JPH01165399A - 組換えヒトインターロイキン２およびその製造法 - Google Patents
組換えヒトインターロイキン２およびその製造法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えヒトインターロイキン２およびその製造
法に関する。
法に関する。
インターロイキン２はその特異な免疫応答作用から医薬
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
トＴ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
トＴ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
１５２巻、 １７０９頁、 １９８０年）。
しかし、このヒトＴ白血病細胞株によるインターロイキ
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の方法として、イン
ターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクターに
組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微生
物により生産させることが考えられる。
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の方法として、イン
ターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクターに
組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微生
物により生産させることが考えられる。
本発明者らは微生物により生産させるために必要なイン
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
本発明はヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しない組
換えヒトインターロイキン２ならびにその製造法に関し
、さらには分子内に次のアミノ酸配列を含む、ヒト由来
の他の蛋白質を実質的に含有しない組換えヒトインター
ロイキン２ならびに次のアミノ酸配列を含むインターロ
イキン２をコードする遺伝子を含有するベクターを有す
る形質転換体を培地に培養することを特徴とする上記組
換えヒトインターロイキ′／２の製造法に関する。
換えヒトインターロイキン２ならびにその製造法に関し
、さらには分子内に次のアミノ酸配列を含む、ヒト由来
の他の蛋白質を実質的に含有しない組換えヒトインター
ロイキン２ならびに次のアミノ酸配列を含むインターロ
イキン２をコードする遺伝子を含有するベクターを有す
る形質転換体を培地に培養することを特徴とする上記組
換えヒトインターロイキ′／２の製造法に関する。
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ｅｕｈｒ 本発明のヒトインターロイキン２は以下のアミノ酸配列
Ｉまたは１１を有するものである。
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Ｉまたは１１を有するものである。
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Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕｈｒ 本発明のヒトインターロイキン２はインターロイキン２
活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
ベクターを有する形質転換体を培地に培養することによ
り得られる。この遺伝子は、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素
ＢｓｔＮＩ、 ＸｂａＩおよびＢｓｔＮＩで切断される
個所がこの順序で配置されている部分を含み、以下のポ
リペプチドＩ又は！■をコードするものであり、以下の
塩基配列！又はＩＩを有するものである。
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Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕｈｒ 本発明のヒトインターロイキン２はインターロイキン２
活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
ベクターを有する形質転換体を培地に培養することによ
り得られる。この遺伝子は、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素
ＢｓｔＮＩ、 ＸｂａＩおよびＢｓｔＮＩで切断される
個所がこの順序で配置されている部分を含み、以下のポ
リペプチドＩ又は！■をコードするものであり、以下の
塩基配列！又はＩＩを有するものである。
ポリペプチド■
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ＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＡＣＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２３画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｎ＋ＲＮＡと略称する。）より調製される
。即ち、インターロイキン２産生能を有するリンパ球由
来細胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜
１２３画分のｍＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えば
エシェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエ
シェリヒア・コリ細胞内で増巾せしめ、インターロイキ
ン２ポリペプチドを発現しつるＤＮＡを有するクローン
を単離し、単離されたクローンが有するプラスミド中に
挿入されているＤＮＡを分離すればよい。
ｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮ Ｌｅｕ ＧＩＮＬｅｕ Ｇｌｕ
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ｇ Ｔｒｐｌｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ｌｉｅ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕｈｒ 塩基配列■ ＡＴＧ ＴＡＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣＣＴＧ
ＴＣＴ ＴＧＣＡＴＴ ＧＣＡＣＴＡ ＡＧＴ ＣＴ
Ｔ ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＴＣＡＣＡ ＡＡＣＡＧＴ Ｇ
ＣＡ ＣＣＴＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＣＡ
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ＡＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴＴＴＧ ＡＡ
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ＡＴＴ ＡＣＣＴＴＴ ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＧ
ＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＡＣＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２３画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｎ＋ＲＮＡと略称する。）より調製される
。即ち、インターロイキン２産生能を有するリンパ球由
来細胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜
１２３画分のｍＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えば
エシェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエ
シェリヒア・コリ細胞内で増巾せしめ、インターロイキ
ン２ポリペプチドを発現しつるＤＮＡを有するクローン
を単離し、単離されたクローンが有するプラスミド中に
挿入されているＤＮＡを分離すればよい。
本発明においてインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドをコードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに
接続して得られた組換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に導
入すれば、その微生物をインターロイキン２生産能を有
するように形質転換することができる。
チドをコードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに
接続して得られた組換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に導
入すれば、その微生物をインターロイキン２生産能を有
するように形質転換することができる。
ｍＲＮＡは、上記したように、インターロイキン２に対
応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２３画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出１分離することによって製造できる。
応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２３画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出１分離することによって製造できる。
本発明に用いるインターロイキン２産生能を有するヒト
リンパ球由来細胞を例として説明すれば、ヒト末梢血、
扁桃腺、 １！１！臓等より得られるリンパ球そのもの
も含まれる。また、これらのリンパ球をナイロンカラム
処理、抗血清−補体処理。
リンパ球由来細胞を例として説明すれば、ヒト末梢血、
扁桃腺、 １！１！臓等より得られるリンパ球そのもの
も含まれる。また、これらのリンパ球をナイロンカラム
処理、抗血清−補体処理。
密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガラクト
ース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並びにＸ
線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理等に
よりインターロイキン２の産生能が付与されたものも本
発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。さらに、これ
らヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴリンパ球をＴリ
ンパ球成長因子等の存在下にクローン化したように、ク
ローン化したものも好ましいヒトリンパ球由来細胞であ
る。
ース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並びにＸ
線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理等に
よりインターロイキン２の産生能が付与されたものも本
発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。さらに、これ
らヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴリンパ球をＴリ
ンパ球成長因子等の存在下にクローン化したように、ク
ローン化したものも好ましいヒトリンパ球由来細胞であ
る。
また、ヒト白血病細胞およびＴリンパ腫細胞のようなヒ
トリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞
を上記のような前処理もしくは変異処理したものまたは
悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒトリ
ンパ球由来細胞として用いることができる。特にクロー
ン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い
。
トリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞
を上記のような前処理もしくは変異処理したものまたは
悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒトリ
ンパ球由来細胞として用いることができる。特にクロー
ン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い
。
さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＣＥＭ。
Ｍｏ１ｔ４Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる、いわゆるバイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
られる、いわゆるバイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
これらヒトリンパ球由来細胞には（１）自発的にインタ
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ヒトリンパ球由来細胞にインターロイキン２ｍＲＮＡを
生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産土株
を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養すれ
ばよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を産
生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ロ
ーズウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート１
８４０ （以下、ＲＰＭＩ １６４０と略記する。）培
地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂａｃｃｏ’
ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ）培地、クリック
培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有し
ても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜
４ Ｘ １０６個／ｍＪの細胞密度で懸濁し、ここにマ
イトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；
塩化亜鉛等の亜鉛化合物ニブロチインＡ、ストレプトリ
ジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後
、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産土株
を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養すれ
ばよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を産
生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ロ
ーズウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート１
８４０ （以下、ＲＰＭＩ １６４０と略記する。）培
地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂａｃｃｏ’
ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ）培地、クリック
培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有し
ても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜
４ Ｘ １０６個／ｍＪの細胞密度で懸濁し、ここにマ
イトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；
塩化亜鉛等の亜鉛化合物ニブロチインＡ、ストレプトリ
ジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後
、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
マイトゲン刺激の際にマクロファージやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
ＩＩｍやＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
［１ａｕｄｉ、 Ｋ５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共
存させると同様にインターロイキン２の産生能がみられ
るような細胞があり、これらの細胞を用いてインターロ
イキン２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの
細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このようにす
ると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
ＩＩｍやＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
［１ａｕｄｉ、 Ｋ５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共
存させると同様にインターロイキン２の産生能がみられ
るような細胞があり、これらの細胞を用いてインターロ
イキン２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの
細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このようにす
ると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることができることが判っ
た。
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることができることが判っ
た。
リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン２のｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
、インターロイキン２のｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間である。徒
らに培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン２
のｍＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭ＾やＴＰＡなとのホルボールエステル類を
１０〜５０ｎｇ／ｍｉｌ 添加することもある。培養温
度は３２〜３７℃の範囲が望ましい。
らに培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン２
のｍＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭ＾やＴＰＡなとのホルボールエステル類を
１０〜５０ｎｇ／ｍｉｌ 添加することもある。培養温
度は３２〜３７℃の範囲が望ましい。
以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒト
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
（イ）リンホカイン自発産生株の取得
ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハツチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）をｌＸｌ０’個／ｍｚの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合計ａ、ｏｏｏレントゲンのＸ線照射を行なう。この
後、本細胞を０．１細胞／２００μｐの細胞密度で９６
穴の平底マイクロタイタープレート（「ファルコン３０
７２Ｊ ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリック培
地中で３週間３７℃にて５％Ｃ０２インキユベーター中
にて培養する（限界希釈法によるクローニング）。細胞
の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面
全体をおおう密度に到達する前に２４穴のタンク社製培
養プレートに移し、２ｍｌのクリック培地中にて５日間
細胞を増殖させる。
（フレッド・ハツチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）をｌＸｌ０’個／ｍｚの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合計ａ、ｏｏｏレントゲンのＸ線照射を行なう。この
後、本細胞を０．１細胞／２００μｐの細胞密度で９６
穴の平底マイクロタイタープレート（「ファルコン３０
７２Ｊ ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリック培
地中で３週間３７℃にて５％Ｃ０２インキユベーター中
にて培養する（限界希釈法によるクローニング）。細胞
の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面
全体をおおう密度に到達する前に２４穴のタンク社製培
養プレートに移し、２ｍｌのクリック培地中にて５日間
細胞を増殖させる。
十分量の細胞が得られた場合には、本細胞を２×１０６
個／＋ｎＩ！の細胞密度にて血清も血清由来アルブミン
も含まない無血清合成培地２ｍＡに懸濁して２日間培養
し、本培養上清を３．００Ｏｒｐｍ、 ５分間の遠心
分１１３Ｉ操作で分離し、次いで０．２２μのミリポア
フィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行なってインタ
ーロイキン２を得る。こうして得られるクローン細胞よ
りインターロイキン２産生株が得られる。
個／＋ｎＩ！の細胞密度にて血清も血清由来アルブミン
も含まない無血清合成培地２ｍＡに懸濁して２日間培養
し、本培養上清を３．００Ｏｒｐｍ、 ５分間の遠心
分１１３Ｉ操作で分離し、次いで０．２２μのミリポア
フィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行なってインタ
ーロイキン２を得る。こうして得られるクローン細胞よ
りインターロイキン２産生株が得られる。
（ロ）ヒト末梢血Ｔリンパ球よりインターロイキン２産
生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をｌＸｌ０’個／ｍｉ＋の細胞密度でクリック培
地に懸濁し、各２ｍβ宛２４大のタンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ
社製）を５μｇ／ｍβの終末濃度になるように１００μ
！！添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細
胞を培養液で洗浄し、再びｌＸｌ０’個／ｍｊ！の細胞
密度で元のタンクの培養プレートに１ ｍＩ！宛まく。
生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をｌＸｌ０’個／ｍｉ＋の細胞密度でクリック培
地に懸濁し、各２ｍβ宛２４大のタンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ
社製）を５μｇ／ｍβの終末濃度になるように１００μ
！！添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細
胞を培養液で洗浄し、再びｌＸｌ０’個／ｍｊ！の細胞
密度で元のタンクの培養プレートに１ ｍＩ！宛まく。
各ウェルにヒトの牌臓細胞をコンカナバリンＡ（以下、
ＣｏｎＡと略称する。）２．５μｇ／ｍｊ！で４８時間
刺激して得たコンディショニングした培養液を１ ｍＲ
添加し、３日間同様の培養を繰り返し、ヒト末梢血より
得たＴリンパ球を長期継代培養する。このように長期継
代培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法
でクローニングおよび細胞増殖を行なう。こうして得ら
れたクローン化Ｔリンパ球をｌＸｌ０’個／ｍβの細胞
密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、ここに１０４
１０４ｌ７の終末濃度になるようにフィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）を添加し、２４時間、３７℃で７．５％Ｃ
０２インキユベーター中にて培養し、本培養上清を３，
０００ｒｐｍ、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次
いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化を行ない
インターロイキン２が得られる。こうして得られるクロ
ーン化細胞よりインターロイキン２産生株が得られる。
ＣｏｎＡと略称する。）２．５μｇ／ｍｊ！で４８時間
刺激して得たコンディショニングした培養液を１ ｍＲ
添加し、３日間同様の培養を繰り返し、ヒト末梢血より
得たＴリンパ球を長期継代培養する。このように長期継
代培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法
でクローニングおよび細胞増殖を行なう。こうして得ら
れたクローン化Ｔリンパ球をｌＸｌ０’個／ｍβの細胞
密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、ここに１０４
１０４ｌ７の終末濃度になるようにフィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）を添加し、２４時間、３７℃で７．５％Ｃ
０２インキユベーター中にて培養し、本培養上清を３，
０００ｒｐｍ、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次
いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化を行ない
インターロイキン２が得られる。こうして得られるクロ
ーン化細胞よりインターロイキン２産生株が得られる。
（ハ）マイトゲン刺激でインターロイキン２を生産する
ヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカット
細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ−
１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地中にてＣｏｎＡ １１０１ｔ／ｒ
ｎＲやＰ）ＩＡ ２．ｊμｇ／ｍｉ’ の存在下に２
４時間培養すると、１０〜４，０００車位／ｍｆのイン
ターロイキン２を産生ずることが判明した。また、塩化
亜鉛、プロティンＡ、ピシバニール存在下に培養しても
、インターロイキン２を産生ずる。
ヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカット
細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ−
１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地中にてＣｏｎＡ １１０１ｔ／ｒ
ｎＲやＰ）ＩＡ ２．ｊμｇ／ｍｉ’ の存在下に２
４時間培養すると、１０〜４，０００車位／ｍｆのイン
ターロイキン２を産生ずることが判明した。また、塩化
亜鉛、プロティンＡ、ピシバニール存在下に培養しても
、インターロイキン２を産生ずる。
（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の存在
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
２を産生ずる細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１
ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカ
ット細胞の１つのクローン、ジェルカフ８９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノカインの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０ｕ／ｍβまたはに５６２やラ
ージ（ＲａＪｉ）細胞をｌＸｌ０’細胞／ｖａＲ当り０
．５ Ｘ１０６個／ｍＲ相当共存させてクリック培地中
にて３７℃、２４時間培養すると、インターロイキン２
を１０〜１００ｕ／ｍｆ産生ずる。
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
２を産生ずる細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１
ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカ
ット細胞の１つのクローン、ジェルカフ８９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノカインの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０ｕ／ｍβまたはに５６２やラ
ージ（ＲａＪｉ）細胞をｌＸｌ０’細胞／ｖａＲ当り０
．５ Ｘ１０６個／ｍＲ相当共存させてクリック培地中
にて３７℃、２４時間培養すると、インターロイキン２
を１０〜１００ｕ／ｍｆ産生ずる。
このようにして得られた細胞よりインターロイキン２に
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａ
ｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト、フカロイド。ジエチルピロカーボネ
イト、バナジウム複合体などに添加しておくのが好まし
い。また、必要に応じては、インターロイキン２に対応
する抗体を用いてインターロイキン２合成途上のポリゾ
ームを沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤など
で抽出することができる。ａ＋ＲＮＡはオリゴｄＴ−セ
ルロース、ポリローセファロース、セファロース２Ｂな
どの吸着カラムあるいはバッチ法による精製法、ＳＤＧ
遠心法による分画等によって精製することができる。こ
のような精製操作によりインターロイキン２に対応する
ｍＲＮＡは１ｌ−１２Ｓ画分として得られる。
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａ
ｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト、フカロイド。ジエチルピロカーボネ
イト、バナジウム複合体などに添加しておくのが好まし
い。また、必要に応じては、インターロイキン２に対応
する抗体を用いてインターロイキン２合成途上のポリゾ
ームを沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤など
で抽出することができる。ａ＋ＲＮＡはオリゴｄＴ−セ
ルロース、ポリローセファロース、セファロース２Ｂな
どの吸着カラムあるいはバッチ法による精製法、ＳＤＧ
遠心法による分画等によって精製することができる。こ
のような精製操作によりインターロイキン２に対応する
ｍＲＮＡは１ｌ−１２Ｓ画分として得られる。
上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするインター
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
１ａｅｖ＋ｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳
させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小麦胚
芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわれて
いる。
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
１ａｅｖ＋ｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳
させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小麦胚
芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわれて
いる。
ここに用いたインターロイキン２の活性検定法は次の通
りである。即ち、検体１００μｐを９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６穴マイクロプレート上において各１００μ２の希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４
Ｘ １０３個／１００μρの細胞密度として１００μρ
宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
０．５ μＣｉを加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、細胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清は゛ど活性化Ｔリンパ球内にと
り込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体
中に含有されるインターロイキン２量を容易に知ること
ができる。
りである。即ち、検体１００μｐを９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６穴マイクロプレート上において各１００μ２の希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４
Ｘ １０３個／１００μρの細胞密度として１００μρ
宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
０．５ μＣｉを加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、細胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清は゛ど活性化Ｔリンパ球内にと
り込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体
中に含有されるインターロイキン２量を容易に知ること
ができる。
またインターロイキン２はＴリンパ球を分裂増殖せしめ
る作用がありこの作用によるＴリンパ球増殖活性の検定
法は次の通りである。
る作用がありこの作用によるＴリンパ球増殖活性の検定
法は次の通りである。
検体１００μＰを９６穴マイクロタイタープレートの１
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地を２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上に
おいて各１００μｐの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個７１００μｌの細胞密度とし
て１００μβ宛各くぼみに添加する。
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地を２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上に
おいて各１００μｐの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個７１００μｌの細胞密度とし
て１００μβ宛各くぼみに添加する。
３７℃、５％炭炭酸ガスインキュベクター中７２間もし
くは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存
する活性化Ｔリンパ球数をカウントする。
くは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存
する活性化Ｔリンパ球数をカウントする。
この際、１ＱＱｕ／ｍｊ！ 、 １０ｕ／ｍ！の活性を
有するインターロイキン２をポジティブ・コントロール
として用い、検体添加群におけるＴリンパ球の増殖数と
比較し、検体のインターロイキン２活性を算出する。
有するインターロイキン２をポジティブ・コントロール
として用い、検体添加群におけるＴリンパ球の増殖数と
比較し、検体のインターロイキン２活性を算出する。
かくして得られたインターロイキン２ ｍＲＮＡよりイ
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のような方法で行
なうことができる。
なうことができる。
ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして、
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰの存在
下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的なＪｌ、１Ｊｌ
ｃＤＮ＾を合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解
、除去した後、今度は＄１ｆｉｃＤＮＡを鋳型にして、
逆転写酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重１
ＪｌｃＤＮＡを合成する。得られたＤＮＡの両端を必要
によりエキソヌクレエースで処理し、それぞれに適当な
リンカ−ＤＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な
組合せの塩基を複数個重合せしめる。しかる後、これを
例えばエシェリヒア・コリ内で自律複製できるレプリコ
ンを含むベクターに組込む。組込む方法は、ベクターを
適当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−ま
たはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重合せし
める。このように加工した二重ｇｌＤＮＡとベクターＤ
ＮＡを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰの存在
下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的なＪｌ、１Ｊｌ
ｃＤＮ＾を合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解
、除去した後、今度は＄１ｆｉｃＤＮＡを鋳型にして、
逆転写酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重１
ＪｌｃＤＮＡを合成する。得られたＤＮＡの両端を必要
によりエキソヌクレエースで処理し、それぞれに適当な
リンカ−ＤＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な
組合せの塩基を複数個重合せしめる。しかる後、これを
例えばエシェリヒア・コリ内で自律複製できるレプリコ
ンを含むベクターに組込む。組込む方法は、ベクターを
適当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−ま
たはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重合せし
める。このように加工した二重ｇｌＤＮＡとベクターＤ
ＮＡを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス、サツカロマイセス
・セレビシェ等も使用できる。エシェリヒア・コリの場
合に使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核
酸酵素２６巻４号（１９８１）参照） ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｉ：１０１． ｐ）ｌに３５３． ｐＲＫ６４６．
ｐＲに２４８． ｐＤＦ４１等。
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス、サツカロマイセス
・セレビシェ等も使用できる。エシェリヒア・コリの場
合に使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核
酸酵素２６巻４号（１９８１）参照） ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｉ：１０１． ｐ）ｌに３５３． ｐＲＫ６４６．
ｐＲに２４８． ｐＤＦ４１等。
ＥＫ系プラスミドベクター（リラックスド型）のＣａ１
Ｅ１． ｐＶＥ５１． ｐＡｃ１０５． Ｒ５Ｆ
２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９゜ｐＢＲ３１３
，ｐ８Ｒ３２２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ
３２７゜ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９． ｐＫＹ２７
００． ｐＫＮ８０． ｐＫＣ７゜ｐＫＢ１５８． ｐ
ＭＫ２００４． ｐＡｃＹｃｌ、 ｐＡｃＹｃ１８４．
λｄｕ１等。
Ｅ１． ｐＶＥ５１． ｐＡｃ１０５． Ｒ５Ｆ
２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９゜ｐＢＲ３１３
，ｐ８Ｒ３２２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ
３２７゜ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９． ｐＫＹ２７
００． ｐＫＮ８０． ｐＫＣ７゜ｐＫＢ１５８． ｐ
ＭＫ２００４． ｐＡｃＹｃｌ、 ｐＡｃＹｃ１８４．
λｄｕ１等。
λｇｔ系ファージベクターのλｇｔ・λＣ１λｇｔ−１
゜λＷＥＳ−λＣ１λＷＥＳ−λＢ′、λＺＪｖｉｒ・
λＢ′、λ＾ＬＯ・λＢ。
゜λＷＥＳ−λＣ１λＷＥＳ−λＢ′、λＺＪｖｉｒ・
λＢ′、λ＾ＬＯ・λＢ。
λＷＥＳ４ｓ６２２．λＤａｍ等。
これらのベクターのうちエシェリヒア・コリについては
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
ｐＢＲ３２２の場合にはｃＤＮＡの組込み場所はＰｓｔ
Ｉサイト、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
Ｉサイト、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣＲ２処理して自然
にり、ＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込
ませる方法が採用されており、ＭｇＣｌ２あるいはＲｂ
Ｃ１’をさらに共存させることにより形質転換の効率が
一層増すことも知られている。また、微生物細胞をスフ
二ロプラストあるいはプロトプラスト化してから形質転
換させてもよい。
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣＲ２処理して自然
にり、ＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込
ませる方法が採用されており、ＭｇＣｌ２あるいはＲｂ
Ｃ１’をさらに共存させることにより形質転換の効率が
一層増すことも知られている。また、微生物細胞をスフ
二ロプラストあるいはプロトプラスト化してから形質転
換させてもよい。
形質転換株からインターロイキン２遺伝子が組込まれて
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法と称される
もので、まずＣｏｎＡによって刺激したジュルカット細
胞よりｍＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によってインタ
ーロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（１１〜１
２ Ｓ ｍＲＮＡ）、このｍＲＮＡを用いて３２ｐによ
りラベルした１本９１ｃＤＮＡを合成する。ついでｃＤ
Ｎ八合への鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理によフ
て除いた後、このｃＤＮＡとＣｏｎＡで刺激していない
ジュルカット細胞より抽出した１１〜１２ｓ ｍＲＮ
Ａの部分精製ｍＲＮＡの過剰とハイブリダイズさせる。
もので、まずＣｏｎＡによって刺激したジュルカット細
胞よりｍＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によってインタ
ーロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（１１〜１
２ Ｓ ｍＲＮＡ）、このｍＲＮＡを用いて３２ｐによ
りラベルした１本９１ｃＤＮＡを合成する。ついでｃＤ
Ｎ八合への鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理によフ
て除いた後、このｃＤＮＡとＣｏｎＡで刺激していない
ジュルカット細胞より抽出した１１〜１２ｓ ｍＲＮ
Ａの部分精製ｍＲＮＡの過剰とハイブリダイズさせる。
そしてこのＣｏｎＡ刺激していないｍＲＮＡにハイブリ
ダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリッドを形成したｃ
ＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによって分画し
、それぞれプローブＡおよびプローブＢとする。
ダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリッドを形成したｃ
ＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによって分画し
、それぞれプローブＡおよびプローブＢとする。
次に前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ２枚
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさせ
た後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡに
はポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには弱
く、ムしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを検
索する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａＲ，、Ｐａｏｃ
、 Ｊｐｎ。
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさせ
た後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡに
はポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには弱
く、ムしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを検
索する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａＲ，、Ｐａｏｃ
、 Ｊｐｎ。
Ａｃａｄ、、 ｖｏＲ５５Ｂ、 ４６４〜４６９（１９
７９））。
７９））。
あるいは形質転換株、たとえば１０００〜１０，０００
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮＡにしてニトロセルロースフィルター
に固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したような
インターロイキン２ ｍＲＮＡを含むヒトＴ白血球細胞
より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あるい
はＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン２
ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、Ｄ
ＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロースフィル
ターに固定する方法もある。
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮＡにしてニトロセルロースフィルター
に固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したような
インターロイキン２ ｍＲＮＡを含むヒトＴ白血球細胞
より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あるい
はＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン２
ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、Ｄ
ＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロースフィル
ターに固定する方法もある。
次に、このフィルターを１ ｍＭビベス、 １０ｍＭＮ
ａＣＪ！のような低塩溶液でよく洗浄した後、０．５ｍ
ＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＤＳのような溶液で、例えば
９５℃。
ａＣＪ！のような低塩溶液でよく洗浄した後、０．５ｍ
ＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＤＳのような溶液で、例えば
９５℃。
１分間程度の熱処理を行なってフィルターに吸着したｍ
ＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セルロ
ースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡを回
収する。次に、この０ＩＲＮＡをアフリカッメガエルの
卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキン
２活性を測定する。あるいはウサギ網状赤血球ないしは
小麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた
後、インターロイキン２抗体でインターロイキン２を検
定する。
ＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セルロ
ースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡを回
収する。次に、この０ＩＲＮＡをアフリカッメガエルの
卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキン
２活性を測定する。あるいはウサギ網状赤血球ないしは
小麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた
後、インターロイキン２抗体でインターロイキン２を検
定する。
かくしてインターロイキン２活性の検出された集団が見
出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化して
より小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的に
は単数のクローンに細分化し、インターロイキン２ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むクローンを！＃離す
る。
出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化して
より小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的に
は単数のクローンに細分化し、インターロイキン２ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むクローンを！＃離す
る。
得られたクローンよりインターロイキン２ポリペプチド
をコードするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたベクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せばよい。
をコードするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたベクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せばよい。
インターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡの
構造は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉ １ｂｅｒｔの化学法（Ｍｅ
ｔｈ 。
構造は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉ １ｂｅｒｔの化学法（Ｍｅ
ｔｈ 。
Ｅｎｚｙｍ、 ６５．４９９−５８０． ｆ９８０）お
よびジデオキシヌクレオチド鎮終結法（Ｓｍｉｔｈ、
Ａ、 Ｊ、 Ｈ，、Ｍｅｔｈ。
よびジデオキシヌクレオチド鎮終結法（Ｓｍｉｔｈ、
Ａ、 Ｊ、 Ｈ，、Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍ、 ６５．５６０−５８０．１９８０）等を
用いる常法により決定できる。
用いる常法により決定できる。
本発明において単離され、インターロイキン２活性をも
つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもので
ある。
つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもので
ある。
□−ノ
−く
２０ ｚｌ−１／ＩＦ−１２：口
ｌト
ηく Ｌ＋ω コロ −Ｑ
ΦＥ−−＜ ＜（Ｃ−！３０ コロ
Ｑ
Ｌ−＜２← Ｌ−＜ＣＩｊＥ−ｔ
ｚ＜ ＋ｅ：ｗ ｌ／）＜ コロ −ω−く ←
＜ ＜＜ ＋−＜ ＜口Σく Ｌ＋！＋ 為く ηロ ２← 関Ｃ＋５０ロ −ロ ≧く ηく コロ り＜ Ｃ５Ｃ５−＜ ＜＜ くく トド Ｌ＋← コロ ｏＩ−） −ロ ーｃ５＋ｅ：ω ΦＦ−Ｌ、ｌｊ −ζロト ←く
−← −〇 〉ロ ズく 口ｔ−（ＩＪＥ−−ロ コく 〈 −ω −← Φトー＜ く ← コ（ａ）← ← ← ← Ｃ５Ｃ５１−１＜Ｅ−ト ← ・ Ｃ５ロ ロ、← く く ← く〉 ロ
〉ｌ＋５ ← ← ロ ←＜＜
＜ロ ）−１ロ く ← ＋−＋＜ Ｆｍ＜ Ｅ−＜ １ｍ Ｌ） Ｃ
Ｊ／＜ ＜Ｃ５Ｅ−＜ Ｃｊ ＣＪ ヒー＜＜
ロ クー ← く ← ＜（ｊ Ｃ５０−く ← ω く くく ロＥ−Ｉ りく く ロ く ト く ← ＝１−） ← く ← ＜＜＜ ロ上記塩基
配列の中、分子量が１５０００ダルトンであると報告さ
れているインターロイキン２をコードできるフレームは
、上記塩基配列に示されているものだけである。蛋白合
成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧＴドンから始ま
ることが殆んどであるから、最初のイニシェーションコ
ドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧＡの前の八
ＣＴ （スレオニン）迄がインターロイキン２ポリペ
プチドに対応する塩基配列と考えられる。また、インタ
ーロイキン２のような分泌蛋白においては疎水性アミノ
酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチドが存在し、この
ペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋白が知られている
。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ酸に富ん
だＮ−末端部シグナルペプチドに相当するものと考えら
れる。したがフて、例えばＡ丁Ｇコドンから２１番目の
コドンＧＣ＾ （アラニン）よりターミネーションコド
ンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチドであっても
インターロイキン２活性を有するものと考えられる。ま
た、上記アラニン以後の又は上記スレオニン以前のいく
つかのアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基
配列部であってもインターロイキン２蛋白の活性部位を
保持しているようなポリペプチドであるならばインター
ロイキン２活性を有することが十分に考えられる。
＜ ＜＜ ＋−＜ ＜口Σく Ｌ＋！＋ 為く ηロ ２← 関Ｃ＋５０ロ −ロ ≧く ηく コロ り＜ Ｃ５Ｃ５−＜ ＜＜ くく トド Ｌ＋← コロ ｏＩ−） −ロ ーｃ５＋ｅ：ω ΦＦ−Ｌ、ｌｊ −ζロト ←く
−← −〇 〉ロ ズく 口ｔ−（ＩＪＥ−−ロ コく 〈 −ω −← Φトー＜ く ← コ（ａ）← ← ← ← Ｃ５Ｃ５１−１＜Ｅ−ト ← ・ Ｃ５ロ ロ、← く く ← く〉 ロ
〉ｌ＋５ ← ← ロ ←＜＜
＜ロ ）−１ロ く ← ＋−＋＜ Ｆｍ＜ Ｅ−＜ １ｍ Ｌ） Ｃ
Ｊ／＜ ＜Ｃ５Ｅ−＜ Ｃｊ ＣＪ ヒー＜＜
ロ クー ← く ← ＜（ｊ Ｃ５０−く ← ω く くく ロＥ−Ｉ りく く ロ く ト く ← ＝１−） ← く ← ＜＜＜ ロ上記塩基
配列の中、分子量が１５０００ダルトンであると報告さ
れているインターロイキン２をコードできるフレームは
、上記塩基配列に示されているものだけである。蛋白合
成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧＴドンから始ま
ることが殆んどであるから、最初のイニシェーションコ
ドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧＡの前の八
ＣＴ （スレオニン）迄がインターロイキン２ポリペ
プチドに対応する塩基配列と考えられる。また、インタ
ーロイキン２のような分泌蛋白においては疎水性アミノ
酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチドが存在し、この
ペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋白が知られている
。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ酸に富ん
だＮ−末端部シグナルペプチドに相当するものと考えら
れる。したがフて、例えばＡ丁Ｇコドンから２１番目の
コドンＧＣ＾ （アラニン）よりターミネーションコド
ンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチドであっても
インターロイキン２活性を有するものと考えられる。ま
た、上記アラニン以後の又は上記スレオニン以前のいく
つかのアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基
配列部であってもインターロイキン２蛋白の活性部位を
保持しているようなポリペプチドであるならばインター
ロイキン２活性を有することが十分に考えられる。
本発明のＩ）Ｎへの５′−末端に、インターロイキン２
遺伝子の情報発現のために有害でない１又は複数の塩基
が配列されていてもよい。また、５′−末端に１又は複
数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列されていて
も、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロ
イキン２活性を持つために有害でないものであったり、
また有害なものであっても容易に脱離できるようなもの
であれば、問題はない。
遺伝子の情報発現のために有害でない１又は複数の塩基
が配列されていてもよい。また、５′−末端に１又は複
数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列されていて
も、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロ
イキン２活性を持つために有害でないものであったり、
また有害なものであっても容易に脱離できるようなもの
であれば、問題はない。
３′−末端についても同様に、ポリペプチドがインター
ロイキン２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。また
、ＤＮＡの化学合成などにより遺伝子の一部又は遺伝子
構造から推論されるポリペプチドの一部を改変すること
も可能である。さらに、後記する実施例に記載したヒト
細胞以外の細胞より得たｍＲＮＡを用いて遺伝子を得る
こともできる。したがって、要はインターロイキン２活
性をもつポリペプチドをコードするＩ）Ｎ八であれば本
発明において利用することができる。
ロイキン２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。また
、ＤＮＡの化学合成などにより遺伝子の一部又は遺伝子
構造から推論されるポリペプチドの一部を改変すること
も可能である。さらに、後記する実施例に記載したヒト
細胞以外の細胞より得たｍＲＮＡを用いて遺伝子を得る
こともできる。したがって、要はインターロイキン２活
性をもつポリペプチドをコードするＩ）Ｎ八であれば本
発明において利用することができる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
（１） １０容量／容量％の牛胎児血清を含有するＲＰ
Ｍ１１６４０培地で、当分野で良く知られた方法で培養
したヒトＴ白血病細胞ジェルカット細胞（日本。
Ｍ１１６４０培地で、当分野で良く知られた方法で培養
したヒトＴ白血病細胞ジェルカット細胞（日本。
アメリカ、西ドイツ等で自由に入手できる）を上記の培
地に懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
Ｓ １５０／３００−４型を用いて１，０００レントゲ
ンの総照射線量を照射した。次いで、この照射された細
胞をｌＸｌ０’個／Ｉｎ１の細胞密度で上述の培地中で
５％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９６穴
マイクロプレ一トｌＯ枚に０．２個／ｗｅｌｌになるよ
うに本変異細胞を接種し、５％炭酸ガス中３７℃にて２
１日間培養した。細胞増殖の観察されたクローンを順次
継代増殖させ、次いで１×１０６個／ｍＪの細胞密度で
ＣｏｎＡ ＳＯＢ／ｍｊ！存在下に２４時間培養し、培
養上清に放出されるインターロイキン２の産生量を前出
の方法で測定し、原ジュルカット細胞に比し産生量が４
０倍以上に改善された変異化クローン細胞ジュルカット
１１１株（ＡＴＣ（： ＣＲＬ８１２９）を得た。木株
は通常の培養方法で増殖し、その増殖速度はジュルカッ
ト細胞と同程度であった。
地に懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
Ｓ １５０／３００−４型を用いて１，０００レントゲ
ンの総照射線量を照射した。次いで、この照射された細
胞をｌＸｌ０’個／Ｉｎ１の細胞密度で上述の培地中で
５％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９６穴
マイクロプレ一トｌＯ枚に０．２個／ｗｅｌｌになるよ
うに本変異細胞を接種し、５％炭酸ガス中３７℃にて２
１日間培養した。細胞増殖の観察されたクローンを順次
継代増殖させ、次いで１×１０６個／ｍＪの細胞密度で
ＣｏｎＡ ＳＯＢ／ｍｊ！存在下に２４時間培養し、培
養上清に放出されるインターロイキン２の産生量を前出
の方法で測定し、原ジュルカット細胞に比し産生量が４
０倍以上に改善された変異化クローン細胞ジュルカット
１１１株（ＡＴＣ（： ＣＲＬ８１２９）を得た。木株
は通常の培養方法で増殖し、その増殖速度はジュルカッ
ト細胞と同程度であった。
（２）本ジュルカット１１１細胞株を１×１０５個／Ｉ
Ｉ！の細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴｆｌ： ５５−
９１，０００＋＋１に懸濁し、ファルコン社製回転培養
瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操作により細胞
を集めた。この細胞を４ Ｘ １０６個／ｍＪの細胞密
度にて上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎＡ ２５μ
ｇ／ｍｐを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶（４
本）に１．０００ｎ＋ｉＶで張り込み６時間回転培養し
た。
Ｉ！の細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴｆｌ： ５５−
９１，０００＋＋１に懸濁し、ファルコン社製回転培養
瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操作により細胞
を集めた。この細胞を４ Ｘ １０６個／ｍＪの細胞密
度にて上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎＡ ２５μ
ｇ／ｍｐを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶（４
本）に１．０００ｎ＋ｉＶで張り込み６時間回転培養し
た。
（３）このようにして得たＣｏｎＡ ２５ｕｇ／＋＋ｌ
で６時間誘導したジュルカット細胞（１，２ｘ １ａ１
０細胞）をＰＢＳ溶液８００ｍ１＋に懸濁し、細胞を遠
心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であ
るＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ
（：ｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ）を含んだＲ５Ｂ溶液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭ
ＮａＣＲ，１，５ｍＭ ＭｇＣｊ’ｚ） ８００＋ｕ
ｉｌに懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になる
ように加えた後、ゆるやかに攪拌後３，０００ｒｐｍで
５分遠心して核を除去し、その上滑液に５０５ （０，
５％）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後、ただちにフ
ェノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回
フェノール抽出を繰返してから２容のエタノールでＲＮ
Ａを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｉ’、 ｐＨ７，５で溶解した。
で６時間誘導したジュルカット細胞（１，２ｘ １ａ１
０細胞）をＰＢＳ溶液８００ｍ１＋に懸濁し、細胞を遠
心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であ
るＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ
（：ｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ）を含んだＲ５Ｂ溶液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭ
ＮａＣＲ，１，５ｍＭ ＭｇＣｊ’ｚ） ８００＋ｕ
ｉｌに懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になる
ように加えた後、ゆるやかに攪拌後３，０００ｒｐｍで
５分遠心して核を除去し、その上滑液に５０５ （０，
５％）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後、ただちにフ
ェノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回
フェノール抽出を繰返してから２容のエタノールでＲＮ
Ａを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｉ’、 ｐＨ７，５で溶解した。
このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮＡ量
は１９６ｍｇであった。
は１９６ｍｇであった。
次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、 Ｔｙｐｅ７）を用い、カラムクロマトグラフ
ィーを行なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐ）Ｉ ７．５．０．５Ｍ ＮａＣ１＋。
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、 Ｔｙｐｅ７）を用い、カラムクロマトグラフ
ィーを行なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐ）Ｉ ７．５．０．５Ｍ ＮａＣ１＋。
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５％ ＳＤＳ溶液にＲＮＡ
を溶解して行ない、溶出は緩衝液（２０＋ｎＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ）、 ｐ）Ｉ ７．５゜０．５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１＋、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ （ｐ）Ｉ ７．５）で交互にｍＲＮ
Ａを溶出することにより行なった。この結果、溶出され
たｍＲＮＡ量は３．６ｍｇであった。
を溶解して行ない、溶出は緩衝液（２０＋ｎＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ）、 ｐ）Ｉ ７．５゜０．５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１＋、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ （ｐ）Ｉ ７．５）で交互にｍＲＮ
Ａを溶出することにより行なった。この結果、溶出され
たｍＲＮＡ量は３．６ｍｇであった。
さらに、このｍＲＮへの一部（２，４ｍｇ）をＳＤＧ遠
心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、 ｐＨ７，５，１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ＭＮａＣ１＋を含む５〜２５
％シヨ糖密度勾配、ＨｉｔａｃｈｉＲＰＳ ２８０−タ
ーで２６，０００ｒｐｍ、 ２４時間、４℃）して分画
し、１１−１２３のｍＲＮＡ画分を分画番号１２゜１３
、１４としてそれぞれ５９μｇ、４６μｇ、６０μｇ得
た。
心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、 ｐＨ７，５，１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ＭＮａＣ１＋を含む５〜２５
％シヨ糖密度勾配、ＨｉｔａｃｈｉＲＰＳ ２８０−タ
ーで２６，０００ｒｐｍ、 ２４時間、４℃）して分画
し、１１−１２３のｍＲＮＡ画分を分画番号１２゜１３
、１４としてそれぞれ５９μｇ、４６μｇ、６０μｇ得
た。
（４）ここに得られた分画番号１３のｍＲＮＡを前出の
検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１個当
り５０ｎｇをマイクロインジェクションン去によりン主
人して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン２
の活性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化チ
ミジンの取り込みおよび活性化Ｔリンパ球数の増加がみ
られ、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロ
イキン２ ｍＲＮＡを含有することが証明された。
検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１個当
り５０ｎｇをマイクロインジェクションン去によりン主
人して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン２
の活性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化チ
ミジンの取り込みおよび活性化Ｔリンパ球数の増加がみ
られ、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロ
イキン２ ｍＲＮＡを含有することが証明された。
表 −１
（イ）
（ロ）
・各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン２
（１０単位／１ａＲ）と比較して求めた。
ｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン２
（１０単位／１ａＲ）と比較して求めた。
（５）次に、ここで得られたインターロイキン２ｍＲＮ
Ａを含む１１〜１２３ ｍＲＮＡ分画１３よりｃＤＮ八
をインビトロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ３２
２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア・コリ
にトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤＮＡク
ローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
Ａを含む１１〜１２３ ｍＲＮＡ分画１３よりｃＤＮ八
をインビトロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ３２
２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア・コリ
にトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤＮＡク
ローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
（５−１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）、 ３０＋ｎＭＮａＣＮ、 ６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ！２． ５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴ
Ｐ、 ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３２ｐラベルしたも
のを含む）、０．７μｇオリゴ（ｄＴ）、、、 １０ｇ
ｇ ｍＲＮＡおよび１５ユニット八ＭＶ逆転写酵素（Ｊ
、 Ｗ、 Ｂｅａｒｄ）を混ぜ、４１℃に９０分間保っ
た。反応終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノ
ール沈澱としてＤＮ八を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
Ｈ７，５）、 ３０＋ｎＭＮａＣＮ、 ６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ！２． ５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴ
Ｐ、 ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３２ｐラベルしたも
のを含む）、０．７μｇオリゴ（ｄＴ）、、、 １０ｇ
ｇ ｍＲＮＡおよび１５ユニット八ＭＶ逆転写酵素（Ｊ
、 Ｗ、 Ｂｅａｒｄ）を混ぜ、４１℃に９０分間保っ
た。反応終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノ
ール沈澱としてＤＮ八を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
ｌ ｍｈｌ ＥＤＴＡ ｐＨ７，５溶液に溶解した。こ
れにより約２．５μｇの１本鎖ＣＤＮＡが合成された。
れにより約２．５μｇの１本鎖ＣＤＮＡが合成された。
この溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加
えて０．３３ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次
いで溶液をＩＭＴｒｉｓ−１１ｃｊ）、 ｐｉ（７，５
の等量で中和し「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通
した。これにより１．８μｇのｃＤＮＡを回収した。
えて０．３３ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次
いで溶液をＩＭＴｒｉｓ−１１ｃｊ）、 ｐｉ（７，５
の等量で中和し「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通
した。これにより１．８μｇのｃＤＮＡを回収した。
（５−２） ５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭＭｇＣｌ１２．ｌｏｍＭ ＤＴＴ、 ０．
７５ｍＭの各ｃＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ。
１０ｍＭＭｇＣｌ１２．ｌｏｍＭ ＤＴＴ、 ０．
７５ｍＭの各ｃＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ。
ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む
）。
）。
１．８μｇ１本鎖ｃＤＮＡ、 ８ユニツトボリメレー
ス（Ｐｏｌｙａ＋ｅｒａｓｅ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）
を混ぜ、１５℃で１５時間反応を行なった。反応終了後
、フェノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない
、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応に
より１．１０Ｍｇの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
ス（Ｐｏｌｙａ＋ｅｒａｓｅ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）
を混ぜ、１５℃で１５時間反応を行なった。反応終了後
、フェノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない
、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応に
より１．１０Ｍｇの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
次いで、５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、
０．２ＭＮａＣＲ，１ｍＭ ＺｎＣＲ２，１，１０Ｍｇ
二重１ｊｌｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分間インキュ
ベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアーゼＳ＋（
三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベートした
。反応終了後、フェノール処理を２回行ない、「セファ
デックスＧ−５０」カラムに通し、０．５５Ｍｇの二重
１ｊｌｃＤＮＡを回収した。
０．２ＭＮａＣＲ，１ｍＭ ＺｎＣＲ２，１，１０Ｍｇ
二重１ｊｌｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分間インキュ
ベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアーゼＳ＋（
三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベートした
。反応終了後、フェノール処理を２回行ない、「セファ
デックスＧ−５０」カラムに通し、０．５５Ｍｇの二重
１ｊｌｃＤＮＡを回収した。
（５−３） ０．１４Ｍカコジル酸カリウム、 ３０
ｍＭ トリス塩基、 ０．１ｍＭ ＤＴＴ、１ ｍＭ
Ｃ０Ｃｊ！ｉ、 ０．６４ｍＭ ”Ｐ −ｄＣＴＰ
（比活性２．７Ｘ １０’ｃｐｍ／ｎｍｏｊり 、 ０
．５５μｓ二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミナ
ルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７℃で７分間
インキュベートし、反応終了後、フェノール処理１回を
行ない、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通しエタ
ノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０Ｍｇを回収したとこ
ろ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加された。
ｍＭ トリス塩基、 ０．１ｍＭ ＤＴＴ、１ ｍＭ
Ｃ０Ｃｊ！ｉ、 ０．６４ｍＭ ”Ｐ −ｄＣＴＰ
（比活性２．７Ｘ １０’ｃｐｍ／ｎｍｏｊり 、 ０
．５５μｓ二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミナ
ルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７℃で７分間
インキュベートし、反応終了後、フェノール処理１回を
行ない、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通しエタ
ノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０Ｍｇを回収したとこ
ろ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加された。
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ、 Ｌ？ター ｊ＋
３ （ｌ？７７〕）’、ニー□−−１０μｇを制限酵
素Ｐｓｔ Ｉで切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡに
ｄＣＭ Ｐ ｋｌを付加したのと全く同じ条件でｄＣＴ
Ｐの代りにｄＧＴＰを用いて両３′末端にｄＧＭＰｆｉ
を付加した。かくして約５０個のｄＧＭＰが両３′末端
に付加された。
３ （ｌ？７７〕）’、ニー□−−１０μｇを制限酵
素Ｐｓｔ Ｉで切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡに
ｄＣＭ Ｐ ｋｌを付加したのと全く同じ条件でｄＣＴ
Ｐの代りにｄＧＴＰを用いて両３′末端にｄＧＭＰｆｉ
を付加した。かくして約５０個のｄＧＭＰが両３′末端
に付加された。
（５−４） ５０ＩＩＩＭ Ｔｒｉｓ−ＩＲ（ｐＨ７，
５）、 ０．ＩＭ ＮａＣＲ。
５）、 ０．ＩＭ ＮａＣＲ。
５ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．０５ＭｇのｄＧＭＰが付加
されたｐＢＲ３２２゜０．０１９ｇのｄｃ＆ＩＰが付加
されたｃＤＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６℃で
１２０分間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６
０分間保持した。
されたｐＢＲ３２２゜０．０１９ｇのｄｃ＆ＩＰが付加
されたｃＤＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６℃で
１２０分間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６
０分間保持した。
エシェリヒア・コリχ１７７Ｇ を５０ｍｊ！のＬ培
地１００μｇ７ｍＲのジアミノピメリン酸と５０Ｍｇ／
ｍｌ！のチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス。
地１００μｇ７ｍＲのジアミノピメリン酸と５０Ｍｇ／
ｍｌ！のチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス。
０．５％ＮａＣ１および０．１％グルコースを含む）に
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
．３になるまで３７℃で振どう培養した。培養終了後、
培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離に
より集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１！（ｐＨ７，６
）。
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
．３になるまで３７℃で振どう培養した。培養終了後、
培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離に
より集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１！（ｐＨ７，６
）。
０．１Ｍ ＮａＣ１、５ｍＭ ＭｇＣＲｔ、 １０ｍ
Ｍ ＲｂＣＲの溶液２Ｓｍｊ！で２回洗浄した。
Ｍ ＲｂＣＲの溶液２Ｓｍｊ！で２回洗浄した。
得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＪＩ （ｐ
）Ｉ ７．６）。
）Ｉ ７．６）。
０．２５Ｍ ＫＣＪ！、 ５１ＭＭ ＭｇＣＲ２，
０，１Ｍ ＣａＣＲｚおよび１０ｍＭ ＲｂＣｊ！を
含む溶液２０ｍｊ！に懸濁し、０℃にて２５分間静置後
、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液１ ｍ
ｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０．２ｍ
Ａ＋に上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置し
た。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０℃で６
０分間静置した。次に、これに前記り培地０．７ｍｊ！
を加えて３７℃で３０分分間上う培養した。この培養液
０．１ｍＲを１００μｇ／ｍｐジアミノピメリン酸、５
０Ｍｇ／ｍｌ！チミジンと１５Ｍｇ７ｍＡテトラサイタ
リンを含むし培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し
、３７℃にて２日間インキュベートした。
０，１Ｍ ＣａＣＲｚおよび１０ｍＭ ＲｂＣｊ！を
含む溶液２０ｍｊ！に懸濁し、０℃にて２５分間静置後
、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液１ ｍ
ｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０．２ｍ
Ａ＋に上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置し
た。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０℃で６
０分間静置した。次に、これに前記り培地０．７ｍｊ！
を加えて３７℃で３０分分間上う培養した。この培養液
０．１ｍＲを１００μｇ／ｍｐジアミノピメリン酸、５
０Ｍｇ／ｍｌ！チミジンと１５Ｍｇ７ｍＡテトラサイタ
リンを含むし培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し
、３７℃にて２日間インキュベートした。
（５−５）上記において出現したコロニー４３２個をそ
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体と
して１００μｇ／ｍｘのジアミノピメリン酸。
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体と
して１００μｇ／ｍｘのジアミノピメリン酸。
５０Ｍｇ７ｍＲのチミジンと１０μｚ／ｍＩｌのテトラ
サイクリンを含むＬ培地２００ｍ１）に接種し、３７℃
で５〜７時間振どう培養後、クロラムフェニコールを最
終濃度で１７０ｇｇ／ｍｊ！になるように加えた新鮮な
上記し培地２００ｍＪを追加し、さらに−晩振どう培養
する。
サイクリンを含むＬ培地２００ｍ１）に接種し、３７℃
で５〜７時間振どう培養後、クロラムフェニコールを最
終濃度で１７０ｇｇ／ｍｊ！になるように加えた新鮮な
上記し培地２００ｍＪを追加し、さらに−晩振どう培養
する。
こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法に従っ
てプラスミドＤＮＡを精製した。このＤＮＡを用いてＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｆｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ法でインターロイキン２ ｃＤＮＡをもつク
クーンをスクリーニングした。ここで用いたＨｙｂｒｉ
ｄＬｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａ
ｙは以下のようにして行なった。
てプラスミドＤＮＡを精製した。このＤＮＡを用いてＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｆｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ法でインターロイキン２ ｃＤＮＡをもつク
クーンをスクリーニングした。ここで用いたＨｙｂｒｉ
ｄＬｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａ
ｙは以下のようにして行なった。
精製したＤＮＡ ２５μｓを制限酵素Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ
ＩＩで切断し、フェノール処理３回、フェノール−クロ
ロホルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なっ
てＤＮＡをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄
したのち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μ
！に溶解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、１
０ｘ ＳＳＣ（１，５Ｍ ＮａＣｊ、 ０．１５Ｍ：’
クエン酸３ナトリウム）で１．３ｍｊに希釈した。これ
をニトロセルロースフィルターに固定し、８０℃で３時
間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムアミド
。
ＩＩで切断し、フェノール処理３回、フェノール−クロ
ロホルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なっ
てＤＮＡをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄
したのち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μ
！に溶解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、１
０ｘ ＳＳＣ（１，５Ｍ ＮａＣｊ、 ０．１５Ｍ：’
クエン酸３ナトリウム）で１．３ｍｊに希釈した。これ
をニトロセルロースフィルターに固定し、８０℃で３時
間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムアミド
。
２０ｍＭピペス、 ｐＨ１！、５．０．７５Ｍ ＮａＣ
ｊ 、 ５ｍＭ ＥＤＴ＾。
ｊ 、 ５ｍＭ ＥＤＴ＾。
０．２％ ＳＯＳおよび２５０μｇ ｍＲＮＡを含む
溶液中で３７℃、１８時間インキュベートしてフィルタ
ー上のＤＮＡとインターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイ
ブリダイズさせた。次いで、このフィルターを１０！Ｌ
ＭピペスｐＨ６，５，０，１５Ｍ ＮａＣｊ 、
１ ｅ＋Ｍ ＥＤＴ＾、０．２％ ＳＤＳ溶液で６５℃
で３回洗浄した後、さらに１ ｍＭピペス。
溶液中で３７℃、１８時間インキュベートしてフィルタ
ー上のＤＮＡとインターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイ
ブリダイズさせた。次いで、このフィルターを１０！Ｌ
ＭピペスｐＨ６，５，０，１５Ｍ ＮａＣｊ 、
１ ｅ＋Ｍ ＥＤＴ＾、０．２％ ＳＤＳ溶液で６５℃
で３回洗浄した後、さらに１ ｍＭピペス。
１０ｍＭ ＮａＣｊ溶液で３回洗浄し、次いで０．５ｍ
ＭＥＤＴ＾、０．１％ＳＤＳ溶゛液で９５℃で１分間処
理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶出した。これ
を常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムにかけて
回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリカッメガエル
の卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させインターロイキン
２活性を測定した。この結果、１８集団の中の１集団に
前述のトリチウム化チミジンの取り込み量による活性検
定法により４８単位／ｍＲのインターロイキン２の活性
が検出された。そこで、さらにこの集団に属する２４コ
ロニーを今度は単独にそれぞれ前述したように１００μ
ｇ／ｍＲのジアミノピメリン酸、 ５０Ｂｇ／ｍＲのチ
ミジンと１０Ｍｇ／ｍｐのテトラサイタリンを含むＬ培
地２００ｍ１！に接種し、３７℃で５〜７時間振どう培
養後、クロラムフェニコールを最終濃度で１７０μｇ／
ｒｔｒｌｌになるように加えた新鮮な上記し培地２００
ａ＋Ｒを追加し、さらに−夜振どう培養してプラスミド
ＤＮＡを増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を精製した。そして各ＤＮＡ５μｓをＨｉ ｎ ｄ Ｉ
ＩＩで切断した後、前回と同様にニトロセルロースフィ
ルターに固定してインターロイキン２ ｍＲＮＡとハイ
ブリダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエ
ルの卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン
２活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーに
インターロイキン２クローンが存在するか検定したとこ
ろ１コロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ 、プ
ラスミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵
母細胞に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見
出され（表−２）、本クローンがインターロイキン２
ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７
ａ／３−ｔｅＡ、＋ １１９９５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２
５））であると同定された。即ちプラスミドｐ３−１８
のｃＤＮＡはインターロイキン２ ｍＲＮＡと特異的に
ハイブリッドを形成するＤＮＡ （インターロイキン
２遺伝子）をもっことが証明された。
ＭＥＤＴ＾、０．１％ＳＤＳ溶゛液で９５℃で１分間処
理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶出した。これ
を常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムにかけて
回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリカッメガエル
の卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させインターロイキン
２活性を測定した。この結果、１８集団の中の１集団に
前述のトリチウム化チミジンの取り込み量による活性検
定法により４８単位／ｍＲのインターロイキン２の活性
が検出された。そこで、さらにこの集団に属する２４コ
ロニーを今度は単独にそれぞれ前述したように１００μ
ｇ／ｍＲのジアミノピメリン酸、 ５０Ｂｇ／ｍＲのチ
ミジンと１０Ｍｇ／ｍｐのテトラサイタリンを含むＬ培
地２００ｍ１！に接種し、３７℃で５〜７時間振どう培
養後、クロラムフェニコールを最終濃度で１７０μｇ／
ｒｔｒｌｌになるように加えた新鮮な上記し培地２００
ａ＋Ｒを追加し、さらに−夜振どう培養してプラスミド
ＤＮＡを増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を精製した。そして各ＤＮＡ５μｓをＨｉ ｎ ｄ Ｉ
ＩＩで切断した後、前回と同様にニトロセルロースフィ
ルターに固定してインターロイキン２ ｍＲＮＡとハイ
ブリダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエ
ルの卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン
２活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーに
インターロイキン２クローンが存在するか検定したとこ
ろ１コロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ 、プ
ラスミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵
母細胞に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見
出され（表−２）、本クローンがインターロイキン２
ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７
ａ／３−ｔｅＡ、＋ １１９９５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２
５））であると同定された。即ちプラスミドｐ３−１８
のｃＤＮＡはインターロイキン２ ｍＲＮＡと特異的に
ハイブリッドを形成するＤＮＡ （インターロイキン
２遺伝子）をもっことが証明された。
次にプラスミドｐ３−１ｆｉのｃＤＮＡの制限酵素切断
個所を検討したところ、ＸｂａＩ （米国ａＲＬ社）で
１ケ所、 ＢｓｔＮＩ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（Ｘｂａｌ切断個所
の上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡは
約６５０塩基対よりなり、１１〜１２Ｓのインターロイ
キン２１ＲＮＡの一部に対応するものとわかったので、
再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍＲ
ＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄ ｅｔ
ａＲ，Ｎｕｃｌｅｆｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
個所を検討したところ、ＸｂａＩ （米国ａＲＬ社）で
１ケ所、 ＢｓｔＮＩ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（Ｘｂａｌ切断個所
の上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡは
約６５０塩基対よりなり、１１〜１２Ｓのインターロイ
キン２１ＲＮＡの一部に対応するものとわかったので、
再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍＲ
ＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄ ｅｔ
ａＲ，Ｎｕｃｌｅｆｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
ｖｏｌ、 ９． ｐ２５５１（１９８１））により前述
同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２２
に挿入した。このプラスミドを用いてＥ−ｃｏｌｉχ１
７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株のなかか
ら、プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持つ
ｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓ
ｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃＤＮＡイ
ンサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−５ＯＡを持つ転
換株（エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０
Ａ ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２Ｂ））を得た
。
同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２２
に挿入した。このプラスミドを用いてＥ−ｃｏｌｉχ１
７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株のなかか
ら、プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持つ
ｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓ
ｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃＤＮＡイ
ンサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−５ＯＡを持つ転
換株（エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０
Ａ ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２Ｂ））を得た
。
このｐＩＬ２−５０ＡのｃＤＮＡの制限酵素切断地図を
図−１に示す。
図−１に示す。
表 −２
（イ）
（ロ）
◆ｌ プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡにパイプリダイ
ズしたｍＲＮＡ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２８プラスミ
ドベクター（Ｇｅｎｅ、 ！、 ２８７−３０５（１９
８０））にｐＫＣＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ｖｏｌ ７８゜Ｎｏ
、３．１５２７−１５３１．１９８１）のＳＶ ４０
ウィルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組み
込んだｐＣＥ−１ベクターを造成した。そしてプラスミ
ドｐＩＬ−２−５０ＡクローンのプラスミドよりＰｓｔ
Ｉで挿入されたｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１ベクタ
ーのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐｃＥｏ、
−２）。なお、このプラスミドｐＣＥＩＬ−２が組み込
まれているエシェリヒア・コリ）ＩＢ １０１（ＡＪ
１２００８）は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２４４として
寄託されている。このときの挿入様式は図−２に示すよ
うにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流にインタ
ーロイキン２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＧが
接続されているものである（図のＩ）。このベクターを
サル培養細胞のＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ
、 Ｃｅ１ｌ ｖａｔ、 ２３１）１７５−１８２ （
１９８１））に感染せしめ（Ｍｃ Ｃｕｔｃｈａｎ ｅ
ｔａｊｌ Ｊ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ
、 ｖｏｌ、４１ ｐ３５１−３５７（１９６８））
、培養上清に出てくるインターロイキン２活性を検討し
た。対照としてベクタープラスミドｐｃＥ−１を用いて
同様の方法で実験を行ないインターロイキン２活性を調
べた。結果を表−３に示す。
ズしたｍＲＮＡ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２８プラスミ
ドベクター（Ｇｅｎｅ、 ！、 ２８７−３０５（１９
８０））にｐＫＣＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ｖｏｌ ７８゜Ｎｏ
、３．１５２７−１５３１．１９８１）のＳＶ ４０
ウィルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組み
込んだｐＣＥ−１ベクターを造成した。そしてプラスミ
ドｐＩＬ−２−５０ＡクローンのプラスミドよりＰｓｔ
Ｉで挿入されたｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１ベクタ
ーのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐｃＥｏ、
−２）。なお、このプラスミドｐＣＥＩＬ−２が組み込
まれているエシェリヒア・コリ）ＩＢ １０１（ＡＪ
１２００８）は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２４４として
寄託されている。このときの挿入様式は図−２に示すよ
うにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流にインタ
ーロイキン２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＧが
接続されているものである（図のＩ）。このベクターを
サル培養細胞のＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ
、 Ｃｅ１ｌ ｖａｔ、 ２３１）１７５−１８２ （
１９８１））に感染せしめ（Ｍｃ Ｃｕｔｃｈａｎ ｅ
ｔａｊｌ Ｊ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ
、 ｖｏｌ、４１ ｐ３５１−３５７（１９６８））
、培養上清に出てくるインターロイキン２活性を検討し
た。対照としてベクタープラスミドｐｃＥ−１を用いて
同様の方法で実験を行ないインターロイキン２活性を調
べた。結果を表−３に示す。
表 −３
更にこのインターロイキン２活性は、マウス抗ヒトイン
ターロイキン２モノクローナル抗体によって中和され、
インターロイキン２活性は１ ｕ／ｍｊ！以下となった
。
ターロイキン２モノクローナル抗体によって中和され、
インターロイキン２活性は１ ｕ／ｍｊ！以下となった
。
インターロイキン２活性を持つポリペプチドをコードし
ているＤＮＡは、エシェリヒア・コリχ１７７８／ＩＬ
−２−５ＯＡ細胞より常法によりプラスミドＤＮＡ部を
分離し、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ
で消化した後、生成した二つのＤＮＡフラグメントより
分子量の小さいフラグメントを分離することにより得た
。
ているＤＮＡは、エシェリヒア・コリχ１７７８／ＩＬ
−２−５ＯＡ細胞より常法によりプラスミドＤＮＡ部を
分離し、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ
で消化した後、生成した二つのＤＮＡフラグメントより
分子量の小さいフラグメントを分離することにより得た
。
得られたＤＮＡの塩基配列は、前記Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔの化学法に準じて調べたところ、前述のとおり
の配列を有していることが判明した。
ｂｅｒｔの化学法に準じて調べたところ、前述のとおり
の配列を有していることが判明した。
図−１はインターロイキン２活性を持つポリペプチドを
コードしつる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＣＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 特許出願人 財団法人 癌 研 究 合同 味の素
株式会社 １、些けち
コードしつる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＣＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 特許出願人 財団法人 癌 研 究 合同 味の素
株式会社 １、些けち
Claims (6)
- （１）ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しない組換
えヒトインターロイキン２。 - （２）分子内に次のアミノ酸配列を含むヒト由来の他の
蛋白質を実質的に含有しない組換えヒトインターロイキ
ン２。 【遺伝子配列があります。】 - （３）ヒトインターロイキン２をコードする遺伝子を含
有するベクターを有する形質転換体により得られるヒト
由来の他の蛋白質を実質的に含有しない組換えヒトイン
ターロイキン２。 - （４）ヒトインターロイキン２をコードする遺伝子を含
有するベクターを有する形質転換体により得られ、分子
内に次のアミノ酸配列を含むヒト由来の他の蛋白質を実
質的に含有しない組換えヒトインターロイキン２。 【遺伝子配列があります。】 - （５）ヒトインターロイキン２をコードする遺伝子を含
有するベクターを有する形質転換体を培地に培養するこ
とを特徴とするヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有し
ない組換えヒトインターロイキン２の製造法。 - （６）分子内に次のアミノ酸配列を含むインターロイキ
ン２をコードする遺伝子を含有するベクターを有する形
質転換体を培地に培養することを特徴とする分子内に次
のアミノ酸配列を含むヒト由来の他の蛋白質を実質的に
含有しない組換えヒトインターロイキン２の製造法。 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63292084A JPH0832236B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 組換えヒトインターロイキン２およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63292084A JPH0832236B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 組換えヒトインターロイキン２およびその製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57229619A Division JPS59140882A (ja) | 1982-03-31 | 1982-12-24 | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165399A true JPH01165399A (ja) | 1989-06-29 |
| JPH0832236B2 JPH0832236B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=17777340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63292084A Expired - Lifetime JPH0832236B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 組換えヒトインターロイキン２およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0832236B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57181698A (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-09 | Girisu Suteiibun | Systematic production of interloikin 2 by t cell hibridomer |
-
1988
- 1988-11-18 JP JP63292084A patent/JPH0832236B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57181698A (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-09 | Girisu Suteiibun | Systematic production of interloikin 2 by t cell hibridomer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0832236B2 (ja) | 1996-03-29 |
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