−Ｃの溶解度を高めるように、水酸化すＩ〜
リウノ＼を徐々に加えて得られた溶液のｌ）Ｈを約１２
に調整する工程。

（６）心筋保護液の場きには、前記食塩水１リットル当
り約１乃至約４グラム、好ましくは約２グラムのアスコ
ルビン酸を添加し、肝臓保護液の場合には、好ましくは
塩酸を添加し；いずれの場合にも約６．５乃至約８．０
、好ましくは約７．２乃至約７８、もつとも好ましくは
約７．４よりも低いか又は等しいｐＨを得るように十分
な酸を加える工程。

及び （７）　　ｐＨを約６．５乃至約８．０、好ましくは約
７．２乃至約７８、もっとも好ましくは約７．４に調整
する必要がある場きには、必要な程度まで徐々に水酸化
ナトリウムを加える工程。

本発明の現在のところ好ましい処置によれば、吐乳動物
に対してたとえば心停止法、心臓手術、発作、又は組織
或いは臓器移植の間に起るような血流が一時的に弱まっ
た組織の再灌流開始と実質的に同時に、静脈内又は動脈
内に本発明の好適な組成物（その内容及び助製法につい
ては前述した）を投与することによって、吐乳動物は再
灌流損傷から守られる。本発明の組成物の投与は、再灌
流が始まる約０５乃至約５分前、もつとも好ましくは再
灌流が始まる約０．５乃至約１分前に開始し、再灌流開
始後約２乃至約５分間継続することがさらに好ましい。

本発明の組成物は直接血流中に加えることが現在のとこ
ろ好ましい投与方法であるけれども、本発明は、また適
当な状況下での筋向のみならず腹腔的投与も意図してい
る。本発明の範囲内の他の適当な投与形態には、特に心
臓バイパス又は臓器或いは組織移植を含む予定された手
術のような状況の場合に、単独又は前記の池の投与形態
と組きせて経口又は心停止性投与がある。

下記の実施例は本発明の詳細な説明するために示すもの
である。

夫施贋ユニ ＴＸ−Ｃ溶液を次のようにして調製した。

溶解０２を減少させるために２−３時間窒素（Ｎ２）を
液中にバブルさせて５００Ｊの生理的食塩水を処理した
。次いで撹拌及びＮ２のバブルを続けながら、１８ｍｙ
のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加え、続いて
２０００　ｍ　ｇのアスコルビン酸を加えた。次に撹拌
及びＮ２のバブルを行いながら２０００ｎ＋ｇのＴＸ−
Ｃを加え、さらにＴＸ−Ｃを可溶化させるためにＮａＯ
Ｈ’″Ｃ′ｐＨを約１２に調整した。５分以内に分光的
に透明なく均質な）溶液が得られた。ＴＸ−Ｃの溶解後
、１０１００Ｏのアスコルビン酸を加え、さらにＩ）Ｈ
を約７．４とするために十分なＮａＯＨを加えた。

ＬＡＤ（左前下行技冠動脈）局所虚血２時間に続く再灌
流４時間のイヌモデルを使用した。心臓摘出後水銀柱１
００　＋ｎｏ＋圧力（生理的冠潅流圧力）で潅流させた
エバンズブルー及びトリフェニルテトラゾリウノ、塩酸
塩を用いる二重染色法によって危険領域及び梗塞領域を
評価した。より詳細には、約１５乃至２５ｋｙの体重の
イヌに、ＬＡＤを２時間閉塞し、次いで４時間再灌流さ
せた。これが「無処理の」対照物であった。同じモデル
について、２．０ｇのＴｘ−ｃ、３．ｏｌ？のアスコル
ビン酸、及び１８ＢのＥＤＴＡｆ！：含む５００ｍｍｇ
の食塩水（前記のように調製）を再灌流３０秒前から始
めさらに再灌流の初期３分間供試イヌの上行大動脈中に
迅速に注入した。再灌流４時間後、心臓を摘出して、エ
バンズブルー及びテトラゾリウノ、染色を行って危険領
域及び梗塞された領域を確認した。

第１表に示すように、医療用再灌流（対照〉は危ｔ６ｊ
Ｈｉａｔ４）２７．４＋／−４，８＄ノ梗塞形成（Ｎ　
＝　７　）となり、Ｔｒｏｌｏｘ−アスコルバート再灌
流は危険領域の８．２＋７１．６＄（Ｎ　＝　７　）の
梗塞を形成した。不対Ｔ試験の結果は、自由度１２及び
Ｐζ０．００１で３．８２という値になる。（我々の知
る限りでは、この値は今日までに報告された任意の治療
介入による虚血２時間後の局所心筋壊死のもっともｍ著
な減少である。） 用いた外ｆｌ的及び病理学的手法の詳細は次の如くであ
る。

いずれの場合も、雑種犬をベンｌ−パルビタールナトリ
ウム＜３０　＋ｎｇｙ’ｋｇ　ｒ　Ｖ　）で麻酔にかけ
、管を挿入して、バーバードＩＩ’Ｆ吸機械で通気する
。滅菌状況下で第５左肋間腔から胸壁切開を行い、左肺
を静かに退縮させて、心膜を切除する。血液ガス試料を
得るためにカテーテルを右大腿動脈内に入れる。血圧を
監視するために別のカテーテルを左大腿動脈含経て中心
大動脈に押込める。第３のカテーテルを大腿静脈内に入
れて静脈注射用に使用する。ＬＡＤを最初の対角部に対
して末端部近くで単埴して、３乃至５＋Ｉ１ｍの部分に
切り分ける。心臓を注意深く調べ、右すなわち回旋動脈
からの任意の大側副管を心室頂部近傍で結さつして、虚
血の復原領域を与える。ＬＡＤ冠動脈周辺にドプラーフ
ロープローブを置いて、虚血に伴う血流の乏損を、再）
Ｍ流に伴う血流の回復を確めるのに使用する。

危険領域及び梗塞領域はそれぞれエバンスブルー及びト
リフェニルテトラゾリウム塩酸塩を用いる二重染色法で
評価されるが、両者は心臓摘出後水銀柱１００ｍｍ圧（
生理的冠潅流圧力）で注入される。カニユーレは近位大
動脈及び閉塞位のＬＡＤ内に挿入する。Ｌ　Ａ　Ｄ床は
テトラゾリウ１．１．５Ｘの２０ミリモルリン酸塩緩衝
液（１）Ｈ７，４，３８℃）を潅流させ、大動脈は０．
２５＄エバンスブルーダイを前方に濯流さ伊る。

第１表 一社工り日℃−エボニニ９力１シー ２０、ＯＡ　Ｎ／　Ａ　Ｒ”　　　　６．８　Ａ　Ｎ　
／　Ａ　Ｒｔ２１．６　　　　　　　　５．６ １８．５　　　　　　　１５．９ ２０．８　　　　　　　　５．５ ４３．６　　　　　　　　８．２ １９．３　　　　　　　　４．１ 〔彰　　　　　　　迂」 ２７゜４ｚ　　　　平均　　　　８．２ｚ４．８＄　　
　ＩｓＥＭ　　　１．６＄　　　Ｎ７ Ｔ試験−３，８２（自由度１２．Ｐぐ０．００１）ｔＪ
１！死（梗塞）の領域／危険領域 実ｊ１号」− ＴＸ−Ｃ溶液を次のように調製した。

２０＋ｎｙのＥＤＴＡを含む５００＋ａＬの生理的食塩
水中に窒素をバブルさせた。１時間後、３ｇのアスコル
ビン酸を加え、続いて３ｇのＴＸ−Ｃを加えた。ＴＸ−
Ｃの溶解を助けるなめに、５ＮＮａＯＨを加えてｐＨを
１２に調整した。ＴＸ−Ｃが完全に溶解した後、塩酸で
ｐＨｐ７．４に再調整した。溶液調製の間は、溶液中に
絶えず窒素をバブルさせた。

肝臓虚血を機械的に誘起させたネズミのモデルを使用し
た。壊死の重量％は、テトラニトロＢＴ染色の代りにテ
トラゾリウムブルークロリドを用いるＦ　ｅｄｅｒｉｋ
ｓ等の方法［１組、　Ｍｏ１．　Ｐａｔｌ＋ｏｌ。

４１．１１９１２５頁（１９８４年）］によって求めた
。ｌｌ１Ｌａｃｈｉ７０５オートアナライザーを用いて
、血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ転移酵素）を測定
した。

体重が３００乃至６００ｇの雄のＳ　ｐｒａｇｕｅＤａ
ｗｌｅｙ種のネズミ分用いた。手術の直前、動物に１０
１１１１９のゲンタマイシンを筋肉的投与し、ニスレイ
ン（ｅｔｈｒａｎｅ）吸入剤で麻酔にかけ、腹腔内にヘ
パリン（１００Ｕ／Ｊｙ）を注射した。次に小児用５ａ
ｔｉｎｓｋｙ血管鉗子を用いて肝動味及び門脈を７０分
間閉塞した。３＋ｎＬポーラスのＴｒｏｌｏｘ及びアス
コルビン酸溶液又は対照溶液（アスコルビン酸又はＴｒ
ｏｌｏｘを含まない通常の食塩水及びＥＤＴＡのビヒク
ル）を、閉塞解除の４５秒前から始めて再灌流の初めの
２分間の間、バタフライ針を用いて右腎静脈を通して注
入した。次に動物に陰茎静脈中に４ｍｌポーラスの３．
７５１重炭酸ナトリウムを投与した。アスパラギン酸ア
ミノ転移酵素（八ＳＴ）の生化学測定並びに共１スジエ
ン測定用に０．１２゜及び４８時間反に血液を採取した
。４８時間反、動物を麻酔にかけ、除血によって死亡さ
せた。肝臓を取り出して組織学的分析にさきだって室温
の食塩水中に入れた。４８時間まで生きていた動物のみ
を壊死及び血清ＡＳＴｊｌの分析用に使用した。

対照動物の４０−５０％については、閉塞解除後の数時
間以内に死亡し、ＴＸ−Ｃ処理動物の中には４８時間の
試験期間中には死亡がなかったということは注目に値し
た。ネズミの死亡率に対するこの効果は再灌流損傷から
肝臓組織を保護するという点で、ＴｒｏｌｏｘＣの効果
をおそらくもっとも効果的に示すものであろう、処理動
物の２倍の対照動物を用いることによって、４８時間の
時点で略々同数の肝臓を得ることができよう。対照グル
ープ（Ｎ　＝　６　）は２４．５＋／−１１，０％（７
［死ヲ示Ｌ４：モのに対し、Ｔｒｏｌｏｘで処理したグ
ループ（Ｎ　＝　７　）は４．５＋／−２，５ｍｇの壊
死を示した。従って、外科手術的に誘起される肝臓虚血
後の再灌流の際に通常失われる組織の８２％がＴｒｏｌ
ｏｘＣの投与によって救われた。４８時間後の壊死の度
合を反映して、対照動物の血清ＡＳＴはＴｒｏｌｏｘ処
理動物の血清ＡＳＴの３倍であった：９７８＋／−３６
９ＩＵ／Ｌ対３０１＋／−１１４ＩＵ／Ｌ。

特許庁長官　　　吉　１）文　毅　殿 ｌ、　・ｊ（件の表示 平成１年特許願第２７３１３号 ２、発明の名称 哺乳動物の組織を再：イＬ流損傷から守る組成物及び方
法３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　（７０７）イーストマン・コダック・カンパ
ニー４、代理人 住　所　　東京都千代田区大千町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 ５、補正の対象 手続補正書 平成昭和元年　５月　２日 特許庁長官　吉　田文　毅　縦Ｊ払 １、事件の表示 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　（７０７）　イーストマン・コダック・カンパ
ニー４、代理人 ６、補正の内容 明細書第１２頁第１２行目と第１３行目の間に以下の記
載を挿入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、虚血に続く再灌流に関連する組織損傷から哺乳動物
   を守る薬剤で、再灌流損傷を抑制するのに有効な量のク
   ロマン化合物６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラ
   メチルクロマン−２−カルボン酸を含む薬剤。 ２、前記クロマン化合物の損傷抑制効果を高めるのに十
   分な量のアスコルビン酸を前記哺乳動物に投与すること
   を、さらに含んでなる請求項１記載の薬剤。 ３、虚血後の再灌流に関連する組織損傷から哺乳動物を
   守る、蛋白質を含まない組成物において、薬剤として許
   容しうるビヒクル中に有効量の６−ヒドロキシ−２，５
   ，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸及び
   存在するいささかの鉄をもキレート化させるだけの量の
   薬剤として許容しうるキレート化剤を含んでなる組成物
   。 ４、さらにアスコルビン酸を含んでなる請求項３記載の
   組成物。 ５、水、塩化ナトリウム、前記クロマン化合物、アスコ
   ルビン酸、及びエチレンジアミン四酢酸よりなる塩水を
   含む請求項４記載の組成物。 ６、７．２乃至７．８の範囲のｐＨを有する請求項４記
   載の組成物。 ７、生理的食塩水１リットル当り約３乃至６グラムの前
   記クロマン化合物、同１リットル当り約４乃至約１０グ
   ラムのアスコルビン酸、同１リットル当り約２５乃至約
   ５０ｍｇのエチレンジアミン四酢酸、及びｐＨを６．５
   乃至８．０の範囲とするのに必要な量の水酸化ナトリウ
   ムが添加された生理的食塩水を含んでなる請求項５記載
   の組成物。 ８、非経口投与に適する形状である請求項３乃至請求項
   ７の任意の１つの項に記載の水性滅菌組成物。 ９、下記工程よりなる請求項７記載組成物の調製方法。 （１）前記溶液中の酸素含量を低減させるために約１乃
   至約３時間の間生理的食塩水中に窒素をバブルさせる工
   程、 （２）前記窒素のバブルを継続しながら前記エチレンジ
   アミン四酢酸を加える工程、 （３）前記窒素のバブルを継続しながら前記溶液の１リ
   ットル当り約４乃至６ｇのアスコルビン酸を添加する工
   程、 （４）撹拌及び窒素バブルを行いながら前記クロマン化
   合物を添加する工程、 （５）前記クロマン化合物の溶解度を高めるように水酸
   化ナトリウムを徐々に加えて得られた溶液のｐＨを約１
   ２に調製する工程、 （６）ｐＨを約６．５乃至約８．０の範囲内の値より低
   いか又は等しくするようにアスコルビン酸又は塩酸を加
   える工程、及び （７）ｐＨを前記範囲内に調整する必要がある場合には
   、必要な程度まで水酸化ナトリウムを徐々に加える工程
   。